KR890000729B1

KR890000729B1 - 세포 배양 매질

Info

Publication number: KR890000729B1
Application number: KR1019830002482A
Authority: KR
Inventors: 샤이브 윌리암
Original assignee: 클레이딘 파운데이션 훠 리서치; 엠 · 티 · 라우니우스 2세
Priority date: 1982-06-03
Filing date: 1983-06-03
Publication date: 1989-03-30
Also published as: AU560934B2; ES522980A0; FI832005L; US4499064A; SG57287G; GB2124366A; ES8405953A1; IE55162B1; NZ204471A; IE831322L; DK254383D0; DK172418B1; GB8315287D0; EP0096560A1; KR840005012A; HK90188A; FI77470C; PT76808A; CA1199883A; NO164252B

Abstract

내용 없음.

Description

세포 배양 매질

본 발명은 각 개인에 있어 양양소의 결핍 또는 비정상적인 요구, 영양소 불균형에 대한 감수성, 영양소, 약물 및 여러가지 물질의 독성 효과에 대한 감수성, 및 여러가지 생합성 능력에 관해 광범한 검사를 할 수 있는 검정법 및 이에 사용되는 배양 매질에 관한 것이다. 본 발명에 이르러 비로서, 각 개인의 영양상태 및 요구도, 정량적 필요량을 정확히 측정할 수 있게 되어,개인에 의한 영양소의 효율적인 이용 및 그의 측정이 가능케 되었다. ″영양소″란 용어는 성장, 정상기능, 및 생명 유지를 위해 필요한 성분을 의미한다. 여기에는 비타민, 아미노산(단백), 무기물, 탄수화물 및 지질(지방)이 포함된다.

본 발명은 개인의 영양 요구를 최적화하여 건강 및 생산성을 개선시키기 위한 개인 영양상태의 평가 및 치료에 관한 것이다.

펠라그라 및 악성 빈혈과 같은 영양인자에 기인한 임상적 질환을 경감시키는 능력은 몇가지 새로운 비타민의 발견 및 규정할 수 있는 질병상태와 특정 영양소 결핍증과의 연관 관계와 통한다. 이들 질환은 임상적으로 진단되고 실험실적 시험에 의해 확인될 수 있으므로, 이들 질환의 영양적 치료법은 의학적 실제에 도입되었다.

영양과 인간의 질병, 습성, 능력 및 복리 사이에 광범위한 연관관계가 있다는 증거는 많으나, 그와 같은 개념을 일반적인 의학적 실제에 도입시키는 것은 이루어진 바 없는데, 개인의 영양상태를 판정하는 방법이 부족했기 때문이다. 영양소의 혈액 및 뇨중의 수준, 특정 비타민으로부터 유도되는 조효서와의 효소 포화도, 및 모발의 분석치같은 데이타를 정상값과 비교하여 영양 결피을 결정하여 왔다. 그러나, 그런 방법으로는 개인의 영양요구를 정확히 결정할 수 없으며, 생화학적 개체성에 근거할 때, 영양 요구도-특히 정량적 필요도-는 ″정상″인 사이에도 현저히 차이난다고 알려져 있다. 요컨대, 이들 선행 판정법은 단순히 영양소 수준, 영양소 섭취등만을 측정하여 대조군의 평균치와 비교하는 것이다. 이들 종래의 방법은 정도의 차는 있지만 개인에 따른 변동을 인정치 않았다.

개별적 상태를 판정하는 적절한 임상적 시험의 부재로, 영양 요법의 의학적 사용은 제약을 받아왔다. 균형잡힌 식사, 때로는 제한 비타민이 보충된 그러한 식사가 환자의 영양에 대해 의학적 실제에서 통상 행해져온 시도였다. 거대-비타민 시도는 의학적 실제에서 더 제약을 받는데, 이는 가능한 유해 효과에 대한 한정된 실험실적 증거, 장기간 사용에 의한 부작용에 관한 데이타 결여, 및 특정 질환의 치료에 관한 효과의 신빙성 있는 증거 결여 때문에 심한 비판을 받고 있다.

얼마동안은 의학적 실제에서 영양의 효과적 이용은 각 개인의 영양상태를 판정하고 개인의 영양 반응을 한정하는 인자를 식별하는 방법을 개발하는 것에 관계된다고 여겨져 왔다. 각 개인의 영양을 최적화하면 건강 및 생산성에 현저한 영향을 나타낸다고 예기되었다.

수년전부터, 본 출원인은 연구에 참여하는 개인으로부터 유도한 세포 배양물의 영양적 변동을 평가하므로써 이러한 문제에 관한 해결책을 시도하게 되었다. 여러가지의 잠재적 세포형태가 고려된 후에, 혈액의 임파구가 선택되었는데, 우선은 환자로부터 얻을 수 있기 때문이다. 또한 임파구는 미토게(mitogen)에 의해 활성화될 때까지는 대사적으로 불활성이므로 이들 세포는 과거의 영양상태에 관한 정보를 제공하며 영양 반응에서 시간에 따라 별다른 변등을 나타내지 않는다는 또다른 이점을 갖고 있다. 활성화 및 성장의 개시에 있어, 임파구는 체내의 어떤 성장 세포든 필요로 하는 거의 모든 반응을 수행해야 한다; 결과적으로, 임파구의 영양적 요구 또는 대사의 이상은 다른 세포의 상태를 반영하리라 여겨지며, 또한 보충에 의한 적절한 중재, 또는 독성의 경우에는 식이요법에 의해 독성물질의 적절한 제한 또는 그 효과의 상쇄 역시 효과적일 것이다.

그런 방법을 개발하기 위해, 임파구를 통상적인 태자 송아지 혈청의 보충없이 화학적으로 규정된 매질중에서 배양하는 것이 필요하다. 혈청-부재 조건하의 임파구 활성화도 보고되어 왔으나, 다른 실험실에서 그와 동일한 결과를 얻기 힘들다는 보고는, 혈청-부재 실험에 가능한 미량 혈청 오염물 또는 다른 인공물이 포함되었음을 시사하여 준다. 형청 알부민 또는 미확인 혈청 거대분자가 인체의 말초 혈액 임파구에서 미토겐-유도 DNA 합성에 절대적으로 필수적임이 보고 되었다.

본 발명의 시초에, 세포 배양에 종래 사용되어온 여러가지의 화학적으로 규정된 매질에 의해서는 임파구의 제한적 활성화 및 매우 제한된 증식만을 확인하였다. 따라서 현저한 증식반응을 얻기 위해서는 새로운 매질을 개발할 필요가 있다. 임파구의 영양상태에 적절한 매질을 얻기 위해선, 성분의 농도를 임파구의 최적 반응을 제한하지는 않는한 최소 농도로 조절한 매질을 개발해야 한다. 농도를 변화시키면서, 다른 성분의 반응에 미치는 효과를 측정해야 한다.

요컨대, 임파구를 혈청-부재, 완충화 배양 매질중에서 배양시키는데 매질로부터 하나 또는 여러 성분을 생략할 수 있으며/있거나 약물같은 변칙적인 성분을 포함하는 혈액의 여러가지 가능성분을 추가할 수도 있다.

배양물을 수득하여 임파구의 반응을 측정한다. 예를 들어, 비타민 결핍 또는 비타민 반응의 이상을 시험하는 경우, 시험 비타민을 배양 매질중에서 생략시켜며, 대조로 사용되는 것은 모든 비타민을 함유하도록 한다. 아미노산 불균형에 대한 감수성을 시험하는 경우, 임파구에 필수적인 13가지의 아미노산 및 다수의 사람에 있어 필요한 수도 있는 세린 및 글리신을 함유시키며, 통상 혈액중에서와 같은 농도 및 약간 높은 농도에서 하나 또는 여러가지 아미노산에 대해 억제 효과를 시험한다. 탄수화물 이용 시험에서는, 매질중 글루코스를 생략할 수 있으며, 다른 여러가지 탄수화물(예, 만노스 및 갈락토스) 각각의 반응을 측정한다.

임파구의 최적 영양 요구를 측정하기 위한 배양 매질은 혈청-부재의, 무기염, 글루코스, 아미노산, 비타민, 피루베이트, 콜린, 이노시톨 및 아데닌을 함유하는 완충화용액으로 이루어진다. pH는 7.6으로 조절하며 다른 미생물에 의한 오염을 막기 위해 항생제를 보충하며 염화칼슘 및 황산 마그네슘용액, 황산 제 1 철 및 에틸렌-디아민 테트라 아세트산(EDTA)를 포함시킨다. 탈이온수를 가해 최종 용적을 채우고, 배양 매질을 무균 여과장치를 통해 여과한다. 여과후, 식물성 혈구 응집소(PHA) 멸균 용액같은 미토겐을 배양 매질에 가한다.

검정법의 배양 매질 및 방법에 대해 보다 상세한 것은 후술되어 있다.

본 발명의 목적은 각 개인에 있어 영양소의 결핍 또는 이상 요구, 영양소 불균형에 대한 감수성, 영양소, 약물 및 여러가지 물질의 독성작용에 대한 감수성 및 여러가지 생합성 능력을 광범위하게 검사할 수 있는 배양 매질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 개인의 영양 상태를 평가하는데, 재현성을 가지며 정량적인 결과를 얻게되는, 임파구법을 제공하는 것이다.

임파구 검정에 소량의 혈액으로도 충분한 그런 검정법의 제공 역시 본 발명의 목적이다.

또한 본 발명의 목적에는 비타민, 무기물, 필수아미노산, 탄수화물 및 다른 영양소 및 생화학적 중간체의 결핍, 이상 요구 또는 불균형을 측정하는데 재현성 및 정량성을 보이며, 이를 위해 최소량의 배양 성분이면 충분한 그와 같은 임파구 검정법을 제공하는 것이 포함된다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 각 개인에 있어 영양소의 결핍 또는 이상 요구, 영양소 불균형에 대한 감수성, 영양소, 약물 및 여러가지 물질의 독성 효과에 대한감수성, 및 여러가지 생합성 능력을 평가하고, 그 결과 각 개인의 영양을 최적화하여 인류의 건강 및 생산성을 개선시킴을 목적하는 인체 영양상태의 임파구 검정법에 관한 것이다. 이러한 결과를 얻기 위해서는, 성분의 농도를 임파구의 최적 반응을 제한하지는 않는 최저 수준으로 조절하고 그 성분들은 임파구의 반응에 부작용을 미치지 않는, 배양 매질이 필요하다.

일부 형태의 시험에서는 완전 매질로부터 비타민, 아미노산 및 무기염을 적절하게 생략시켜, 생략된 영양소의 영향을 측정한다. 예를 들어, 비타민 시험에서는 완전 비타민 보충물을 배양 매질로부터 생략하고, 시험할 비타민이 생략된 비타민 용액을 각 시험관에 개별적으로 가한다. 대조역할을 하는 3개의 시험관에는 모든 비타민이 존재한다. 그러나 아미노산 불균형을 시험할 때는, 모든 15가지의 아미노산을 포함시키며 각각 또는 여러가지의 시험 천연 아미노산 고농도 보충물을 가한다.

본 발명에서 임파구의 최적 영양 요구도를 측정하는데 바람직한 배양 매질에는 다음 성분이 포함되며 다음과 같이 제조된다.

용액

2배 농도 매질 완충액 : 사용하는 이배 농도 매질 완충액에는 탈이온수 1ℓ당 헤페스(완충액) 23.8g, 수산화 나트륨 1.28g, 염화나트륨 14.02g, 인산 수소칼륨 (K₂HPO₄) 1.05g 및 페놀래드 2.48㎎을 함유한다. 이 완충액을 0.22㎛ 밀리포어 필터로 여과한다.

매질염 : 임파구 세척 및 현탁화에 사용되는 매질염 원액은 이배 농도 매질 완충액을 탈이온수로 2배 희석하여 제조한다. 임의 성분으로써 글루코스를 사용할 경우 최종 농동는 4mM으로 한다. 4N NaOH에 의해 pH7.6으로 조절하고 용액을 여과한다. 계산된 양의 원액에 보충물을 가해 염화칼슘의 최종 농도를 55.5㎎/1, 황산마그네슘은 60.0㎎/1, 황산 제 1 철은 0.695㎎/1 및 EDTA는 0.373㎎/1로 한다. 황산 제 1 철 및 EDTA는 함께 제조하여 가한다. 최종 용액을 재여과한다. 무기물 요구 시험에서, 적절한 무기물을 매질염으로부터 생략시킨다.

아미노산 보충물 : 사용된 아미노산 보충물 1ℓ당 다음 성분이 포함된다. 0.7g L-알기닌, 5.85g L-글로타민, 0.25g 글리신, 0.23g L-히스티딘, 0.13g L-이소로이신, 0.44g L-로이신, 1.22g L-리신, 0.15g L-메티오닌, 0.0825g L-페닐알라닌, 0.35g L-세린, 0.4g L-트레오닌, 0.034g L-트립토판, 0.063g L-티로신, 및 0.39g L-발린, 필요하면 글루타민을 따로 가할 수 있다. 시스테인은 피루베이트와 함께 아래에 나타난대로 별도로 가한다.

비타민 보충물 : 사용된 비타민 보충물 1ℓ 당 다음이 함유된다. : 0.735㎎ 비오틴, 0.602㎎ 풀린산(칼슘염), 0.61g 니코틴아미드, 23.8㎎ 판토텐산 칼슘 , 6.15㎎ 피리독신, 33.7㎎ 티아민, 13.6㎎ 비타민 B₁₂및 3.75㎎ 리보플라빈.

항상제 보충물 : 사용된 항생제 보충물 1ℓ당 다음을 함유된다. : 10⁷IU 패닐실린, 10⁷㎍ 스트텝토마이신 및 25000㎍ 암포테리신 B(펀지존).

인산염 완충화 염수 : 인산염으로 완충화한 염류 용액 1ℓ당 다음이 함유된다. 7.1g NaC1, 2.17g Na₂HPO₄, 7H₂O, 200㎎ KH₂PO₄및 200㎎ KC1.

배양매질

본 발명에서 임파구의 최적 영양 요구를 결정하는데 적절한 바람직한 배양 매질은 다음과 같이 제조한다 :

매질 완충액 50㎖에 72㎎의 글루코스, 1㎖의 아미노산 보충물, 3㎖의 5.5㎎/㎖ 피루베이트-0.88㎎/㎖ 시스테인 용액 1㎖의 1.4㎎/㎖ 콜린 클로라이드-1.8㎎/㎖ 이노시톨 용액, 1㎖의 상기비타민 보충물, 및 1㎖의 135μg/㎖ 아데닌 용액을 가한다 : 묽은 NaOH로 pH를 7.6으로 조절하고, 다음 보충물을 가한다 : 1㎖의 항생제 보충물, 0.5㎖의 22.2㎎/㎖ 염화칼슘 용액,0.5㎖의 24㎎/㎖ 황산마그네슘 용액, 0.149㎎/㎖ EDTA 중 0.278㎎/㎖ 황산 제 1 철 용액 1㎖, 탈이온수를 가해 최종 용적 100㎖로 하고 매질을 날겐(Nalgene)막 필터 유니트를 통해 멸균 여과한다. 여과후, 식물성 혈구 응집소(PHA)의 1㎎/㎖ 멸균용액 0.2㎖를 100㎖씩의 매질에 가한다. PHA는 시그마 케미칼사로부터 5㎎을 얻어 멸균, 탈이온수로 희석한다.

따라서, 임파구의 최직 영양 요구를 결정 하는데 적절한 바람직한 배양 매질은 탈이온수 용액 1ℓ당 다음을 함유하는, 혈청-부재, 완충화(pH7.6)용액으로 이루어진다.

미토겐

식물성 혈구응집소(PHA) 2.0㎎

앞서 언급하였으며 후술된 바와 같이, 표1의 배양 매질에서 글루코스는 대사 산물로써 글루코스를 생성할 수 있는 물질로 바꿔어질 수 있으며, 황산 제 1 철은 트랜스페린(Fe⁺³이온은 트랜스페린을 제외하고는 그 자체로는 효과적으로 사용될 수 없다.)으로 치환될 수 있고, 세린은 일부 시험 조건하에서 생략될 수 있으며, 영양 상태가 좋은 사람에 있어선 단지 판토텐산 경우만이 그 축적량이 임파구의 활성화 및 초기 세포 분열에 불충분하다.

표1의 배양 매질의 성분은 변화 될 수 있다. 일반적으로, 성분의 유효량을 이용하는데, 이는 여러가지 영양 검정법 및 개개인에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. 유효량이란, 환자로부터 목적반응을 얻게 되는 양을 말한다. 바람직하게는, 성분의 양은 환자의 특정 성분에 대한 용량반응 곡선에 현저히 못미쳐서는 안된다.

거의 모든 환자 및 검정에서 다음 범위가 만족스럽다. 유효반응을 얻기 위한 성분의 정확한 양은 배양 매질을 사용한 간단한 시험으로 결정할 수 있다.

글루코스-표1에 글루코스의 상용 시험을 위한 바람직한 중앙값이 표시되어 있는데 720㎎/l이다. 상용 시험에서 글루코스 농도범위는 72㎎/l내지 7200㎎(7.2g)/l이다. 그러나, 탄수화물 치환시험에서, 세포의 다른 탄수화물에 비한 글루코스 이용능력을 측정하거나 글루코스 필요량을 감소시키는 물질을 시험하는데, 약 8내지 72㎎/l의 범위가 가장 유용하다. 아미노산-상용 시험을 위해 바람직한 아미노산 수준이 표 1에 나와 있다 ; 그러나 모든 아미노산이 표 1에 나타나 있는 농도에 비교해 동량 증가된 경우에는, 농도가 20배로 증가되도 반응은 현저한 감소없이 유용한 데이타를 구할 수 있다. 40배 증가에서, 억제가 분명해지기 시작하고 60내지 80배에서, 아미노산에 의한 반응억제로 유용한 상용 시험이 방해를 받게 된다. 아미노산의 양은 총괄적으로 약간 감소될 수 있으며 개별적으로는 표1에 나타난 농도에 대해 0.3내지 0.1의 수준으로 감소될 수 있는데, 이때에도 유용한 정보를 얻을 수 있다. 아미노산 요구를 측정할 때, 최대-반응의 절반을 위한 용량은 통상적으로 표에 나와있는 양의 약 0.1배이며 그 양의 0.03배 정도인 경우도 있다. 불균형 시험에서, 아미노산을 높은 수순으로, 예를 들어 정상 혈중수준보다 6내지 10배량을 기해도 유용한 결과가 얻어진다.

비타민

판토텐산-거의 모든 사람에 있어 상용시험을 위해 절대적으로 필요한 유일한 비타민이다. 반응은 표 1에 나와 있는 양의 1/20 정도의 양으로도 구해질 수 있으며, 그 상한선은 정해지지 않는데, 표 1에 비해 매우 높은 수준에서도 무독성이기 때문이다. 양을 약 10μg/매질 ℓ부터 시작하여 변화시켜 중요한 용량-반응 곡선을 구비한다. 표 1에 나와 있는 수준 훨씬 이하에서도 최적 반응이 나타나며 독성이 나타나는 수준은 매우 높다.

리보필라빈-임파구의 리보플라빈에 대한 반응은 표 1에 나와 있는 양의 0.001배 농도에서 현저히 나타나기 시작하여, 개인에 따라 차이가 있는 최고 반응은 표 1에 나와 있는 양의 0.003배 내지 0.1배 사이에서 나타난다. 표 1의 수준은 이상 요구에 관한 어떤 정보를 얻기 위해 사용하나, 표 1에 나와 있는 수준의 0.01내지 0.1배 범위에서도 유용한 결과가 얻어진다. 독성이 나타나는 상한선을 구하는 시험은 행해지지 않았으나, 매우 높은 것으로 생각된다.

폴린산-반응을 탐지하기 위한 폴린산의 최저 유효 수준은 표 1 수준의 0.03 내지 0.1배 범위이나, 아데닌 또는 세린-글리신 상호전환이 제한된 시험에서는 10 내지 20배까지의 폴린산이 최적 반응에 필요할 수도 있다. 폴린산은 매우 높은 수준에서는 반응을 저하시키는 경향이 있다.

비오틴-반응에 필요한 비오틴의 수준은 표 1에 나타나 있는 수준에 훨씬 못미친다. 비오틴 결핍을 보이는 사람의 경우, 표 1에 나타난 수준의 0.01 내지 0.003배 수준에서도 현저한 반응이 얻어질 수 있으나 비정상 요구를 탐지하기 위해서는 보다 높은 수준이 필요하며 그 상한선은 비교적 높을 것이다. 비타민 B₆-비타민 B₆결핍증 환자에서, 표 1의 양에 대해 약 0.03 내지 0.1배 수준에서 유용한 반응이 얻어질 수 있는데, 단, 글리신 및/또는 세린이 생략된 조건하에서는 기본 매질에 관해 표 1에 나와 있는 수준의 10배 내지 20배 수준을 사용해 왔다. 독성 수준은 실제적으로 훨씬 높을 것이다.

비타민B₁₂-모든 가능한 조건을 시험하는데 0.1 내지 10⁴μg/l 가 필요하다.

니코틴아민드, 티아민-이들의 독성은 그 상한선이 측정된바 없다. 결핍증 환자에 있어, 반응을 보이는 최저 수준은 표 1에 대해 0.01 내지 0.03배 범위이다.

염

염화칼슘-표 1의 0.1배 수준(즉, 11.1㎎/l)에서 저하된 반응이 나타나며 ; 거의 최적 반응은 55.5㎎/l에서 얻어지고 ; 대부분의 사람에서 최적 반응은 222㎎/l에서도 나타나며 실제로 최적 반응을 위해 이보다 더 큰양이 필요한 경우도 있다. 333㎎/l 농도에서 시험자 4인중 1인에서 반응의 저하가 나타난다. 여러 개별 시험에서 염화칼슘의 양을 표 1의 3배정도를 증가시켜도 반응의 현저한 억제는 일어나지 않는다. 유해 효과가 인자로 되는 상한선은 그리 높지는 않다.

황산마그네슘-하한선은 표 1의 약 0.1배 수준이며, 표 1 수준의 3배 수준 즉 360㎎/l가 만족스럽게 사용되어 왔으며, 표 1 수준의 5배 까지에서 반응의 어떤 현저한 억제도 나타나지 않는다.

에틸렌디아민 7수화물과 황산제 1 철 7수화물-몇명의 환자에서 하한선은 표 1 수준의 0.1배이며, 1명에서는 표 1의 0.05배-수준에서도 우수한 반응을 보인다. 표 1의 3배까지의 농도가 만족스럽게 사용되었으며, 독성이 나타나지 않는한 10배량도 적절한다.

트랜스페닐은 황산 제 1철 대신 사용될 수 있으며, 0.3㎎/l가 하한선인데 약간 반응이 감소되며 ; 30㎎/l까지에서 최적반응을 보인다. 독성의 상한선은 측정된 바 없다.

염화나트륨-염화나트륨의 농도는 중요하다. 25%의 증가 또는 감소조차 시험에 현저한 유해 효과를 미칠 수 있다.

K₂HPO₄-4배로 증가시키면 세포수가 11800에서 9350으로 감소되는데, 이는 만족스런 시험 결과를 제공할 수 있다 ; 그러나 표 1의 10배로 증가되면 불충분한 반응이 나타난다.

수산화나트륨-매질의 pH를 6.8 내지 약 7.6으로 조절하기 위해 충분량이 필요하다.

기타 성분

이노시톨-0.018㎎/l 농도에서 최대반응의 약 70%가 나타나며 0.18㎎/l에서 최대 반응의 90 내지 100%가 나타난다. 72㎎/l에서도 최대 반응이 나타나며, 독성은 매우 높은 농도를 제외하고는 나타나지 않는다. 이노시틀은 단순히 자극성분이므로, 이를 생략해도 반응은 통상적으로 약간만 감소된다. 한 그룹에서는, 50%까지의 반응 감소가 나타났으나, 어떤 경우에는 아무런 감소도 관찰되지 않았다.

콜린-0.014㎎/l의 농도는 불충분하며, 0.14㎎/l에서 거의 최대 반응이 나타나며, 1.4㎎/l 내지 56㎎/l에서 최적 반응이 나타나는데, 이때 거의 모든 경우에 임파구에 대한 현저한 독성은 나타나지 않는다.

피루베이트-적절한 범위는 약 56㎎/l 내지 약 495㎎/l이며, 16.5㎎/l는 불충분하며, 1650㎎/l는 독성을 나타낸다.

아데닌-13.5㎎/l가 만족스러우며, 135㎎/l에서는 독성이 나타난다. 하한선은 표 1 수준의 대략 0.1배이다.

PHA-적절한 범위는 1ℓ 당 1㎎ 내지 2㎎이며, 개개인의 경우에 따라 한계가 달라진다.

판토테산을 제외한 비타민중 어느 하나를 완전히 생략할 수도 있다 ; 예를들어 니코틴아미드를 생략해도 다수 환자에 있어 반응에 현저한 영향을 미치지 않는다. 따라서, 드문 경우를 제외하고는 그런 매질도 만족스런 결과를 나타낸다.

알기닌같은 한가지 아미노산, 또는 몇가지의 아미노산은 높은 수준까지 증가시켜도 대부분의 환자에 있어 시험에 현저한 영향을 미치지 않는다. 표 1 에 기술된 최소 매질은 기본 시험 매질에 관해 나타낸 아미노산 수준의 0.3 내지 3배 범위에서 가장 만족스런 결과를 나타냄이 밝혀졌다.

표 1의 최소 매질에서 배양되는 임파구의 경우 각 아미노산에 대해 일정한 최소 요구량이 존재한다. 상한선 뿐 아니라 이 한계치도 매질의 조성에 관계되는데 임파구 반응은 성분의 농도보다는 농도비의 결과일 경우가 많기 때문이다. 이는 상호 길항작용의 결과이며, 최소요구량이 그러하듯이 개인에 따라 달라진다.

미토겐은 시험 세포를 최대로 자극시키기에 충분한 양 존재해야 하며, 완충액은 pH를 약 6.8 내지 7.8로 유지시키기에 충분해야 하며, 항생제는 배양 매질의 오염을 막기에 충분해야 한다.

배양 매질의 각 성분은 전기한 양 및 범위에서 효과적으로 그 기능을 다한다.

임파구의 분리

임파구는 바람직한 어떤 방법으로도 혈액 샘플로부터 분리할 수 있다. 다음은 임파구를 혈액으로부터 분리하는 방법을 예를 들어 설명한다.

혈액샘플을 멸균된, 헤라린처리한 10㎖ 베큐테이너 튜브에 모아 실온에 30분 이하 유지시킨다. 샘플을 인산염 완충화 염수로 2.4배 희석하고 희석 혈액(8㎖)을 적절한 튜브에 들어있는 히스토파크(시그마 케미칼사에서 시판되는, 피콜(Ficoll) 및 나트륨 디아트 리조에이트 화합물) 3㎖에 주의하여 가한다. IEC 임상 원심분리기에서 200rpm으로 20분 원심분리시키면 적혈구와 임파구가 분리되는대, 임파구는 히스토파크의 상층에 존재한다. 이층은 주로 임파구로 이루어진다.

임파구를 멸균 파르테르 피펫을 이용하여 튜브로부터 뽑아낸다. 약 6㎖의 매질염, 또는 다른 적절한 용액을 함유하는 15㎖용 코닝 플라스틱 원심분리관에 약 0.5 내지 2.5㎖의 뽑아낸 임파구를 넣는다. (일반적으로 20㎖ 혈액에 대해 6개의 히스토파크 튜브가 필요하며, 이 튜브로부터의 임파구를 4개의 코닝 튜브에 넣는다)

원심분리관을 수차례 뒤집어 세포 세척을 돕고 1700rpm으로 10분간 원심분리시킨다. 상등액을 버리고, 각관의 세포를 약 1㎖의 매질염에 멸균 파스테트 피펫으로 약하게 흡인하여 재현탁시킨다. 4개의 관의 내용물을 모두 1개의 관으로 합해, 나머지 3개의 관을 매질염으로 헹구고 이를 파스테트 피펫에 의해 임파구 현탁액으로 옮긴다. 임파구를 함유하는 관을 수차례 뒤집고, 1700rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액은 버린다.

임파구 펠렛을 전술한 방법으로 3㎖의 매질염에 재현탁시킨다. 세포수를 콜터(coulter) 계수기로 다음 방법으로 측정한 : 20μl의 현탁액을 플라스틱 콜터 아큐베트중 10㎖이 이소톤에 가하고, 핵을 계수하기 위해 짜포글로빈(콜터 진단제) 1적을 가해 세포막을 용해시킨다. 용액을 약하게 교반하고 콜터 계수기로 3회 측정한다. 그 평균치를 기준하여, 임파구 용액을 매질염으로 3×10⁶세포/㎖ 농도로 희석하여 재계수한다. 이 임파구 현탁액을 사용하여 시험물을 접종한다.

임파구는 이 분야의 다른 방법에 따라 혈액으로부터 분리할 수 있다. 예를 들어, 피시험자로부터 얻은 혈액을 통상적 방법으로, 예를 들어 헤파린같은 항응고제를 가해 비-응고성으로 하고, 이로부터 공지방법, 예를 들어 혈액 샘플을 유리구가 채워진 칼럼에 도입시키므로써 임파구르 회수한다. 착성(adherent)세포는 유리구에 부착된다. 임파구는 용출물로부터 구배 원심분리에 의해 회수할 수 있다. 또는, 구배 원심분리를 직접 적용하면 유리구상 착성 세포의 흡착단계를 안거칠 수도 있다.

임파구를 얻기 위한 다른 적절한 방법은 다음 참조문헌에 기술되어 있다 : Johnson, G. J and Russel, P.S., Nature 208, pp.343(1965) ; Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 77(1966) : Oppenheimer.

J. J., Leventhal, P. G., Hersh, E. M., Journal Immunology 101, pp. 262-270(1968) : Twomey, J. J., Sharkey, O., Journal Immunology 108, pp. 984-990(1972).

상기 방법중의 하나로 수득 및 정제된 임파구 모두를 적절한 농도로 희석하고 이 현탁액을 배양 매질 접종에 사용할 수 있다.

임파구 검정

일반적으로, 검정 과정은 배양 매질을 시험 임파구로 접종하고, 접종된 배양 매질을 배양하고, 배양물을 수득하며 임파구의 활성화 및 성장시작과 같은 반응을 측정한다.

다음은 바람직한 임파구 검정법의 예이다.

미리 멸균한(에틸렌 옥사이드에 의해)캡을 가진 12×75㎜ 폴리스티텐과 (scientific 제품)을 사용한다. 각관에 1㎖의 배양 매질을 가하고 필요하면, 30μl까지의 보충물을 각 관에 가하거나, 이 보다 높은 농도의 매질을 그 보다 소량가하고 보충물을 가해 최종 용적을 1㎖로 할 수도 있다. 이어서 이를 50μl의 희석한 임파구 현탁액(15×10⁴임파구)으로 접종한다. 배양-배양관을 스텐테스 강철래크에 넣어 수증기로 포화된 5% 이산화탄소대기중 37℃에서 4일간 배양한다. 제 4 일에 이를 꺼내어 37℃ 수욕에 넣고 특이 활성이 300μ Ci1.nmole인 H-티미딘이 함유된 관 하나당 0.1μ Ci로 펄스시킨다. 배양물을 수득하기 전에 23 내지 25시간 배양기중에 다시 넣는다. 이 시간은 달라질 수도 있는데 (예. 8시간) 대조에 비해 유사한 결과가 얻어진다.

수득-헥산을 여과할 수 있는 0.45μm 여과지를 이용하여 밀리포어 샘플링 장치상에서 배양물을 수득한다.

관의 마개를 제거하고, 관을 빙욕상에 놓고 볼텍스 혼합기로 잘 혼합한다. 여과지를 일단 장치했으면 수득과정을 통해 사용되는 1/2배 농도의 인산염 완충화 염수로 습윤시킨다. 처음 12개의 관을 다시 볼텍스 혼합기상에서 혼합하고 동일 염류용액으로 3/4까지 채운다. 이들은 샘플링 장치의 12개 여과지상에 연속적으로 붓는다. 각 관은 염류 용액으로 3/4까지 채운다. 이들은 샘플링 장치의 12개 여과지상에 연속적으로 붓는다. 각관은 염류 용액으로 2회 세척하고 세척액 또한 여과지상에 붓는다. 이어서 약 5㎖의 염류 용액을 가 여과지에 부어 최종적으로 세척한다. 12개씩의 튜브에 대해 이 과정을 반복한다.

여과지를 건조 기중에서 120℃로 5분간 건조하고 10㎖의 톨루엔-PPO 신틸레이션 칵테일(20g PPO/4l 톨루엔)을 함유한 계수 바아알에 넣는다. 바이알을 베크만 LS 250 액체 신틸레이션 계수기로 측정한다.

상기 검정 과정은 변형 시킬 수 있는데, 예를 들어 배양관 및 1㎖의 배양 매질 대신에 미량 검정판 웰(well)(예. 코닝 또는 팔콘 제품) 및 0.2㎖의 배양매질을 사용하여 검정을 수행할 수 있다. 동일 배양매질 및 동일 농도의 보충물을 사용한다. 보충물을

먼저 적절한 웰에 통상적인 10μ 대신에 2μl의 양을 넣는데 최종 용적이 1/5이 되기 때문이다. 임파구를 통상적 경우와 같이 매질염으로 세척하나, 최종 세척후에 웰내에 15×10⁴세포/㎖ 농도로 가할 매질과 동일 종류의 매질에 현탁시킨다. 이 현탁액을 피펫에 의해 각각의 웰내로 가하면(0.2㎖/웰) 최종 용적이 0.22㎖가 되면 최종 세포농도는 3×10⁴/0.22㎖이다. 판을 통산적 경우 대로 배양시킨다 ; 단, 제 4 일에 펄스시키는데 동일한³H-티미딘 용액(특이활성 300μ Ci/n mole)50μl 대신 10μl를 사용한다.. 제 5일 또는 티미딘으로 펄스시킨 후 적절한 시기에 1㎖ 배양법의 경우에 사용된 밀리포어 여과지 및 샘플링 장치 대신에 브란델 M-12 세포수득기 및 브란델 여과지를 사용하여 배양물을 수득한다.

상기 과정은 두 가지의 배양조건을 나타내며, 개인의 영양 필요도 판정의 기본 개념을 충족시키고 보통의 결핍상태뿐 아니라 생화학적 개체상에 기본한 요구량 차이를 탐지하는 과정은 다른 많은 변형이 가능하다.

필수 아미노산에 대한 이상 요구, 고농도 아미노산(예. 아미노산 불균형)의 유해 효과 감수성 및 비-필수 아미노산 필요량 합성 불능을 측정키 위해, 매질 중에 존재하지 않는 아미노산을 포함하여 모든 아미노산, 각각의 보충물에 대해 평균혈중 농도에 근사하는 수준 및 이와 동시에 평균 농도보다 현저히 높은 수준에서 사용측정을수행할 수 있다. 아미노산의 상승된 농도가 미치는 유해 효과는 다른 아미노산 또는 일부 비타민 보충물 첨가로 극복할 수 있다.

아미노산의 이상 요구는, 매질을 상술한 대로 단, 그의 정량적 필요량을 측정할 아미노산은 생략시켜 제조하고, 그 아미노산을 각각의 시험관에 일정 농도 범위에 걸쳐 가해 용량-반응 곡선을 구해 측정할 수 있다.

또는 특정 아미노산의 일정한 농도에 있어서의 환자 임파구의 반응을 제한 농도에 대한 피실험자 집단의 임파구 반응 범위와 비교하므로써 아미노산의 농도를 한가지로 제한하여 실험할 수 있다. 전 용량-반응 곡선을 구하지 않고도 두가지 농도를 이용하면 필요한 정보를 얻을 수 있다. 시험에 사용될 농도의 선택에 있어, 표 Ⅱ에기술된 바와 같은 아미노산 농도는 특정 아미노산으로 제한되는 반응을 나타낸다. 표 Ⅱ에 나타난 농도 근처에서 최대 반응의 50%가 나타난다.

최대 반응의 50%가 나타나는 수준 근처의 한가지 특정 농도를 이용하여 최소의 시험으로 이상 요구에 관한 정보를 얻을 수 있다. 그 보다 약간 낮은 농도 및 약간 높은 농도, 예를 들어 최대 반응의 50%가 나타나는 농도의 2/3 및 4/3에 의해 2점 반응곡선을 구하거나 상기의 일반적 범위 중 여러가지 농도를 이용하여 완전한 용량-반응 곡선을 구할 수 있다.

칼슘 또는 마그네슘같은 무기물의 이상 요구, 및 고농도 무기물의 유해 효과에 대한 감수성도 비슷한 방법으로 측정할 수 있다.

매질로부터 비타민 B를 한번에 한가지, 또는 비타민 B₁₂및 폴린산의 생략같이 몇가지를 생략해도, 판토텐산의 경우를 제외하고는 통산 반응의 저하가 나타나지 않는다. 따라서 판토테산이 아닌 비타민의 경우에 감소된 반응은 비타민의 결핍, 이상요구, 또는 비타민의 측적 부족을 나타낸다. 판토텐산 부재하의 반응수준 또한 판토텐산의 영양적 지위 판정에 마찬가지로 이용될 수 있다. 비타민 길항제(예. 비오틴 이용의 억제제로써의 데스티오비오틴)를 가했을 때 감소된 반응을, 억제시스템을 위한 비타민의 적정성의 척도로 이용할 수 있다. 이는 어떤 비타민에 관해서는 비타민 요구보다 더 특이적일 수 있다.

매질 성분을 오염시킬 수 있는 미량 원소를 제거하는데 공지된 방법을 사용하면 미량원소 결핍증 또는 그런 영양 인자의 이상 요구를 탐지할 수 있다. 약물 및 여러가지 독성 물질에 대한 감수성 및 영양 요구를 변화시키는데 관한 이들의 상호작용 또한 시험할 수 있다.

배양 매질의 어떤 성분은 다른 성분을 증가시키므로써 생략할 수 있다. 예를 들어, 많은 사람의 임파구 검정에서 배양 매질로부터 폴린산 및 비타민 B₆(피리독신) 농도를 수배로 증가시키므로써 세린 및 글리신을 생략할 수 있다. 폴리산 및 비타민 B₁₂의 보충물 부재하에 세린만에 대한 반응과 글리신 단독에 대한 반응의 비는 대부분 사람에 임파구에서 1을 초과한다. 한편, 악성빈혈환자의 임파구에서는 세린에 대한 반응은 이 조건하에서 글리신에 대한 반응을 초과한다.

개인의 이노시틀 또는 콜린 합성능은 배양매질로부터 이들 성분을 생략하므로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 어떤 사람의 임파구는 이노시톨을 충분히 합성할 수 없으나 대부분 사람의 임파구는 이노시를 요구의 상당 부분을 합성할 수 있다. 콜린을 합성하는 능력의 차이가 개인에 따라 관찰된다. 2-디메틸아미노에탄올은 콜린을 거의 대체할 수 있으며, 이 대체도를 이용하여 개인의 임파구가 이중간체로부터 콜린을 합성하는 능력을 측정할 수 있다.

아데닌을 생략하는 경우에, 개인에 있어, 푸린 합성에 영향을 미치는 인자의 측정이 가능하다. 예를 들어, 폴린산, 글리신 및 글루타민의 요구는 개인에 따라 이런 조건하에서 변화된다. 5-아미노-4-이미다졸카복사이드 또는 그의 리보실 유도체는 임파구 자극에 있어 아데닌을 유의적을 대체한다. 그런 보충은 푸린 생합성의 어떤 단계가 제한적인가에 관한 정보를 제공할 뿐 아니라 푸린핵에 대한 포르메이트의 최종 삽입을 위한 폴린산 요구량의 측정을 가능케 한다.

영양상태, 영양소 상호관계 변동, 약물 및 영양소 감수성의 광범한 검사를 위해 약 3×10⁴임파구의 접종물을 필요로 하는 소용적(예 0.2㎖) 배양물을 이용한 검정은 약 20㎖의 혈액으로부터의 임파구에 관해 750 개별 시험을 포함할 수 있으며, 3배수로 이루어지는 경우, 250가지의 다른 시험변동을 인정한다. 이로 인해 개인의 영양소 결핍 또는 이상요구, 영양소 불균형에 대한 감수성, 영양소, 약물 및 다양한 물질의 독성 효과에 대한 감수성 및 여러가지 생합성 능력에 관해 매우 광범한 검사가 가능하다.

배양 매질에서, 활성화에는 약 하루가 걸리며 다음 약 4일 동안에 대수기 반응곡선이 구해지며, 그 이후에는 세포를 분리하고 새 매질을 가하지 않는 한 반응이 감소된다. 불완전 매질에서의 초기 배양은 어떤 성분을 고갈시키며, 후속 시험을 수행하여 결핍증을 확실하게 확인할 수 있다. 판토텐산같은 특정 영양소 존재하에 활성화된 세포는 이들 성분을 충분량 저장하므로 후속 배양시 최대 반응을 구하기 위해 이들이 반드시 존재할 필요는 없다.

배양 매질로부터 글루탐산, 아스파르트산, 아스파라긴, 알라닌 및 프롤린을 생략할 수 있다. 단백합성에 필수적인 나머지 15가지 아미노산 중, 글리신 및 세린은 일부 임파구 조건하에서는 생략될 수 있으나 나머지 경우에 대해서는 자극시킨다.

영양상태가 우수한 대부분 사람의 경우, 비타민 B중 판토텐산만이 최적 반응에 절대적을 필요하다 ; 그러나, 리보플라빈 및 비타민 B₆는 반응을 촉진시키는 경우가 빈번하거, 다른 비타민 경우에는 그 빈도수가 감소된다. 이러한 빈도수는 여러 방법으로 측정된 비타민 결핍 빈도수에 거의 일치한다. 따라서 판토텐산을 제외하고는 비타민 B는 통상 활성화 및 성장의 개시에 충분한 양 임파구내에 저장되는 것 같다. 반응의 촉진이 나타나는 것은 효소량/및 또는 특정 비타민 저장량에 비해 임파구가 부족하거나 그 비타민에 대해 이상 요구를 나타낸다는 것을 의미한다. 임파구는 미토겐에 의해 활성화되기까지는 불활성 상태이며 엽산 같은 비타민을 흡수하지 않으므로, 이들 세포는 가능하게는 활성골수 세포로부터 이들이 분화되는 시기부터의 개별적인 영양적 내력을 가지고 있다. 이는 영양상태 판정에는 큰 장점이 되나 영양 요법의 결과 판정에는 그렇지 못하다.

임파구는 리보플라빈 결핍에 매우 민감하다. 리보플라빈에 의해 임파구가 자극되는(자극의 정도뿐 아니라) 환자수의 증가와 리보플라빈의 뇨 배설량감소사이에는 연관 관계가 있다.

또한 감소된 적혈구 글루타메이트-옥살 아세테이트 트랜스아미나제 수준과 비타민 B₆의 생략에 대해 임파구의 반응이 저하되는 환자수사이에도 유사한 연관 관계가 있다. 임파구 매질로부터 아스파르트산 및 아스파라긴을 생략했기 때문에 이와 같이 예측된다. 또한 비타민 B₆보충물이 트랜스아미나제의 양을 현저히 증가시키므로 비타민 B₆섭위수준을 나타내는 데 이 효소의 적혈구 수준을 이용하여 왔다.

그런 데이타는 임파구에 영향을 미치는 비타민의 세포결핍 가능성과 흡수 수준사이의 관계를 나타낸다. 그러나, 흡수수준이 매우 높으면 저장기전을 억제할 두도 있다는 가능성이 있다. 그런경우, 비타민의 높은 뇨배설량 및 정상 반응곡선과 관련된 임파구 결핍은 흡수 수준의 저하로 보는 것이 타당할 수 있다. 두가지 그런 경우가 발견된 바 있다.

개발중인 방법과 관련된 전반적 모든 문제를 연구하기 위해, 여러 종류의 장해를 나타내는 환자를 시험기간중에 사용한다.

검정시 배양매질로부터 글루코스를 생략하는 경우, 다른 탄수화물이 글루코스를 대체할 수 있는 능력을 사용하여 개인이 이들 탄수화물을 효과적으로 이용하는 능력을 갖고 있는지 여부를 측정할 수 있다. 예를 들어, 갈락토스혈증의 경우는 락토스로부터 유도된 갈락토스를 대사할 수 있는 능력이 없으며, 이 기전에는 갈락토스의 글루코스로의 전환이 포함된다. 갈락토스를 적절히 대사하지 못하는 것으로 정신 퇴행, 백내장등을 포함한 여러 장해현상이 나타난다. 또한, 과량의 갈락토스에 의한 억제에 대한 감수성을 측정할 수 있다. 이는 노년기의 백내장 발생에 있어 중요성을 지닌다.

갈락토스외의 탄수화물(예, 만노스)에 대해 마찬가지로 글루코스 대신 애용될 수 있는 가능성 및 독성 효과(예. 핵산 생합성에 필수적 탄수화물인 리보스에 의한 억제에 대한 이상 감수성)를 시험할 수 있다. 각각의 경우 탄수화물 시험 과정은 탄수화물의 글루코스 대체능을 측정하고, 탄수화물에 의한 성장 억제에 대한 임파구의 감수성을 측정한다.

갈락토스 이용불능 경우의 치료는 그 공급원(예. 유제품의 락토스)을 함유하는 식품을 피하는 것이다. 이상리보스 억제와 같은 다른 경우에, 억제효과를 역전시킬 능력을 갖는 영양소 또는 상호-관련된 생화학물질을 임파구 검정에 의해 결정할 수 있다.

인슐린 결핍은 최적 반응에 충분한 양의 글루코스를 함유하는 매질 중에서 임파구를 배양하여 탐지할 수 있다. 예를 들어, 인슐린 결핍증은 정상 글루코스 매질 농도의 0.01,0.03,0.1 및 1.0배에 대한 인슐린 ㎖당 0.01유니트의 효과를 측정하므로써 탐지할 수 있다. 저수준의 글루코스, 예를 들어 정상 매질 농도의 0.03 수준에서, 인슐린은 글루코스 요구량에 대한 ″절약 효과″로 설명되는 상장 효과를 나타내는데 대부분 경우에는 정상 글루코스 매질 농도의 0.1 또는 1.0배에서도 인슐린의 실질적인 어떠한 효과도 관찰되지 않는다.

그러나, 인슐린 결핍증 환자에서, 인슐린에 의한 부가적인 성장 촉진은 고수준의 글루코스에서도 지속된다.

후에 글루코스 내성 시험에 의해 당뇨병으로 확인된 두 환자를 이와 같은 방법으로 찾아냈다.

비타민 및, 가능하게는 미량 원소의 축적 결핍, 아미노산 같은 영양소의 이상 요구 및 그 불균형에 대한 감수성, 푸린 및 피리미딘 생합성의 이상 및 중간 대사의 여러가지 차이를 개별적 임파구 배양을 통해 탐지할 수 있음이 발견되었다.

개인의 영양상태 검사에서 10 내지 20㎖ 혈액샘플로부터 0.2㎖의 임파구 배양물을 사용하여 배양조건을 200가지 변화시켜 3배수 측정하는 것이 통상적이다.

개인의 영양상태를 판정하는 이런 방법에 필요한 배양 매질의 개발도중에, 반응의 변동정도를 결정하기 위해 다양한 대조 및 여러가지 질환의 적용되었다. 그 결과, 이 방법이 유용한 임상 과정으로 사용될 수 있는 몇 가지 적응증이 발견되었다.

실시예 1

임파구 매질 개발 프로그램에 참여하므로써 성과를 얻은 최초 경우중의 하나는 오랜동안 피로, 심한 지각이상, 근육통, 약한 우울증 및 심한 불안감을 느껴온 환자 경우이다. 그의 병을 경감시키기 위한 모든 의학적 방법을 다 시도해본 뒤, 영양사와 의논한 결과 우리 프로그램의 일원으로 참여하기에 이르렀다. 임파구 검정 결과 비오틴 보충물 부재시 성장이 약 50% 감소되었는데, 이는 거의 대부분의 정상인에서는 감소되지 않음과 대조적이다. 계속 조사결과 이 환자는 날달걀 환자가 함유된 음료를 좋아하며, 이를 매일 들고 있다는 것이 밝혀졌다. 이와함께, 단지 익히기만 한 계란을 아침으로 먹고 있다는 사실로 볼 때, 이 경우는 의심할 여지없이 아비딘-유도 비오틴 결핍증 범주에 속한다고 판단된다. 300g의 비오틴을 5일간 주사하므로써 환자의 심한 증상은경감되었으며, 그는 경구용 비오틴을 계속 복용해오고 있다.

실시예 2

나이가 86세이며 심한 정신퇴행을 보이는 화자 A.LW.도 마찬가지 과정으로 리보플라빈 결핍뿐 아니라 비오틴 결핍증을 나타나는 것으로 확인되었다. 비오틴 및 리보플라빈 처리로 이야기를 할 수 있게 되었는데 이는 그전에는 불가능했다. 비오틴 및 리보플라빈의 뇨배설로 결핍 상태임을 확인했다. 또한, 두 비타민을 투여하면, 그의 뇨배설(불쾌한 냄새가 난다) 이 관찰되지 않았다. 임파구 시험에 근거하고, 많은 경우에서 뇨분석에 의해 확인할 때, 비오틴 결핍증은 특히 노년기에 예기했던 것보다 훨씬 큰 빈도수로 발생하는것 같다.

실시예 3

H.M은, 근육무기력증, 눈을 감은 상태에서 균형을 잡지 못하며, 머리를 계속 세우고 있지 못하며, 안구 회전 시험시 이상 안구운동을 보이며, 다른 물리적 문제에 있어서는 매우 영리한 어린이라는 평가를 받은 5세여아이다. 그녀의 임파구 시험결과 리보플라빈을 생략하면 대조군에 비해 57% 감소를 나타내었는데, 이는 정상인과의 현저한 차이이다. 매일아침 10㎖의 리보플라빈을 투여하면 1년간의 물리요법 중 처음으로, 회전 시험에서 정상 안구 운동을 보일뿐 아니라 운동 및 놀이 첨가에 대한 태도에서 뚜렸한 변화가 나타난다. 그녀 부모는 그녀를 다시 정상으로 돌아왔다고 인정했으며, 물리요법의는 이런 변화를 매우 예의적이라고 판단했다. 이 어린 소녀의 경우, 초기 임파구 시험에서 리보플라빈 뇨배설량은 최저 위험수준이었다. 따라서 임파구 시험으로 리보플라빈에 대한 이상 요구로 확인하였으며, 계속된 실험으로 보충 및 보충의 중단에 대한 신속한 반응을 입증하는 물리적 실제 데이타를 얻을 수 있다.

실시예 4

임파구의 비타민 B₁₂ 및 엽산 요구에 관한 연구를 위해 추가 기술의 개발이 필요한데, 이들 비타민은 티미딘 흡수에 영향을 미치는 티미딜산의 생성에 관계하기 때문이다. 비타민 B₁₂는 임파구의 활성화 및 성장에서 호모시스테인으로 하여금 메티오닌을 대체하게 하는데 다소의 작용을 나타낸다. 그러나, 비처치 악성빈혈 환자의 연구에서, 악성빈혈 환자는 글리신의 생성에 세린을 사용할 수 있으나 글리신으로부터 적정량의 세린을 생성할 수 없는 것 같다. 이러한 결과는 악성빈혈 환자의 경우는 N⁵,¹⁰-메틸렌 테트라하이드로폴레이트가 결핍되어 있으나 테트라하이드로폴레이트는 충분하며, 그 반면에 세린이 아니라 글리신을 이용하는 정상인의 경우에는 N⁵,¹⁰-메틸렌테트라하이드로폴레이트의 양은 충분하나 테트라하이드로폴레이트는 부족하다. 여러해전, 악성빈혈 환자에서 포르메이트가 아니라 세린의β-탄소가 DNA의 티미딘 생합성에 이용될 수 있다고 알려졌다. 따라서, 비타민 B₁₂결핍증은 환원된 폴레이트 조효소에 부착된 메틸렌의 단일 탄소유니트의 양에 큰 영향을 미치게 된다.

임파구의 비타민 결핍은 특이반응으로 추적될 수 있다. 글리신, 피리독신, 폴리산 및 비타민 B₁₂를 매질로부터 삭제하므로써, 피리독살 포스페이트 및 테트라하이드로 폴산을 필요로 하는 세린의 글리신으로의 전환단계가 임파구의 활성화 및 성장개시에 제한 반응이 된다. 임파구 내의 이용될 수 있는 테트라하이드로폴산 유도체 양에는 환자에 따라 광범위한 차이가 있다. 약 50명의 환자에 대한 연구결과, 정상인은 세린으로부터 충분량의 글리신을 생성하는데 상기 형태의 엽산 유도체를 충분량 함유치 않으나, 악성빈혈 환자인 L.A. 경우에는 단일 탄소 유니트에 대해 엽산 수용체를 공급하기에 충분한 양의 저장물을 지니고 있음이 확인되었다.

피리독신은 다른 시스템을 위해는 충분한 수준이 못될지라도 일반적으로 이 반응을 위해서는 충분한 양 존재하나, 특별한 환자(예. 에스. 비.)의 임파구는 충분량의 폴린산이 존재할 때 피리독신의 부재하에 현저한 감소를 보인다. 수주의 간격으로 2회에 걸쳐 구한 데이타는, S.B의 경우에 이런조건하에 비타민 B₆가 결핍되었음을 보여주는데, 이는 이 그룹의 처음 30명 환자에서는 관찰된 바 없다.

실시예 5

임파구의 글리신 및 세린 합성능에는 보다 광범한 변동이 존재한다. 매질내 글리신 및 세린부재시 최대 반응에 폴리산 및 피리독신이 필요한 것은 마찬가지이나, 한 경우에는 이들 비타민이 부재시에도 대조 반응의 70%를 나타낼 수 있다. 다른 환자의 경우, N.B.에서 세틴 및 글리신이 없어도 되는 가능성은 최소이며 피리독신 및 롤린산 보충물 존재하에서 조차 대조반응의 24 내지 27퍼센트만이 나타난다. 이 환자의 경우 세린 보충물에 대해 이로운 쪽으로 반응을 보인다.

실시예 6

정신 장해를 보이는 어린이들에 대해 임파구 검정을 행했다. 연구 그룹에서, 자페증과 유사한 증상을 보이는 두명의 어린이는 Childhood Onset Pervasive Developmental Disorder의 진단 분류에 부합되었다.

A는 광선공포증, 언어발달 지연, 기괴한 행동 및 전반적 미숙을 보이는 8세 남아이다. 그는 그 또래에 비해 매우 작고 미숙아였다. 즉 그는 혼자 놀거나 면담자와 함게 놀지 못했으며 엄마와 떨어지는데 매우 심한 불안을 보였으며, 단지 면담자의 말을 정확히 반복할 뿐이었다. 임파구 검정결과 피리독신의 부재에 대해 20% 감소된 반응을 보였으며, 엽산 생략에 의해 18% 감소되었는데, 이는 비타민 Biz 생략에 변화된다. 세린, 글리신, 비타민 B₁₂및 엽산을 생략한 매질의 경우 세린에 대한 반응과 글리신의 반응비는 0.76인데 이는 악성빈혈 환자의 경우와 매우 유사하다. 임파구 반응에 근거하여, 다른 비타민의 1일 최소 요구량을 제공하는 100μg의 비타민 b_{12 ,}25㎎의 피리독신, 0.3㎎의 엽산 및 멀티비타민 제제의 보충을 시작하였다. 또한, 1주 1회 정신요법을 실시하였다. 그는 놀라울 만한 진전을 보였으며, 치료의 도움으로 잘 놀게 되었다. 엄마와 떨어져 있어도 불안해하지 않았으며, 자발적이며 적절한 태도로 유창하게 이야기하게 되었다. 이러한 변화는 분명한 진전이다. 시험을 시작할 때, 이와 유사한 증상을 나타내는 많은 환자에 대한 경험에 비추어 그러한 진전을 예측되지 못했다.

S는 삼형제중 첫째로, 정신병 진단을 위해 처음 왔을 때 8세이었는데, 줄곧 불안스럽게 손안에서 나무토막을 굴렸으며, 눈이 마주치는 것을 피하고, 자극을 받으면 팔과 손을 이상하게 내젓곤 하였다. 집에서, 그는 이해력이 지체된다고 여겨졌으며 그의 부모는 그와 통할 수 없다고 느끼고 있었다. 그는 그의 방에 약간의 변화라도 있으면 매우 당황해하며, 기분이 나쁠 때는 머리를 마루에 부딪곤 하였으며, 차를 타고 있을 때 언제나 같은 길을 택하기를 원하였다.감정적으로 혼돈된 어린이반에 넣어졌을 때, 그의 선생님에 의하여 그는 주로 그의 걷잡을 수 없는 행동 때문에 그의 능력에 훨씬 못미쳐 실행할 뿐이다. 정신병 진단결과 어린이 정신장애(즉, 자폐증, 정신분열증, 발달 장애)인데, 그렇지 않다면 영리한 아이였다. 정규적 정신요법과 뒤이어 부모 요법을 2년간 실시할 때, 진전과 퇴보의 시기가 교대되었는데 이런 경우는 드문것이다. 또한, S가 학교에서 그 구실을 다하도록 행동 조절을 하기 위해, 페노티아진(스탤라진, 멜라릴)으 사용했다.

이 시점에서, 환자의 임파구를 시험한 결과 비타민 B₆에 있어 35% 결핍, 리보플라빈에 있어 34% 결핍을 나타냈으며 최대 반응을 위해 글루타민의 경우 정상양 보다 큰 양이 필요하였다.

S의 식사에 25㎎의 리보플라빈, 25㎎의 피리독신 및 2g의 글루타민을 매일 보충하였다. 다음 4달에 걸쳐 S는 1주 1회 요범에 참여했으며, 그의 부모 또한 1주 1회 요법을 받았으며 그는 계속 특별 교육반에 속하였다. 보충물의 개시후 4내지 6주 이내에, S의 부모는, 그가 규칙적으로 복용해 좋은 결과를 보였던 페노티아진이 통상적으로 과량에서 나타나는 부작용을 야기시킴을 주목하였다. 지시받은 대로, 그들은 용량을 점차로 줄였으며 마침내는 중단하게 되었다. 이때, 그의 행동에 어떤 퇴보도 주목되지 않으며 (즉, 치료전 행동으로 되돌아가지 않는다), 그의 선생님 또한 그의 지속적인 행동 개선을 보고하였다. 동시에, S의 치료의도 처음에는 행동에서, 또한 자아 발달 수준에 있어서도 변화를 주목하게 되었다. 요컨대, 보충물을 시작하기 이전에는, S는 유아에서나통상적으로 볼 수 있는 행동을 나타냈었다.

S.H.는 약한 정신 퇴행을 보이는 부정형 유기 뇌 증후군으로 진단 받은, IQ가 60인 6세 남아이다. 치료량이 딜라틴 및 마이솔린을 계속 투여하나, 여전히 1일 8 내지 10회 발작을 일으키고 있었다. 임파구 반응에서, 세포내 리보플라빈 결핍, 글루타민의 통상 보다 높은 요구량 및 글리신 및 알라닌에 의한 억제에 대한 보기드문 감수성을 확인했다. 리보플라빈(25㎎, 매일) 및 글루타민(2g, 매일)을 투여하기 시작했다. 10주 경과시, 발작 형태는 주로 정신 운동 발작 및 소발작으로 바뀌었으며, 16주 경과시 더 이상 발적을 일으키지 않았다.

따라서, 본 발명은 목적을 달성하는데 만족스럽게 적용되며 상기 언급된 장점 및 특징을 갖고 있다.

본 발명의 바람직한 태양이 설명의 목적을 위해 기술되었으나, 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명 범위내에서 여러 가지 변화가 가능함을 주목해야 한다.

Claims

글루코즈, 및 세포내에서 생물학적으로 글루코즈를 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 탄수화물 : 생물학적으로 이용될 수 있는 형태의 판토텐산 : 콜린, 또는 세포내에서 콜린을 생성할 수 있는, 생물학적으로 이용될 수 있는 형태의 물질 : 클로라이드, 포스페이트, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 생물학적으로 이용될 수 있는 형태의 철 이온으로 이루어진 무기 이온 : 탈이온수 : 및 분석할 임파구를 자극 시키는데 유효한 양의 미토젠(mitogen)을 최대용량 반응을 나타내는데 유효한 최소량 내지 억제작용 및 독작용을 나타내는 농도 미만의 범위로 함유하는 pH 약 6.8 내지 7.6의 완충화된 혈청-부재 용액을 포함함을 특징으로 하는 배양 매질.
제1항에 있어서, 생물학적으로 이용할 수 있는 형태의 아미노산 및 비타민 중에서 선택되며 시험하고자 하는 영양분이 생략되거나 제한 또는 억제량으로 존재하는 영양 보충물이 보충된 세포 배양 매질.
제2항에 있어서, 생물학적으로 이용할 수 있는 형태의 아미노산 및 비타민중에서 선택되며 시험하고자 하는 영양분이 생략되거나 제한 또는 억제량을 존재하는 영양 보충물이 보충되며, 여기에서 비타민은 비오틴, 폴린산 또는 생물학적으로 이용할 수 있는 형태의 엽산, 니코틴 아미드 도는 니코틴산, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B₆및 비타민 B₁₂및 세포내에서 이들을 생성할 수 있는 화합물 중에서 선택되고, 아미노산 도는 생물학적으로 아미노산을 생성할 수 있는 화합물은 L-아르가닌, L-시스테인,L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소로이신, L-로이신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린으로 이루어지면, 이들 아미노산은 각각 억제 농도를 초과하지 않는 양으로 그룹으로서 존재하는 세포 배양 매질.
제 2 또는 3항에 있어서, 피루베이트 아데닌, 이노시톨 또는 세포내에서 이들을 생성할 수 있는 화합물 중에서 선택된 자극성 영양분 하나 이상이 대략 최대 반응을 나타내는 농도로 보충된 세포 배양 매질.
제 2 항에 있어서, 아미노산 보충물의 각 아미노산이 시험할 아미노산을 제외하고는 대략, 최대 세포반응을 나타낼 수 있는 최저 농도로 존재하는 세포 배양 매질.
제 2 항에 있어서, 세린 및 글르신 중 하나 또는 모두가 함유되지 않고 비타민 B₆및 이용될 수 있는 형태의 엽산 중 하나 또는 모두가 세포 반응을 나타낼 수 있는 양으로 함유된 세포 배양 매질.
제 2 항에 있어서, 판토텐산 및 콜린 중 하나가 함유되지 않은 세포배양 물질.
제 2 항에 있어서, 하나 이상의 무기 이온이 함유되지 않은 세포배양 매질.