CN113101416B - 一种方格星虫脱细胞生物材料、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种方格星虫脱细胞生物材料、制备方法及其应用，涉及生物医用材料技术领域。所述生物材料包含由方格星虫经脱细胞处理后所形成的细胞外基质材料，很好地保留了方格星虫原有的环肌和纵肌结构，且完好保留了肌肉束中取向排列的纳米纤维结构，能够促进细胞的渗透、粘附和生长，可用于创伤护理和/或促进其他组织的愈合和修复。本发明还提供了所述生物材料的制备方法及其在外周神经损伤修复及真皮组织再生领域的应用。

Description

一种方格星虫脱细胞生物材料、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种方格星虫脱细胞生物材料、制备方法及其应用。
背景技术
人源或动物源的组织器官经过脱细胞处理后可保持原有的组织结构和生物活性。采用脱细胞技术获取的生物材料已经广泛应用于骨、软骨、血管、软组织、神经等组织缺损修复的研究中。随着脱细胞技术的不断成熟，脱细胞基质生物材料的研究不断深入，脱细胞基质生物材料的安全性和有效性逐渐得到临床验证。目前，临床上所使用的脱细胞基质生物材料主要为同种异体或异种异体组织。其中，同种异体组织仍面临供体不足的情况；异种异体组织主要源于牛、猪、羊等哺乳动物，具有较高的人畜共患疾病风险。
外周神经缺损引起支配区域感觉和运动功能障碍，影响患者生活质量，给个人和社会带来沉重的负担。对于无法实施神经外膜缝合术的外周神经缺损，自体神经移植仍是临床治疗的黄金标准。但是，自体神经移植通常存在供体不足、供体部位功能丧失、供/受体结构性差异、尺寸不符以及形成神经瘤的问题。人工神经导管是满足临床需求的一个有效选择。神经导管材料能够辅助缺损神经实现促神经再生因子富集，定向引导神经轴突生长，并避免周围组织侵入，减少神经瘤和疤痕形成，从而促进神经缺损修复和再生。人工神经导管材料具有的取向纤维结构能够为神经细胞的定向铺展提供物理信号，诱导神经细胞有序排列，促进神经细胞的成熟以及轴突的定向生长，从而提高神经缺损修复和再生效果。例如专利CN110975016A描述了一种双层纤维神经修复导管，所述导管的内层为可降解取向纤维层，外层为无规则取向纤维层，其中所述取向纤维层的取向方向与所述导管轴向平行。但是，受制于材料稳定性、微纳结构加工技术精度和体量不足以及微纳结构在生物体内较短的维持时间，有序微纳结构多作为体外模型来指导其在体内的潜在作用方式，真正有临床应用价值的有序微纳结构神经导管目前极少。
皮肤是人体最大的组织器官，且在日常生活中极易受到伤害。当皮肤受损程度较大时，如严重的烧伤、外伤或一些不能愈合的慢性创伤引起的皮肤缺损，人体无法实现皮肤的自我修复，需要通过植皮的方式促进受损皮肤的修复。自体皮肤移植仍是修复大面积皮肤缺损最有效的办法。但自体皮肤移植最大的问题是皮肤来源不足，且会对供体部位产生二次创伤。另一种方式是通过移植尸体皮来促进皮肤缺损的修复。但尸体皮同样面临皮源不足，以及传染病携带和伦理学的风险与制约。目前，能够促进真皮组织再生的异种脱细胞真皮基质，如猪脱细胞真皮基质，逐渐应用到临床上。临床应用脱细胞真皮基质的最大难点在于血管化。要实现充分的血管化，要求脱细胞真皮基质具有丰富的、互相连通的空洞结构。但现有脱细胞真皮基质仍缺乏理想的多孔结构而保留了较为致密的三维网状结构，导致其促进伤口愈合效果不够理想。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方格星虫脱细胞生物材料、制备方法及其应用。本发明旨在解决现有技术中有序微纳拓扑结构神经诱导再生材料加工技术精度和体量不足，难以实现产业化的难点，同时解决现有技术中脱细胞真皮基质缺乏理想的多孔结构，不利于血管化，且促进伤口愈合效果不好的技术缺陷。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了一种生物材料，所述生物材料包含由方格星虫经脱细胞处理后所形成的细胞外基质材料。
在一个具体的实施方案中，所述细胞外基质材料为方格星虫体壁的脱细胞的细胞外基质材料。
方格星虫(Sipunculus nudus)，又叫作光裸星虫，属于方格星虫科方格星虫属(Sipunculus)。一般生活在沿海滩涂一带沙泥底质的海域。中国沿海地区目前共发现5种方格星虫。
本发明采用生理结构简单、资源丰富的方格星虫为原材料，采用方格星虫体壁进行脱细胞生物材料的制备。方格星虫体壁具有明显的分层，最外层是一层角质膜，向内为结缔组织层和肌肉层，最内为单层偏平细胞组成的壁体腔膜。肌肉层分为外环肌、中斜肌和内纵肌，且环肌和纵肌排列成束状。组织学染色分析表明，方格星虫体壁具有丰富的、有序分布的肌肉纤维。
本发明所述生物材料来源于方格星虫，所制备的细胞外基质具有良好的可降解性、生物相容性。此外，方格星虫组织结构简单，含有的细胞组分少，能够有效降低哺乳动物源或鱼源脱细胞细胞外基质携带病毒和致病菌的风险。
在一个实施方案中，所述细胞外基质材料保留了方格星虫体壁中肌肉纤维束的三维立体结构；
优选地，所述细胞外基质材料保留了方格星虫体壁中环肌和纵肌交错排列的网状结构。
在一个实施方案中，所述细胞外基质材料保留了所述方格星虫体壁中含有纳米肌肉纤维结构的取向肌肉纤维束；
优选地，所述取向纳米肌肉纤维结构的肌束为纵肌和/或横肌；
更优选地，所述取向纳米肌肉纤维结构的肌束为纵肌。
方格星虫体壁经脱细胞处理后，可保持原有的环肌和纵肌结构，同时保留材料中定向排列的纤维束结构。因此，本发明的生物材料具有有序三维结构和纳米纤维结构。本发明获得的方格星虫体壁脱细胞材料，保留方格星虫体壁横机纵肌交错排列的空间结构，具有丰富的连通孔结构。同时，方格星虫肌肉纤维之间也具有疏松的连通孔结构。
在本发明的实施方案中，所述方格星虫包括裸体方格星虫、印度方格星虫、挪威方格星虫、强壮方格星虫、拟安氏方格星虫；优选地，所述方格星虫为裸体方格星虫。
在一个实施方案中，所述生物材料可以单独使用，也可以配合其他物质使用，只要互相不影响各自的功能即可。所述其他物质可以包括但不限于例如：抗生素、防腐剂、抗病毒剂、抗微生物剂、抗炎剂、抗氧化剂、药物、蛋白质和肽中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述生物材料在使用时可以按照以下形式使用，包括：创伤敷料、粉剂、缝合材料和/或网状物的形式，但不限于上述形式。
本发明的生物材料可以作为细胞支架(也即作为支架材料)用于生物体的不同组织，例如血管、神经、皮肤和人工器官等。
在另一个方面，本发明还提供了所述生物材料的制备方法，所述方法包括：
(a)获取方格星虫的体壁并进行预处理；
(b)进行脱细胞处理获得脱细胞组织。
所述预处理包括消毒和酸处理；优选地，所述酸处理用水杨酸或醋酸溶液进行；
所脱细胞处理包括将步骤(a)获得的体壁用Triton-100震荡浸泡后，依次用胰蛋白酶溶液和脱氧胆酸钠水溶液处理。
在一个具体的实施方案中，所述方法在获得所述脱细胞组织后，还包括冷冻干燥、裁切和/或包装灭菌的步骤。
在另一个方面，本发明还提供了所述的生物材料在制备用于治疗或修复外周神经损伤药物中的应用。
在一个实施方案中，所述生物材料直接缝合于缺损神经两端或填充于神经导管官腔内。
在另一个方面，本发明还提供了所述的生物材料在制备用于治疗或修复皮肤创伤的医疗器械中的应用，优选地，皮肤创伤为真皮组织创伤，提供了所述生物材料在促进真皮组织再生中的应用。
在一具体的实施方案中，方格星虫脱细胞材料可以以颗粒状、粉状或片状形式用于促进真皮组织再生。
本发明的生物材料的多孔结构能够保证细胞的渗透、粘附和生长，也有利于血管化的形成，能够促进真皮组织的再生，可用于创伤护理(例如皮肤损伤)和/或促进其他组织的愈合和修复。
有益效果：
(1)本发明所述方格星虫脱细胞生物材料以方格星虫体壁为原料，方格星虫属于无脊椎动物，相对所述脊椎动物而言，携带共同病原体的可能性更小，因此相较人源、哺乳动物源、鱼源等动物源生物材料具有更高的安全性。
(2)本发明所述方格星虫脱细胞生物材料具有取向纳米纤维结构，其制备过程操作简单、可重复性高，可以有效解决现有取向纳米纤维结构制备技术稳定差、批量化程度低的不足，能够实现产品产业化。
(3)本发明的方格星虫脱细胞生物材料作为一种促进外周神经缺损修复的生物材料具有较大的临床和市场前景。
(4)本发明所述脱细胞方格星虫生物材料具有丰富的孔结构、足够的力学强度，能够提供真皮组织再生所需的物理环境。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1所获得的脱细胞方格星虫生物材料的外观；
图2为本发明实施例1所获得的脱细胞方格星虫生物材料的组织学染色结果；
图3为本发明实施例3所获得的脱细胞方格星虫生物材料的包装外观；
图4为本发明实施例3所获得获得的脱细胞方格星虫生物材料的电子扫描电镜照片；
图5为本发明实验例1所获得的脱细胞方格星虫生物材料诱导外周神经缺损再生效果图；
图6为本发明实验例2所获得的脱细胞方格星虫生物材料在诱导真皮组织再生过程中的血管化效果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1脱细胞方格星虫生物材料的制备
(1)取材：选取新鲜方格星虫(裸体方格星虫)，沿纵肌剖开，冲洗内外体壁，去除体腔膜。
(2)消毒和稳定：处理后的方格星虫体壁用分别含有50mM抗坏血酸、500ppm链霉素的无菌生理盐水在4℃洗涤2次持续1小时。
(3)酸处理：将方格星虫体壁置于2％水杨酸溶液中，在37℃下搅拌24小时。然后用生理盐水浸泡、冲洗。
(4)脱细胞：
a)将清洗后的方格星虫体壁置于3％的Triton-100中，在室温下震荡浸泡48小时，期间每隔24小时更换一次Triton-100溶液，然后用生理盐水冲洗。
b)用2.5％(w/v)胰蛋白酶溶液处理，4℃下处理10小时。然后用生理盐水洗净。
c)用2％(w/v)脱氧胆酸钠水溶液处理10小时，然后用生理盐水冲洗干净。
(5)冷冻干燥：将裁切后的材料用30％、50％、75％、85％、90％、95％、100％的乙醇梯度脱水，然后置于叔丁醇中浸泡2次脱除乙醇，置于冰箱中冷冻，最后置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
(6)裁切：将冷冻干燥后的脱细胞方格星虫生物材料裁切一定尺寸。
(7)包装：材料采用灭菌袋密封包装。
(8)灭菌：包装后的材料采用环氧乙烷灭菌。
所获得的脱细胞方格星虫生物材料的外观见图1；所获得的脱细胞方格星虫生物材料的组织学染色结果见图2。
实施例2脱细胞方格星虫生物材料的制备
(1)取材：选取新鲜方格星虫，沿纵肌剖开，冲洗内外体壁，去除体腔膜。
(2)消毒和稳定：将处理后的方格星虫体壁用分别含有50mM抗坏血酸、500ppm链霉素的无菌磷酸盐缓冲液在4℃洗涤2次持续1小时。
(3)酸处理：将方格星虫体壁置于2％水杨酸溶液中，在37℃下搅拌24小时。然后用无菌磷酸盐缓冲液浸泡、冲洗。
(4)脱细胞：
a)将清洗后的方格星虫体壁置于3％的Triton-100中，在室温下震荡浸泡48小时，期间每隔24小时更换一次Triton-100溶液，然后用无菌磷酸盐缓冲液冲洗。
b)用2.5％(w/v)胰蛋白酶溶液处理，4℃下处理10小时。然后用无菌磷酸盐缓冲液洗净。
c)用2％(w/v)脱氧胆酸钠水溶液处理10小时，然后用无菌磷酸盐缓冲液冲洗干净。
(5)裁切：将脱细胞方格星虫生物材料裁切一定尺寸。
(6)保存液包装：将裁切后的材料浸泡在25％甘油-水混合液中。
(7)包装：材料采用灭菌袋密封包装。
(8)灭菌：包装后的材料采用15kGy C60辐照灭菌。
实施例3脱细胞方格星虫生物材料的制备
(1)取材：选取新鲜方格星虫，沿纵肌剖开，冲洗内外体壁，去除体腔膜。
(2)消毒和稳定：将处理后的方格星虫体壁用分别含有50mM抗坏血酸、500ppm链霉素的无菌磷酸盐缓冲液在4℃洗涤2次持续1小时。
(3)酸处理：将方格星虫体壁置于2％醋酸溶液中，在37℃下搅拌24小时。
(4)分离：将酸处理后的材料铺展，人工将方格星虫体壁的横肌和纵肌分离，然后用无菌磷酸盐缓冲液浸泡、冲洗。
(5)脱细胞：a)将清洗后的方格星虫肌束置于3％的Triton-100中，在室温下震荡浸泡48小时，期间每隔24小时更换一次Triton-100溶液，然后用无菌磷酸盐缓冲液冲洗。
b)用2.5％(w/v)胰蛋白酶溶液处理，4℃下处理10小时。然后用无菌磷酸盐缓冲液洗净。
c)用2％(w/v)脱氧胆酸钠水溶液处理10小时，然后用无菌磷酸盐缓冲液冲洗干净。
(6)冷冻干燥：将材料用30％、50％、75％、85％、90％、95％、100％的乙醇梯度脱水，然后置于叔丁醇中浸泡2次脱除乙醇，置于冰箱中冷冻，最后置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
(7)包装：材料采用灭菌袋密封包装。
(8)灭菌：包装后的材料采用15kGy C60辐照灭菌。
所获得的脱细胞方格星虫生物材料的包装外观见图3；所获得获得的脱细胞方格星虫生物材料的电子扫描电镜照片见图4。
实施例4脱细胞方格星虫生物材料的制备
(1)取材：选取新鲜方格星虫，沿纵肌剖开，冲洗内外体壁，去除体腔膜。
(2)消毒和稳定：处理后的方格星虫体壁用分别含有50mM抗坏血酸、500ppm链霉素的无菌生理盐水在4℃洗涤2次持续1小时。
(3)酸处理：将方格星虫体壁置于2％水杨酸溶液中，在37℃下搅拌24小时。然后用生理盐水浸泡、冲洗。
(4)脱细胞：a)将清洗后的方格星虫体壁置于3％的Triton-100中，在室温下震荡浸泡48小时，期间每隔24小时更换一次Triton-100溶液，然后用生理盐水冲洗。
b)用2.5％(w/v)胰蛋白酶溶液处理，4℃下处理10小时。然后用生理盐水洗净。
c)用2％(w/v)脱氧胆酸钠水溶液处理10小时，然后用生理盐水冲洗干净。
(5)冷冻干燥：将裁切后的材料用30％、50％、75％、85％、90％、95％、100％的乙醇梯度脱水，然后置于叔丁醇中浸泡2次脱除乙醇，置于冰箱中冷冻，最后置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
(6)粉碎：采用粉碎机将冷冻干燥后的脱细胞方格星虫生物材料粉碎，采用网筛筛选粒径500～1000μm的颗粒。
(7)包装：粉碎后的脱细胞方格星虫生物材料采用灭菌袋密封包装。
(8)灭菌：包装后的材料采用15kGy电子辐照灭菌。
实验例1脱细胞方格星虫生物材料诱导外周神经缺损再生
(1)材料准备：将实施例3制备得到的脱细胞方格星虫纵肌浸泡在生理盐水中稳定。然后填充于中空神经导管材料中，浸泡在生理盐水中备用。
(2)手术准备：将实验兔放到麻醉架上，卡口固定颈部，用3％戊巴比妥钠溶液按1mL/kg的剂量从耳缘静脉进行注射麻醉。麻醉满意后，用剃毛器剃去实验兔右侧大腿外侧及周边兔毛，将实验兔左侧卧位用绳索固定在动物实验台上，用医用碘伏消毒大腿及周边皮肤。
(3)实验造模：常规铺洞巾，扪清右侧股骨，沿股骨外侧稍后方做一长约8cm的纵行切口，分别切开皮肤、皮下组织，向两侧钝性分离牵开，暴露股外侧肌和股二头肌长头之间白色的肌间组织，沿肌间组织钝性分离，可见下方的腓神经和胫神经。游离腓神经和胫神经，向上游离至坐骨神经边缘，向下游离至膝关节后外上方分叉处。切口两边分别用皮肤缝合线沿垂直切口方向缝合2～3针牵开暴露切口。用显微剪刀横行快速将腓神经和胫神经剪短。
(4)材料植入：将近端的神经束用12-0的无创缝合线与神经导管缝合，然后将远端的神经束与神经导管另一端缝合。使股外侧肌和股二头肌复位。
(5)缝合处理：依次缝合筋膜层和皮肤层。缝合后的伤口用碘伏消毒。最后注射庆大霉素防止伤口感染。
(6)结果观察：术后8周解剖手术部位，观察外周神经缺损再生情况。如图5所示，神经缺损两端连接良好，导管内部有新生神经组织。
实验例2脱细胞方格星虫生物材料诱导真皮组织再生
(1)手术准备：采用腹腔注射3％戊巴比妥钠溶液的方式麻醉实验鼠，麻醉剂用量为1mL/kg。麻醉满意后，用剃毛器剃去实验鼠背部脊柱一侧的毛，并用刀片刮除残余短毛，露出表皮。将实验鼠俯卧位用绳索固定在动物实验台上，用医用碘伏消毒脊柱一侧的皮肤。
(2)实验造模：常规铺洞巾，用皮肤标记笔预先做出2cm×2cm的正方形。用手术刀沿着标记好的正方形边缘切开皮肤，然后用手术剪剪掉真皮层，获得2cm×2cm的全层皮肤缺损伤口。
(3)材料植入：将实施例1制备的脱细胞方格星虫生物材料剪裁成2cm×2cm的正方形，平铺于伤口，然后用手术缝合线缝合，每边缝合3针。在方格星虫生物材料上覆盖凡士林纱布，最后用纱布常规打包。
(4)术后处理：术后实验鼠注射庆大霉素注射液，防止感染。
(5)自体表皮移植：术后2周后拆除覆盖物，露出伤口，观察脱细胞方格星虫生物材料植入后的血管化情况，如图6所示，植入的生物材料基本降解，并有丰富的血管化，满足后续自体表皮的移植要求。从同体臀部取表皮层覆盖于伤口。采用同样方式覆盖伤口，常规打包。两周后拆包，完成手术。
实验例3脱细胞方格星虫生物材料诱导真皮组织再生
(1)手术准备：采用腹腔注射3％戊巴比妥钠溶液的方式麻醉实验鼠，麻醉剂用量为1mL/kg。麻醉满意后，用剃毛器剃去实验鼠背部脊柱一侧的毛，并用刀片刮除残余短毛，露出表皮。将实验鼠俯卧位用绳索固定在动物实验台上，用医用碘伏消毒脊柱一侧的皮肤。
(2)实验造模：常规铺洞巾，用皮肤标记笔预先做出2cm×2cm的正方形。用手术刀沿着标记好的正方形边缘切开皮肤，然后用手术剪剪掉真皮层，获得2cm×2cm的全层皮肤缺损伤口。
(3)材料植入：用实施例4制备的脱细胞方格星虫生物材料颗粒均匀覆盖伤口，然后在方格星虫生物材料上覆盖凡士林纱布，最后用纱布常规打包。术后实验鼠注射0.6毫升庆大霉素注射液，防止感染。术后2周后拆除覆盖物，露出伤口，从同体臀部取表皮层覆盖于伤口。采用同样方式覆盖伤口，常规打包。两周后拆包，完成手术。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包含由方格星虫经脱细胞处理后所形成的细胞外基质材料；
所述细胞外基质材料为方格星虫体壁的脱细胞的细胞外基质材料；
所述细胞外基质材料保留了方格星虫体壁中肌肉纤维束的三维立体结构；
所述细胞外基质材料保留了方格星虫体壁肌肉纤维束中的取向纳米肌肉纤维结构的肌束；所述取向纳米肌肉纤维结构的肌束为环肌和/或纵肌。
2.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述细胞外基质材料保留了方格星虫体壁中环肌和纵肌交错排列的网状结构。
3.根据权利要求1或2所述的生物材料，其特征在于，所述方格星虫包括裸体方格星虫、印度方格星虫、挪威方格星虫、强壮方格星虫、拟安氏方格星虫。
4.根据权利要求1或2所述的生物材料，其特征在于，所述方格星虫为裸体方格星虫。
5.权利要求1-4任一项所述的生物材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
（a）获取方格星虫的体壁并进行预处理；
（b）进行脱细胞处理获得脱细胞组织。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述预处理包括消毒和酸处理；
所脱细胞处理包括将步骤（a）获得的体壁用Triton-100震荡浸泡后，依次用胰蛋白酶溶液和脱氧胆酸钠水溶液处理。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酸处理用水杨酸或醋酸溶液进行。
8.如权利要求1-4中任一项所述的生物材料在制备用于治疗或修复外周神经损伤的医疗器械中的应用。
9.如权利要求1-4中任一项所述的生物材料在制备用于治疗或修复皮肤创伤的医疗器械中的应用。
10.如权利要求1-4中任一项所述的生物材料在制备用于治疗或修复真皮组织损伤的医疗器械中的应用。
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