CN110201000A - 一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的制备方法及其应用 - Google Patents

一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉，方格星虫具有免疫调节、抗菌、抗炎和外周镇痛等功效；对创伤部位止血，然后具有抗菌消炎的作用；机体摄入方格星虫酶解蛋白肽粉，诱导产生蛋白肽Pro‑Hyp，影响成纤维细胞生长，从而促进伤口部位胶原合成，促进伤口愈合，预防异常瘢痕形成。在此过程中也具有促进内皮细胞和角质形成细胞的增殖和迁移作用，进而促进血管生成，为创口提供营养物质和氧气，促进表皮再上皮化，快速形成封闭空间，防止感染。

Description

一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的制备 方法及其应用
技术领域
本发明涉及水产品加工与利用和医药领域，更具体地，涉及一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的制备方法及其应用。
背景技术
从古至今，伤口愈合一直都是人类所会面临的问题，在皮肤遭受创伤后，会造成血管破裂，血液流出，同时组织碎片、环境污染物和微生物等入侵，造成局部炎症。轻度感染会引起愈合延迟，愈合后易于形成异常瘢痕和瘢痕瘤；而严重的感染甚至会引起毒血症和败血症等，进而危及人的性命。如果皮肤遭受创伤后能快速止血，则可以减少血液流失，减少感染的机会；若加速再上皮化，封闭表皮，有助于减少感染，让体内维持比较稳定的环境；加速血管生成有助于为创口提供氧气和营养物质，保障愈合顺利进行；同时加速胶原蛋白合成有助于细胞外基质(ECM)和肉芽组织快速形成、胶原沉积进而促进组织重塑，有助于预防异常瘢痕形成。
现在市面上促进伤口愈合药物和保健品都是根据伤口愈合的四个时期来设计，有些有止血功效，有些有抗炎功效，有些可以促进胶原蛋白合成等功效，但只有伤口愈合过程中一个或者两个时期的功效，不能同时兼顾多个时期并共同发挥作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有促进创伤愈合作用同时能够兼顾多时期发挥作用的方格星虫酶解蛋白肽粉制备方法。
本发明提供了一种方格星虫酶解蛋白肽粉，由蛋白质、总糖、无机质和水组成，按重量百分比，其蛋白质的含量为70％-80％，总糖的含量为8％-10％，无机质的含量为1％-1.5％，水分的含量为7％-10％；其蛋白质的分子量大于2.5KD的肽占18％-22％，蛋白质的分子量小于2.5KD的肽占78％-82％。
优选的，一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉制备方法，包
括制备方法包括：
原料处理：去除方格星虫的内脏及其体腔液，并清洗干净的方格星虫；
匀浆处理：将所述方格星虫进行加水绞碎形成匀浆液；
酶解处理：向所述匀浆液中加入复合蛋白酶形成酶解液，其中，所述酶解液在50℃条件下，酶解4.5-5.5h；然后将酶解液升温到100℃条件下，进行灭酶，时间为15min，再对酶解后的匀浆液进行冷却；
离心处理：将所述冷却后的酶解液置于离心机内离心处理，离心机转速为8000转/分钟，离心时间为20min，然后收集离心后的酶解液的上清液；
干燥处理：将所述上清液进行真空浓缩后，再进行冷冻干燥，从而得到方格星虫酶解蛋白肽粉。
优选的，所述复合蛋白酶包括动物蛋白酶和风味蛋白酶；动物蛋白酶和风味蛋白酶的添加量均为2000U/g-3000U/g。
优选的，还包括超滤处理，将所述上清液进行超滤，收集蛋白质的分子量为3000～1000Da组分形成超滤组份，再将超滤组份进行干燥处理。
优选的，所述上清液在50℃条件下，旋转蒸发，浓缩液体体积到1/5以后，再进行干燥处理。
优选的，在酶解处理中，将酶解液置于50℃恒温摇床上，采用100rpm的速度，旋转酶解5h。
优选的，还包括补水处理，向所述绞碎后的匀浆液进行补水至料液比为1：3，再将所述补水后的匀浆液通过加入0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的HCl，将匀浆液的调节pH至7.0后，再进行酶解处理。
优选的，将所述超滤组份在65℃，气压-0.085MPa条件下进行真空干燥，然后粉碎，过80目筛，得到方格星虫酶解蛋白肽粉。
优选的，所述的一种方格星虫酶解蛋白肽粉在制备促进皮肤创伤愈合药物中的应用。
优选的，将所述具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉和水按料液比1:2-1:5加入蒸馏水配成促进创伤愈合膏。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种方格星虫酶解蛋白肽粉，方格星虫具有免疫调节、抗菌、抗炎和外周镇痛等功效；方格星虫酶解蛋白肽粉对创伤部位止血，同时方格星虫酶解蛋白肽粉具有抗菌消炎的作用；机体摄入方格星虫酶解蛋白肽粉，诱导产生蛋白肽Pro-Hyp，影响成纤维细胞生长，还可以促进伤口部位胶原合成，进而促进伤口愈合，预防异常瘢痕形成。在此过程中也具有促进内皮细胞和角质形成细胞的增殖和迁移作用，进而促进血管生成为创口提供营养物质和氧气和促进表皮再上皮化，快速形成封闭空间，防止感染。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1为本发明的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的动物创伤模型分析的空白对照组的分析图；
图2为本发明的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的动物创伤模型分析的给药组的分析图；
图3为本发明的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉为给药后对伤口愈合的影响的分析图；
图4为本发明的一种方格星虫酶解蛋白肽粉给药7天后羟脯氨酸含量的分析图；
图5为本发明的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的止血能力分析图；
图6为本发明的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的促进HUVEC细胞增殖的分析图；
图7为本发明的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的促进HaCaT细胞增殖的分析图；
图8为本发明的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的HUVEC内皮细胞迁移实验的分析图；
图9为本发明的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的HaCaT角质形成细胞迁移实验的分析图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
本实施例的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉，由蛋白质、总糖、无机质和水组成，按重量百分比，方格星虫酶解蛋白粉的蛋白质含量70％-80％，总糖的含量为8％-10％.无机质的含量为1％-1.5％，水分的含量为7％-10％，方格星虫酶解蛋白粉的蛋白质的分子量大于2.5KD肽占18％-22％，蛋白质的分子量小于2.5KD的肽占78％-82％。所述方格星虫酶解蛋白肽粉能够对涂抹在创伤的伤口上，同时还能够口服，能够起到对消炎杀菌的作用，对伤口进行涂抹的时候能够通过方格星虫酶解蛋白粉的蛋白质促进伤口部位的胶原蛋白合成，加速伤口的愈合；另外，方格星虫酶解蛋白粉具有活性功能，能够促进内皮细胞和角质形成细胞的增殖和迁移作用，进而促进血管生成为创口提供营养物质和氧气和促进表皮再上皮化，快速形成封闭空间，预防异常瘢痕和防止感染。
一种方格星虫蛋白肽粉制备方法，所述制备方法包括原料处理、匀浆处理、补水处理、酶解处理、离心处理、超滤处理和干燥处理。所述制备方法包括：
原料处理：去除方格星虫的内脏及其体腔液，并清洗干净；
匀浆处理：将去内脏及体腔液的方格星虫洗净，放入绞肉机中，加入适当的水，绞碎成浆液。
补水处理：向所述绞碎后的匀浆液进行补水至料液比为1：3，再将所述补水后的匀浆液通过加入0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的Hcl，将匀浆液的调节pH至7.0。
酶解处理：向经过补水处理后的所述匀浆液中加入复合蛋白酶形成酶解液；优选的，所述复合蛋白酶包括动物蛋白酶和风味蛋白酶，所述动物蛋白酶和风味蛋白酶均按照2000U/g-3000U/g。所述酶解液在50℃条件下，酶解5小时后，所述酶解时间为4.5-5.5小时均可；具体为，将所述酶解液置于50℃酶解5h；后100℃灭酶，冷却。所述冷却方式可以通过水冷或者风冷的形式。
离心处理：将所述冷却后的酶解液离心，离心机转速为8000转/min，离心时间为10min，然后收集离心后的酶解液的上清液；
超滤处理：将所述上清液进行超滤，收集蛋白质的分子量为3000～1000Da组分形成超滤组份，再将超滤组份进行干燥处理。
干燥处理：所述将所述超滤组通过50℃旋转蒸发浓缩至原酶解液体积1/5，将浓缩酶解液进行冷冻干燥，所述冷冻干燥为将所述超滤组份在65℃，气压-0.085MPa条件下进行真空干燥，然后粉碎，过80目筛，得到方格星虫酶解蛋白肽粉。
通过上述方格星虫蛋白肽粉制备方法制备的方格星虫蛋白肽粉能够保持较好的活性功能，同时能够形成微小的分子量，相较于其他方格星虫的应用，本制备方法制备的方格星虫能够起到很好的促进伤口的愈合的作用。
所述方格星虫有众多生理活性，如抗氧化、抗疲劳、抗辐射、辅助肾病治疗、抗乙型肝炎病毒、延缓衰老、抗肿瘤、抗病毒、改善学习记忆、脂肪性肝病保护、溶栓、调节免疫、抗菌、抗炎和外周镇痛等功效，本方格星虫蛋白肽粉具有很好的促进伤口的愈合的效果，能够较好的应用在制备促进皮肤创伤愈合药物中。
将所述制备方法中得到的具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉称取每7.25g干粉加入2mL蒸馏水配成创伤膏，即方格星虫酶解蛋白肽粉和水按料液比2:1-5:1加入蒸馏水配成促进创伤愈合膏。所述促进创伤愈合膏便于敷在伤口上，能够具有比较好的粘性，能够在伤口保持住较长的时间。
动物创伤模型分析：
建立创伤模型，采用SPF级ICR小鼠，分3组，利用8mm直径打孔器在脱毛后ICR小鼠后背制造一个伤口，每天取方格星虫促伤口愈合膏于小鼠背部伤口处给药，涂满为止，每天给药一次以及固定高度用相机拍照，以尺子作为标尺，实验设置如下分组。
a.空白对照组(NT)：伤口造模后不予处理，正常喂食。
b.方格星虫促伤口愈合膏给药组(SNH)：每天给药，以涂满伤口为宜，正常喂食。
C.阳性对照组(PC)：每天以云南白药粉进行给药，覆盖伤口，正常喂食。
(1)用ELISA法检测炎症因子IL-1β和TNF-α分泌量，过度炎症延迟愈合并导致瘢痕形成，组织损伤后需要消除炎症反应才能成功修复，低水平的炎症分泌有助于伤口的快速无痕愈合。图1为空白对照组给药7天后的IL-1β和TNF-α分泌量，图2为方格星虫促伤口愈合膏给药7天后的IL-1β和TNF-α分泌量。
(2)伤口愈合率是伤口愈合最直观的表现方式，以伤口面积统计。
计算公式如下：伤口愈合率(％)＝(初始伤口面积-第n天伤口面积)/初始伤口面积×100
如图3所示，本发明中方格星虫促伤口愈合膏给药后对伤口愈合的影响。空白对照组(NT)、方格星虫促伤口愈合膏给药组(SNH)和阳性对照组(PC)，第10天时愈合率分别为SNH组(93.02±5.56％)、PC(云南白药)组(81.04±6.06％)和NT组(74.79±17.06％)，10天开始后，与空白对照组(NT)相比，方格星虫促伤口愈合膏给药组(SNH)均具有极显著性差异(P≤0.01)，**代表极显著性差异。
(3)方格星虫促伤口愈合膏促进胶原蛋白生成能力评价
取用给药7天和14天后老鼠伤口周围2mm的皮肤分别剪碎，进行匀浆，用羟脯氨酸试剂盒测定其羟脯氨酸含量，这是表征胶原蛋白生成量的重要指标。分别设置如下四组反应。
a.空白对照组(NT)
b.方格星虫促伤口愈合膏给药组(SNH)
C.阳性对照组(PC)，为云南白药粉
d.正常皮肤组(NS)
如图4所示，实验结果表明在给药7天后，方格星虫促伤口愈合膏给药组(SNH)羟脯氨酸含量比空白组(NT)高，但没有显著性差异(P>0.05),而在第14天时，方格星虫促伤口愈合膏给药组(SNH)羟脯氨酸含量显著高于空白组(NT)(P≤0.05)，和阳性组(PC)无显著性差异(P>0.05)，显著低于正常组(P≤0.05)。这表明方格星虫促伤口愈合膏给药组(SNH)具有促进胶原蛋白生成的能力。
方格星虫促伤口愈合膏止血能力评价
6周龄ICR小鼠29只，随机分3组(n≥7)，将尾巴固定后，用酒精消毒后，用尺子量取尾部3mm处剪断，开始出血时间计时，同时用药粉涂抹伤口，每10s用称重滤纸从尾巴侧面吸取血液，直至滤纸不能吸取为止，记录出血时间，将滤纸于恒定湿度为55％的分析天平称重，计算出血量。分组如下：
a.空白对照组(NT)
b.方格星虫酶解蛋白肽粉(SNH)
C.阳性对照组(PC)，为云南白药粉
如图5所示，实验结果表明方格星虫酶解蛋白肽粉冻干粉(SNH组)和PC组(云南白药)有相似的止血效果，出血时间无显著性差异(P≥0.05)，出血量显著少于PC组(P≤0.01)。SNH组和NT组相比，出血量和出血时间均显著降低(P≤0.01)。
细胞实验分析
a.方格星虫酶解蛋白肽粉对HUVEC内皮细胞和HaCaT角质形成细胞增殖的影响，测试方法如下：
将培养好的的HUVEC内皮细胞稀释成5×104个/mL、HaCaT角质形成细胞稀释成2×105个/mL，分别吸取10μm加入96孔板，于5％CO2和37℃饱和湿度培养4h，至细胞完全贴壁后，取用PBS梯度配置40mg/mL、20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL的方格星虫酶解蛋白肽粉各10μL加入贴壁的细胞中。分别培养12h、24h、36h和48h后加入100uL培养基稀释好的CCK8进行反应1h然后再450nm测OD值。实验分组如下：
样品组，有细胞，加入培养基和含方格星虫酶解蛋白肽粉的PBS，n≥6。
阴性组，有细胞，加入培养基和无方格星虫酶解蛋白肽粉的PBS，n≥6。
空白组，无细胞，只加培养基和含方格星虫酶解蛋白肽粉的PBS，n≥6。
零孔组，无细胞，只加入培养基和无方格星虫酶解蛋白肽粉的PBS，n≥6。
增殖率计算公式如下：
如图6所示，实验结果表明，方格星虫酶解蛋白肽粉可以促进HUVEC细胞增殖，随时间先增大后减少，第24h，增值率最大。HUVEC增殖有剂量依赖关系。40mg/ml率最大。当细胞进入对数生长期，酶解物会显著促进细胞增殖。SNH促进细胞增殖的最佳作用时长为24h，进一步说明细胞在24h之内经历了从潜伏期到生长期的变化。如图7所示，方格星虫酶解蛋白肽粉可以促进HaCaT细胞增殖，随时间先增大后减少，第36h，增值率最大，增值率随药物浓度先增加后减少，在36h增值率达到最大值。
b.方格星虫酶解蛋白肽粉对HUVEC内皮细胞和HaCaT角质形成细胞迁移的影响，测试方法如下：
如图8所示，(1)HUVEC内皮细胞迁移实验，在24孔板中加入Ibidi细胞划痕专用两孔插件，两孔中间隔着500μm的壁，将培养好的HUVEC内皮细胞稀释成5×104个/ml，分别取70μL加入两孔，于5％CO2和37℃培养过夜至细胞长满成单层；拔除划痕插件后，用PBS清洗3次，洗去漂浮的细胞，加入含20mg/mL方格星虫酶解蛋白肽粉的培养基1mL，于5％CO2和37℃培养0h、6h、12h和20h进行拍照，采用imageJ软件进行迁移面积分析。
如图9所示，HaCaT角质形成细胞迁移实验，在24孔板中加入Ibidi细胞划痕专用两孔插件，将培养好的HaCaT细胞稀释成4×105个/mL，分别取70μL加入两孔，于5％CO2和37℃培养过夜至细胞长满成单层；拔除划痕插件后，用PBS清洗3次，洗去漂浮的细胞，加入含10mg/mL方格星虫酶解蛋白肽粉的培养基1mL，于5％CO2和37℃培养0h、6h、12h和20h进行拍照，采用imageJ软件进行迁移面积分析。
计算公式如下
实验分组如下：
a空白组(NT)
b方格星虫酶解蛋白肽粉组(SNH)
方格星虫酶解蛋白肽粉组(SNH)作用于HUVEC细胞和HaCaT细胞6、12、20h增殖迁移情况如图所示。伤口愈合期间角质形成细胞和内皮细胞对于有效的再上皮化、血管生成和ECM合成是必需的。相比于非治疗组，SNH组迁移率均显著升高。20h时SNH组与非治疗组HUVEC内皮细胞的迁移率分别为(83.44±6.54％)A和(56.14±10.23％)b，SNH组显著高于非治疗组(P≤0.01)。20h时SNH组与非治疗组HaCaT细胞的迁移率分别为(99.57±0.75％)A和(58.36±12.58％)b，SNH组显著高于非治疗组(P≤0.01)比例尺为200μm，(n≥9)。
由此可知，一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉对伤口愈合的止血凝血期、炎症期、增殖期都有一定作用，对预防异常瘢痕的形成也有一定作用。
以上所述实施例子仅为了说明本发明所做的例子，其描述比较详细具体，并不能因此而理解为对发明的限制范围。对于所属领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的基础上，还可以做出其他不同形式的改变和改进，这里无法对所有实施方式予以穷举，凡是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉，其特征在于，由蛋白质、总糖、无机质和水组成，按重量百分比，其蛋白质的含量为70％-80％，总糖的含量为8％-10％，无机质的含量为1％-1.5％，水分的含量为7％-10％；其蛋白质的分子量大于2.5KD的肽占18％-22％，蛋白质的分子量小于2.5KD的肽占78％-82％。
2.如权利要求1所述的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
原料处理：包括去除方格星虫的内脏及其体腔液，并清洗干净；
匀浆处理：将所述方格星虫进行加水绞碎形成匀浆液；
酶解处理：向所述匀浆液中加入复合蛋白酶形成酶解液，其中，所述酶解液在50℃条件下，酶解4.5-5.5h；然后将酶解液升温到100℃条件下，进行灭酶，时间为15min，再对酶解后的匀浆液进行冷却；
离心处理：将所述冷却后的酶解液置于离心机内离心处理，离心机转速为8000转/分钟，离心时间为20min，然后收集离心后的酶解液的上清液；
干燥处理：将所述上清液进行真空浓缩后，再进行冷冻干燥，从而得到方格星虫酶解蛋白肽粉。
3.如权利要求2所述的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶包括动物蛋白酶和风味蛋白酶；动物蛋白酶和风味蛋白酶的添加量均为2000U/g-3000U/g。
4.如权利要求1所述的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉制备方法，其特征在于，还包括超滤处理，将所述上清液进行超滤，收集蛋白质的分子量为3000～1000Da组分形成超滤组份，再将超滤组份进行干燥处理。
5.如权利要求1所述的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉制备方法，其特征在于，所述上清液在50℃条件下，旋转蒸发，浓缩液体体积到1/5以后，再进行干燥处理。
6.如权利要求2所述的一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉制备方法，其特征在于，在酶解处理中，将酶解液覆盖上保鲜膜，置于50℃恒温摇床上，采用100rpm的速度，旋转酶解5h。
7.如权利要求2所述的一种方格星虫酶解蛋白肽粉制备方法，其特征在于，还包括补水处理，向所述绞碎后的匀浆液进行补水至料液比为1：3，再将所述补水后的匀浆液通过加入0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的HCl，将匀浆液的调节pH至7.0后，再进行酶解处理。
8.如权利要求4所述的一种方格星虫酶解蛋白肽粉制备方法，其特征在于，将所述超滤组份在65℃，气压-0.085MPa条件下进行真空干燥，然后粉碎，过80目筛，得到方格星虫酶解蛋白肽粉。
9.如上述任意一个权利要求所述的一种方格星虫酶解蛋白肽粉在制备促进皮肤创伤愈合药物中的应用。
10.如权利要求1所述的由一种利用方格星虫酶解蛋白肽粉制备的促进创伤愈合膏，其特征在于，将所述方格星虫酶解蛋白肽按料液比2:1-5:1加入蒸馏水配成促进创伤愈合膏。
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