CN114533959A - 一种肌腱修复材料、制备方法及在制备肌腱修复产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种肌腱修复材料、制备方法及在制备肌腱修复产品中的应用。目前的肌腱修复材料还存在诱导再生效果不足、修复后肌腱组织的力学差、活性诱导因子的加入难以实现理想的释放效果等缺陷。本发明针对现有技术中存在的问题提供了一种骨膜蛋白生物交联的肌腱修复产品，通过单胺氧化酶的加入促使骨膜蛋白与脱细胞基质、脱细胞支架发生交联从而实现良好的缓释效果，植入机体后，上述修复材料还能够刺激体内胺氧化酶的活性，进一步提升肌腱修复效果，具有良好的工业化和治疗前景。
Description
技术领域
本发明属于医用修复材料技术领域，具体涉及一种肌腱修复材料、所述肌腱修复材料的制备，包含所述肌腱修复材料的药物组合物及其在制备肌腱修复产品中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
肌腱传递着肌肉到骨骼的收缩力，支持关节部位姿势的稳定性。肌腱授予排列整齐的胶原纤维组成的分层索状网状结构，为负载传递关节活动，维持关节稳定性提供了一种灵活而不可伸缩的连接。从肌腱组织成分上看，肌腱70％是水， 30％是干重，干重90％为I型胶原，少量为III、V、X型胶原和弹性蛋白，其余 10％为细胞成分，因此密集平行的胶原基质和位于其内部的腱细胞组成了肌腱的核心。从结构方面看，肌腱分为三个结构独特的部分：骨腱连接处、肌腱本身、腱肉连接处。肌腱相邻界面-肌肉、骨膜的性质存在显著差异，肌肉主要是由细胞组成的，而ECM是主要的肌腱成分，这导致组织血管化和随之产生的代谢需求的不匹配。从力学性能上看，肌腱在刚度方面具有较高的力学特性，肌肉具有柔韧性和弹性。机械荷载的适应性反应导致了组织尺度的适应，如增加横截面面积，包含抗压夹杂物(纤维软骨)和肌腱长度，也会导致细胞形态、密度、行为以及细胞外基质组成的改变。
肌腱本身具有有限的再生能力，使用生物可降解支架、电纺纤维或细胞治疗等策略已经被开发，以指导愈合过程再生功能性肌腱组织，尽管在改善修复效果方面取得了进展，但仍存在各种不足。肌腱和韧带的高度组织层次纤维结构被设计来承担负荷并提供生物力学功能，如维持、承载和加强关节。有生物或合成材料支撑的纤维基支架被认为是再现胶原纤维取向、促进肌腱和韧带组织修复和再生的重要途径。纤维支架在植入后提供了即时的稳定性和胶原沉积，但他们会引起炎症反应、滑膜炎和长期疲劳现象，需要二次手术取出，限制了临床应用。I 型胶原蛋白生物膜和壳聚糖生物膜在临床应用中，多作为防黏连材料发挥隔离作用，专门组织部位的诱导再生效果不如原始肌腱，修复后肌腱组织的力学性能较差，在后期的超机械负荷的作用下，易发生二次黏连的风险。专利2013800158729 公布了一种韧带或肌腱的修补方法，所述补片是柔性的和生物相容的且包含多孔胶原的支持层和透明质酸钠基质层，具有较好的生物相容性和柔性；专利 2017110769625生物肌腱修复材料及其制备方法，公开了不同区域力学强度不同的生物支架材料，通过多层细胞细胞外基质模具压实获得了断裂拉力和缝合保持力较高的生物可降解材料。以上材料均忽略了诱导肌腱组织再生以及再生组织力学特性恢复的问题。
很多研究通过将脱细胞支架负载凝胶包裹的生物活性因子或活性细胞达到促进受损肌腱恢复原有的功能。专利WO2018120672A1一种诱导肌腱组织再生的生物活性支架及其制备方法和用途，公开了动物肌腱复合细胞外基质的方法，细胞外基质用于包裹生物活性因子或活性细胞，以提高整个材料的生物活力，忽略了活性物质在未交联的情况下植入体内后快速释放的问题。《复合肌腱修复材料－重组表皮生长因子缓释微球的实验研究》公开了缓释微球包裹生长因子提高复合材料活性的方法。目前缓释微球制备工艺的共同点在于，在有机高分子物质的参与下乳化分散形成微球。该种操作增加了有机物挥发、去除工艺的繁琐步骤，可能带来有机高分子物质残留带来的材料植入体内后的炎症风险，不利于产业化生产。
发明内容
基于上述技术背景中提供的问题，本发明的目的在于提供了一种适于产业化、满足临床需求的肌腱修复产品。通过尽量模拟体内组织再生的生化环境，针对肌腱组织诱导再生及肌腱组织再生后力学特性恢复问题，本发明将骨膜蛋白与动物肌腱脱细胞支架交联结合，诱导体内成纤维细胞再生，同时激活体内胺氧化酶的活性，促进机体内源胶原组织再生并交联，进而提高再生后组织的生物力学性能。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种肌腱修复材料，所述肌腱修复材料中，骨膜蛋白均匀分布于脱细胞基质凝胶及脱细胞支架中，并且所述骨膜蛋白、脱细胞基质凝胶及脱细胞支架彼此间交联。
第一方面的技术方案中，考虑到原料来源的便利性，上述骨膜蛋白优选重组蛋白。
优选的，所述脱细胞基质凝胶或脱细胞支架来源于动物体中胶原蛋白含量较高的结缔组织，包括但不限于筋膜、韧带、肌腱、皮肤、软骨中的一种或几种。进一步的，所述脱细胞基质凝胶或脱细胞支架优选动物的韧带或肌腱组织。
应当说明的是，上述修复材料中，所述骨膜蛋白、脱细胞基质凝胶或脱细胞支架的动物来源优选哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猕猴、羊、马、牛、驴、猪、鸡、狗。
进一步的，为了降低免疫原性，所述骨膜蛋白依据使用肌腱修复材料的使用对象进行调整，具体的实例中，所述应用于人体肌腱修复的材料中，骨膜蛋白优选重组人骨膜蛋白；而所述脱细胞基质凝胶或脱细胞支架的来源可能需要依据肌腱修复材料的使用对象和材料获取难度、材料加工难度进行调整，具体的实例中，应用于人的肌腱修复材料中，所述脱细胞基质凝胶或脱细胞支架的来源可以是羊、马、牛、驴、猪等体型较大的哺乳动物。
本领域常见将生物支架材料作为生物活性支架应用于肌腱修复或创面修复，将生物活性因子加入生物活性支架材料有利于提高修复活性，骨膜蛋白是细胞外基质蛋白可以调节细胞外基质的内稳态，诱导成纤维细胞分泌I型胶原，加速纤维化的发展进程，是组织纤维化发展的标志物。本发明选择将骨膜蛋白加入生物活性支架中用以提高材料降解后自体再生组织的力学强度。但是，发明人在研究过程中发现，将骨膜蛋白直接添加至生物活性支架材料中存在骨膜蛋白释放速度过快的缺陷。特别是作为一种植入材料在生物体内发挥修复作用时，释放速度过快不利于植入体持续发挥修复作用，甚至可能导致局部炎症。基于该现象，本发明联想到提供一种将骨膜蛋白交联至生物活性支架材料中的方式，然而，常规的化学交联剂对生物材料的结构具有一定的影响且容易残留，因此，本发明的另一个技术目的在于，提供一种恰当的骨膜蛋白交联方式。
因此，本发明第二方面，提供第一方面所述肌腱修复材料的制备方法，所述肌腱修复材料的制备方法中，包括采用生物交联剂处理促使骨膜蛋白与脱细胞基质凝胶、脱细胞支架发生交联；所述制备方法的特征在于，所述生物交联剂中至少包括胺氧化酶。
所述胺氧化酶包括单胺氧化酶和二胺氧化酶；进一步的，为单胺氧化酶。
单胺氧化酶在肝、心、肾、脑、肺、骨骼肌等组织的线粒体中分布，在血小板和胎盘中也含有单胺氧化酶，与结缔组织中的纤维化程度相关。本发明联想到单胺氧化酶能够提高结缔组织的纤维化程度，有可能作为一种生物交联剂。另外，当上述肌腱修复材料植入体内发挥修复作用时，单胺氧化酶还能够辅助修复受损纤维，提高肌腱修复效果。
由于单胺氧化酶在生物体内发挥活性需要黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，并且单胺氧化酶中还含有铜离子。因此，本发明提供的生物交联剂中，还包括黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶、以及铜离子作为活化因子。
进一步的，所述铜离子优选采用无机盐形式进行添加，包括氯化铜及硫酸铜等。
一种具体的实施方式中，所述生物交联剂中各成分比例如下：单胺氧化酶 0.05-5％(w/w)、0.01-5％黄素腺嘌呤二核苷酸(w/w)、0.01M～0.5M的硫酸铜 (w/w)；所述生物交联剂以Tris缓冲液作为溶剂，所述溶剂浓度为10-50mmol/L， pH为6～8。
优选的，所述肌腱修复材料的制备方法包括以下步骤：取动物组织去除油脂后置于高渗溶液中脱除细胞组织，再通过核酸酶、胃蛋白酶去除免疫原性物质得到所述动物组织的脱细胞基质；
将所述脱细胞基质干燥获得脱细胞支架；
将所述脱细胞基质加入蛋白酶溶液中孵育获得脱细胞基质凝胶；
将骨膜蛋白溶于上述脱细胞基质凝胶中获得骨膜蛋白凝胶；将所述骨膜蛋白凝胶灌入脱细胞支架后浸入生物交联剂浸泡得到所述肌腱修复材料。
进一步的，所述动物组织为羊、马、牛、驴、猪等哺乳动物的韧带或肌腱组织。
进一步的，所述去除油脂的方式如下：将清洗后的动物组织反复冻融若干次之后再对组织表面油脂进行刮除。将动物组织反复冻融可以通过冰晶形成刺破细胞膜，并且促使脂质氧化更容易剥离。
进一步的，所述脱除细胞组织的操作中，还包括采用胰蛋白酶和/或EDTA 处理去除油脂后的动物组织，再通过高渗溶液去除细胞组织。
进一步的，所述高渗溶液为氯化钠、氢氧化钠及碳酸钠的混合溶液；更进一步的，所述高渗溶液中包含1M～5M NaCl、0.01M～0.5M NaOH、0.1M～1M Na2CO3。
进一步的，所述核酸酶、胃蛋白酶为0.05～0.15％核酸酶、胃蛋白酶的PBS 溶液。
进一步的，所述脱细胞支架采用冷冻干燥的方式。
进一步的，所述脱细胞基质凝胶的制备方式如下：所述蛋白酶溶液中包括 0.5-1％的胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液。
更进一步的，所述脱细胞基质凝胶的制备方式如下：将脱细胞基质置于 0.5-1％的胃蛋白酶溶液0.01M pH＝2的HCl溶液中常温振荡24h，加入0.1M氢氧化钠溶液和PBS缓冲液中和，调节pH至7.4，再置于胰蛋白酶溶液溶于PBS 缓冲液常温48h后，得到所述脱细胞基质凝胶。
进一步的，所述骨膜蛋白凝胶灌入脱细胞支架的方式为通过加压的方式灌入；具体的实施方式中，将所述骨膜蛋白凝胶涂覆在脱细胞支架表面后放入密封环境中进行加压。
效果较好的一种实施方式中，所述肌腱修复材料的制备方法如下：
(1)将动物跟腱或韧带组织用氧化电位水超声波清洗去除表面病毒，置于 -20℃-80℃反复冻融3-4次，刮除组织表面油脂；于室温25℃将组织浸入 0.5mol/LEDTA溶液中振荡1-2h；再置于1M～5M NaCl、0.01M～0.5M NaOH、 0.1M～1M Na2CO3混合的高渗溶液中，振荡40min，重复震荡及高渗溶液震荡过程5-10次；最后采用纯净水震荡1h，重复5-10次；
(2)去除免疫原性：将(1)中处理后的动物组织依次用含0.01％-0.1％核酸酶、胃蛋白酶的PBS溶液脱除残留的核酸以及端肽，再用PBS缓冲液清洗若干次后得到脱细胞基质；将所述脱细胞基质冷冻干燥获得脱细胞支架材料；
(3)脱细胞基质孵育：将(2)中所述脱细胞基质置于0.5-1％的胃蛋白酶溶液和0.01M pH＝2的HCl溶液中常温振荡24h，37℃孵育48h后向孵育体系中加入0.1M氢氧化钠溶液和PBS缓冲液，调节pH至7.4，再置于胰蛋白酶溶液溶于PBS缓冲液常温48h后，得到动物组织的脱细胞基质凝胶，配置成脱细胞基质凝胶的质量浓度为0.05％-10％，优选质量分数为3％；
(3)将骨膜蛋白溶于动物组织的脱细胞基质凝胶中，获得含骨膜蛋白的凝胶，其中骨膜蛋白的质量分数为0.005％-0.5％，优选质量分数为0.1％；
(4)将(3)中所述骨膜蛋白凝胶涂覆在(2)中所述脱细胞支架中，密闭环境中-0.01～-0.1MPa抽滤加压0.5-1h，使骨膜蛋白凝胶灌入脱细胞支架空隙中获得一种骨膜蛋白凝胶支架，所述脱细胞支架(ECM)与骨膜蛋白凝胶 (CG-POSTN)的质量比为(80％-50％)：(20％-50％)，优选60％:40％；
(5)用含有质量分数0.1-5％的单胺氧化酶、0.01-5％黄素腺嘌呤二核苷酸、0.01M～0.5M的硫酸铜的混合溶液浸泡上述骨膜蛋白凝胶支架，37℃反应2-24小时，反应结束后，将骨膜蛋白凝胶支架采用PBS缓冲液多次冲洗，再在压缩机中冷冻干燥，环氧乙烷灭菌得到所述肌腱修复材料。
本发明第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中，第一方面所述肌腱修复材料作为活性成分。
优选的，所述药物组合物中，还包括药学上所必需的载体；所述载体的实例如，乳剂、膏剂、凝胶剂、医用无纺布或医用绷带。
优选的，所述药物组合物中，还包括其他活性诱导因子，所述活性诱导因子包括但不限于类胰岛素生长因子(IGF)、转化生长因子-β、血小板源性生长因子 (PDGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)中的一种或几种。
本发明第四方面，提供第一方面所述肌腱修复材料、第三方面所述药物组合物在制备肌腱修复产品中的应用。
优选的，所述肌腱修复产品为包括但不限于药物或保健品；所述药物的制剂形式包括但不限于补片、外科用密封剂、修复凝胶中的一种。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
(1)本发明充分模拟人体结缔组织胶原蛋白的交联环境，在无化学交联物质的参与下，采用单胺氧化酶对伯氨、仲氨、叔氨的氧化特性，在辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸以及铜离子的活化下，将脱细胞支架、脱细胞基质凝胶和骨膜蛋白交联，与化学交联剂相比，避免了化学交联剂残留可能引起的机体组织炎症风险，减少了生产工艺化学残留验证环节。与辐射交联工艺相比，避免了材料中的有益成分破坏。提高了整体材料的生物相容性和生物活性。
(2)本发明采用0.05％-10％质量分数的动物脱细胞基质骨膜蛋白凝胶，使混合物在负压状态下填充到跟腱脱细胞支架中，冷冻干燥后，依然保持了30％-75％的孔隙率。且凝胶在胺氧化酶的催化作用下与骨膜蛋白、细胞外基质交联，提供了一定地应力应变弹性，更好模拟了天然组织纤维软骨的粘弹特性。
(3)骨膜蛋白以交联的形式包裹在脱细胞基质凝胶中，再以负压的形式渗透到支架组织的不同层面，在体液浸析的作用下，不断持续的释放到修复环境中，有利于持续诱导组织成纤维细胞再生，避免蛋白直接混合在凝胶中，产品植入到体内后造成的细胞因子在局部组织突释和无效聚集，进而可能造成炎症发生。
(4)本发明采用骨膜蛋白或重组人骨膜蛋白作为肌腱损伤部位的重组成分，可有效提高植入体内胶原纤维的力学强度。材料移植后的鸡肌腱缺损模型与单纯牛肌腱细胞外基质移植后的鸡肌腱缺损模型相比，混合材料修复的鸡肌腱愈后成功率高，且后期无其他并发症。混合材料修复的鸡肌腱组织中胶原蛋白的直径较单纯细胞外基质修复后的肌腱中胶原蛋白直径大，拉伸力较强。产品植入5周后，混合材料修复的肌腱组织中赖氨酰氧化酶和骨膜蛋白相对含量显著增加，表明材料可能通过骨膜蛋白激活赖氨酰氧化酶，促进体内再生胶原蛋白交联，提高结缔组织的力学特性。
附图说明
构成本发明的一部分说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1、对比例1、对比例2中所述肌腱修复材料中骨膜蛋白的释放曲线；
图2位实施例1、对比例1中所述肌腱修复材料的大鼠皮下植入后10天组织病理切片；
其中左图为实施例1皮下植入后组织病理切片，右图为对比例1皮下植入后组织病理切片。
图3为大鼠跟腱中成纤维细胞的荧光染色照片；
其中，左图为免疫荧光染色观察共培养后3天的增殖情况，右图为免疫荧光染色观察共培养后7天的增殖情况。
图4为SD大鼠缺损修复试验模型照片；
其中，左图为对跟腱进行缝合的空白对照组照片；右图为采用实施例1中所述肌腱修复材料包裹修复后的效果。
图5为来享鸡肌腱修复效果图；
其中，图5A为来享鸡肌腱修复后2周后效果图；
图5B为来享鸡肌腱修复5周后效果图；
图5C为来享鸡肌腱修复8周后效果图；
图5D为对照组直接缝合的来享鸡肌腱效果图。
图6为来享鸡肌腱修复5周后，组织中的LOX蛋白、POSTN蛋白的相对含量图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中提供的肌腱修复材料作为一种植入材料应用还存在生物相容性不佳、制备工艺复杂难以实现工业化等缺陷，为了解决如上的技术问题，本发明提供了一种骨膜蛋白交联的肌腱修复材料。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1、牛跟腱的脱细胞基质凝胶制备
(1)将牛跟腱用氧化电位水超声波清洗去除表面病毒，置于-20℃反复冻融3次，刮除组织表面油脂。于室温25℃将牛跟腱浸于0.5mol/LEDTA溶液中，振荡1.5h，再置于5MNaCl、0.05M NaOH、0.5M Na2CO3混合的高渗溶液中，振荡40min，该过程重复8次，最后采用纯净水震荡1h，重复5次。
(2)去除免疫原性：用分别含0.1％核酸酶、胃蛋白酶的PBS溶液脱除残留的核酸以及端肽，多次PBS缓冲液清洗后得到牛跟腱组织的脱细胞基质，将其冷冻干燥获得一种多孔的脱细胞支架材料。
(3)脱细胞基质孵育：将脱细胞基质加入0.5％的胃蛋白酶溶液和0.01M pH＝2 的HCl溶液中常温振荡24h，37℃孵育48h后向孵育体系中加入0.1M氢氧化钠溶液和PBS缓冲液，调节pH至7.4，再置于胰蛋白酶溶液溶于PBS缓冲液常温 48h后，得到动物组织的脱细胞基质凝胶，得到牛跟腱的脱细胞基质凝胶 (Collagen Gel)，配成质量分数为3％的脱细胞基质凝胶。
2、骨膜蛋白交联后的膜材料
(1)将骨膜蛋白(POSTN)溶于牛跟腱的脱细胞基质凝胶中得到一种骨膜蛋白凝胶(CG-POSTN)，所述凝胶中，骨膜蛋白的质量分数为0.1％。
(2)将质量分数为3％的骨膜蛋白凝胶涂覆在上述脱细胞支架中，密闭环境中 -0.03MPa抽滤加压1h，使骨膜蛋白凝胶灌入脱细胞支架的空隙中获得一种骨膜蛋白凝胶支架，脱细胞支架(ECM)与骨膜蛋白凝胶(CG-POSTN)的质量比为 60％：40％。
(3)用含有质量分数1％的单胺氧化酶、1％黄素腺嘌呤二核苷酸、0.1M的硫酸铜的混合溶液浸泡所述骨膜蛋白凝胶支架，37℃反应24小时，PBS水多次冲洗后，在压缩机中冷冻干燥，环氧乙烷灭菌。
实施例2
1、牛韧带的脱细胞基质凝胶的制备
(1)将牛韧带组织用氧化电位水超声波清洗去除韧带组织表面病毒，置于-20℃反复冻融4次，刮除表面油脂。于室温25℃将牛韧带组织浸于0.5mol/LEDTA溶液中，振荡2.0h，再置于1.0M NaCl、0.5M NaOH、0.2M Na2CO3混合的高渗溶液中，振荡40min，该过程重复5次；最后采用纯净水震荡1h，重复10次。
(2)去除免疫原性：用分别含0.05％核酸酶、胃蛋白酶的PBS溶液脱除残留的核酸以及端肽，多次PBS缓冲液清洗后得到牛韧带组织的脱细胞基质，再经冷冻干燥获得相应的脱细胞支架材料。
(3)脱细胞基质孵育：0.5％的胃蛋白酶溶液和0.01M pH＝2的HCl溶液中常温振荡24h，37℃孵育48h后向孵育体系中加入0.1M氢氧化钠溶液和PBS缓冲液，调节pH至7.4，再置于胰蛋白酶溶液溶于PBS缓冲液常温48h后，得到牛韧带的脱细胞基质凝胶(CollagenGel)。
2、骨膜蛋白交联后的膜材料
(1)将骨膜蛋白(POSTN)溶于上述质量分数6％牛韧带的脱细胞基质凝胶中获得一种骨膜蛋白凝胶(CG-POSTN)，其中，所述骨膜蛋白的质量分数为0.3％。
(2)将含骨膜蛋白脱细胞基质凝胶涂覆在冷冻干燥的脱细胞支架上，密闭环境中-0.1MPa抽滤加压30min，使混合物灌入脱细胞支架空隙中获得一种骨膜蛋白凝胶支架；脱细胞支架(ECM)与骨膜蛋白凝胶(CG-POSTN)的质量比为50％： 50％。
(3)用含有质量分数3.0％的单胺氧化酶、3.0％黄素腺嘌呤二核苷酸、0.25M的硫酸铜的混合溶液浸泡所述骨膜蛋白凝胶支架，37℃反应24小时，PBS缓冲液多次冲洗后，在压缩机中冷冻干燥，环氧乙烷灭菌。
实施例3
1、牛跟腱细胞外基质及凝胶的制备
(1)将牛跟腱用氧化电位水超声波清洗去除动物表面病毒，置于-20℃反复冻融 4次，刮除组织表面油脂。于室温25℃将动物组织浸于0.5mol/LEDTA溶液中，振荡1h，再置于3M NaCl、0.1M NaOH、1M Na2CO3混合的高渗溶液中，振荡 40min，该过程重复10次。最后采用纯净水震荡1h，重复6次。
(2)去除免疫原性：用分别含0.08％核酸酶、胃蛋白酶的PBS溶液脱除残留的核酸以及端肽，多次PBS缓冲液清洗后得到牛跟腱组织的脱细胞基质。冷冻干燥获得多孔支架材料。
(3)脱细胞基质孵育：1％的胃蛋白酶溶液和0.01M pH＝2的HCl溶液中常温振荡24h，37℃孵育48h后向孵育体系中加入0.1M氢氧化钠溶液和PBS缓冲液，调节pH至7.4，再置于胰蛋白酶溶液溶于PBS缓冲液常温48h后，得到牛跟腱脱细胞基质凝胶(Collagen Gel)。
2、骨膜蛋白交联后的膜材料
(1)将骨膜蛋白(POSTN)溶于牛跟腱或韧带组织的脱细胞基质凝胶中，获得质量分数0.5％的骨膜蛋白-脱细胞基质凝胶的混合物(CG-POSTN)。
(2)将质量分数为1％含0.5％骨膜蛋白的凝胶涂覆在冷冻干燥的脱细胞支架，密闭环境中-0.05MPa抽滤加压30min，使混合物灌入脱细胞支架空隙中获得一种骨膜蛋白凝胶支架，细胞外基质支架(ECM)与骨膜蛋白凝胶(CG-POSTN) 的质量比为80％：20％。
(3)用含有质量分数5％的单胺氧化酶、5％黄素腺嘌呤二核苷酸、0.5M的硫酸铜的混合溶液浸泡所述骨膜蛋白凝胶支架，37℃反应24小时，PBS缓冲液多次冲洗后，在压缩机中冷冻干燥，环氧乙烷灭菌。
对比例1
1、牛跟腱的脱细胞基质凝胶制备
(1)将牛跟腱用氧化电位水超声波清洗去除表面病毒，置于-20℃反复冻融 3次，刮除组织表面油脂。于室温25℃将牛跟腱浸于0.5mol/LEDTA溶液中，振荡1.5h；5M NaCl、0.05M NaOH、0.5M Na2CO3混合的高渗溶液中，振荡40min，该过程重复8次，最后采用纯净水震荡1h，重复5次。
(2)去除免疫原性：用分别含0.1％核酸酶、胃蛋白酶的PBS溶液脱除残留的核酸以及端肽，多次PBS缓冲液清洗后得到牛跟腱组织的脱细胞基质，将其冷冻干燥获得一种多孔的脱细胞支架材料。
(3)脱细胞基质孵育：将脱细胞基质加入0.5％的胃蛋白酶溶液和0.01M pH＝2的HCl溶液中常温振荡24h，37℃孵育48h后向孵育体系中加入0.1M氢氧化钠溶液和PBS缓冲液，调节pH至7.4，再置于胰蛋白酶溶液溶于PBS缓冲液常温48h后，得到牛跟腱的脱细胞基质凝胶，配成质量分数为3％的脱细胞基质凝胶。
2、混合骨膜蛋白的膜材料
(1)将骨膜蛋白(POSTN)溶于牛跟腱的脱细胞基质凝胶中得到一种骨膜蛋白凝胶(CG-POSTN)，所述凝胶中，骨膜蛋白的质量分数为0.1％。
(2)将质量分数为3％的骨膜蛋白凝胶涂覆在上述脱细胞支架中，密闭环境中-0.5MPa抽滤加压1h，使骨膜蛋白凝胶灌入脱细胞支架的空隙中获得一种骨膜蛋白凝胶支架，脱细胞支架(ECM)与骨膜蛋白凝胶(CG-POSTN)的质量比为 60％：40％。在压缩机中冷冻干燥，环氧乙烷灭菌。
对比例2
在对比例1的基础上，将覆合骨膜蛋白的膜材料整体在钴60作用下辐照交联并灭菌，再冷冻干燥。
性能表征
1、材料孔隙率
方法：采用排液法，即通过循环抽真空的方法，将材料内部孔隙中的气体排出，并使其充满液体，计算这部分液体重量占材料总重量的百分比。称取干燥后的试样0.6g(W)左右剪成条状放入乘有水的容量瓶中，循环抽真空至样品表面不再有气泡溢出并且样品沉底，称含有样品与水的容量瓶重量(W2)，再将内部含有水的试样取出，称剩余的容量瓶与水重量(W3)，计算孔隙率公式为＝ (W2-W3-W1)/(W2-W3)*100％，结果见下表1：
表1
结论：5％CG-POSTN按照不同比例浸入到脱细胞支架后，ECM与混合凝胶的质量比为5:5时，材料依然保持较好的孔隙率；当ECM与CG-POSTN的质量比为4:6时，材料孔隙率较低。增加CG-POSTN的质量分数会降低材料的孔隙率，不利于诱导周围细胞转移爬行生长。
2、溶胀性能
用PBS(PH 7.4、37℃)测定膜的溶胀率，将干燥的膜切成1×1cm碎片，称量溶胀前的质量(WD)，再将碎片浸泡在PBS中，1h后取出薄膜碎片，用滤纸吸干表面液体后称量其质量(WS)，溶胀率＝(WS-WD)/WD×100％。溶胀率如下表2所示：
表2
材料溶胀特性随着混合凝胶的质量浓度增加而降低，考虑到肌腱周围狭小的空间，材料溶胀体积过大必然会导致肌腱卡压和受阻，因此选择溶胀率在300％左右的材料有利于移植后材料在机体环境中的适应性，其中选择溶胀率在200％以下的材料对周围组织的压迫更符合临床需求。
3、体外缓释效果
将干燥的膜材料分别剪成20×30mm长条，再将其置于pH为7.4含0.05mg/ml 胶原酶I的PBS缓冲液的密闭容器，放置于37℃恒温摇床中，ELISA试剂盒分析材料在30天内的缓冲液中POSTN的释放量，并绘制释放曲线。
结果：在模拟体液降解的环境下，实施例1的POSTN蛋白随着材料降解缓慢释放到环境中，将蛋白因子与凝胶、ECM支架交联，避免了因材料降解不均匀造成的蛋白因子突释风险。对比例2的结果显示辐照交联可能引起凝胶和骨膜蛋白质结构破坏，造成材料整体不稳定，在模拟体液作用下降解比较快。
4、拉伸强度
将干燥的膜材料分别剪成60×10mm长条在生理盐水中浸湿后，用夹具夹住产品长的两端，开启拉力试验机，以100mm/min的速度进行拉伸，取最大断裂力作为本产品的拉伸强度。断裂伸长率＝变形后高度-原始高度/原始高度×100％。采用市售产品I型胶原膜作为对照。
表3
支架力学性质：脱细胞基质凝胶与ECM支架交联后，材料的断裂拉伸力和伸长率明显增加(P<0.05)，且材料在实际拉伸后有一定的回弹效果，可能是因为凝胶充入ECM支架的空隙中，形成了空隙内的织网微结构，相较单独空隙具有更好的抗张强度和回弹特性。
5、大鼠皮下植入验证
试验大鼠术前禁食，待麻醉完全后，大鼠背部备皮，75％酒精消毒后，沿背部中线做皮肤切口，用钝性分离法制备四个皮下囊，分别将实施例1和对比例1 的样品放入皮下囊内，逐层缝合切口，术后10天观察试验大鼠局部、全身的异常。切下植入后的组织，进行病理学检查。
结果：实施例1植入后得大鼠背部皮肤正常无红肿、斑块现场，近周围组织的病理切片显示组织细胞排列规则、有序；对比例1植入后的大鼠背部皮肤有少部分红肿和结块，病例切片显示有较多细胞不规则聚集，可能与炎症发生有关。如图2所示。
6、成纤维细胞增殖验证
方法：取新生SPF级SD大鼠跟腱，蛋白酶消化、PBS冲洗后，分离纯化的成纤维细胞，接种于25mL DMEM/F12培养，制备为106-107的细胞悬液，在96 孔板内与样品进行共同培养。免疫荧光染色观察共培养后3天、7天成纤维细胞的增殖情况。
结果：产品与成纤维细胞有较好的生物相容性，能够诱导成纤维细胞间产生大量微丝结构，交织连接成网状。细胞数量增多后，细胞核多见重合。因此，产品对细胞增殖及功能分化起促进作用。
7、SD大鼠缺损修复试验
方法：去除大鼠脚跟部皮肤暴露跟腱组织，在距远端附着点1cm的位置剪断两根跟腱，构建跟腱不规则断裂受伤模型。
图4左图为跟腱断裂后简单缝合后30天的空白对照；图3右图为跟腱断裂后使用本发明的复合材料包裹修复30天后的效果图。左图显示大鼠肌肉萎缩坏死，肌腱液化；右图显示大鼠两根肌腱生长修复状态正常，肌肉部位血供良好，未见异常现象。
8、来享鸡肌腱缺损修复试验
方法：取健康白色雌性来享鸡，氯胺酬肌肉注射麻醉(10-20mg/kg)后，常规消毒铺巾，在无菌条件下，取鸡的右足第4趾暴露趾浅及趾深屈肌腱。于中节趾骨处切断趾浅及趾深屈肌腱。对照组为肌腱断裂后直接用可吸收缝线缝合；实验组1采用ECM支架在断裂处用可吸收缝线缝合修复；实验组2用 ECM+5％CG-POSTN用可吸收缝线缝合修复；对比例组采用对比例1中未交联的ECM复合5％CG-POSTN可吸收缝线修复。术后3周，解除固定让鸡自由活动。术后2、5、8周观察两组动物右足第3趾皮肤切口的愈合，肌腱的色泽、吻合口处的愈合形态、粘连范围及性质。
生物力学测定：取出移植后6周来享鸡的肌腱。用9％氯化钠注射液保湿处理后，用万能测试仪行拉伸负荷试验。
结果：ECM+5％CG-POSTN植入后肌腱修复效果图，图5A来享鸡肌腱修复后2周，周围有明显的血供生成，整个肌腱无炎证，肌腱外表皮颜色正常；图 5B来享鸡肌腱修复5周，修复处有明显膨胀感，可能是体液浸析材料引起，但无炎症反应；图5C为来享鸡肌腱修复8周后效果图肌腱周围无黏连，新生肌腱透明且排列整齐；图5D为对照组直接缝合后肌腱与周围组织黏连在一起，鸡行走表现不顺畅。
表4
注：ECM组、ECM+CG-POSTN组、对比例组和对照比P＜0.05
结果：术后8周，ECM+CG-POSTN实验组修复后的新生肌腱抗张力明显大于ECM组、对照组和对比例组；术后12周ECM+CG-POSTN实验组的肌腱修复成功率高于另外三组，差异有统计学意义(P<0.05)。
9、LOX蛋白、POSTN蛋白的相对含量分析
分别取ECM、ECM+CG-POSTN修复后5周的来享鸡肌腱组织，用ELISA 检测组织中的LOX蛋白、POSTN蛋白的相对含量。结果发现，ECM+CG-POSTN 在修复过程中的肌腱组织中LOX蛋白、POSTN蛋白含量较高，可能影响再生肌腱组织的力学特性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肌腱修复材料，其特征在于，所述肌腱修复材料中，骨膜蛋白均匀分布于脱细胞基质凝胶及脱细胞支架中，并且所述骨膜蛋白、脱细胞基质凝胶及脱细胞支架彼此间交联。
2.如权利要求1所述的肌腱修复材料，其特征在于，所述骨膜蛋白为重组蛋白；
优选的，所述脱细胞基质凝胶或脱细胞支架来源于动物体中胶原蛋白含量较高的结缔组织，包括但不限于筋膜、韧带、肌腱、皮肤、软骨中的一种或几种；进一步的，所述脱细胞基质凝胶或脱细胞支架优选动物的韧带或肌腱组织。
3.如权利要求1所述的肌腱修复材料，其特征在于，所述骨膜蛋白、脱细胞基质凝胶或脱细胞支架的动物来源于哺乳动物，为包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猕猴、羊、马、牛、驴、猪、鸡、狗中的一种；
优选的，所述骨膜蛋白依据使用肌腱修复材料的使用对象进行调整，应用于人体肌腱修复的材料中，骨膜蛋白为人来源骨膜蛋白；
优选的，所述脱细胞基质凝胶或脱细胞支架的来源可能需要依据肌腱修复材料的使用对象和材料获取难度、材料加工难度进行调整，应用于人的肌腱修复材料中，所述脱细胞基质凝胶或脱细胞支架的为羊、马、牛、驴或猪。
4.权利要求1-3任一项所述肌腱修复材料的制备方法，其特征在于，所述肌腱修复材料的制备方法中，包括采用生物交联剂处理促使骨膜蛋白与脱细胞基质凝胶、脱细胞支架发生交联；所述生物交联剂中至少包括胺氧化酶。
5.如权利要求4所述肌腱修复材料的制备方法，其特征在于，所述胺氧化酶包括单胺氧化酶和二胺氧化酶；
进一步的，为单胺氧化酶；
进一步的，所述铜离子优选采用无机盐形式进行添加，包括氯化铜及硫酸铜；
更进一步的，所述生物交联剂中各成分比例如下：单胺氧化酶0.05-5％(w/w)、0.01-5％黄素腺嘌呤二核苷酸(w/w)、0.01M～0.5M的硫酸铜(w/w)；所述生物交联剂以Tris缓冲液作为溶剂，所述溶剂浓度为50-100mmol/L，pH为6～8。
6.如权利要求4所述肌腱修复材料的制备方法，其特征在于，所述肌腱修复材料的制备方法包括以下步骤：取动物组织去除油脂后置于高渗溶液中脱除细胞组织，再通过核酸酶、胃蛋白酶去除免疫原性物质得到所述动物组织的脱细胞基质；
将所述脱细胞基质干燥获得脱细胞支架；
将所述脱细胞基质加入蛋白酶溶液中孵育获得脱细胞基质凝胶；
将骨膜蛋白溶于上述脱细胞基质凝胶中获得骨膜蛋白凝胶；将所述骨膜蛋白凝胶灌入脱细胞支架后浸入生物交联剂浸泡得到所述肌腱修复材料。
7.如权利要求6所述肌腱修复材料的制备方法，其特征在于，所述动物组织为羊、马、牛、驴、猪等哺乳动物的韧带或肌腱组织；
或，所述去除油脂的方式如下：将清洗后的动物组织反复冻融若干次之后再对组织表面油脂进行刮除；将动物组织反复冻融通过冰晶形成刺破细胞膜使动物组织更容易剥离；
进一步的，所述脱除细胞组织的操作中，还包括采用胰蛋白酶和/或EDTA处理去除油脂后的动物组织，再通过高渗溶液去除细胞组织；
或，所述高渗溶液为氯化钠、氢氧化钠及碳酸钠的混合溶液；更进一步的，所述高渗溶液中包含1M～5M NaCl、0.01M～0.5M NaOH、0.1M～1M Na2CO3；
或，所述核酸酶、胃蛋白酶为0.05～0.15％核酸酶、胃蛋白酶的PBS溶液；
或，所述脱细胞支架采用冷冻干燥的方式；
或，所述脱细胞基质凝胶的制备方式如下：所述蛋白酶溶液中包括0.5-1％的胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液；
优选的，所述脱细胞基质凝胶的制备方式如下：将脱细胞基质置于0.5-1％的胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液和0.01M pH＝2的HCL溶液中常温振荡24h，37℃孵育48h后加入0.1M氢氧化钠溶液和PBS缓冲液，调节pH至7.4，再置于胰蛋白酶溶液溶于PBS缓冲液常温48h后，得到所述脱细胞基质凝胶；
或，所述骨膜蛋白凝胶灌入脱细胞支架的方式为通过加压的方式灌入；具体的实施方式中，将所述骨膜蛋白凝胶涂覆在脱细胞支架表面后放入密封环境中进行加压。
8.如权利要求7所述肌腱修复材料的制备方法，其特征在于，所述肌腱修复材料的制备方法如下：
(1)将动物跟腱或韧带组织用氧化电位水超声波清洗去除表面病毒，置于-20℃-80℃反复冻融3-4次，刮除组织表面油脂；于室温25℃将组织置浸入0.5mol/LEDTA溶液中振荡1-2h；再置于1M～5M NaCl、0.01M～0.5M NaOH、0.1M～1M Na2CO3混合的高渗溶液中，振荡40min，重复震荡及高渗溶液震荡过程5-10次；最后采用纯净水震荡1h，重复5-10次；
(2)去除免疫原性：将(1)中处理后的动物组织依次用含0.01％-0.1％核酸酶、胰蛋白酶的PBS溶液脱除残留的核酸以及端肽，再用PBS缓冲液清洗若干次后得到脱细胞基质；将所述脱细胞基质冷冻干燥获得脱细胞支架材料；
(3)脱细胞基质孵育：将(2)中所述脱细胞基质置于0.5-1％的胃蛋白酶溶液和0.01MpH＝2的HCl溶液中常温振荡24h，37℃孵育48h后向孵育体系中加入0.1M氢氧化钠溶液和PBS缓冲液，调节pH至7.4，再置于胰蛋白酶溶液溶于PBS缓冲液常温48h后，得到动物组织的脱细胞基质凝胶，配置成脱细胞基质凝胶的质量浓度为0.05％-10％，优选质量分数为3％；
(3)将骨膜蛋白溶于动物组织的脱细胞基质凝胶中，获得质量分数0.005％-0.5％的骨膜蛋白凝胶；其中骨膜蛋白的质量分数为0.005％-0.5％，优选质量分数为0.1％；
(4)将(3)中所述骨膜蛋白凝胶涂覆在(2)中所述脱细胞支架中，密闭环境中-0.01～-0.1MPa抽滤加压0.5-1h，使骨膜蛋白凝胶灌入脱细胞支架空隙中获得一种骨膜蛋白凝胶支架，所述脱细胞支架与骨膜蛋白凝胶的质量比为(80％-50％)：(20％-50％)，优选60％:40％；
(5)用含有质量分数0.1-5％的单胺氧化酶、0.01-5％黄素腺嘌呤二核苷酸、0.01M～0.5M的硫酸铜的混合溶液浸泡上述骨膜蛋白凝胶支架，37℃反应2-24小时，反应结束后，将骨膜蛋白凝胶支架采用PBS水多次冲洗，再在压缩机中冷冻干燥，环氧乙烷灭菌得到所述肌腱修复材料。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中权利要求1-3任一项所述肌腱修复材料作为活性成分；
优选的，所述药物组合物中，还包括药学上所必需的载体；所述载体的实例如，乳剂、膏剂、凝胶剂、医用无纺布或医用绷带；
优选的，所述药物组合物中，还包括其他活性诱导因子，所述活性诱导因子包括但不限于类胰岛素生长因子、转化生长因子-β、血小板源性生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子中的一种或几种。
10.权利要求1-3任一项所述肌腱修复材料、权利要求9所述药物组合物在制备肌腱修复产品中的应用；
优选的，所述肌腱修复产品为包括但不限于药物或保健品；所述药物的制剂形式包括但不限于补片、外科用密封剂、肌腱修复器中的一种。
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