FI77470C - Cellodlingsmedium foer anvaendning vid bestaemning av naerings- och biokemiska tillstaondet hos lymfocyter och foerfaranden foer uppskattning av naeringstillstaondet hos individer medelst detta cellodlingsmedium. - Google Patents

Description

1 77470

Soluviljelyalusta käytettäväksi lymfosyyttien ravitsemuksellisen ja biokemiallisen tilan määritykseen ja menetelmiä yksilöiden ravitsemustilan arvioimiseksi tämän soluvil jelysalustan avulla 5

Esillä oleva keksintö koskee soluviljelysalustaa, jota voidaan käyttää yksilöiden ravitsemuksen arviointiin, jotta yksilön ravitsemusvaatimukset voidaan optimoida niin, että saadaan aikaan parannettu terveys ja tuotta-10 vuus.

Mahdollisuus lievittää kliinisesti tunnistettavia tauteja, kuten pellagraa (c. A. Elvehjum, R. J. Madden, F. M. Strong ja D. W. Woolley, J. Am. Chem. Soc. 59 (1937) s. 1767; T. D. Spies, C. Cooper ja M. A. Blankenhorn, J.

15 Am. Med. Assoc. 110 (1938), s. 622; ja P. J. Fouts, O. M. Helmer, S. Lepkovsky ja T. H. Jukes, Proc. Soc. Exptl.

Biol. Med. 37 (1937), s. 405^ ja perniöösiä anemiaa ^E. L. Rickes, N. G. Brink, F. R. Koniuszy, T. R. Wood ja K. Fol-kers, Science 107 (1948), s. 396; G. R. Minot ja L. P.

20 Murphy, J. Am. Med. Assoc. 87 (1928), s. 47θ7 ravitsemus-tekijöiden avulla, johti useiden vitamiinien keksimiseen ja määrättyjen tautitilojen yhdistämiseen ravitsemuksessa oleviin puutteisiin. Koska nämä sairaudet ovat kliinisesti diagnostoitavissa ja ne voidaan varmistaa laboratoriotes-25 teillä, näiden sairauksien ravitsemuksen kautta tapahtuva hoito vakiintui nopeasti lääketieteelliseen käytäntöön.

Vaikkakin huomattavia todisteita on koottu ravitsemuksen ja ihmisen sairauksien, käyttäytymisen, ulkonäön ja hyvinvoinnin laajemmasta yhdyssiteestä . B. Stabury, 30 J. B. Wyngaarden ja D. S. Fredrickson, The Metabolic Basis of Inherited Diseases, McGraw-Hill Book Co., 1978; R. J. Williams, Biochemical Individuality, John Wiley and Sons, Inc. 19567, näiden tekijöiden saattaminen yleiseen lääketieteelliseen käytäntöön ei ole pitkälti toteutunut, kos-35 ka arviointimenetelmät yksilön ravitsemustilasta puuttu vat. Tietoja, kuten veren ja virtsan ravintoaineiden tasoa, entsyymien kyllästysastetta erityisistä vitamiineista johdetuilla koentsyymeillä, ja hiusanalyysejä on verrat- 2 77470 tu normaaliarvoihin tarkoituksena määrittää ravitsemuksen puutteita ^H. E. Sauberlich, R. P. Dowly ja J. H. Skala, Laboratory Tests for the Assessment of Nutritional Status, CRC Press, Inc., 1974^. Kuitenkaan tällaiset menetelmät 5 eivät todellisuudessa määritä yksilön ravitsemuksessa olevia puutteita, ja biokemiallisen yksilöllisyyden perusteella ravinnon tarpeet - erityisesti määrälliset tarpeet -tunnetusti vaihtelevat merkittävästi eri yksilöiden välillä. Niinpä nämä aikaisemmat arviointimenetelmät pelkästään 10 määrittävät ravitsemuksen tason, ravinnon oton jne. ja vertaavat niitä kontrolliryhmien keskiarvoihin. Nämä aiemmin käytetyt menetelmät eivät huomioi yksilöllisiä vaihteluja, jotka vaikuttavat jokaiseen enemmän tai vähemmän.

Sopivien kliinisten testien puuttuessa yksilölli-15 sen tason arvioimiseksi ovat yritykset käyttää ravitsemusterapiaa lääketieteellisessä käytännössä olleet rajoitettuja. "Hyvin tasapainotettu" dieetti rajoitetulla vitamiinien lisäyksellä on ollut tavallisin lähestymistapa lääketieteellisessä käytännössä yksittäisten potilaiden ravit-20 semuksessa. Rajoitetumpaa lääketieteellisessä käytännössä on ollut mega-vitamiinin käyttö, joka on saanut huomattavaa kritiikkiä, koska mahdollisista haitallisista sivuvaikutuksista on rajoitetusti kokeellista tietoa, mahdollisia pitkäaikaisia haittavaikutuksia koskevat tiedot puuttuvat, 25 ja samoin luotettavat todisteet siitä, että käsittelyllä on hyödyllinen vaikutus hoidettaessa tiettyjä tautitiloja.

Jo jonkin aikaa on ollut ilmeistä, että ravitsemuksen tehokas hyväksikäyttö lääketieteellisessä käytännössä on riippuvainen siitä, että saadaan kehitettyä mene-30 telmä kunkin yksilön ravitsemustilan arvioimiseksi ja sellaisten tekijöiden, jotka rajoittavat kunkin yksilön vastetta ravitsemukselle, identifioimiseksi. On ennakoitavissa, että kunkin yksilön ravitsemuksen optimoinnilla voisi olla hyvin merkittävät vaikutus yksilön terveyteen ja tuot-35 tavuuteen.

Useita vuosia sitten aloitettiin tämän ongelman lähestyminen arvioimalla tutkimuksiin osallistuvista yksilöistä peräisin olevien soluviljemien ravitsemuksen vaihtelevuutta. Useista mahdollisista solutyypeistä valittiin 77470 veren lymfosyytit/ pääasiassa koska ne ovat helposti saatavissa potilaiden rutiinitutkimuksissa. Lymfosyyteillä on lisäksi se etu, että ne ovat metabolisesti inaktiivisia kunnes ne on aktivoitu mitogeenillä, joten näissä so-5 luissa on informaatiota menneestä ravitsemustasosta ja niiden vaste ravitsemukseen vaihtelee vain vähän päivästä toiseen. Kasvun aktivoinnissa ja aloituksessa lymfosyytit joutuvat läpikäymään useimmat reaktioista, joita tarvitaan minkä tahansa ruumiin solun kasvussa; niinpä voidaan 10 ennustaa, että epänormaalius lymfosyyttien ravinnon tarpeessa tai metaboliassa heijastaa todennäköisesti muiden solujen tilaa. Niinpä sopiva lisäys ravintoon, tai myrkyllisten aineiden ollessa kyseessä, myrkyllisen aineen sopiva rajoitus tai sen vaikutuksen 15 poistaminen ravintoon tehdyllä lisäyksellä, olisi yksilölle hyödyllinen.

Kun tavoitteena oli kehittää tällainen menetelmä, oli välttämätöntä viljellä lymfosyyttejä kemiallisesti määritellyssä väliaineessa ilman tavallista vasikan si-20 kiön seerumin lisäystä. Vaikkakin lymfosyyttien aktivointia seerumivapaissa olosuhteissa on kuvattu, vaikeudet, joita on ollut samanlaisten tulosten saamisessa eri laboratorioista, johtivat päätelmään, että mahdollisia jäänteitä seerumiepäpuhtauksista tai vastaavista oli 25 mukana seerumivapaissa kokeissa. Seerumin albumiinin tai identifioimattomien seerumin makromolekyylien on esitetty olevan ehdottoman välttämättömiä mitogeenin indusoi-malle DNA-synteesille ihmisen perifeerisissä veren lymfosyyteissä.

30 Esillä olevan keksinnön alkuvaiheissa, useiden .. kemiallisesti määriteltyjen väliaineiden, joita on käy tetty soluviljelmissä, havaittiin ylläpitävän vain marginaalista aktivointia ja hyvin rajoitettua kasvua lymfosyyteissä. Tuli ilmeiseksi, että pitää kehittää uusi 35 väliaine, jotta saavutettaisiin merkittävää kasvuvastetta. Kun tarkoituksena oli saada väliaine, joka sopisi lymfosyyttien ravitsemustason arvioimiseen, oli välttämätöntä kehittää sellainen väliaine, johon kompo- 4 77470 nentteja voitiin säätää minimikonsentraatioina, mutta tasolla, joka ei vielä rajoita lymfosyyttien optimaalista vastetta. Kukin muutos tarvitsi määrityksen vaikutuksesta on muiden komponenttien vasteeseen.

5 Esillä oleva keksintö kohdistuu testiin ja testis sä käytettävään elatusaineeseen , jolla testillä voidaan määrittää laaja kartoitus ravintoaineiden puutteesta tai epänormaaleista tarpeista, herkkyydestä ravintoaineiden epätasapainolle, herkkyydestä ravintoaineiden, lää-10 keaineiden ja lukuisan joukon muita aineita myrkyllisille vaikutuksille, ja kunkin yksilön monista biosynteet- tisistä mahdollisuuksista. Lyhyesti sanottuna esillä oleva keksintö ensimmäisen kerran mahdollistaa yksilön ravitsemuksellisen tilan ja kvantitatiivisten tarpeiden tar-15 kan määrittämisen niin, että yksilön tehokas ravinnon hyväksikäyttö voidaan määrittää ja toteuttaa. Termillä "ravintoaineet" tarkoitetaan tässä ravintoaineita, jotka ovat välttämättömiä kasvulle, normaalille toiminnalle ja elämän ylläpitämiselle. Näihin ravintoaineisiin kuuluvat vitamii-20 nit, aminohapot (proteiinit), mineraalit, hiilihydraatit ja lipidit (rasvat).

Lyhyesti, lymfosyyttejä viljellään seerumivapaassa puskuroidussa elatusalustassa, josta jokin komponentti tai ryhmä komponentteja voidaan jättää pois ja/tai johon 25 voidaan lisätä erilaisia mahdollisia veren komponentteja sisältäen myös normaalista poikkeavat komponentit, kuten ; lääkeaineet. Viljelmät korjataan ja lymfosyyttien vas teet mitataan. Esimerkiksi testattaessa vitamiinien puutosta tai epänormaalista vastetta vitamiineille, testat-30 tava vitamiini jätetään pois viljelyalustalta. Yksi vertailuna käytettävä viljelmä sisältää kaikkia vitamiineja. Testattaessa herkkyyttä aminohappojen epätasapainolle läsnä on kaikki kolmetoista lymfosyyteille välttämätöntä aminohappoa ja seriiniä, ja ryhmä amino-35 happoja konsentraatioina, jotka ovat normaalisti veressä ja hiukan suurempina konsentraatioina, testataan inhiboivien vaikutusten selville saamiseksi. Testattaessa hiilihydraattien hyväksikäyttöä voidaan glukoosi jät-

II

5 77470 tää pois elatusalustalta ja kunkin monista muista hiilihydraateista (kuten mannoosi ja galaktoosi) vasteet voidaan mitata.

Viljelysalusta lymfosyyttien optimaalisten ravinto-5 tarpeiden määrittämiseksi sisältää seerumivapaan pusku roidun liuoksen, joka sisältää epäorgaanisia suoloja, glukoosia, aminohappoja, vitamiineja, pyruvaattia, koliinia, inositolia ja adeniinia. Liuoksen pH on säädetty arvoon 7,6. Antibiootin lisäys tehdään muiden organis-10 mien kontaminaation tukahduttamiseksi, samoin kalsiumklo- ridi- ja magnesiumsulfaattiliuoksia, ferrosulfaattia ja etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) on mukana. Deionisoitua vettä lisätään lopullisen tilavuuden aikaansaamiseksi ja viljelyalusta suodatetaan suodatusyksi-15 köiden läpi sterilisaation aikaansaamiseksi. Suodatuksen jälkeen lisätään viljelyalustaan mitogeenia, kuten fyto-hemagglutininiinin (PHA) steriiliä liuosta.

Yksityiskohtaisempi kuvaus viljelyalustasta ja testimenetelmistä on seuraavassa keksinnön erityisen edul-20 listen suoritusmuotojen kuvauksessa.

Niinpä esillä olevan keksinnön tavoitteena on saada ;/ aikaan viljelyalusta, jolla voidaan määrittää laaja ·' kartoitus ravintoaineiden puutteista tai epänormaaleista tarpeista, herkkyydestä ravintoaineiden epätasapainolle, 25 herkkyydestä ravintoaineiden, lääkeaineiden ja lukuisan joukon muita aineita myrkyllisille vaikutuksille ja kunkin yksilön monista biosynteettisistä mahdollisuuksista.

Edelleen esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan lymfosyyttinen menetelmä ravitsemustason 30 määrittämiseksi, jolla menetelmällä saadaan toistettavia ja kvantitatiivisia tuloksia.

Edelleen esillä olevan keksinnön tavoitteena on saada aikaan testi, jossa lymfosyyttiseen menetelmään riittää hyvin pienet määrät verta.

35 Edelleen esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tällainen testi, joka on toistettavissa ja kvantitatiivinen määritettäessä vitamiinien, mineraalien, välttämättömien aminohappojen, hiilihydraattien ja muiden ravinteiden ja biokemiallisten välituotteiden puutteita, 77470 e epänormaaleja tarpeita tai epätasapainoa ja jossa käytetään minimaalisen pieniä määriä viljelykomponentteja, jolloin saavutetaan toistettavia ja kvantitatiivisia tuloksia.

5 Kuten edellä on mainittu, esillä oleva keksintö kohdistuu lymfosyyttitestiin ihmisen ravitsemustasosta, ja tällä testillä voidaan määrittää ravintoaineiden puutteet tai epänormaalit tarpeet, herkkyys ravinteiden epätasapainolle, herkkyys ravinteiden, lääkeainei-10 den ja monien muiden aineiden toksisille vaikutuksille, ja monet biosynteettiset mahdollisuudet kullekin yksilölle, niin että kunkin yksilön ravitsemus voidaan optimoida, jolloin saadaan ihmiselle parempi terveys ja tuottavuus. Tämän tuloksen toteuttamiseksi tarvitaan vil-15 jelyalusta, jossa komponentit on minimikonsentraatioina, mutta kuitenkin tasolla, joka ei vielä rajoita lymfosyyttien optimaalista vastetta ja jossa viljelyalustan komponenteilla ei ole vastakkaista vaikutusta lymfosyyttien vasteeseen.

20 Edellä esitetyt tavoitteet saavutetaan keksinnön mukaisella soluviljelysalustalla, joka sisältää puskuroitua seerumivapaata liuosta, joka sisältää seuraavia aineita: hiilihydraattia, joko glukoosia tai sen prekursoria, koliinia tai sen biologisesti käyttökelpoista perkursoria, 25 epäorgaanisia ioneja, kuten sulfaattia, kloridia, fosfaat tia, kalsiumia, magnesiumia, kaliumia, natriumia ja rautaa biologisesti käyttökelpoisessa muodossa, deionisoivaa vettä, ja mitogeeniä, ja jonka puskuroidun seerumivapaan liuoksen pH on välillä 6,8 - 7,6; ja jolle on tunnusomais-30 ta, että siihen lisätään lisäravinteina aminohappojen ja vitamiinien käyttökelpoisia muotoja ja testattava ravinne jätetään pois tai sitä on ravinnelisäyksessä mukana rajoittavia tai inhiboivia määriä.

Il 7 77470 Käytettäessä viljelyalustaa tietyn tyyppisissä testeissä jätetään elatusaineesta sopivasti pois vitamiinit, aminohapot, ja epäorgaaniset suolat jne., ja pois jätetyn ravinteen vaikutus määritetään. Esimerkiksi koko vitamiini-5 lisäys jätetään pois viljelyalustasta vitamiineja testattaessa ja vitamiiniliuos, josta testattava vitamiini on jätetty pois, lisätään yksittäin kuhunkin putkeen. Yksi kolmoissarja, jota käytetään kontrollina, sisältää kaikkia vitamiineja. Kuitenkin testattaessa aminohappojen 10 epätasapainoa kaikki 15 aminohappoa ovat mukana, ja kutakin testattavaa luonnossa esiintyvää aminohappoa tai ryhmää aminohappoja lisätään suurempina konsentraatioina.

Edullinen viljelyalusta testattaessa lymfosyyttien optimaalista ravinnontarvetta käsittää seuraavia kompo-15 nentteja ja se valmistetaan seuraavasti:

Liuokset

Kaksinkertaisesti väkevä elatusaineen puskuri. Käytetty kaksinkertaisen väkevä puskuri sisältää litraa deionisoitua vettä kohden: Hepes (puskuri), 23,8 g; nat-20 riumhydroksidia, 1,28 g; natriumkloridia, 14,02 g; dika- : liumvetyfosfaattia, 1,05; ja fenolipunaista, 2,48 g.

Tämä puskuri suodatettiin 0,22 pm Millipore-suodattimen läpi.

Elatusaineen suolat. Elatusaineen suolojen perus-25 liuos, jota käytetään lymfosyyttien pesuun ja suspendoin-tiin, valmistetaan laimentamalla kaksinkertaisen väkevää elatusaineen puskuria suhteessa 1:2 deionisoidulla vedellä. Kun valinnaisena komponenttina käytetään glukoosia, se lisätään niin, että lopullinen konsentraatio on 30 4 mM. pH säädetään arvoon 7,6 4-n NaOH:11a ja liuos suoda tetaan. Lisäaineet lisätään mitattuina määrinä tähän perusliuokseen niin* että saadaan lopullisiksi konsentraa-tioiksi kalsiumkloridille 55,5 mg/1, magnesiumsulfaatille 60,0 mg/1, ferrosulfaatille 0,695 mg/1 ja EDTA:lie 35 0,373 mg/1. Ferrosulfaatti ja EDTA valmistetaan ja lisä tään yhdessä. Sitten lopullinen liuos suodatetaan. Testattaessa mineraalien tarvetta jätetään tarvittavat mineraalit pois elatusaineen suoloista.

8 77470

Aminohappolisäys. Lisättävä aminohappoliuos sisältää litraa kohden: 0,7 g L-arginiinia, 5,85 g L-glutamii-nia, 0,25 g glysiiniä, 0,23 g L-histidiiniä, 013 g L-iso-leusiinia, 0,44 g L-leusiinia, 1,22 g L-lysiiniä, 0,15 g L-5 metioniiniä, 0,0825 g L-fenyylialaniinia, 0,35 g L-serii- niä, 0,4 g L-treoniinia, 0,034 g L-tryptofaania, 0,063 g L-tyrosiinia ja 0,39 g L-valiinia. Haluttaessa gluta-miinia voidaan lisätä erikseen. Kysteiini lisätään erikseen pyruvaatin kanssa kuten myöhemmin esitetään.

10 Vitamiinien lisäys. Lisättävä vitamiiniliuos sisäl tää litraa kohden: 0,735 mg biotiinia, 0,602 mg fooli-happoa (kalsiumsuolana), 0,61 g nikotiiniamidia, 23,8 mg kalsiumpantotenaattia, 6,15 mg pyridoksiinia, 33,7 mg tiamiinia, 13,6 mg B12-vitamiinia, ja 3,75 mg ribofla-15 viiniä.

Antibioottien lisäys. Lisättävä antibioottiliuos sisältää litraa kohti: 10 000 000 IU penisilliiniä, 10 000 000 pg streptomysiiniä ja 25 000 pg amfoterisiini B:tä (fungisidi).

20 Fosfaatilla puskuroitu suolaliuos. Fosfaatilla puskuroitu suolaliuos sisältää litraa kohti: 7,1 g NaCl:a, 2,17 g Na2HP04.7H20:a, 200 mg KH2PO^:a ja 200 mg KCl:a.

Viljelyalusta 25 Edullinen viljelyalusta, joka on sopiva lymfosyyt tien optimaalisen ravinnon tarpeen määrittämiseen, valmistetaan seuraavasti: 50 ml:aan elatusainepuskuria lisätään 72 mg glukoosia, 1 ml aminohappoliuosta, 3 ml liuosta, joka sisältää 5,5 mg/ml pyruvaattia ja 0,88 mg/ml 30 kysteiiniä, 1 ml liuosta, joka sisältää 1,4 mg/ml koliini-kloridia ja 1,8 mg/ml inositolia, 1 ml yllä mainittua vitamiiniliuosta ja 1 ml liuosta, joka sisältää 135 pg/ml adeiinia. pH säädetään laimealla NaOH-liuoksella arvoon 7,6. Tehdään seuraavat lisäykset: 1 ml antibioottiliuosta, 35 0,5 ml 22,2 mg/ml kalsiumkloridia sisältävää liuosta, 0,5 ml 24 mg/m 1 magnesiumsulfaattia sisältävää liuosta, 1 ml liuosta, joka sisältää 0,278 mg/ml ferrosulfaattia ja 0,149 mg/ml EDTA:a. Deionisoitua vettä lisätään niin n 9 77470 paljon, että lopulliseksi tilavuudeksi saadaan 100 ml, ja elatusaine suodatetaan Nalgane-membraanisuodattimen läpi liuoksen steriloimiseksi. Suodattamisen jälkeen lisätään 0,2 ml steriiliä liuosta, joka sisältää 1 mg/ml 5 fytohemagglutiniinia (PHA), kuhunkin 100 ml:n erään ela-tusainetta. PHA saadaan Sigma Chemical Co:lta 5 mg:n määrissä ja se laimennetaan steriilillä deionisoidulla vedellä.

Niinpä edullinen viljelyalusta, joka on sopiva 10 lymfosyyttien optimaalisen ravinnontarpeen määrittämiseen, sisältää seerumivapaan, puskuroidun (pH 7,6) liuoksen, joka deionisoidussa vedessä sisältää litraa kohti liuosta seuraavat talukossa I annetut komponentit.

10 77470 Taulukko I

Hiilihydraatti

Glukoosi 720 mg Aminohapot 5 L-Arginiinin hydrokloridi 7 mg L-Kysteiinin hydrokloridihydraatti 26,4 mg L-Glutamiini 58,5 mg

Glysiini 2,5 mg L-Histidiinin hydrokloridihydraatti 2,3 mg 10 L-Isoleusiini 1,3 mg L-Leusiini 4,4 mg L-Lysiinin hydrokloridi 12,2 mg L-Metioniini 1,5 mg L-Fenyylialaniini 0,825 mg 15 L-Treoniini 4,0 mg L-Tryptofaani 0,34 mg L-Tyrosiini 0,63 mg L-Valiini 3,9 mg

Vitamiinit 20 Biotiini 7,35 pg

Foolihappo (kalsiumsuola) 6,02 pg

Nikotiiniamidi 6,1 mg

Pantoteenihappo (hemikalsiumsuola) 0,238 mg 238 pg 25 Pyridoksiinin hydrokloridi 61,5 pg

Tiamiinikloridi hydrokloridi 0,337 mg 337 pg B12-vitamiini “ (Hydroksokobalamiinihydrokloridi)

Riboflaviini 37,5 pg 30 Suolat (epäorgaaniset)

Kalsiumkloridi 111 mg

Magnesiumsulfaatti 120 mg

Dikaliumvetyfosfaatti 525 mg

Natriumhydroksidi 640 mg 35 Natriumkloridi 7,01 g

Ferrosulfaatti, heptahydraatti 2,78 mg yhdessä 1,49 mg:n EDTA:a kanssa (Etyleenidiamiinitetraetikkahappo, natriumsuola) (jatkuu..) il il 77470

Taulukko I (jatkoa)

Muut komponentit

Inositoli 18 mg

Koliinikloridi 14 mg 5 Natriumpyruvaatti 165 mg

Adeniini 1,35 mg

Hepes-puskuri 11,9 g

Fenolipuna 1,24 mg

Antibioottiliuos: 10 100 000 IU penisilliiniä 100 000 |ig streptomysiiniä 250 pg amfotericin B:tä Mitogeeni

Fytohemagglutiniini (PHA) 2,0 mg 15

Kuten aiemmin on mainittu ja myöhemmin esitetään, voidaan glukoosi taulukon I mukaisessa viljelyalustassa korvata aineella, joka voi tuottaa glukoosia metabolia-20 tuotteena, ferrosulfaatti voidaan korvata transferriinillä, ferri-ioneja ei voida käyttää tehokkaasti sellaisenaan transferriiniä lukuunottamatta, seriini voidaan jättää pois tietyissä olosuhteissa tiettyjä testejä tehtäessä, ja hyvin ravituilla yksilöillä ainoastaan pantoteeni-25 happovarastot ovat riittämättömät lymfosyyttien aktivoin-' - nissa ja alkuperäisessä solun jakautumisessa.

: : Komponentit taulukon I mukaisessa viljelyalustas sa voivat vaihdella. Yleensä komponentteja käytetään tehokkaina annoksina, jotka voivat vaihdella laajasti 30 erilaisissa ravitsemustesteissä, sekä potilaiden yksilöllisten ominaisuuksien mukaan. Komponentin tehokas määrä tässä on määrä, jolla saavutetaan haluttu vaste potilaalla. Edullisesti komponentin määrän ei pitäisi laskea oleellisesti potilaalle kullakin komponentilla 35 saadun annos-vaste-käyrän alapuolelle. Useimmille potilaille ja testeille seuraavat komponenttien vaihteluvä- i2 77470 lit ovat tyydyttäviä. Komponenttien täsmälliset annokset, joilla saavutetaan tehokas vaste, voidaan määrittää yksinkertaisella kokeella viljelyalustalla.

Glukoosi. Taulukossa I on esitetty glukoosin 5 edullinen taso, 729 mg/1 elatusaineessa rutiinitestejä varten. Rutiinitestaus voidaan tehdä niinkin korkealla glukoosin konsentraatiolla kuin 7200 mg eli 7,2 g/1 sekä niin matalalle kuin 72 mg/1. Kuitenkin hiilihydraatin korvaustesteissä ovat tasot noin 8-72 mg/1 käyttö-10 kelpoisempia määritettäessä solujen kykyä käyttää hyväksi glukoosia suhteessa muihin hiilihydraatteihin, tai testattaessa aiheita, jotka säästävät glukoosin tarvetta.

Aminohapot. Suositeltavat aminohappomäärät rutiini-15 testauksessa on esitetty taulukossa I. Kuitenkin, jos kaikkien aminohappojen määrää nostetaan samassa suhteessa taulukossa I esitettyihin konsentraatioihin nähden, hyödyllistä tietoa voidaan saada ilman merkittävää laskua vasteessa konsentraatioiden 20-kertaisella lisäyk-20 sellä. 40-kertaisella lisäyksellä inhibointi alkaa tulla ilmeiseksi ja 60-80-kertaisella lisäyksellä ami-nohappojen vasteen inhibitio estää hyödylliset rutiinites-;; tit. Aminohappojen määrää voidaan yhteisesti laskea hiu kan ja yksilöllisesti voidaan määrää laskea 0,3-0,1-25 osaan taulukossa I esitetyistä konsentraatioista ja V vielä saadaan hyödyllistä tietoa. Aminohappotarpeen määrittämiseksi annos, jolla saadaan puolet maksimi-vasteesta, on tavallisesti noin 0,1-kertainen määrä taulukossa esitettyyn määrään nähden samalla kun jonkun 30 määrä on 0,03-kertainen taulukossa esitettyyn määrään nähden. Testattaessa epätasapainoa lisätään aminohappoja korkeina pitoisuuksina, esimerkiksi 6-10-kertaisina normaaleihin veren pitoisuuksiin verrattuna, jolloin saadaan hyödyllisiä tuloksia.

13 77470

Vitamiinit

Pantoteenihappo. Tämä on ainoa vitamiini, joka on ehdottoman välttämätön useimpien yksilöiden rutiini-testauksessa. Vasteita voidaan saada niinkin pieninä 5 annoksina kuin kahdeskymmensosa taulukossa I esitetystä määrästä ja yläraja on avoin, koska se ei ole myrkyllinen suhteellisesti hyvin suurillakaan annoksilla. Annosvasteet, jotka ovat tärkeitä, saadaan vaihtelemalla annoksia ja aloittamalla annoksesta 10 jig/1 elatusai-10 netta. Optimivaste saadaan paljon alle taulukossa I

esitetyn tason ja myrkyllisyystaso on erittäin korkea.

Riboflaviini. Lymfosyyttien vaste riboflaviinille alkaa olla merkittävä konsentraatiolla, joka on 0,001-kertainen taulukossa I esitettyyn verrattuna ja 15 maksimivaste, joka vaihtelee yksilöiden puutoksen mukaan, 0,003-0,1-kertainen taulukossa I esitettyyn tasoon verrattuna. Taulukossa I esitettyä tasoa käytetään, jotta saadaan näyttöä epänormaaleista tarpeista, mutta hyödyllisiä tuloksia saadaan 0,01-0,1-kertaisilla annok-20 silla taulukon I annokseen verrattuna. Yrityksiä ei ole tehty myrkyllisyyden ylärajan löytämiseksi, mutta se on paljon korkeampi.

Foolihappo. Alhaisin hyödyllinen foolihapon määrä, jolla havaitaan vastetta, vaihtelee välillä 0,03-0,1-25 kertaa taulukossa I esitetty määrä, mutta testeissä, joissa adeniinin tai seriini-glysiinin interkonversio on rajoittunut, aina 10-20-kertainen määrä foolihappoa voi olla tarpeen optimivasteen saavuttamiseksi. Hyvin korkeat foolihappopitoisuudet pyrkivät pienentämään vas-30 tetta.

Biotiini. Se määrä biotiinia, joka tarvitaan vasteen aikaansaamiseksi, on oleellisesti pienempi kuin taulukossa I esitetty. Yksilöillä, joilla biotiinin määrä on riittämätön, merkittävä vaste voidaan saada määrillä, 14 77470 jotka ovat 0,01-0,03-kertaisia taulukossa I esitettyihin määriin verrattuna, mutta korkeampia pitoisuuksia tarvitaan havaitsemaan epänormaaleja tarpeita. Yläraja on suhteellisen korkea.

5 Bg-vitamiini. Potilailla, joilla on Bg-vitämiinin puutosta, hyödyllisiä vasteita voidaan saada pitoisuuksilla, jotka ovat noin 0,03-0,1-kertaiset taulukossa I esitettyyn määrään nähden, lukuunottamatta olosuhteita, joissa glysiini ja/tai seriini jätetään pois, jolloin 10 elatusaineessa täytyy käyttää ainakin 10-20-kertaisia pitoisuuksia taulukossa I esitettyyn verrattuna. Myrkyl-lisyystaso on tosiasiassa paljon korkeampi.

B12~vitamiini· Määrä 0,1-10 000 pg/l tarvitaan testeissä kaikissa mahdollisissa olosuhteissa.

15 Nikotiiniamidi, tiamiini. Näiden myrkyllisyyttä ei ole määritetty ylärajan selville saamiseksi. Puutoksesta kärsivillä yksilöillä alhaisin raja, jolla voidaan osoittaa vastetta, on välillä 0,01-0,03-kertainen taulukossa I esitetystä.

20 Suolat

Kalsiumkloridi. Alentunut vaste saadaan annoksella, joka on 0,1-kertainen taulukossa I esitettyyn verrattuna (eli 11,1 mg/1); lähes optimivaste saadaan annoksella 55,5 mg/1; ja useimmilla yksilöillä optimivaste saadaan 25 vielä annoksella 222 mg/1 kun taas jotkut tarvitsevat tästä suuremman annoksen optimivasteen aikaansaamiseksi. Annoksella 333 mg/1 saatiin lasku vasteeseen yhdellä neljäsosalla testatuista yksilöistä. Kalsiumkloridin määrää voidaan nostaa kolminkertaiseksi taulukossa I esitetystä 30 ilman merkittävää vasteen estoa monilla testatuilla yksilöillä. Yläraja, jossa alkaa esiintyä haitallisia vaikutuksia, ei ole kovin paljon korkeampi.

Magnesiumsulfaatti. Alaraja on noin 0,1-kertainen taulukossa I esitettyyn verrattuna. Kolme kertaa suurem-35 pia määriä kuin taulukossa I eli 360 mg/1, on käytetty menestyksellä, eikä vielä viisinkertaisella annoksellakaan taulukkoon I verrattuna ole havaittu merkittävää vasteen estymistä.

is 77470

Ferrosulfaatin heptahydraatti yhdessä etyleeni-diamiiniheptahydraatin kanssa. Alaraja on 0,1-kertainen taulukossa I esitettyyn verrattuna useimmilla potilailla, yhdellä saatiin hyvä vaste vielä 0,05-kertaisella annok* 5 sella taulukossa I esitettyyn verrattuna. Kolminkertaisia annoksia taulukossa I esitettyihin arvoihin verrattuna on käytetty menestyksekkäästi, ja kymmenkertaiset annokset saattavat vielä olla sopivia, ennen kuin myrkyllisyys estää kokeen suorittamisen.

10 Transferriini voi korvata ferrosulfaatin ja 0,3 mg/1 on alaraja, jolloin vaste on lievästi pienentynyt; 30 mg/1 saa aikaan optimisvasteen. Ylärajaa myrkyllisyyden havaitsemiseksi ei ole määritetty.

Natriumkloridi. Natriumkloridin konsentraatio on 15 kriittinen. Jopa 25 %:n lisäys tai vähennys voi olla vahingollinen testille.

Dikaliumvetyfosfaatti. Nelinkertainen nousu pienentää tuloksen ll,800:sta 9350:aan, jolla voidaan saada tyydyttävä testitulos; kuitenkin kymmenkertaisella annok-20 sella taulukon I annokseen verrattuna saadaan riittämätön vaste.

Natriumhydroksidi. Tarvitaan riittävä määrä säätämään elatusaineen pH välille 6,8-7,6.

Muut komponentit 25 Inositoli. Konsentraatio 0,018 mg/1 antaa noin 70 % maksimivasteesta. 72 mg/1 antaa myös maksimivasteen, täten myrkyllisyyttä ei esiinny kuin erittäin suurilla konsent-raatioilla. Koska inositoli on pelkästään stimuloiva, sen pois jättäminen aiheuttaa tavallisesti vain vähäi-30 sen laskun vasteeseen. Yhdellä yksilöryhmällä havaittiin 50 %:n lasku vasteessa, mutta joidenkin yksilöiden lymfosyyteillä ei havaittu lainkaan laskua.

Koliini. Konsentraatio 0,014 mg/1 on riittämätön; 0,14 mg/1 saa aikaan lähes maksimivasteen ja konsentraa- _____- - 7Γ --- 16 77470 tiot välillä 1,4 mg/1-56 mg/1 saavat aikaan maksimivasteen aiheuttamatta merkittävää myrkyllisyyttä useimpien yksilöiden lymfosyyteissä.

Pyruvaatti. Sopiva annos vaihtelee välillä 5 56 mg/1 - 495 mg/1; 16,5 mg/1 on riittämätön, 1650 mg/1 on myrkyllinen.

Adeniini. 13,5 mg/1 on tyydyttävä, mutta 135 mg/1 osoittaa myrkyllisyyttä. Alaraja on noin 0,1-kertainen taulukossa I esitettyyn verrattuna.

10 PHA. Sopiva määrä vaihtelee välillä 1-20 mg litraa kohti, mutta rajat vaihtelevat yksittäisten potilaiden lymfosyyttinen kohdalla. On mahdollista jättää pois yksi vitamiineista kokonaan, paitsi pantoteenihappo; esimerkiksi nikotiiniamidi voidaan jättää pois ilman merkit-15 tävää vaikutusta vasteeseen useimmilla potilailla. Niinpä tällainen elatusaine on sovelias muutamia harvoja potilaita lukuunottamatta. Yksittäisen aminohapon tai pienen joukon aminohappoja määrää voidaan nostaa korkeisiin pitoisuuksiin ilman merkittävää vaikutusta testiin suu-20 rella osalla potilaista. Minimielatusalusta, joka on kuvat-·'· tu taulukossa I, on osoittautunut menestyksekkääksi silloin, kun aminohappojen määrä vaihtelee välillä 0,3-3 kertaa peruselatusaineessa oleva määrä.

On olemassa ehdoton minimitarve kullekin aminohapol-25 le viljeltäessä lymfosyytteja taulukon I mukaisessa mini-mielatusalustassa. Tämä raja, samoin kuin yläraja^ riippuu elatusaineen koostumuksesta^ sillä lymfosyyttien vaste on useimmiten tulos konsentraatioiden suhteesta ennemmin kuin komponenttien konsentraatioista. Tämä on tulos keski-30 näisestä antagonismistä ja vaihtelee eri potilailla, samoin kuin minimitarvekin.

Mitogeeniä tulee olla läsnä niin paljon, että saavutetaan testattavien solujen maksimistimulointi, puskuria tulee olla riittävästi, jotta pH pysyy välillä 35 6,8-7,8, läsnä tulee olla riittävästi fenolipunaa, jotta se toimisi pH-indikaattorina ja riittävästi 17 77470 antibioottia tulee olla läsnä, jotta ehkäistäisiin viljelyalustan kontaminaatio. Edellä esitetyillä määrillä ja vaihteluväleillä saavutetaan tehokas toiminta viljelyalustan komponenteille.

5 Lymfosyyttien erotus

Lymfosyytit voidaan erottaa verinäytteistä millä tahansa halutulla ja edullisella tavalla. Seuraavassa on esimerkki siitä, miten lymfosyytit voidaan erottaa verestä.

10 Verinäytteet kerätään steriileihin heparinisoitui- hin, 10 ml:n Vacutainer-putkiin, joissa niitä ei pidetä 30 minuuttia kauempaa huoneen lämpötilassa. Näytteet laimennetaan suhteessa 1:2,4 fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella. Laimennettu veri (8 ml) levitetään 15 huolellisesti 3 ml:n Histopague'ta (Ficoll ja natriumdi-atrizoaattiyhdiste Sigma Chemical Co:lta) sisältäviin sopiviin putkiin. Kahdenkymmenen minuutin sentrifugointi nopeudella 2000 kierrosta minuutissa IEC:n kliinisessä sentrifugissa erottaa erytrosyytit lymfosyyteistä, jäl-20 kimmäisten jäädessä kerroksena Histopaquet'n päälle. Tämä kerros sisältää pääasiassa lymfosyyttejä.

Lymfosyytit uutetaan putkista käyttäen steriilejä Pasteurin pipettejä. Noin 0,5-2,5 ml lymfosyyttejä laitetaan 15 ml:n Corning'in muovisiin sentrifugiputkiin, 25 jotka sisältävät noin 6 ml elatusaineen suolaliuosta.

(Yleensä tarvitaan 6 Histopaque-putkea 20 ml:lie verta, ja näistä saadut lymfosyytit pannaan 4 Corning-putkeen). Sitten sentrifugiputkia käännellään ylösalaisin useita kertoja solujen pesun edistämiseksi, ja tämän jälkeen 30 niitä sentrifugoidaan nopeudella 1700 kierrosta/min 10 minuutin ajan. Erottunut liuos heitetään pois ja kussakin putkessa olevat solut suspendoidaan uudelleen noin 1 ml:aan elatusaineen suolaliuosta käyttäen hellävaraista imemistä steriilillä Pasteur-pipetillä. Kaikkien 35 neljän putken sisällöt yhdistetään yhteen putkeen, ja huuhteluliuokset siirretään Pasteur-pipetin avulla 18 77470 lymfosyyttisuspensioon. Lymfosyyttejä sisältävää putkea käännellään ylösalaisin useita kertoja ja sentrifugoidaan nopeudella 1700 kierrosta/min 10 minuutin ajan ja erottunut liuos heitetään pois sakan päältä.

Lymfosyyttipallo suspendoidaan uudelleen 3 ml saan 5 elatusaineen suolaliuosta edellä kuvatulla tavalla.

Solut lasketaan nyt Coulter-laskimella seuraavasti: 20^ul suspensiota lisätään 10 ml:aan Isotonia muovisessa Coulter-kyvetissä ja 1 tippa Zapoglobiinia lisätään (Coulter Diagnostics) liuottamaan solun membraanit, niin 10 että tumat voidaan laskea. Liuosta sekoitetaan varovasti ja laskeminen suoritetaan kolme kertaa Coulter-laskimella. Lymfosyyttiliuos laimennetaan konsentraatioon 3 miljoonaa solua/ml (perustana kolmen laskentatuloksen keskiarvo) elatusaineen suolaliuoksella ja laskeminen 15 suoritetaan uudelleen. Tätä lymfosyyttiliuosta käytetään sitten kokeessa.

Lymfosyytit voidaan eristää verestä muidenkin tunnettujen menetelmien avulla. Esimerkiksi testihenkilöltä saatu veri voidaan tehdä hyytymättömäksi tavanomai-20 sella tavalla, esimerkiksi lisäämällä hepariinia, jonka jälkeen lymfosyytit voidaan ottaa talteen siitä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi johtamalla verinäyte pylvääseen, joka on täytetty lasihelmillä. Tahmeat solut tarttuvat helmien pinnalle. Lymfosyytit voidaan ottaa 25 talteen eluaatista gradienttisentrifugoinnin avulla.

Vaihtoehtoisesti tahmeiden solujen adsorptio lasihelmien pinnalle voidaan jakaa niin, että gradienttisentrifugoin-tia voidaan suoraan käyttää.

Edelleen sopivia menetelmiä lymfosyyttien saami-30 seksi on kuvattu ainakin seuraavissa julkaisuissa:

Johnson, G.J. ja Russel, P.S., Nature 208, s. 343 (1965); Boyum, A. Scand, J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 77 (1966); Oppenheimer, J.J., Leventhal, P.G., Hersh, E.M., Journal Immonology 101 ss. 262-270 (1968); Twomey, J. J., Sharkey, 35 0., Journal Immonology 108, ss. 984-990 (1972).

i9 77470

Kaikki lymfosyytit, jotka on saatu ja puhdistettu joillakin yllä olevista menetelmistä, voidaan laimentaa sopivaan konsentraatioon ja tämä suspensio sitten siirretään elatusalustalle.

5 Lymfosyyttitesti. Yleisesti testiin kuuluu testat tavien lymfosyyttien siirrostus viljelyalustalle,siirros-tetun viljelyalustan inkubointi, inkuboidun viljelmän talteenotto ja lymfosyyttien vasteen, kuten kasvun aktivoinnin ja alkamisen, mittaus.

10 Seuraavassa on esimerkki edullisesta lymfosyytti- testistä.

Aiemmin steriloituja (etyleenidioksidilla) poly-styreeniputkia, 12 x 75 mm, joissa on korkit (Scientific Products), käytetään tässä koemenetelmässä. 1 ml elatus-15 ainetta lisätään kuhunkin putkeen. Jos on tarpeen, erilaisia lisäaineliuoksia lisätään aina 30 pl;aan asti kuhunkin putkeen tai elatusainetta voidaan lisätä putkiin pienempi määrä, jolla on sopivasti suurempi konsentraatio, näitä lisäaineliuoksia voidaan lisätä niin, että lopul-20 liseksi tilavuudeksi saadaan 1 ml. Tähän siirrostetaan sen jälkeen 50 pl laimeaa lymfosyyttisuspensiota (150 000 lymfosyyttiä).

Inkubointi. Viljelyputket sijoitetaan ruostumattomasta teräksestä valmistettuihin telineisiin ja inkuboidaan 25 4 päivää 37°C:ssa 5-%:ssa hiilidioksidi-ilmakehässä, joka on kyllästetty vesihöyryllä. Neljäntenä päivänä putket otetaan pois ja laitetaan 37°C:seen vesihautee- 3 seen ja kuhunkin putkeen annostellaan 0,1 juCi H-tymi-diiniä, jonka ominaisaktiivisuus on 300 pCl/mmooli. Vil-30 jelmät pannaan tämän jälkeen uudelleen inkubaattoriin 23-25 tunniksi ennen talteenottoa. Muitakin aikamääriä ennen talteenottoa voidaan käyttää, esim. 8 tunnilla saadaan samoja tuloksia kontrolleihin verrattuna.

Talteenotto. Viljelmät kerätään Milliporen näytteen 35 kokoomaputkilla käyttäen 0,45 pm suodatinpapereita, jotka pystyvät suodattamaan pois nukleiinihapot. Korkit poiste- 20 7 7 4 7 0 taan putkista, putket pannaan jäihin, jonka jälkeen niitä sekoitetaan voimakkaasti Vortex-sekoittajalla. Sovitetut suodatinpaperit kostutetaan fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, joka on laimennettu puoleen ja jota 5 käytetään kautta koko korjuuvaiheen. Ensimmäisiä 12 putkea sekoitetaan uudelleen Vortex-sekoittajalla, sitten ne täytetään 3/4:aan samalla suolaliuoksella. Ne kaadetaan näytteen kokoomaputkien 12 suodattimelle. Kukin putki pestään kahdesti suolaliuoksella ja myös pesuliuok-10 set kaadetaan suodattimille. Sitten noin 5 ml suolaliuos ta kaadetaan kullekin suodattimelle ennen varsinaista pesua. Tämä toistetaan, 12 putkea kerrallaan, lopulle testattavalle materiaalille.

Suodatinpapereita kuivataan 5 minuutin ajan kuiva-15 tusuunissa 120°C:ssa, ja ne asetetaan sitten laskentapul- loihin, jotka sisältävät 10 ml tolueeni-PPO-tuike-nestettä (20 g PPOrta 4 l:ssa tolueenia). Pulloista suoritetaan laskenta Beckmanin LS 250-tuikelaski-mell a.

20 Edellä kuvattua testimenetelmää voidaan modifioida esimerkiksi suorittamalla testi 0,2 mlrssa elatusainetta mikrotestilevyjen syvennyksessä (esim. Corning tai Falcon) sen sijaan, että käytetään 1 ml elatusainetta viljelyput-kissa. Käytetään samaa viljelyalustaa ja aineiden konsent-25 raatioita. Lisättävät aineet lisätään mielellään syven nyksiin 2 μ1:η määrinä 10 pl:n sijasta, koska lopullinen tilavuus tulee olemaan 1/5 suuremman viljelyn tilavuudesta. Lymfosyytit pestään elatusaineen suolaliuoksella tavalliseen tapaan, mutta viimeisen pesun jälkeen 30 ne suspendoidaan saman tyyppiseen elatusaineeseen kuin mihin ne myöhemmin lisätään syvennyksissä konsentraa— tiona 150 000 solua/ml. Tämä suspensio pipetoidaan kuhunkin syvennykseen, 0,2 ml/syvennys, jolloin kokonaistilavuudeksi saadaan 0,22 ml ja lopulliseksi solukonsent- 35 raatioksi 30 000/0,22 ml. Levyjä inkuboidaan tavalliseen 3 tapaan; 10 μΐ 50 μ1:η sijasta samaa H-tymidnnia 21 77470 (ominaisaktiivisuus 300 pCi/mmooli) lisätään neljäntenä päivänä. Talteenotto viidentenä päivänä tai sopivana ajankohtana tymidiinillä käsittelyn jälkeen tehdään käyttäen Brandel M-12 solunkerääjää ja Brandelin suodatinpape-5 ria 1 ml:n viljelmillä käytetyn Milliporen suodatinpape rin ja näyteen kokoojaputkien sijasta.

Edellä kuvatut menetelmät edustavat kahta eri olosuhteissa tapahtuvaa viljelystyyppiä, mutta monet muut muunnelmat ovat menetelmässä mahdollisia jotta saavute-10 taan perustarkoitus eli yksilön ravitsemustarpeen mää ritys ja biokemiallisesta yksilöllisyydestä johtuvien erilaisten tarpeiden^ samoin kuin tavanomaisten puutostilojen havaitseminen.

Välttämättömien aminohappojen epänormaalin tarpeen, 15 herkkyyden aminohappojen korkeammista konsentraatioista (esim. aminohappojen epätasapaino) johtuville haitallisille vaikutuksille ja kyvyttömyyden syntetisoida riittäviä määriä ei-välttämättömiä aminohappoja, määrittämiseksi rutiinimääritys voidaan suorittaa lisäämällä kutakin 20 kaikista aminohapoista, mukaan lukien elatusaineeseen kuulumattomat, pitoisuuksina, jotka suurinpiirtein vastaavat tavallista veren pitoisuutta ja samaan aikaan pitoisuuksina, jotka ovat merkittävästi suurempia kuin tavallinen pitoisuus. Aminohapon nostetuista konsentraa-25 tioista johtuvat haitalliset vaikutukset voivat joskus tulla esille toisen aminohapon (-happojen) tai tiettyjen vitamiinien annoksen lisäyksellä.

Aminohapon epänormaali tarve voidaan havaita valmistamalla edellä esitetty elatusaine, paitsi että amino-30 happo, jonka kvantitatiivinen tarve on tarkoitus määrit tää, jätetään pois ja sitä lisätään erilaisina konsent-raatioina eri putkiin, jotta saadaan annos-vaste-käyrä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää yhden aminohapon rajoitettua konsentraatiota ja verrata vastetta rajoitetul-35 la konsentraatiolla potilaan lymfosyyteissä vasteisiin, jotka on saatu ryhmän potilaita lymfosyyteillä samalla kyseisen aminohapon konsentraatiolla.

22 77470

Kahta eri konsentraatiota voidaan myös käyttää, jotta saadaan lisäinformaatiota tekemättä kokonaista annos- vaste-käyrää. Valittaessa testauksessa käytettäviä kon- sentraatioita seuraavat taulukossa II esitetyt amino-5 happojen konsentraatiot saavat aikaan vasteen, jota rajoittaa spesifinen aminohappo. Vaste, joka on puolet maksimista, voidaan saada konsentraatioilla, jotka ovat lähellä taulukossa II esitettyjä.

^ Taulukko II

konsentraatio mg/litra Arginiini 0,5

Glysiini 0,25

Histidiini 0,25 ^ Isoleusiini 0,25

Leusiini 0,25

Lysiini 0,8

Metioniini 0,2

Fenyylialaniini 0,2 20

Seriini 0,4

Treoniini 0,2

Tyrosiini 0,2

Tryptofaani 0,1 Väliini 0,25 25

Glutamiini 15,0

Kysteiini 5,0

Yksittäinen spesifinen konsentraatio, joka on noin puolet maksimivasteen tasosta, voi tarjota tietoa 30 epänormaalista tarpeesta minimitestauksella. Kahden pisteen vaste voidaan saada konsentraatioilla, jotka ovat hieman alempia ja toisaalta hieman korkeampia, esim.

2/3 ja 4/3, kuin määrät, joilla saadaan puolet maksimi- vasteesta, tai täydellinen annos-vaste-käyrä voidaan 35 saada ryhmällä konsentraatioita tällä yleisellä konsent-raatioiden vaihtelualueella.

Il 23 7 7 4 7 0

Mineraalien, kuten kalsiumin tai magnesiumin epänormaali tarve samoin kuin herkkyys mineraalien korkeammista pitoisuuksista johtuville haitallisille vaikutuksille voidaan määrittää samalla tavalla.

5 B-vitamiinien, yksi kerrallaan tai ryhmissä, pois- jättö elatusaineesta, kuten B12~vitamiinin ja foolihapon poisjättö ei tavallisesti johda pienentyneeseen vasteeseen muiden vitamiinien kuin pantoteenihapon kohdalla. Täten vasteen lasku muiden kuin pantoteenihapon kohdalla on 10 osoitus vitamiinin puutteesta tai epänormaalista tar peesta tai vitamiinin puutteellisesta varastosta.

Vasteen tasoa pantoteenihapon puuttuessa voidaan samalla tavalla käyttää hyödyksi arvioitaessa pantoteenihapon ravitsemustasoa. Vasteen laskua lisättäessä vitamiinin 15 antagonistia, esim. destiobiotiinia biotiinin hyväksikäytön estäjänä, voidaan käyttää mittana vitamiinin riittävyydestä inhiboiduissa systeemeissä. Tämä voi olla spesifisempi kuin vitamiinin tarve suhteessa tiettyihin vitamiineihin.

2Q Käyttäen tunnettuja menetelmiä hivenaineiden pois tamiseksi, joita voi olla elatusalustan aineiden epä-puhtautenaj on mahdollista havaita hivenaineiden puute ja epänormaali tarve ravitsemustekijöitä varten. Herkkyys lääkeaineille ja erilaisille myrkyllisille ai-25 neille ja näiden vuorovaikutus muutettaessa ravitsemus- tarpeita voidaan myös määrittää.

Tiettyjä elatusalustan aineita voidaan jättää pois lisäämällä muita komponentteja. Esimerkiksi seriini ja glysiini voidaan jättää pois viljelyalustalta monien 3Q yksilöiden lymfosyyttitestissä lisäämällä foolihapon ja

Bg-vitamiinin (pyridoksiini) konsentraatiota moninkertaisesti. Tällaiset testit määrittävät yksilön kykyä syntetisoida seriiniä. Foolihapon ja B^2-vitamiinin lisäyksen puuttuessa yksin glysiinin vasteen suhde seriinin vasteeseen yksin on suurempi kuin useimpien yksilöiden lymfosyyteillä. Toisaalta perniöösiä anemiaa 24 77470 sairastavien potilaiden lymfosyyttien vaste seriinille on suurempi kuin vaste glysiinille näissä olosuhteissa.

Yksilön kyky syntetisoida inositolia tai koliinia voidaan määrittää jättämällä nämä komponentit pois elatusalustasta. Esimerkiksi joidenkin yksilöiden lymfosyy-5 tit eivät kykene syntetisoimaan riittävästi inositolia, kun taas useimpien yksiköiden lymfosyytit kykenevät syntetisoimaan oleellisen osan inositolitarpeestaan.

Kyvyssä syntetisoida koliinia on havaittu vaihtelua eri yksilöillä. 2-dimetyyliaminoetanoli voi merkittä-10 västi korvata koliinin, ja korvauksen laajuutta voidaan käyttää määrittämään yksilöiden lymfosyyttien kykyä suoriutua koliinin synteesistä tätä välituotetta hyväksikäyttäen.

Jättämällä pois adeniini voidaan määrittää teki-15 jöitä, jotka vaikuttavat yksilön puriinisynteesiin.

Esimerkiksi foolihapon, glysiinin ja glutamiinin tarve vaihtelee näissä olosuhteissa eri yksilöillä. 5-amino-4-imidatsolikarboksamidi tai sen ribosyylijohdannainen korvaa merkittävästi adeniinin lymfosyyttien stimuloimi-20 sessa. Tällainen korvaus ei ainoastaan tarjoa informaa tiota siitä, millä tasolla puriinin biosynteesi on rajoitettua, vaan sillä voidaan myös määrittää foolihapon tarve viimeisessä vaiheessa puriinituman muodostuksessa.

Laajan ravitsemustasokatsauksen, ravinteiden keski-25 näisten vuorovaikutussuhteiden vaihtelujen, lääkeaineille ja ravinteille herkkyyden jne. määrityksessä testi hyvin pienellä tilavuudella, esim. 0,2 ml:n viljelmillä, joihin on siirrostettu noin 30 000 lymfosyyttiä, tarjoaa mahdollisuuden niin moneen kuin 750 yksittäiseen tes-30 tiin, joista kolminkertaisena suoritettuna voidaan saada 250 erilaista testivariaatiota lymfosyyteille noin 20 ml:sta verta. Tämä tarjoaa hyvin laajan katsauksen ravinteiden puutoksista tai epänormaalista tarpeesta, herkkyydestä ravinteiden epätasapainolle, herkkyydestä 35 ravinteiden, lääkeaineiden ja laajan joukon aineita myrkyllisille vaikutuksille ja yksilön monista biosyn-teettisistä mahdollisuuksista.

25 7 7 4 7 0

Viljely alustassa noin yksi päivä tarvitaan aktivointiin ja eksponentiaalinen vaste-käyrä saadaan seu-raavina neljänä päivänä, jonka jälkeen vaste laskee, ellei soluja eroteta ja uutta elatusäinetta lisätä.

5 Puutteellisen elatusaineen inkubointi johtaa tiettyjen komponenttien tyhjenemiseen ja sitä seuraavaa testiä voidaan käyttää tiettyjen puutteiden kuvaamiseen. Solut, jotka on aktivoitu tiettyjen ravinteiden, kuten panto-teenihapon läsnäollessa,, kehittävät riittäviä määriä 10 näitä komponentteja, niin että niiden määrä ei ole oleellinen tätä seuraavassa inkuboinnissa maksimivas-teen aikaansaamiseksi.

Glutarniinihappo, aspartiinihappo, asparagiini, alaniini ja proliini voidaan jättää pois elatusaineesta.

15 Jäljelle jäävistä 15 aminohaposta, jotka ovat välttämättömiä proteiinisynteesille, glysiini ja seriini voidaan jättää pois tietyissä olosuhteissa joidenkin yksilöiden lymfosyyteillä, mutta muille ne ovat välttämättömiä.

B-vitamiinien joukossa vain pantoteenihappo oli 20 ehdottoman välttämätön oleellisesti optimaalisen vasteen saamiseksi useilla hyvin ravituilla yksilöillä; kuitenkin riboflaviini ja B^-vitamiini usein todettiin stimuloiviksi, ja muut vitamiinit osoittivat stimuloivaa vaikutusta pienenevillä taajuuksilla. Nämä taajuudet 25 vastaavat melko läheisesti vitamiinien puutostilojen taajuuksia, jotka on määritetty erilaisilla menetelmillä. Näyttää siltä, että pantoteenihappoa lukuunottamatta B-vi-tamiinit normaalisti varastoituvat lymfosyytteihin kasvun aktivointiin ja aloitukseen riittävinä määrinä. Stimu-30 latorisen vasteen esiintyminen osoittaa, että lymfosyyteillä oli puutteita entsyymisisällössä ja/tai tietyn vitamiinin varastossa tai että niillä on vitamiinin epänormaali tarve. Koska lymfosyytit ovat inaktiivisia eivätkä ota vastaan vitamiineja/ kuten foolihapooa, ennenkuin ne on 35 aktivoitu mitogeenillä, nämä solut ilmeisesti pitävät sisällään yksilön ravitsemushistorian mahdollisesti syn- 26 7 7 4 7 0 tymästään aktiivisissa luuydinsoluissa saakka. Tämä on suuri etu arvioitaessa ravitsemustasoa, mutta ei arvioitaessa ravitsemusterapian vaikutuksia.

Lymfosyytit ovat hyvin herkkiä riboflaviinin puu-5 tokselle. Riboflaviinilla stimuloituja lymfosyyttejä omaavien potilaiden määrän kasvun (samoin kuin stimuloinnin voimakkuuden) ja virtsaan erittyvän riboflaviinin määrän välillä on korrelaatio.

Samanlainen korrelaatio on myös alentuneiden eryt-10 rosyyttiglutamaattioksaaliasetaattitransaminaasipitoisuuk- sien ja sellaisten potilaiden määrän välillä, joiden lymfosyyteillä on alentunut vaste Bg-vitamiinin poisjättämisen suhteen. Tämä oli odotettavissa, koska aspartiinihap-po ja asparagiini on jätetty pois lymfosyyttien elatus-15 alustasta. Myös tämän transaminaasin erytrosyyttipitoi- suuta on käytetty indikoimaan Bg-vitamiinin oton tasoa, koska Bg-vitamiinin lisäys merkittävästi lisää tämän entsyymin määrää.

Nämä tiedot osoittavat riippuvuussuhteen lymfosyyt-20 tiin vaikuttavan vitamiinin ottotason ja mahdollisen solun puutostilan välillä. Kuitenkin on mahdollista, että hyvin suuret ottotasot voivat tukahduttaa varasto intimekanismin. Jos näin on, lymfosyytin vitamiinin puute yhdessä korkean virtsan kautta erittymisen ja aor-25 maalin vastekäyrän kanssa voi osoittaa mahdollisuutta, että pienennetty ottotaso voisi olla hyödyllinen. Kaksi tällaista tapausta on havaittu.

Tutkittaessa kaikkia ongelmia, jotka liittyivät kehitettävänä olevan menetelmän lopulliseen kehittelyyn, 30 tutkimukseen on sisällytetty potilaita, joilla oli mo nen tyyppisiä sairauksia.

Kun glukoosi jätetään pois viljelyalustasta kokeessa, muiden hiilihydraattien kykyä korvata glukoosi voidaan käyttää määritettäessä kykyä käyttää tehokkaasti hyväksi 35 näitä hiilihydraatteja. Esimerkiksi galaktosemiassa puut tuu kyky metabilisoida galaktoosia, joka on peräisin 2? 77470 laktoosista, ja tämä metabolia sisältää galaktoosin konversion glukoosiksi. Kyvyttömyys metabolisoida galak-toosia sopivasti voi johtaa lukuisiin puutostiloihin, mm. henkiseen jälkeenjäämiseen, kaiheihin, jne. Myös 5 herkkyys inhibitiolle voidaan määrittää ylimäärällä galaktoosia. Tämä voi olla tärkeää kaihin kehittymisessä myöhemmin elämässä.

Muita hiilihydraatteja kuin galaktoosia, esim. mannoosia voidaan testata samalla tavalla, jotta saa-10 daan selville niiden mahdollisuudet tulla käytetyksi glukoosin sijasta ja niiden myrkylliset vaikutukset kullakin yksilöllä, esimerkiksi yksilön epänormaali herkkyys riboosin, joka on välttämätön hiilihydraatti nukleiinihapon biosynteesissä, inhiboinnille. Menetelmä kus-15 sakin hiilihydraatin testaustapauksessa on määrittää hii lihydraatin kyky korvata glukoosi ja määrittää lymfosyyttien herkkyys inhiboida kasvua hiilihydraatilla.

Hoitona tapauksessa, jossa galaktoosin hyväksikäyttö on puutteellista, on välttää ruokia, jotka sisältä-20 vät sen lähteitä, esim. laktoosia maitotuotteissa. Muissa tapauksissa, kuten epänormaalissa riboosin inhiboin-nissa voidaan lymfosyyttitestillä määrittää, millä ravintoaineilla tai läheisillä biokemikaaleilla on kyky kumota inhiboiva vaikutus.

25 Insuliinin puute yksilöllä voidaan havaita viljele mällä yksilön lymfosyyttejä elatusaineessa, joka sisältää riittävästi glukoosia optimaalisen vasteen aikaansaamiseksi. Esimerkiksi insuliinin puute voidaan havaita määrittämällä insuliinin, jota on 0,01 yksikköä/ml, vaiku-30 tus vasteeseen, kun glukoosia on 0,01, 0,03, 0,1 ja 1,0 kertaa elatusaineen normaali konsentraatio. Alhaisilla glukoosipitoisuuksilla, esim. 0,03 kertaa elatusaineen normaali konsentraatio, insuliini saa aikaan kasvu-vaikutuksen, jonka on tulkittu olevan "säästövaikutus" 35 glukoosin tarpeeseen, koska useimmilla yksilöillä ei ole havaittavissa insuliinilla oleellista vaikutusta glukoosin 28 77470 konsentraatioilla, jotka ovat 0,1- tai 1,0-kertaiset elatusaineen normaaliin konsentraatioon verrattuna. Kuitenkin potilailla, joilla on insuliinin puutosta, insuliinin aiheuttama lisääntynyt kasvun stimulointi 5 jatkuu jopa korkeammilla glukoospitoisuuksilla. Kaksi potilasta, jotka myöhemmin osoitettiin glukoosirasitus-kokeissa diabeettisiksi, havaittiin tällä tavalla.

Tuloksista, jotka saatiin elatusaineen kehittelyn aikana, havaittiin, että puutteet vitamiinien ja mahdol-10 lisesti hivenaineiden varastoinnissa, ravintoaineiden, kuten aminohappojen epänormaalit tarpeet sekä herkkyys näiden ravintoaineiden epätasapainolle, epänormaaliudet puriinin ja pyrimidiinin biosynteesissä, ja monet tekijät metabolian vaiheissa, voidaan havaita yksilön lym-15 fosyyttiviljelmän avulla. On yleensä mahdollista saada 0,2 ml:n lymfosyyttiviljelmillä kolmoismäärityk-siä yli 200 viljelysolosuhteiden variaatiosta 10-20 ml:n verinäytteestä katsauksena yksilön ravitsemustasosta.

Kehiteltäessä viljelysalustaa, joka on välttämätön 20 tässä menetelmässä yksilön ravitsemustason arvioimisek si, mukana oli laaja joukko kontrollipotilaita, joilla oli erilaisia sairauksia, jotta voitaisiin määrittää vaihtelujen laajuus vasteissa. Tuloksena oli muutamia todisteita siitä, että menetelmää voidaan käyttää hyödyl-25 lisenä kliinisenä menetelmänä.

Esimerkki 1

Yksi ensimmäisistä tapauksista, jotka hyötyivät osallistumisesta lymfosyyttien elatusaineen kehittelyohjel-maan, oli potilas, jolla on pitkä lääketieteellinen his-30 toria, johon sisältyi väsymystä, voimakkaita halvauksia, lihaskipuja, lievää depressiota ja voimakasta tuskaisuutta. Kun lääketieteelliset resurssit oli käytetty hänen sairautensa lievittämiseksi, konsultaatio ravitse-musasiantuntijän kanssa johti hänen tuloonsa ohjelman 35 piiriin. Lymfosyyttitesti paljasti noin 50 %:n laskun 29 7 7 4 7 0 kasvussa ilman biotiinin lisäystä, kun taas normaalitapauksissa ei havaita ollenkaan laskua. Lisätutkimus paljasti, että potilas oli ihastunut juomaan, joka sisälsi raakaa munanvalkuaista, ja tätä hän nautti päivittäin.

5 Tämä yhdistettynä siihen, että hän nautti aamiaiseksi vain vähän kuumennettuja munia, epäilemättä sijoitti potilaan ryhmään, joka kärsii avidiinin indusoimasta biotiinin puuttueesta. Injektoimalla 300 g biotiinia 5 päivän ajan lievitettiin potilaan vaikeita oireita 10 ja siitä lähtien häntä on hoidettu oraalisella biotii- nilla.

Esimerkki 2 86-vuotiaalla potilaalla, jolla oli vakava henkinen rappeutumistila, havaittiin samalla tavalla 15 biotiinin puutetta, samoin kuin riboflaviinin puutetta.

Käsittely biotiinilla ja riboflaviinilla johti kykyyn kommunikoida, mikä ei ollut aiemmin mahdollista.

Biotiinin ja riboflaviinin poistuminen virtsan kautta vahvisti puutostilan. Myös näiden kahden vitamiinin 20 lisäys lopetti komponentin (komponenttien) erittymisen virtsaan, josta aiheutui epämiellyttävä haju. Lymfosyyt-titestin perusteella, jota monissa tapauksissa on vahvistettu virtsa-analyyseillä, näyttää siltä, että biotiinin puutetta esiintyy erityisesti vanhemmalla iällä paljon 25 useammin kuin on oletettu.

Esimerkki 3 5-vuotias tyttö kärsi lihasten jänteyden puutteesta, kyvyttömyydestä pitää tasapainonsa silmät suljettuina, vaikeudesta pitää päätä pystyssä ja epänormaaleista silmänkö liikkeistä pyöritystestissä, ja fysioterapeutti oli arvi oinut hänet fysikaalisista ongelmista huolimatta poikkeuksellisen älykkääksi lapseksi. Hänen lymfosyyttitestinsä osoittivat 57 %:n laskua kontrolliin verrattuna, kun ribo-flaviini oli jätetty pois, mikä poikkesi huomattavasti nor-k5 maaleista potilaista. Annettaessa 10 mg riboflaviinia päivittäin joka aamu havaittiin muutos ei vain normaaleissa 3o 7 7470 silmän liikkeissä pyöritystestissä ensimmäistä kertaa vuoden kestäneen fysioterapian aikana, vaan myös käyttäytyminen muuttui kohti harjoitusrutiineja ja leikkiin osallistumista. Vanhempien mielestä hän taas oli nor-5 maali ja fysioterapeutin mielestä muutos oli hyvin poikkeuksellinen. Tällä pienellä tytöllä riboflaviinin eritys virtsaan oli alemmalla riskirajalla lymfosyytti-testiä aloitettaessa. Niinpä lymfosyyttitestissä havaittiin riboflaviinin epänormaali tarve, ja vaikut-10 taa todennäköiseltä, että jatkettaessa tutkimusta saadaan todellisia fysikaalisia arvoja, jotka todistavat lisäyksen ja lisäyksen pois jättämisen aiheuttaman nopean vasteen.

Esimerkki 4 15 Tutkittaessa lymfosyyttien tarvetta B^-vitamii- nin ja foolihapon suhteen oli välttämätöntä kehittää lisätekniikkaa, koska nämä vitamiinit ovat osallisina tymidyylihapon muodostuksessa, joka vaikuttaa tymidii- nin liittämiseen. B^-vitamiinilla on vaikutusta siihen, 20 että homokysteiini voi korvata metioniinin lymfosyyttien aktivoinnissa ja kasvussa. Kuitenkin hoitamatonta perniöö- siä anemiaa sairastavan potilaan tutkimuksen perusteella on ilmeistä, että perniöösiä anemiaa sairastava potilas voi käyttää hyväksi seriiniä glysiinin muodostamiseen, 25 mutta ei kykene muodostamaan riittäviä määriä seriiniä glysiinistä. Tulokset osoittavat/ että perniöösiä anemiaa sairastavalla potilaalla on puute N ' -metyleenitetrahyd- rofolaateista, mutta riittävä määriä tetrahydrofolaatteja, kun taas "normaalipotilaalla", joka käyttää hyväksi gly- 30 siiniä, mutta ei seriiniä tehokkaasti, on riittäviä mää- 5 10 riä N ' -metyleenitetrahydrofolaatteja, mutta puutetta tetrahydrofolaateista. Monia vuosia sitten on osoitettu, että perniöösiä anemiaa sairastavat potilaat voivat käyttää hyväksi seriinin, mutta eivät formaatin ^-hiiltä 35 DNArssa olevan tymidiinin biosynteesissä. Niinpä B^-vitamiinin puute voimakkaasti vaikuttaa yksittäisten 11 31 77470 hiiliyksiköiden määrään metyleeniasteella, joka on liittynyt pelkistettyihin folaattikoentsyymeihin.

Vitamiinien puutosta lymfosyyteissä voidaan seurata tiettyihin reaktioihin . Eliminoimalla glysiini, pyridok-5 siini, foolihappo ja Bi2-Vitamiini elatusaineesta, serii-nin konversio glysiiniksi,jossa tarvitaan pyridoksaali-fosfaattia ja tetrahydrofoolihappoa, voidaan tehdä rajoittavaksi reaktioiksi lymfosyyttisen aktivoinnissa ja kasvun initioinnissa. Hyvin laajasti vaihtelevia määriä 10 tetrahydrofoolihappojohdannaisia oli lymfosyyttien käytet tävissä eri potilailla. Noin 50 potilaan tutkimuksen perusteella havaittiin, että normaaliyksilöillä ei ole foolihappojohdannaisia tässä muodossa riittävästi, jotta voitaisiin muodostaa riittäviä määriä glysiiniä serii-15 nistä, kuitenkin eräällä perniöösiä anemiaa sairastaval- la potilaalla oli käytettävissä varastot, jotka täyttivät riittävät määrät foolihapporeseptoreita yksittäistä hiiliyksikköä varten. Pyridoksiinia on yleensä riittävästi läsnä tätä reaktiota varten, vaikkakaan sitä ei 20 olisi riittävästi muita systeemejä varten, mutta silloin tällöin potilaan lymfosyytit osoittavat merkittävää laskua pyridoksiinin poissa ollessa, kun riittävästi foolihappoa on läsnä. Potilaalle määritettiin kaksi sarjaa tuloksia useiden viikkojen välein, jotta 25 voitaisiin olla varmoja B^-vitamiinin puutoksesta näis sä olosuhteissa, jota ei oltu havaittu ensimmäisissä 30:ssä tämän ryhmän potilaassa.

Esimerkki 5

Lymfosyyttien kyky syntetisoida glysiiniä ja seriiniä 30 vaihtelee melko laajasti. Poikkeuksetta foolihappoa ja pyridoksiinia tarvitaan maksimaalisen vasteen saamiseksi glysiinin ja seriinin puuttuessa elatusaineesta, mutta yhden yksilön solut kykenivät saavuttamaan 70 %:n vasteen kontrollivasteeseen verrattuna näiden vitamiinien 35 puuttuessa. Toisessa tapauksessa potilaan kyky käyttää seriiniä ja glysiiniä oli minimaalinen, vain 24-27 % kontrolli- 32 7 7 4 7 0 vasteesta, vaikka pyridoksiinia ja foolihappoa oli lisätty. Tämä potilas reagoi seriininlisäykseen suotuisalla tavalla.

Esimerkki 6 5 Yksi tutkimuksen ja arvioinnin alue, jossa lymfo- syyttitestiä on käytetty, on lapset, joilla on psyykkisiä sairauksia. Tutkitussa ryhmässä kaksi autistis-tyyppistä yksilöä sopi diagnostistiseen ryhmään lapsuusiässä puhjennut pervasiivinen kehityshäiriö.

10 8-vuotiaalla pojalla oli fobista pelkoa valoa koh taan, viivästynyt puheen kehitys, eriskummallinen käytös ja yleinen kypsymättömyys. Hän oli hyvin pieni ja kehittymätön ikäisekseen; hän ei kyennyt leikkimään yksin tai haastattelijan kanssa. Hän oli hyvin ahdistunut siitä, 15 että joutuisi eroon äidistään ja ainoa hänen käyttämänsä kieli oli täsmällinen haastattelijan sanojen toisto. Lym-fosyyttitesti osoitti 20 %:n laskua vasteessa silloin, kun pyridoksiinia ei oltu lisätty, ja 18 %:n laskua, kun pois jätettiin foolihappo, jota vaihdeltiin B^2-vita-20 miinin poisjättämisen kanssa. Glysiinin vaste suhteessa seriinin vasteeseen elatusaineessa, josta seriini, glysiini, B^-vitamiini ja foolihappo oli jätetty pois, oli 0,76, joka on lähellä suhdetta, joka on saatu perni-öösiä anemiaa sairastaville potilaille. Lymfosyyttitestin 25 perusteella alettiin antaa 100 jug B12-vitamiinia, 25 mg pyridoksiinia, 0,3 mg foolihappoa ja monivitamiinivalmis-tetta, josta saa vitamiineja minimipäiväannoksen. Lisäksi hänet pantiin viikottaiseen yksilölliseen terapiaan.

Hänen edistymisensä oli huomattavaa. Hän oli kehittynyt 30 terapeuttinsa avustuksella leikkimisessä. Hän eroaa äidis tään vain vähäistä ahdistusta osoittaen, ja mikä kaikkein merkittävintä, kommunikoi verbaalisesti spontaanisti ja tarkoituksenmukaisella tavalla. Nämä muutokset osoittavat selvää kehitystä. Arvioinnin alussa ei sellaista 35 kehitystä olisi voitu ennustaa sen kokemuksen perusteella, jota samantapaisista lukuisista potilaista on ennestään.

77470 33

Eräs potilas, vanhin kolmesta sisaruksesta, ollessaan ensimmäisen kerran psykiatrin arvioitavana 8-vuotiaaha vietti suuren osan ajastaan tuskaisesti pyöritellen keppiä käsiensä välissä, välitti katsekontaktia ja herätettäessä 5 heilutteli käsiään ja käsivarsiaan eriskummallisella tavalla. Kotona hänellä kuvailtiin olevan "hidastunut käsityskyky" ja hänen vanhempansa olivat sitä mieltä, ettei hänestä "saa otetta". Hän tuli hyvin kiihtyneeksi, kun jotain muutettiin hänen huoneessaan, hänellä oli kiukkui-10 siä raivokohtauksia, jolloin hän saattoi lyödä päätään oveen ja hän halusi aina mennä samaa reittiä autoa ajettaessa. Hänet sijoitettiin emotionaalisesti häiriintyneiden nuorten luokalle, ja hänen opettajansa näki hänen toimivan kykyjensä alapuolella, etupäässä kontrolloi-15 mattoman käytöksensä johdosta. Psykiatrin lausunto oli lapsuusiän psykoottinen sairaus (autismi, skitsofrenia, pervasiivinen kehityshäiriö), mutta toisaalta älykäs lapsi. Kahden vuoden säännöllisen psykoterapian aikana, jota seurasi perheterapian aloitus, oli vaihtelevasti edistys-20 ja taantumusjaksoja, joka ei ole harvinaista tällaisissa tapauksissa. Lisäksi annettiin fenotiatsiineja (Stelazine, Mellaril) jotta saatiin riittävä käyttäytymiskontrolli, jotta potilas saattoi toimia koulussa.

Tällöin potilaan lymfosyytit testattiin ja 25 havaittiin 35 %:n puute riboflaviinista ja myös tarvit tiin normaaleja suurempia määriä glutamiinia maksimaalisen vasteen saamiseksi.

Ruokavalioon lisättiin 25 mg riboflaviinia, 25 mg pyridoksiinia ja 2 g glutamiinia päivittäin. Seu-30 raavan neljän kuukauden aikana potilas kävi viikottain terapiassa, myös hänen vanhempansa kävivät viikottain terapiassa ja hän jatkoi erityisluokilla 4-6 viikon kuluttua ravinnelisäyksen aloittamisesta vanhemmat huomasivat, että fenotiatsiini, jota hän oli ottanut säännölli-35 sesti hyvin tuloksin, aiheutti sivuvaikutuksia, joita nor- 34 7 7 4 7 0 maalisti havaitaan vasta yliannoksilla. Ohjeiden mukaisesti he vähitellen pienensivät annosta kunnes se lopulta kokonaan lopetettiin. Tänä aikana ei mitään huononemista hänen käytöksessään havaittu (eli hän ei palannut 5 lääkitystä edeltäneeseen käyttäytymiseen). Hänen opet tajansa myös kertoivat hänen käyttäytymisensä jatkuvasti paranevan. Samaan aikaan havaitsi potilaan terapeuttu muutoksia, ensin käyttäytymisessä, mutta myös persoonallisuuden kehittymisen tasossa. Ennen lisäravinnon aloitus-10 ta potilas oli käyttäytynyt tavalla, jota normaalisti nähdään pikkulapsilla.

6-vuotias lapsi kärsi diagnoosin mukaan ei-tyypilli-sestä orgaanisperäisestä aivo-oireyhtymästä, johon liittyi lievä henkinen jälkeenjääneisyys, IQ 60. Häntä hoi-15 dettiin terapeuttisilla annoksilla dilantiinia ja Myso-liinia, mutta silti hän sai 8-10 kohtausta päivittäin. Lymfosyyttivaste osoitti riboflaviinin puutetta soluissa, normaalia korkeampaa glutamiinin tarvetta ja epätavallista herkkyyttä glysiinin ja alaniinin inhibitiolle.

20 Riboflaviinin (25 mg päivittäin) ja glutamiinin (2 g päi vittäin) annostelu aloitettiin. 10 viikon kuluttua kohtausten tyyppi oli muuttunut ensin psykomotoriseksi ja petit mal-tyyppisiksi kohtauksiksi, ja 16 viikon kuluttua potilas oli vapaa kohtauksista.

25 Niinpä esillä olevaa keksintöä voidaan hyvin sovel taa, jotta saavutettaisiin halutut tavoitteet ja päämäärät, ja sillä on mainitut edut ja piirteet samoin kuin muut siihen luontaisesti kuuluvat ominaisuudet.

Vaikka on esitetty keksinnön mukaisia edullisia suo-30 ritusmuotoja, muutoksia voidaan tehdä keksinnön hengessä kuten on esitetty, patenttivaatimusten puitteissa.

Il

Claims (19)

1. 35 7 7 4 7 0
2. 1. Soluviljelyalusta käytettäväksi lymfosyyttien ravitsemuksellisen ja biokemiallisen tilan määrätykseen, 5 joka alusta sisältää puskuroitua seerumivapaata liuosta, joka sisältää seuraavia aineita: hiilihydraattia, joko glukoosia tai sen prekursoria, koliinia tai sen biologisesti käyttökelpoista prekursoria, epäorgaanisia ioneja, kuten sulfaattia, kloridia, fosfaattia, kalsiumia, magnesiu-10 mia, kaliumia, natriumia ja rautaa biologisesti käyttökelpoisessa muodossa, deionisoitua vettä, ja mitogeenia, ja jonka puskuroidun seerumivapaan liuoksenpH on välillä 6,8-7,6, tunnettu siitä, että siihen lisätään lisäravinteina aminohappojen ja vitamiinien käyttökelpoisia 15 muotoja ja testattava ravinne jätetään pois tai sitä on ravinnelisäyksessä mukana rajoittavia tai inhiboivia määriä.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen soluviljelyalusta, tunnettu siitä, että vitamiinit on valittu 20 joukosta pantoteenihappo, biotiini, foliinihappo tai foo-lihapon biologisesti käyttökelpoinen muoto, nikotiini-amidi tai nikotiinihappo, riboflaviini, tiamiini, vitamiini Bg, vitamiini B^r ja niiden prekursorit, ja aminohapot tai niiden prekursorit on valittu joukosta L-ar-25 giniini, L-kysteiini, L-glutamiini, glysiini, L-histidiini, L-isoleusiini, L-leusiini, L-lysiini, L-metioniini, L-fe-nyylialaniini, L-seriini, L-treoniini,L-tryptofaani, L-ty-rosiini ja L-valiini.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen soluvilje-30 lyalusta, tunnettu siitä, että soluviljelyalustaan lisätään konsentraatioina, jotka saavat aikaan suunnilleen maksimaalisen vasteen, yhtä tai useampaa stimuloivaa ravinnetta, joka on valittu ryhmästä pyruvaatti, adeniini ja inositoli, tai niiden prekursorit.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen solu vil jelyalusta, tunnettu siitä, että aminohappo- 36 7 7 4 7 0 lisäyksessä on kutakin aminohappoa mukana minimikonsentraa-tio, joka on tehokas maksimaalisen vasteen saamiseksi soluissa, lukuun ottamatta testattavaa aminohappoa.
6. 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen so-5 luviljelyalusta, tunnettu siitä, että alusta on vapaa joko L-seriinistä tai glysiinistä tai kummastakin, ja alustassa on vitamiinia Bg ja/tai foolihapon käyttökelpoista muotoa.
7. 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen solu-10 viljelyalusta, tunnettu siitä, että alusta on vapaa koliinista, jolloin soluviljelyllä tässä alustassa voidaan määrittää ravitsemukselliset puutteet ja epänormaalit tarpeet, kun siihen lisätään vastetta rajoittavia määriä koliinia, josta viljelyalusta on vapaa.
8. 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen solu vil jelyalusta, tunnettu siitä, että soluviljely-alusta on vapaa ainakin yhdestä patenttivaatimuksessa 1 esitetyistä epäorgaanisista ioneista, jolloin soluviljelyllä tässä alustassa voidaan määrittää puutteet ja epänormaalit tarpeet, kun siihen lisätään kasvua rajoittavia 20 määriä kyseistä epäorgaanista ionia, jota ei ole läsnä soluviljelyalustassa.
9. 8. Menetelmä määrittää yksilön välttämättömien ravinteiden puutteet tai varaston vajavuudet, tunnettu siitä, että siirrostetaan yksilön lymfosyyttejä pa- 25 tenttivaatimuksien 1-7 mukaiseen soluviljelyalustaan, jossa ei ole testattavaa ravinnetta, viljellään siirrostet-tua soluviljelyalustaa ajan, joka riittää tyhjentämään sen testattavasta ravinteesta, ja verrataan yksilön lymfosyyttien vastetta vasteeseen, joka on saatu lymfosyyteil-30 ie samassa alustassa, johon on lisätty testattavaa ravinnetta, ja vertailuyksilöiden lymfosyyttien vasteisiin.
10. 9. Menetelmä määrittää yksilön epänormaalit kvantitatiiviset ravitsemukselliset tarpeet tietyille tarvittaville ravinteille, tunnettu siitä, että siirros- 35 tetaan patenttivaatimuksen 1-7 mukaiseen soluviljelyalus- ti 37 7 7 4 7 0 taan yksilön lymfosyyttejä, kun viljelyalustassa on rajoittavat konsentraatiot testattavaa ravinnetta, viljellään siirrostettua soluviljelyalustaa ja verrataan lymfosyyttien vastetta kontrolliryhmän keskimääräiseen lym-5 fosyyttivasteeseen.
11. 10. Menetelmä määrittää yksilön herkkyys ravinteiden epätasapainon, metabolisten välituotteiden ja niiden tuotteiden ja veren muiden komponenttien haitallisille vaikutuksille, tunnettu siitä, että siirrostetaan 10 yksilön lymfosyyttejä patenttivaatimuksien 1-5 mukaiseen soluviljelyalustaan, johon on lisätty ainakin yhtä ravinteista, metabolisista välituotteista ja niiden tuotteista tai muista veren komponenteista, lääkeaineet mukaan lukien, konsentraatioina, jotka ovat joko yhtä suuria tai suurem-15 pia kuin veren normaalipitoisuudet, viljellään siirrostettua soluviljelyalustaa, ja verrataan lymfosyyttien vastetta vasteeseen, joka on saatu lymfosyyteillä alustassa, johon ei ole lisätty ravinteita, metaboliatuotteita tai muuta veren komponenttia, tai tapauksessa, jossa haluttua 20 komponenttia on alustassa, vasteeseen, joka on saatu alustassa, joka sisältää haluttua komponenttia minimimäärän, jolla saadaan esiin solujen maksimaalinen vaste. - 11. Menetelmä määrittää yksilön välttämättömien ravinteiden tai metabolisten välituotteiden puutteet tai 25 epänormaali varasto, tunnettu siitä, että siirrostetaan yksilön lymfosyyttejä patenttivaatimuksien 1-7 mukaiseen soluviljelyalustaan, joka sisältää ravinteen meta-bolista antagonistia tai metabolista välituotetta tai sen tuotetta konsentraationa, joka on riittävä saamaan aikaan 30 määrätyn inhibition soluvasteessa, viljellään siirrostettua soluviljelyalustaa ja verrataan solujen vastetta erilaisilla testattavien ravinteiden, metabolisten välituotteiden tai tuotteiden konsentraatioilla analogisiin solujen vasteisiin, jotka on saatu yksilöiden vertailuryh-35 mässä. 38 7 7 4 7 0
12. 12. Menetelmä määrittää yksilöllä tarve lisätä ravintoon välttämättömiä biokemiallisia välituotteita tai näiden tuotteita, joita useimmat yksilöt tavallisesti syntetisoivat riittävästi, tunnettu siitä, että siir-5 rostetaan yksilön lymfosyyttejä patenttivaatimuksien 1-5 mukaiseen soluviljelyalustaan, joka sisältää ainakin yhtä välttämätöntä biokemiallista välituotetta tai tuotetta ryhmästä tällaisia biokemiallisia välituotteita tai tuotteita, viljellään siirrostettua soluviljelyalustaa, ja ver-10 rataan lymfosyyttien vastetta vasteeseen, joka on saatu lymfosyyteillä, joita on viljelty soluviljelyalustassa, jossa ei ole mukana välttämätöntä biokemiallista välituotetta tai ryhmää tällaisia biokemiallisia välituotteita tai näiden tuotteita.
13. 13. Menetelmä määrittää glykolyysin tehokkuus yk silöllä, tunnettu siitä, että siirrostetaan yksilön lymfosyyttejä patenttivaatimuksien 1-5 mukaiseen soluviljelyalustaan, jossa ei ole pyruvaattia, viljellään siirrostettua viljelyalustaa, ja verrataan lymfosyyttien 20 vastetta vasteeseen, joka on saatu lymfosyyteille soluvil jelyalustassa, joka sisältää pyruvaattia, ja näin voidaan määrittää yksilön kyky metaboloida glukoosia.
14. 14. Menetelmä määrittää yksilön kyky syntetisoida inositolia tai koliinia, tunnettu siitä, että vil- 25 jellään yksilön lymfosyyttejä patenttivaatimuksien 1-5 mukaisessa viljelyalustassa, joka on vapaa joko inosito-lista tai koliinista ja verrataan lymfosyyttien vastetta vasteeseen, joka on saatu lymfosyyteillä soluviljelyalustassa, joka sisältää sekä inositolia että koliinia, ja näin ·'- 30 saadaan määritetyksi yksilön kyky syntetisoida inositolia tai koliinia.
15. 15. Menetelmä määrittää yksilön kyky syntetisoida puriineja, tunnettu siitä, että viljellään yksilön lymfosyyttejä patenttivaatimuksien 1-5 mukaisessa 35 soluviljelyalustassa, jossa ei ole puriineja, ja verra- ti 39 7 7 4 7 0 taan lymfosyyttien vastetta vasteeseen, joka on saatu viljelemällä lymfosyyttejä soluviljelyalustassa, jossa on läsnä puriinien prekursoreita ja jossa niitä ei ole, jossa on läsnä yksi tai useampia B-vitamiineja ja jossa niitä 5 ei ole, ja jossa on läsnä käyttökelpoisia puriinilähteitä ja jossa niitä ei ole.
16. 16. Menetelmä määrittää yksilön lymfosyyttien kyky syntetisoida stimuloivia komponentteja, kuten puruvaattia, adeniinia, inositolia tai niiden prekursoreita, t u n -10 n e t t u siitä, että viljellään yksilön lymfosyyttejä patenttivaatimuksien 1-5 mukaisessa soluviljelyalustassa, jossa ei ole stimuloivaa yhdistettä, ja johon on lisätty biosynteesissä tarvittavia vitamiineja ja niiden prekursoreita ja sitten alustassa, johon näitä ei ole lisät-15 ty, ja verrataan lymfosyyttien vastetta vasteeseen, joka on saatu lymfosyyteille alustassa, joka sisältää tehokkaita määriä stimuloivaa yhdistettä, ja näin saadaan määritetyksi yksilön kyky syntetisoida stimuloivaa komponenttia.
17. 17. Menetelmä määrittää yksilön kyky korvata glu koosi toisilla hiilihydraateilla, tunnettu siitä, että viljellään yksilön lymfosyyttejä patenttivaatimuk-; sien 1-5 mukaisessa viljelyalustassa, jossa testattava hiilihydraatti korvaa joko kokonaan tai osittain glukoo-25 sin, ja verrataan lymfosyyttien vastetta vasteeseen, joka on saatu viljelemällä lymfosyyttejä soluviljelysalustassa, joka sisältää glukoosia ilman korvaavaa hiilihydraattia.
18. 18. Menetelmä määrittää yksilön kyky syntetisoida joko glysiiniä tai seriiniätai molempia, tunnettu 30 siitä, että viljellään yksilön lymfosyyttejä sisältävää patenttivaatimuksien 1-5 mukaista alustaa, joka sisältää joko foolihapon tai vitamiinin Bg biologisesti käyttökelpoista muotoa tai molempia ja joka ei sisällä joko glysiiniä tai seriiniä tai ei kumpaakaan, ja verrataan lym-35 fosyyttien vastetta vasteeseen, joka on saatu viljelemäl- 40 77470 lä lymfosyyttejä soluviljelyalustassa, joka sisältää näitä aminohappoja ja vitamiineja sisältäviä ravinnelisäyksiä.
19. 19. Menetelmä määrittää insuliinin puute yksilöllä, tunnettu siitä, että viljellään soluja patentti-5 vaatimuksien 1-5 mukaisessa soluviljelyalustassa, jossa on yksilön lymfosyyttejä, ja verrataan lymfosyyttien vastetta vasteeseen, joka on saatu viljelyllä insuliinin läsnä ollessa, jolloin kasvanut vaste on osoituksena siitä, että joko yksilöllä on insuliinin puutetta tai epänormaali in-10 suliinin vaste. Il 77470