CN115298319A - 培养细胞的方法、从细胞制备水解物及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种通过体外细胞培养产生细胞水解物的方法，包括以下步骤：通过超声处理裂解细胞以释放细胞中的蛋白质；通过使用蛋白酶消化蛋白质以产生具有小于500道尔顿(Da)的分子大小的短肽；通过将蛋白酶加热到预定温度并于预定时间期间持续加热或将蛋白酶稀释到预定浓度来终止消化步骤，并且通过膜过滤器将来自消化终止步骤的混合物无菌过滤。产生的细胞水解物可用于各种产品，包括但不限于护肤品、伤口护理、化妆品、食品、补充剂、药物和其他医药应用。
Description
技术领域
本发明的实施例一般涉及用于培养细胞的方法和从细胞制备水解产物的方法。本发明的实施例还涉及来自培养细胞的水解产物的应用。
背景技术
动物肉蛋白质含量高，足够提供构建用于支持身体所需蛋白质的所有氨基酸。传统食用肉是从农场饲养的动物或鱼类中获取的。然而，农业和水产养殖业消耗大量的能源和资源，其碳足印亦高。农业或水产养殖生产的肉类亦会对公共健康造成威胁，因为肉类可能在生产过程中接触到致病原、污染物和毒素。人口增长、肉类需求增加、环境问题、土地和水资源有限、生物多样性丧失以及对动物屠宰的负面看法等一系列问题促使科学家开发出替代生产肉类的技术。
体外细胞培养肉生产是指利用细胞培养技术在实验室中培养动物肌肉组织或器官组织以制造肉类和肉制品的过程。如本文所述，体外细胞培养肉和肉制品包括动物蛋白制品以及可溶性和固体的非肉制品。虽然体外细胞培养肉和肉制品仍处于早期开发阶段，与传统肉制品相比，体外细胞培养肉和肉制品具有更多优势，例如健康和环境上的优势，以及对动物的好处。体外细胞培养肉和肉制品是下一代新兴技术，属于比细胞农业或从细胞培养制造农产品更广阔的领域。
从动物活检中获取的细胞(例如肌肉细胞、体细胞、干细胞等)可以作为用于生产体外细胞培养肉的细胞，这些细胞被放在生物反应器或其他无菌环境的培养基中独立于动物活体生长。细胞可以通过在生物反应器中的可食用三维支架上，模仿动物器官生长成半固体或固体。起始细胞可以是直接从动物组织中获得的原代细胞，也可以是连续细胞系。如果在正确的条件下及适当的培养基中生长，原代细胞将根据其细胞脱氧核糖核酸末端端粒的长度所限的次数生长和增殖。而连续细胞系则可以在体外长期培养。细胞生物学端粒研究已经能够将原代细胞转化为不朽的连续细胞系。通过利用病毒癌基因、化学处理或端粒酶逆转录酶的过度表达，我们可以将原代细胞转化为连续的细胞系，以防止端粒缩短。
培养基含有细胞增殖所需的成分，如氨基酸、盐、维生素、生长因子和缓冲系统，以控制pH值。目前的方法是向培养基中添加胎牛血清(FBS)，以提供重要的大分子、生长因子和免疫分子。然而，胎牛血清来自未出生的小牛不符合不含动物产品的指标。因此从事生产体外细胞培养肉研究的科学家认为在无动物成分的培养基中培养细胞是的一个重要的因素。而某些生长因子可能来自于人类。
目前的体外细胞培养肉生产涵盖大多数商品肉类种类，例如基于细胞的牛肉、猪肉和家禽肉类。然而，这些肉类具有复杂的组织结构和涉及多种细胞，当前的生物医学技术难以生产这些肉类，成本也很高。体外细胞培养肉生产还缺乏提高肉类蛋白质水平和生物产量的非转基因方法。此外，如上所述，当前的细胞培养技术仍然依赖动物成分(如胎牛血清)作为营养源，以及昂贵的非食品级生长因子。
除了人类食用外，肉类通常用于生产用于护肤品、化妆品和伤口护理产品的动物源性原材料。例如，护肤品、化妆品和伤口护理产品通常包含刺激皮肤组织修复和再生的生长因子、细胞因子和细胞外基质(ECM)蛋白。它们包括透明质酸衍生物，以滋润皮肤并减少皱纹；抗氧化剂，以防止与衰老相关的氧化应激。活性成分大多来源于野生动物和野生植物。然而，从野生动物和野生植物中制造衍生原材料具有以下缺点。
首先，它需要动物和植物来源的恒定供应。对动物产品需求的增加导致更多的动物在农场和屠宰场遭受痛苦和被杀。饲养牲畜的增长也可能给环境或生态系统带来额外的负担。此外，它还可能引起虐待动物和福利问题。
其次，仅目标蛋白从野生动物或野生植物中提取，而剩余由野生动物或野生植物产生的功能性蛋白质则丢失。通常，衍生原材料是通过从野生动物或野生植物中提取某些目标/感兴趣的蛋白来制造的。提取过程中不会捕获剩余的其他蛋白或营养物质。然而，由于这些功能性蛋白可以增强特定目的的结果，在衍生原料中包括微量的功能性蛋白可能是可取的。例如，与仅从橙子中提取的维生素C相比，橙子中的总营养对于特定目的可能对人类更有益。此外，只是为了获得一些可用的部分来生产衍生原料来饲养动物或种植植物这做法的效率非常低。
第三，它涉及使用有害化学物质。例如，从鱼皮中提取胶原蛋白涉及一系列步骤，包括将鱼皮与碱性和酸性溶液混合的步骤。这给环境或生态系统带来了额外的负担。此外，它可能会导致潜在的职业危害。衍生原料也可能含有有害化学物质。
第四，由于环境污染物(重金属、抗生素、微塑料、除草剂、杀真菌剂、杀虫剂)、外来因子(细菌、病毒、真菌、传染性海绵状脑病剂)和野生动物和野生植物中过敏原的存在，存在安全问题。
第五，在控制分子谱和确定动物源(例如动物血清)和植物源(例如植物提取物、植物水解物)原料的一致性方面存在困难。每批动物源性或植物源性原料均由不同批次的动植物制成，由于温度、收获时间、动物饲料和肥料的类型、害虫和寄生虫的存在等因素的不同，这些原料可能存在显着差异。某个批次中的某些分子可能会引发某些个体的过敏反应。
第六，进一步的，如果动物源性和植物源性原料取自野生动物和野生植物，则很难溯源。
作为替代方法，可以通过使用重组生物来产生衍生原料。然而，这种方法涉及使用转基因生物，当这些生物意外被释放时可能对环境有害。此外，每条生产线只能生产一种蛋白质。以这种方法从而获得多种源自原料的蛋白质的效率低。此外，重组生物产生的蛋白还需要进一步分离和纯化。分离和纯化通常涉及多个步骤，导致生产成本增加。此外，通过这种方法产生的蛋白的折叠可能存在差异。在某些变体中，某些功能可能会丢失。
另一方面，用过的培养基也可以是功能性蛋白的来源。然而，与上述方法类似，它也有几个缺点。首先，它需要不断供应动植物来源。其缺点已在前文中讨论过，在此不再赘述。其次，由于环境污染物(重金属、抗生素、微塑料、除草剂、杀真菌剂、杀虫剂)、外来因子(细菌、病毒、真菌、传染性海绵状脑病因子)和在野生动物和野生植物来源中的过敏原。第三，用过的培养基中不需要的代谢物和废物可能会影响最终产品的纯度。额外的纯化步骤将导致生产成本增加。
发明概要
本发明提供可供人类食用的体外细胞培养肉类的生产方法，为上述挑战提供解决方案。
本发明的一个目的是提供一种在受控过程下获得动物来源的原材料和/或植物来源的原材料的替代方法。根据本发明获得的衍生原料不含环境污染物、外来物质和过敏原。它还有助于限制与动物衍生材料的生产相关的动物痛苦和牺牲。
细胞水解物通常从衍生原料中提取，并作为活性成分应用于护肤品、伤口护理、化妆品或食品中。细胞水解物包括但不限于透明质酸。鉴于上述情况，本发明的另一个目的是提供一种更有效和利于环境的方法来制造各种产品，包括但不限于护肤品、伤口护理、化妆品、食品、补充剂、药物和其他医药应用。它还为此类产品改善其批次间一致性和产品可追溯性。
本发明的另一个目的是为各种行业/产品中的消费者或制造商创造更多价值，包括但不限于护肤品、伤口护理、化妆品、食品、补充剂、药物和其他医药应用，因为它同时解决了传统衍生原料创建方法(即从野生动物/植物、重组DNA生物和用过的培养基中提取)遇到的所有缺点。本发明提供以下益处：
(1)不依赖动物和/或植物来源；
(2)不依赖转基因生物；
(3)捕获目标细胞天然产生的所有功能性蛋白；
(4)纯度(产品中无废物)；
(5)不使用有害化学物质；
(6)简单的下游程序，从而降低成本；和
(7)多功能代替单一用途/功能/动作。
本发明的益处创造满足消费者需求的新价值。它为各种产品的活性成分或产品本身(包括但不限于护肤品、伤口护理、化妆品、食品、补充剂、药物和其他药用应用)提供以下特性：
(1)清洁标签:由于衍生原料纯度高，不含废物或有害化学物质；
(2)可持续性:由于对动物和/或植物来源的依赖很少或很低而导致；
(3)非化学合成:由于使用生物材料；
(4)多功能:因为它具有完整的分子谱，其中所有功能蛋白均由受试细胞自然产生；
(5)有科学原理和测试结果的支持。
根据本公开的一些实施例，本发明提供一种通过体外细胞培养生产肉的方法包括从动物或植物来源分离组织并制备细胞的细胞悬液。该方法还包括使细胞在培养基中的食品级支架上生长，使得细胞生长成模拟动物器官的固体或半固体结构。此外，该方法还包括通过改变一种或多种调节蛋白质表达的微核糖核酸的水平来增加生长细胞中蛋白质的表达。
根据本公开的另一个实施例，本发明提供一种通过体外细胞培养生产肉类的方法包括从植物或动物来源中分离组织并制备细胞的细胞悬液，并在处于培养基中的食品级支架上培养细胞，使细胞生长成模拟动物器官的固体或半固体结构。该方法还包括将细胞与分泌支持细胞生长的营养物质、生长因子和细胞因子的生物工程细胞共培养。
根据本公开的另一个实施例，本发明提供一种通过体外细胞培养产生细胞水解物的方法包括以下步骤：(i)通过使用超声处理来裂解细胞以释放细胞中的蛋白质；(ii)通过使用蛋白酶消化蛋白质以产生分子大小小于500道尔顿(Da)的短肽；(iii)通过将蛋白酶加热至95℃15分钟或使用PBS将蛋白酶稀释100倍来终止消化步骤；(iv)通过膜过滤器对由消化终止步骤获得的混合物进行无菌过滤。
附图简要说明
为更好地理解本发明，可以参考详细说明并结合附图一并考虑。图中的组件不一定按比例缩放，而是强调解说本发明背后的原理。
图1是根据本发明一些实施例的通过体外细胞培养进行肉类生产的方法的流程图。
图2是根据本发明一些实施例用于增强转录后蛋白质表达的方法的示意图。
图3是根据本发明一些实施例用于增强转录后表达胶原1型α1(COL1A1)的方法的示意图。
图4是根据本发明一些实施例用于增强转录后表达胶原1型α2(COL1A2)的方法的示意图。
图5是根据本发明一些实施例，用于体外细胞培养肉类生产的具有固相生物反应器的示意图或概念横截面图。
图6是根据本发明的一个与图5类似的实施例，但具有第二固相的生物反应器的示意图或概念横截面图。
图7是根据本公开的一些实施例的用于从体外细胞培养物中产生细胞水解物的方法的流程图。
图8是根据本公开的一些实施例的用于评估细胞水解物对人体皮肤细胞的影响的方法的流程图。
图9是经水解产物处理时皮肤细胞层粘连蛋白表达的图表。
详细说明
体外细胞培养肉生产
图1显示用于生产体外细胞培养肉的方法10。如本文所述，“体外细胞培养肉生产”是指基于细胞的肉类生产过程或基于细胞的农业过程，其中来自动物和/或植物的组织在实验室中使用细胞培养技术增长以制造肉类和肉类产品。在区块12，组织从动物或植物中分离。在一些实施例中，该组织源自硬骨鱼纲的骨性鱼，包括咸水鱼，例如石斑鱼、鲈鱼或黄鱼。在其他实施例中，其他类型的动物组织也可以被分离，例如牛组织。在一些实施例中，区块12可从鱼收集器官组织，例如鱼鳔，并制备细胞悬浮液。尽管以下描述主要源自鱼类的组织，但这些概念可应用于源自其他动物和/或植物的组织，以提供其他类型的体外细胞培养肉和/或动物蛋白产品，以及素食肉和/或蛋白产品。
许多分离的细胞是成体细胞，可以使用医学研究中已建立的各种方法使其持续增殖(区块14)。例如，特定基因，如山中(Yamanaka)因子，可用于将成年细胞重新编程为干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。作为替代选择，分离的成年细胞可以通过端粒酶逆转录酶的过度表达转化为连续的细胞系。在其他实施例中，可分离其他类型的细胞，例如成体干细胞和胚胎干细胞。在这方面，应当理解，本发明的方法包括细胞系的所有来源。
在下一个区块16中，通过在无菌室或容器(如生物反应器)中附着/粘附食品级生物兼容性支架，将细胞生长为模拟动物器官(如鱼器官)的固体或半固体结构。无菌室或容器可进行温度控制，并可具有入口和出口，用于引入和移除化学物、营养素和细胞等物质。食品级生物兼容性支架最终成为食用产品的一部分，由基于植物或基于真菌的材料制成，例如但不限于琼脂糖、海藻酸钠、壳聚糖、菌丝体和魔芋葡甘聚糖。海藻酸钠是一种从褐藻中自然提取的生物聚合物，具有生物兼容性。此外，从真菌中提取的植物性壳聚糖具有抗菌性能。在一些实施例中，区块16在没有抗生素或抗菌化合物的无菌容器中进行。区块18涉及向生物反应器提供培养基以支持细胞存活和生长。培养基可以是含有不同成分的缓冲溶液,所述成分包括但不限于无机盐(例如氯化钙(CaCl2)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、硫酸镁(MgSO4)等)、氨基酸、维生素(例如硫胺素、核黄素、叶酸等)，和其他成分如葡萄糖，β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)和丙酮酸钠。生长培养基的非限制性示例包括但不限于莱柏维兹的L-15(Leibovitz’s L-15)培养基、Eagle’s培养基(MEM)、培养基199、杜尔贝科的改良Eagle培养基(DMEM)、Ham’s F12营养混合液、Ham’s F10营养混合液、MacCoy’s 5A培养基、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、Iscove’s改良Dulbecco培养基和RPMI 1640。
如果使用植物组织/细胞，培养基可以含有植物细胞增殖所必需的组分，例如氨基酸、盐、维生素、生长因子、碳水化合物、硝酸盐和缓冲系统以控制pH。培养基可以是Murashige and Skoog(MS)培养基、Linsmaier and Skoog(LS)培养基、Gamborg(B5)培养基、Nitsch and Nitsch(NN)培养基和White氏培养基。
根据区块20，将食品级生长因子和细胞因子引入生物反应器中的培养基中能够支持细胞生长和增殖。生长因子和细胞因子可包括但不限于胰岛素生长因子1(IGF-1)、胰岛素、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、白细胞介素11(IL-11)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)和转铁蛋白。区块20可涉及在没有胎牛血清(FBS)的情况下共同培养生物工程细胞和分离细胞。生物工程细胞被改造以分泌上述生长因子和细胞因子，并根据生长和增殖的需要向分离细胞提供这些生物分子。如本文所述，“生物工程”细胞并不等同于转基因细胞。生物工程细胞有一个特定的基因，该基因过度表达一种或多种特定的蛋白质。生物工程细胞可以是鱼细胞，也可以是其他类型的动物细胞，如牛细胞。生物工程细胞不存在于最终的肉制品中。作为非限制性示例，生物工程鱼细胞可与分离的鱼细胞共同培养，或生物工程牛细胞可与分离的牛细胞共同培养。本发明的共同培养方法消除了培养基中对动物源性胎牛血清(FBS)的需要。此外，该共同培养方法在原位向正在生长的细胞持续提供食品级特异性生长因子和细胞因子，并简化生产过程和降低生产成本。然而，在其他实施例中，FBS或其他血清可用于供应生长因子、细胞因子和其他营养物以支持块16期间的细胞生长。
此外，根据区块22，细胞中的蛋白质表达或可被增加以提高所得肉制品中的生物量产量。如本文所用，“生物量产量”是指所得肉制品中可消化物质(例如蛋白质)的量，该物质在消耗后可用于能源生产。具体来说，区块22涉及通过改变细胞中的微核糖核酸水平来增加蛋白质表达，并在培养之前对细胞进行操纵。微核糖核酸是一种内源性的、短的、非编码的单链核糖核酸序列，涉及调节转录后基因的表达。区块22涉及通过促进信使核糖核酸(mRNA)翻译增加蛋白表达的上调微核糖核酸的数量，和/或通过抑制信使核糖核酸翻译减少蛋白表达的下调微核糖核酸的数量。通过向细胞中引入微核糖核酸、微核糖核酸模拟物或微核糖核酸抑制剂，可以增加或减少微核糖核酸的水平。微核糖核酸模拟物具有与微核糖核酸相同的功能，但在调节蛋白质表达方面可能更稳定和有效。在一些实施例中，电穿孔法可用于将游离型载体引入执行表达特定微核糖核酸指令的细胞。作为替代选择，或与此相互结合，腺相关病毒可以用作携带游离型指令的载体，以表达特定的微核糖核酸。通过转染将目标微核糖核酸抑制剂引入细胞，可以减少目标下调微核糖核酸的数量。要注意的是，根据本发明增加蛋白质表达/生物量产量的方法是在不修改细胞基因组的情况下进行的。
图2概要性地描绘了细胞系中增强转录后蛋白质表达的方法。可以增加一个或多个上调微核糖核酸(miRNA)，以增加所选蛋白质的信使核糖核酸翻译和蛋白质生产。作为替代选择，或与此相互结合，一个或多个下调微核糖核酸可被抑制剂(抗微核糖核酸)阻断，以增加所选蛋白质的信使核糖核酸翻译和蛋白质生产。
鱼鳔主要包括成纤维细胞和胶原蛋白。I型胶原(胶原蛋白I)是鱼鳔中的主要蛋白质，增加培养的鱼鳔细胞中I型胶原的表达可能会提高生物产量。鱼鳔细胞中的I型胶原包括胶原1型α1(COL1A1)和胶原1型α2(COL1A2)。COL1A1和COL1A2的表达通过上调微核糖核酸21(miR-21)而增加，因此提高上调微核糖核酸21的水平可提高鱼鳔细胞中胶原1型α1和胶原1型α2的生成。此外，下调微核糖核酸29a(miR-29a)可降低胶原1型α1和胶原1型α2的表达，因此降低下调微核糖核酸29a的水平或阻断下调微核糖核酸29a的作用可提高鱼鳔细胞中胶原1型α1和胶原1型α2的生成。图3-4显示通过提高上调微核糖核酸21水平和通过使用抑制剂(抗miR29a)阻断下调微核糖核酸29a的作用来提高胶原1型α1(图3)和胶原1型α2(图4)的生成。胶原1型α1和胶原1型α2产量的增加使肉制品的产量增加。类似的策略可用于提高其他类型动物细胞中的相关蛋白质水平。
图5显示用于培养分离细胞的示例性生物反应器30。细胞附着在由食品级支架34提供的固相支架32上并在其上生长，该支架34固定在生物反应器30的无菌室36中。支架34可以决定肉制品的形状。食品级支架34由基于植物或基于真菌的材料制成，例如但不限于琼脂糖、海藻酸钠、壳聚糖、菌丝体和魔芋葡甘聚糖。固相支架32可以是多孔的，以便细胞可以附着支架32的内表面并在其上生长。向细胞提供营养的培养基通过入口38引入生物反应器30，并通过出口40从生物反应器30中排空。
图6所示的生物反应器50类似于图5的生物反应器30，不同的是生物反应器50还包括第二固相52，而第二固相52通过细网54与固相支架32分隔开。第二固相52可包含或支持生物工程细胞，该生物工程细胞会在其原本位置为固相支架32上生长的细胞分泌营养素、生长因子和细胞因子，并可将生物工程细胞与固相支架32上的细胞分离。第二固相52由基于植物的材料制成，类似于固相支架32。营养素、生长因子和细胞因子可渗透网54，细胞则不能渗透网54。图6的生物反应器50允许生物工程细胞与生长细胞共同培养。在某些实施例中，图5和6的生物反应器可以串联布置。在其他实施例中，多个生物反应器30可以与多个生物反应器50或生物反应器30和50的混合串联布置，以扩大规模。生物反应器30可主要用于生物质生产，而生物反应器50则可用于向生长细胞提供营养、生长因子和细胞因子。
本发明的体外细胞培养肉生产方法提供了具有单个细胞类型的简单组织的肉制品。与其他具有多个细胞类型的养殖肉类相比，具有单个细胞类型的肉类产品更容易制造、开发和商业化。本发明的其他实施例提供了具有多个细胞类型的肉制品。此外，申请人发现一种通过改变生长细胞中的微核糖核酸水平或活性来增加生物质/蛋白质生产的方法。例如，两个关键的微核糖核酸(上调微核糖核酸21和下调微核糖核酸29a)被用于提高鱼鳔细胞中的主要蛋白质(胶原蛋白I)的水平。据申请人所知，改变微核糖核酸水平或活性以提高养殖肉制品中蛋白质/生物量产量的做法尚未被其他人用于开发养殖肉制品此领域。与已知的基因敲入或敲除方法相比，将目标放在微核糖核酸以增加蛋白质产量可能会对细胞造成更少的压力。生物工程细胞将会与生长中的动物细胞共同培养，为生长中的鱼类细胞提供用于原位细胞生长和增殖的食物级生长因子和细胞因子，减少或消除培养基中对源自于动物的胎牛血清需求。共同培养技术亦能够简化生产过程和降低生产成本。
此外，养殖肉制品中的营养素可以被定制成更健康的食品。例如，养殖肉制品可根据营养师或个人基因测试的饮食建议来定制。在特定条件下培养细胞可以丰富肉制品中的高密度胆固醇、多不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸等健康营养素。作为替代选择，或与此相互结合，可以通过在特定条件下培养细胞来减少对健康有害的营养素，如低密度胆固醇和饱和脂肪酸。微量营养素，如维生素和矿物质，也可能得到加强。养殖肉制品的营养定制可通过各种方式取得，例如但不限于：1)在细胞培养过程中调整喂给生长细胞的营养，和/或2)控制带有不同细胞的分层支架的比例。
养殖食品的生产是在清洁、无菌和高度控制的过程中进行的。因此，可将食品中的营养素被微生物(如细菌或真菌)降解此类不希望发生的情形被最小化。因分解营养物质而产生的不良味道和气味亦会被最小化。这种特性使养殖食品在烹饪中有新的用途，并有助于创造出新的食谱。养殖食品的一个例子是从鱼鳔中提取的养殖鱼肚。传统鱼肚中的胺由于在生产过程中被细菌降解而产生不良的鱼腥味和气味。这种不受欢迎的特性限制了食物的用途，导致鱼肚只能用于热食或暖食的菜肴。采用细胞培养技术生产的养殖鱼肚没有令人讨厌的鱼腥味和气味。除了热菜外，养殖鱼肚还可以用于甜品或在冷冻或室温下食用的即食菜。
通过体外细胞培养产生细胞水解物
本发明的通过体外细胞培养肉产生的产品可用于生产动物源性原料或植物源性原料。除了人类食用这些衍生原料外，这些原料还可用于各种产品，包括但不限于护肤品、伤口护理、化妆品、食品、补充剂、药物和其他医药应用。与由野生动物或植物产生的原料相比，本发明的通过体外细胞培养肉产生的产品的动物源性原料和/或植物源性原料提供了许多益处。
首先，由于细胞在无污染和无疾病的条件下生长，培养基不含环境污染物(重金属、抗生素、微塑料、除草剂、杀真菌剂、杀虫剂)或外来试剂(细菌、病毒、真菌、传染性海绵状脑病剂)。因此，所产生的动物源性原料或植物源性原料也将无污染和无病害。
其次，可以使用不含动物成分和化学成分确定的培养基来减少引发使用者过敏反应的机会。这是通过使用重组生长因子代替培养基中的动物血清和动物源性生长因子(例如牛胰岛素)来实现的。在化学成分确定的培养基中不需要植物提取物/水解物。
第三，可以显着提高动物源性原料或植物源性原料的批次间一致性。这是因为基础培养基的营养成分(碳水化合物、氨基酸、维生素、矿物质)是已知且一致的，并且可以使用化学成分确定的培养基(即所有营养物质和生长因子浓度已知的培养基)进一步精制。
第四，增强可追溯性。由于每个培养基成分的供应链都是已知的，因此一切都可以轻松追溯到原始来源。
第五，减少动物的痛苦和牺牲。执行生产过程不需要不断供应来自野生动物的动物组织。最初，起始细胞是从一小块动物组织中纯化出来的，并发育成细胞系，可以在培养基中冷冻保存和无限期繁殖。这减少了动物的痛苦和牺牲。
第六，减少浪费，提高效率。培养基中的营养物质直接提供给细胞进行细胞生长。每个培养的细胞都被裂解以产生细胞水解物。当中不涉及生长不予使用的动植物部分或动物交配和运动等生命过程，因此不会浪费能量和营养。
此外，本发明为各种行业/产品的消费者或制造商创造了价值，包括但不限于护肤品、伤口护理、化妆品、食品、补充剂、药物和其他医药应用，因为它解决了在背景部分中提到的常规方法中遇到的所有缺点。本发明提供以下益处：
首先，它不依赖于动物源的连续饲料。例如，为了通过传统方法生产更多的基于胶原蛋白的乳霜，需要更多的动物身体部位，这可能导致更多的动物痛苦或牺牲。在本发明中，起始细胞(不限于干细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、脂肪细胞)从一小块动物组织中纯化并建立成细胞系。细胞系可以冷冻保存并储存在液氮中。需要时，可以将细胞系解冻并在细胞培养条件下无限增殖以产生活性成分(例如生长因子、ECM分子)。因此，整个过程是自给自足的，几乎不会造成动物的痛苦/牺牲。
第二，它不依赖于动物来源。在本发明中，起始细胞(不限于干细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、脂肪细胞)从一小块动物组织中纯化并建立成细胞系。该细胞系没有经过基因改造。
第三，本发明的衍生原料是多功能的，因为它除了关键的目标蛋白外还含有许多微量的功能性蛋白。这种微量的功能性蛋白质对于许多细胞功能可能是必不可少的。由具有与野生动物/植物的提取部分的功能性蛋白质谱更接近的衍生原料制成的产品通常比由功能性蛋白质谱不太完整的衍生原料制成的产品具有更好的性能。尽管可以通过外部补充将功能性蛋白添加到衍生原料中，很难补充大量的功能性蛋白。此外，成本随着添加次数的增加而提高。
第四，由本发明产生的功能性蛋白质不含废物，因为生长培养基中的成分受到良好控制。
第五，本发明产生的衍生原料不含有害化学物质，因为功能性蛋白不是使用有害化学物质提取的。生长培养基中的成分控制得很好。
第六，本发明产生的功能性蛋白不含废物和有害化学物质，因此无需进一步分离纯化。因此，生产成本可以更低。
本发明的益处允许创造满足消费者需求的新价值。它为各种产品的活性成分或产品本身(包括但不限于护肤品、伤口护理、化妆品、食品、补充剂、药物和其他药用应用)提供以下特性：
(1)清洁标签:由于衍生原料纯度高，不含废物或有害化学物质；
(2)可持续性:由于对动物和/或植物来源的依赖很少或很低而导致；
(3)非化学合成:由于使用生物材料；
(4)多功能:因为它具有完整的分子谱，其中所有功能蛋白均由受试细胞自然产生；
(5)有科学原理和测试结果的支持。
现在参考附图，并具体参考图7。本发明提供一种从体外细胞培养物生产细胞水解物的方法。在细胞生长步骤100中，细胞首先在受控条件下使用部分确定的培养基(即补充有FBS/植物水解物/人血小板裂解物的确定的基础培养基)或化学确定的培养基(即具有确定浓度的所有营养物质和生长因子)，当中不含动物或植物成分。在一些实施例中，将细胞以4x104个细胞/cm2接种在生长培养基(DMEM/F12+10％FBS)中并保持在加湿培养箱内(34℃；5％CO2，95％空气)。在一些实施例中，使用本发明的体外细胞培养肉生产方法10培养细胞。在又一些实施方案中，至少一种细胞系可用于细胞生长步骤100。在一些实施例中，细胞系包括干细胞、肌肉细胞、成纤维细胞和脂肪细胞。在另一个具体实施例中，培养的鱼鳔细胞用于细胞生长步骤100。
一旦细胞汇合达到至少90％，分离步骤102开始。在分离步骤102中，使用胰蛋白酶/EDTA或任何其他重组蛋白酶(例如重组胶原酶IV、TrypLe Express)将细胞从其粘附表面分离。在一些实施例中，在达到90％汇合时，去除生长培养基。细胞用PBS洗涤一次，并通过在CO2培养箱内用胰蛋白酶/EDTA进行分离处理。细胞脱落后，通过添加生长培养基停止胰蛋白酶活性。将细胞悬浮液收集到50mL管中。
从分离步骤102获得的混合物然后在离心步骤104中以400x g离心5分钟。去除上清液。将细胞沉淀重新悬浮在基础培养基(例如DMEM/F12)中。将剩余的细胞悬液转移到预先称重的50mL试管中。将细胞以400x g离心5分钟。然后除去上清液。管再次被称重。记录细胞数量和细胞团块的质量。在一些的实施例中，使用Countess II自动细胞计数器确定细胞浓度，并且接种一部分细胞用于制备下一批细胞水解物。
在离心后，获得细胞沉淀并且可以储存在-80℃。
在重悬浮步骤106中，将细胞沉淀悬浮在PBS中。在一些实施例中，细胞沉淀悬浮在1mL PBS中。
在裂解步骤108中，来自步骤106的细胞通过超声裂解。在一些实施例中，通过使用Branson Digital Sonifier S450D对细胞悬浮液进行超声处理来裂解细胞(振幅＝25％；15秒开，15秒关，总共＝10个循环)。将管放在冰上(即在0℃左右进行超声处理)。
在通过超声处理细胞裂解之后，将可溶部分从细胞碎片中分离出来。在消化步骤110中，可溶性部分中的蛋白质被酶消化成短功能肽。在37℃下将所需的所选蛋白酶添加到可溶性部分中1-2小时。在一些实施例中，蛋白酶是蛋白酶K。短肽(即具有小于500道尔顿(Da)的分子大小)更可取，因为具有大于500道尔顿(Da)的分子大小的分子不能有效地穿透最外层表皮和被下面的皮肤层吸收。在一些实施例中，将适量的蛋白酶添加到细胞悬浮液中以将细胞蛋白分解成更小的肽。消化1-2小时，并将试管置于37℃水浴中。每10分钟旋转一次试管。
在消化步骤110之后，来自消化步骤110的混合物然后在第二离心步骤112中以20000x g离心30分钟。在一些实施例中，将内容物转移到1.5mL微量离心管中。将来自微量离心管的上清液合并到50mL管中。避免干扰微量离心管中的沉淀物。
在终止步骤114中，将上清液加热至95℃持续15分钟以停止酶消化活性。或者，将PBS添加到上清液中以通过稀释停止酶消化活性。在一些实施例中，稀释度应该是100倍。
在过滤步骤116中，来自终止步骤114的混合物中的水解产物通过0.2μm PVDF膜过滤器进行无菌过滤。
在最后的步骤118中，从过滤步骤116获得的水解产物可以用作护肤品、化妆品和伤口护理产品的外用剂。水解产物还可用作各种产品中的活性成分，包括但不限于护肤品、伤口护理、化妆品、食品、补充剂、药物和其他医药应用。如果不立即使用水解产物，在一些实施例中，将其储存在-20℃。
培养细胞的水解产物营养丰富，含有多种刺激皮肤细胞修复和再生的蛋白质因子，分子大小小于500道尔顿(Da)。本发明的水解产物可以到达深层皮肤层(真皮、皮下组织)并发挥作用，因为本发明的水解产物小到足以穿过角质层，并且还保留了生长因子和细胞因子的关键蛋白结构域以引发他们的功能活动。
进一步测试水解产物对人皮肤细胞的功效。
现在参考附图，并具体参考图8。本发明提供一种评估细胞水解物对人体皮肤细胞作用的方法。
在接种步骤200中，将人细胞接种在完全生长培养基中。在一些实施例中，人角质形成细胞系(HaCaT细胞)或人包皮成纤维细胞系(BJ细胞)可用于此目的。将细胞接种到完全培养基(例如DMEM/F12+10％FBS)中的24孔/96孔板上，以便它们在第二天达到80-90％的汇合度。
在接种步骤200之后的至少一天，在水解物添加步骤202中将细胞水解物添加到人细胞中。当人细胞达到至少80％汇合时，执行该步骤202。优选地，当人细胞达到至少90％汇合时执行该步骤202。在一些实施方案中，使用完全培养基或无血清培养基(例如DMEM/F12)将细胞水解物稀释至0.1％至10％、优选1％的所需浓度。在另一些实施例中，孔中的旧培养基被对照培养基(即载体对照)或含有稀释的细胞水解物的培养基代替。
在步骤202之后，在孵育步骤中将细胞放回到加湿的孵育器中6-24小时。在一些实施例中，将细胞放回加湿培养箱(37℃；5％CO2，95％空气)6-24小时，优选18小时。
然后，从细胞中收获总RNA以使用RT-PCR研究目标基因的表达。或者，可以通过CyQUANT细胞增殖测定(Thermofisher Scientific)研究经水解产物处理后的细胞增殖。
评估目标基因的表达
执行以下步骤以评估来自皮肤细胞的目标基因的表达。
在总RNA提取步骤206中，执行以下次步骤：
1.在转染后6-24小时，使用PureLink RNA Mini Kit(Thermofisher Scientific)根据制造商的操作说明从细胞单层中提取所有RNA。
2.去除孔中的培养基。用PBS清洗细胞一次并取出PBS。
3.向孔中加入300μL含有1％2-巯基乙醇的裂解缓冲液。通过上下吹打10次来裂解细胞。
4.将裂解液转移到干净的1.5mL微量离心管中。以最大速度涡旋管1分钟。
5.以2600x g离心管5分钟。收集上清液并转移到干净的1.5mL微量离心管中。
6.在每份细胞裂解液中加入1份70％乙醇。涡旋混合物并将其转移到离心柱(带有收集管)中。
7.在室温下以12,000x g离心15秒。丢弃流出液。将离心柱重新插入同一收集管中。
8.将350μL洗涤缓冲液I添加到离心柱中。在室温下以12,000x g离心15秒。丢弃流出液和收集管。将离心柱放入新的收集管中。
9.使用PurelinkDNase通过柱上DNase处理去除基因组DNA污染。如下表1所示制备DNase混合物。向柱膜中加入80μL DNase混合物，室温孵育15分钟。
表1
10.将350μL洗涤缓冲液I添加到离心柱中。在室温下以12,000x g离心15秒。丢弃流出液和收集管。将离心柱放入新的收集管中。
11.提前制备洗涤缓冲液II，每15mL洗涤缓冲液II加入60mL分子生物学级的100％乙醇。将500μL含有乙醇的洗涤缓冲液II添加到Spin Cartridge中。
12.在室温下以12,000x g离心15秒。丢弃流出液。将离心柱重新插入同一收集管中。
13.重复次步骤9-10一次。
14.在室温下以12,000x g离心2分钟，以干燥附着有RNA的膜。丢弃收集管并将离心柱放入回收管中。
15.将30μL无核糖核酸酶水加入离心柱膜的中心。等待2分钟。在室温下以12,000xg离心2分钟以收集RNA洗脱液。
16.用Nanodrop 2000定量RNA浓度。如果纯化的RNA质量好，它的A260/A280和A260/A230比值应大于1.8。此外，当使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent)进行分析时，其RNA完整性数(RIN)应>＝7(完整RNA的RIN＝10)。
17.将RNA保持在冰上，直到进行第一链cDNA合成。
完成步骤206后，进行第一链cDNA合成步骤208，其包括以下次步骤：
1.以制造商操作说明所述类似的形式，使用MMLVRT(RNase H-)酶(Excell Bio)从总RNA合成第一链cDNA。
2.对于每个逆转录反应，在冰上的PCR管中混合总RNA、寡核苷酸(dT)20引物和无核糖核酸酶水，如表2所示。
表2
3.(可选)设置一个样品的额外反应作为无RT对照。这可用于在定量实时PCR后检测基因组DNA污染。
4.将反应混合物在70℃加热10分钟。同时，如表3所示设置RT主混合物和无RT对照混合物。记住要准备至少1个额外的RT主混合物反应以弥补移液错误。
表3
5.加热10分钟后，将样品反应管在冰上冷却2分钟。使用桌上离心机进行快速旋转，将试管内容物收集到试管底部。
6.在每个样品中加入10μL RT主混合物，在无RT对照中加入10μL无RT对照混合物。
7.将反应管在50℃下孵育1小时进行逆转录。将反应管在70℃下孵育15分钟以灭活MMLVRT(RNase H-)酶，然后将反应管置于冰上冷却。
8.加入180μL高压灭菌MQ水(10倍稀释)稀释cDNA样品。将稀释的cDNA样品储存在-20℃。
最后，执行RT-PCR步骤210。它包括以下次步骤：
1.使用Roche LightCycler 480 System(Roche Diagnostics)通过定量实时PCR(qPCR)对样品之间的相对目标基因表达进行定量。使用PowerUp SYBr Green Mastermix(Thermofisher Scientific)中的试剂和特定于目标基因的引物设置PCR反应混合物。混合物的成分如表4所示。
表4
表5列出要测试的基因的例子：
表5
2.将5μL cDNA添加到20μL高压灭菌的MQ水中，对参考cDNA样品进行5倍连续稀释(51到55连续稀释)。使用六个标准(50、51、52、53、54、55倍稀释度)以确定qPCR中的标准曲线。参考cDNA样品可以是未稀释的20μL cDNA样品。
3.在实验记录表上写下添加到qPCR板的每个孔中的内容。
4.在LightCycler Multiwell plate 96(Roche)的每孔中加入12μL PCR反应预混液。避免引入气泡。
5.根据实验记录表，在每个孔中加入8μL稀释的cDNA样品、标准品或MQ水(PCR阴性对照)。避免引入气泡。
6.用LightCycler多孔板96包(Roche)中提供的密封箔覆盖qPCR板。确保所有孔都被密封箔紧紧密封，以防止其在qPCR过程中蒸发。
7.通过在Beckman Coulter Allegra 25R离心机(Beckman Coulter LifeSciences)中以200x g离心将孔内容物收集到孔底部。
8.将qPCR板放入Roche LightCycler 480。设置PCR条件如下：
(i)UDG激活
50℃2分钟(升温速率4.4℃/秒)
1个循环
(ii)初始变性
95℃2分钟(升温速率4.4℃/秒)
1个循环
(iii)聚合酶链反应
分析模式：量化
95℃15秒(升温速率4.4℃/秒)
55℃15秒(升温速率2.2℃/秒)
72℃30秒(升温速率4.4℃/sec,采集模式:单次)
40个循环
(iv)熔解曲线分析
分析模式：熔化曲线
95℃20秒(升温速率4.4℃/秒)
55℃1分钟(升温速率2.2℃/秒)
95℃(升温速率0.11℃/秒,采集模式:连续,采集:5/℃)
1个循环
(v)冷却
4℃∞(升温速率2.2℃/秒)
1个循环
9.开始qPCR运行。
10.qPCR运行完成后，取出qPCR板。通过以下标准验证qPCR运行的有效性：
(i)扩增效率为90-105％，
(ii)标准曲线的决定系数(R2)>0.99，
(iii)熔解曲线分析中存在单峰，
(iv)PCR产物经凝胶电泳后应产生一条正确扩增子大小的条带。
11.记录扩增效率。相对基因目标表达通过管家基因(即Gapdh)的表达进行正规化，
并且可以通过Pfaffl方法计算，如下图所示：
其中:
Ct(A)＝样本A中目标基因的Ct值；
Ct(B)＝样本B中目标基因的Ct值；
Ct(a)＝样本A中Gapdh的Ct值；
Ct(b)＝样本B中Gapdh的Ct值。
通过CyQUANT细胞增殖测定法进行的细胞增殖评估
进行以下步骤以通过CyQUANT细胞增殖测定法评估水解产物处理后的细胞增殖。
在去除步骤212中，执行以下次步骤：
1.CyQUANT Cell Proliferation Assay(Thermofisher Scientific)可用于通过间接测量核酸含量来确定细胞生长。细胞应接种到96孔板上。细胞处理16-24小时后，尽可能去除培养基。
2.在-70℃冷冻板。该板可在-70℃下储存长达4周。
在完成步骤212后，执行CyQUANT步骤214，其包括以下次步骤：
1.CyQUANT Cell Proliferation Assay(Thermofisher Scientific)可用于通过间接测量核酸含量来确定细胞生长。细胞应接种到96孔板上。细胞处理16-24小时后，尽可能去除培养基。
2.在-70℃冷冻板。该板可在-70℃下储存长达4周。
在完成步骤212后，执行CyQUANT步骤214，其包括以下次步骤：
1.在室温下解冻检测试剂盒组件。如表6所示准备CyQUANT GR工作溶液。通过移液器将其混合。
表6
2.在室温下解冻板。
3.在每个样品孔中加入200μL CyQUANT GR工作溶液，在空白孔中加入200μL(无细胞对照)。孵育5分钟。
4.在荧光酶标仪(例如Molecular Devices SpectraMax iD5)中读取板。
将激发滤光片设置为480nm，将发射滤光片设置为520nm。
5.用无细胞对照读数减去所有样品荧光读数。将结果制成表格。
参考图9，该图表说明了用细胞水解物处理的皮肤细胞和未用细胞水解物处理的皮肤细胞之间皮肤细胞层粘连蛋白表达的差异。用细胞水解物处理的皮肤细胞的层粘连蛋白表达约为140％，而未用细胞水解物处理的皮肤细胞的层粘连蛋白表达约为100％。
上述描述是说明性的而非限制性的。在阅读本发明的披露后，本领域技术人员可以清楚地看到本发明的实施例的许多变化。因此，实施例的范围不应根据上述描述来确定，而应参考待审的权利要求及其全部范围或等效范围来确定。
任何实施例的一个或多个特征可以与任何其他实施例的一个或多个特征相结合，而不脱离实施例的范围。除非有明确相反的指示，否则“一个(a)”、“一个(an)”或“这(the)”的意思是“一个或多个”。除非另有明确相反的指示，否则“和/或”旨在代表该术语最具包容性的含义。
虽然本发明可以以多种不同的形式体现，但应理解所提供的附图和讨论为本发明是一项或多项发明的原理的示例，并不旨在将任何一个实施例限制为所示的实施例。
因此，在其更广泛的方面,本发明的披露不限于上述所示和所述的具体细节、代表性系统和方法以及说明性示例。在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以对上述披露进行各种修改和变更，并且本发明旨在涵盖所有此类修改和变更，前提是它们落入权利要求及其等效物的范围。
示例性操作程序
A.鱼鳔细胞系的开发
1.从当地鱼市购买健康的黄鱼、鲈鱼或类似类别的鱼。
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
4.在无菌条件下从鱼身上取出鱼鳔。
5.用次氯酸清洗器官一次或多次。
6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗器官一次或多次。
7.清洗后，将器官切成小块(2-3立方毫米)。
8.将切成小块的器官转移到含有0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。
9.在室温下连续振荡孵育1小时。
10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。
11.将滤液以200克离心5分钟。
12.用完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)重悬细胞沉淀物。
13.将细胞接种到T25培养瓶中。
14.在24至28℃下孵育。
15.第二天去除未附上在组织培养瓶上的细胞。
16.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基。
17.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
B.以组织外植体开发鱼鳔细胞系
1.从当地鱼市购买健康的黄鱼、鲈鱼或类似类别的鱼。
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
4.在无菌条件下从鱼身上取出鱼鳔。
5.用次氯酸清洗器官一次或多次。
6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗器官一次或多次。
7.清洗后，将器官切成小块(1-2立方毫米)。
8.将器官碎片分别放入含有完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)的24孔板中。
9.在24至28℃下孵育。
10.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基，不要干扰组织外植体。
11.孵育组织外植体，直至观察到贴壁细胞。
12.取出组织外植体。
13.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
C.以组织外植体开发鱼肌肉细胞系
1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或类似类别的鱼。
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。
5.用次氯酸清洗组织一次或多次。
6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗组织一次或多次。
7.清洗后，将组织切成小块(2-3立方毫米)
8.将切成小块的组织转移到含有胶原酶和散酶的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。
9.在室温下连续振荡孵育1小时。
10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。
11.将滤液以200克离心5分钟。
12.用完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)重悬细胞沉淀物。
13.将细胞接种到T25培养瓶中。
14.在24至28℃下孵育。
15.第二天去除未附上在组织培养瓶上的细胞。
16.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基。
17.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
D.从组织外植体开发鱼肌肉细胞系
1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或类似类别的鱼。
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。
5.用次氯酸清洗组织一次或多次。
6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗组织一次或多次。
7.清洗后，将肌肉切成小块(1-2立方毫米)。
8.将肌肉块分别放入含有完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)的24孔板中。
9.在24至28℃下孵育。
10.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基，不要干扰组织外植体。
11.孵育组织外植体，直至观察到贴壁细胞。
12.取出组织外植体。
13.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
E.成体干细胞分离和培养
1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或6个月或更小的类似类别的鱼。
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。
5.用次氯酸清洗组织一次或多次。
6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗组织一次或多次。
7.清洗后，将组织切成小块(2-3立方毫米)。
8.将切成小块的组织转移到含有胶原酶和散酶的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。
9.在室温下连续振荡孵育1小时。
10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。
11.将滤液以200克离心5分钟。
12.用完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清、100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)重悬细胞沉淀。
13.在24至28℃下将细胞铺板在未有涂层的板上1小时。
14.收集上清液并置于涂有粘连蛋白、明胶、基质胶或类似基质的板上。
15.在24至28℃下孵育。
16.24小时后，洗去任何松散附着和未附上的细胞。
17.每天用完全培养基更换培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清、100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)。
F.生成和培养诱导性多能干细胞
1.转染前2至4天，将细胞置于放有完整培养基(含10％胎牛血清的L15)的组织培养瓶中。转染当天(第0天)，细胞应约75至90％汇合。
2.从涂有明胶的6孔板中吸取培养基，并在每孔更换2毫升新鲜完整培养基。将有涂层的板放置在37℃下，直到可以使用为止。
3.置于37℃下解冻Epi5TM载体，将其放置在湿冰上直到可以使用为止。使用前，对解冻的载体进行短暂离心，将其收集在试管底部。
4.在磷酸盐缓冲生理盐水中清洗细胞。
5.在含有细胞的培养瓶中添加3毫升0.05％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸。
6.在室温下放置培养瓶3分钟。
7.在每个培养瓶添加5至8毫升完整培养基。小心地将细胞转移到一个空的、无菌的15毫升锥形管中。
8.用台盼蓝染料排斥细胞活性测定法检查活性。
9.离心200克细胞2分钟。
10.小心吸取大部分上清液，用完整培养基重新悬浮。
11.将涂有明胶的培养皿上的细胞接种到6孔培养皿中，每孔培养50000至100000个细胞，在2毫升完整培养基中以30至60％的汇合度，并在24至28℃下培养过夜。
12.预热Opti-MEM/减血清培养基至室温，并按如下所述制备试管A和试管B。
13.在标记为试管A的1.5毫升微型离心管中,分别将1.2微升的两个Epi5TM重新编程矢量混合物(总计2.4微升)添加到118微升的Opti-MEM培养基中。添加4.8微升的P3000TM试剂并充分混合。
14.在标记为试管b含有预先加热121L的Opti MEM培养基的1.5毫升微型离心管中,稀释3.6微升的Lipofectamine 3000试剂。
15.为了制备转染主混合物，将试管A的内容物添加到试管B中，并充分混合。
16.将转染主混合物在室温下培养5分钟。
17.再混合一次，将250微升的转染主混合物加入到向每个孔中。
18.在24-28℃下培养过夜。
19.转染后24小时，从平板中吸取培养基。向每个孔中添加2毫升N2B27培养基(含有IX N-2补充剂，IX B27补充剂，100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子重组蛋白的L15)。
20.每天以2毫升N2B27培养基更换旧培养基的方式更换N2B27培养基，共14天。
21.第14天吸取用过的N2B27培养基，更换为完整培养基。随后每天在每个孔中更换2毫升的培养基。
22.每隔一天在显微镜下观察培养板是否出现表明细胞已转化的细胞团。在转染后15至21天内，诱导性多能干细胞菌落将生长到合适的大小以进行转移。
23.菌落在第21天是不同的，可以挑选出来进行进一步的培养和扩展。
G.细胞继代培养方法
1.取出并丢弃培养基。
2.用磷酸盐缓冲生理盐水简短地冲洗细胞，去除所有含有胰蛋白酶抑制剂的微量血清。
3.向培养瓶添加2至3毫0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液。
4.在室温下培养1分钟。
5.加入5至8毫升完整生长培养基。
6.轻轻移液吸取细胞。
7.以1比2至1比3的继代培养比率将适当等分的细胞悬浮液添加到新的培养瓶中。
8.在24至28℃下培养。
H.悬浮培养适应性
1.以适合所述细胞的频率通过胰蛋白酶传代单层培养。
2.每次传代时，用磷酸盐缓冲生理盐水清洗细胞单层，并用0.25％胰蛋白酶覆盖。
3.室温孵育5分钟。
4.用完全培养基灭活酶。
5.收获细胞悬液，用台盼蓝染料排斥细胞活力测定法检测细胞活力。
6.将细胞悬浮液接种到另一个培养瓶中。
7.重复传代，直至悬浮细胞活力等于或大于90％。
8.在细胞密度为每毫升0.1至0.5百万的旋转瓶或摇瓶中，用50毫升完整培养基建立悬浮培养基。
9.在二氧化碳培养箱中，在最适合单层培养的相同温度、湿度和大气条件下，培养旋转瓶或摇瓶悬浮培养物。
10.每隔2至3天用新鲜培养基将细胞密度调节到每毫升0.1至0.5百万。
11.通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
12.于可促进健康细胞生长的细胞密度下建立多个平行培养物。
13.使用部分培养物将细胞密度逐渐增加至每毫升100万。
14.如果细胞密度增加导致细胞死亡，则丢弃高密度培养物。
15.从步骤12重新启动细胞高密度培养的适应。
16.当细胞适应悬浮生长时，使用3L生物反应器扩大培养。
I.适应无血清培养基(植物水解液)
1.在DMEM/F12完全培养基(1:1DMEM培养基和Ham's F12培养基，2至4mM谷氨酰胺，10％胎牛血清)中培养细胞。
2.制备无血清培养基(1:1DMEM培养基和Ham's F12培养基，2至4mM谷氨酰胺，20％植物水解物例如大豆、棉籽、油菜、小麦、酵母或等效物)。
3.当细胞达到汇合时，用适应培养基I(40％新鲜完整培养基，40％前代条件培养基，20％无血清培养基)代替培养基。
4.每2至3天用台盼蓝染料排斥细胞活性测定法检查活性。
5.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤3。
6.当细胞达到汇合时，用适应培养基II(30％新鲜完整培养基，30％步骤1中细胞的条件培养基，40％无血清培养基)替换培养基。
7.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
8.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤6。
9.当细胞达到汇合时，用适应培养基III(20％新鲜完整培养基，20％步骤1中细胞的条件培养基，60％无血清培养基)替换培养基。
10.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
11.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤9。
12.当细胞达到汇合时，用适应培养基IV(10％新鲜完整培养基，10％步骤1中细胞的条件培养基，80％无血清培养基)替换培养基。
13.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
14.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤12。
15.当细胞汇合时，用无血清培养基代替培养基。
16.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
17.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤15。
18.无血清培养基的使用量可在每一步骤中逐步增加，即每一步骤增加20％或更少。
J.适应无血清培养基(化学定义)
1.在DMEM/F12完全培养基中培养细胞(1:1DMEM培养基和Ham'sF12培养基，2至4mM谷氨酰胺，10％胎牛血清)。
2.制备无血清培养基(1:1DMEM培养基和Ham's F12培养基，2至4mM谷氨酰胺，65-130ug/mL抗坏血酸2-磷酸，550-1100ug/mL碳酸氢钠锭，14-28ng/mL亚硒酸钠，19-38ug/mL胰岛素，11-22ug/mL转铁蛋白，100-200ng/mL成纤维细胞生长因子，2-4ng/mL乙型转化生长因子)。
3.当细胞达到汇合时，用适应培养基I(40％新鲜完全培养基、40％前传代条件培养基、20％无血清培养基)更换培养基。
4.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
5.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤3。
6.当细胞达到汇合时，用适应培养基II(30％新鲜完全培养基、30％步骤1中细胞的条件培养基、40％无血清培养基)更换培养基
7.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
8.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤6。
9.当细胞达到汇合时，用适应培养基III(30％新鲜完全培养基、30％步骤1中细胞的条件培养基、40％无血清培养基)更换培养基。
10.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
11.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤9。
12.当细胞达到汇合时，用适应培养基IV(10％新鲜完全培养基、10％步骤1中细胞的条件培养基、80％无血清培养基)更换培养基。
13.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
14.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤12。
15.当细胞达到汇合时，用无血清培养基更换培养基。
16.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
17.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤15。
18.无血清培养基的用量可在每一步骤逐渐增加。例如，每一步骤增加20％或更少。
K.增强转录后蛋白质表达
1.在完全培养基(Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM与200IU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％胎牛血清)或无血清培养基(DMEM/F12包含植物水解物或化学定义的化合物)中培养细胞。
2.移除并丢弃培养基。
3.使用PBS短暂地冲洗细胞以去除所有含有胰蛋白酶抑制剂的血清。
4.将2-3mL的0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液添加到培养瓶中。
5.在室温下孵育1分钟。
6.通过轻轻移液吸出细胞。
7.以200g离心细胞2分钟。
8.在完全培养基或无血清培养基中重悬细胞。
9.向6孔板的每个孔中加入50万个细胞。
10.在24-28℃下孵育过夜。
11.使用聚乙烯亚胺、脂质体、电穿孔法将微RNA寡核苷酸(miR-21、miR-29a、miR-21模拟物、miR-29a模拟物、抗miR-21、抗miR-29a或等效物)转染到细胞中，或其他方法。
12.在24-28℃下孵育过夜。
13.在相同的温度、湿度和大气的最佳培养条件下，将细胞转移至多层培养瓶、转瓶或摇瓶中的CO2培养箱中。
L.细胞培养支架(魔芋+树胶)
1.用几片藏红花烧开水，直至颜色变成淡黄色。
2.取出藏红花，将溶液静置至温热。
3.准备所有干料
a.魔芋–1至3％
b.泡打粉–0.7至1.4％
c.刺槐豆胶–0.5-1％
d.完善的黄原胶–0.5至1％
4.量取100毫升藏红花溶液。
5.依次加入泡打粉、刺槐豆胶、黄原胶。加入每种成分后，充分搅拌混合物。
6.将魔芋一点一点洒在溶液上。继续搅拌。溶液应该变得糊状。
7.将魔芋混合物铺在模具中，厚度约为1至15毫米。
8.盖上模具，在室温下静置30分钟以上。
9.将模具放入4℃冰箱4小时。
10.将模具用小火蒸40分钟。
11.将模具在室温下静置2小时。
12.将支架在45至55℃下脱水15分钟。
M.细胞培养支架(藻酸盐+糯米粉)
1.称取1克(1％)海藻酸钠。
2.在搅拌机中加入100毫升水。
3.将海藻酸盐粉末加入搅拌机，搅拌至溶解。
4.用塑料薄膜盖住容器，将藻酸盐溶液放入冰箱过夜，以消除气泡。
5.称取10克(10％)的糯米粉，放入模具中。
6.将海藻酸盐溶液加入模具中，约1至15毫米厚。
7.搅拌混合物直至所有粉末溶解。
8.用小火蒸30分钟直至定型。
9.盖上模具，在室温下静置30分钟。
10.称取1％的乳酸钙，搅拌溶解在水中。
11.将支架浸入1％的乳酸钙溶液中至少2.5小时，以便在支架周围形成膜。
Claims (5)
1.一种通过体外细胞培养产生细胞水解物的方法，包括以下步骤：
(i)通过使用超声来裂解细胞以从所述细胞中释放蛋白；
(ii)通过使用蛋白酶消化所述蛋白以产生分子大小小于500道尔顿(Da)的短肽；
(iii)通过将蛋白酶加热至预定温度并于预定时间期间持续加热或将蛋白酶稀释至预定浓度来终止消化步骤；和
(iv)通过膜过滤器对从消化终止步骤获得的混合物进行无菌过滤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜过滤器是0.2μm PVDF膜过滤器。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化终止步骤的预定温度和预定时间分别为95℃和15分钟。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定浓度为100倍，并且所述蛋白酶以PBS稀释。
5.一种包含由权利要求1的方法产生的细胞水解物的外用制剂。
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