CN115607740A - 一种生长因子复合肌腱及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及肌腱/韧带损伤修复技术领域，具体公开了一种生长因子复合肌腱。本申请提供的生长因子复合肌腱包括脱细胞肌腱和生长因子‑PLGA微球，所述生长因子‑PLGA微球负载于所述脱细胞肌腱表面；其中，生长因子‑PLGA微球选自bFGF‑PLGA微球、BMP‑2‑PLGA微球和BMP‑7‑PLGA微球；以及上述生长因子复合肌腱的制备方法：将脱细胞肌腱置于浸泡装置中，并向浸泡装置中加入生长因子‑PLGA微球，浸泡20‑30h，即可获得生长因子复合肌腱。本申请提供的生长因子复合肌腱能够定向促进组织再生，增加肌腱与骨组织之间的固定强度，提高肌腱与骨组织之间的整合能力。

Description

一种生长因子复合肌腱及其制备方法
技术领域
本申请涉及肌腱/韧带损伤修复技术领域，具体涉及一种生长因子复合肌腱及其制备方法。
背景技术
关节韧带损伤是常见的运动损伤之一，世界上每年都有大量的新发病例，因此已经成为了影响全球的健康问题。肌腱/韧带是纤维结缔组织，分别连接肌肉与骨骼或骨骼与骨骼，起到牵引和稳定的作用，一旦发生损伤，将会大大降低患者的生活质量，严重的将会导致功能性残疾。
为了恢复关节韧带损伤后膝关节的功能，往往需要进行ACL重建手术，当前的临床重建移植物有自体肌腱、同种异体肌腱和人工韧带三种。其中自体肌腱取自患者自身的腘绳肌、股薄肌等，自体肌腱移植会对患者造成二次损伤，不利于后期康复，同时自体肌腱的长度和直径受取材部位的限制，难以达到使用标准；同种异体肌腱在临床使用中存在免疫排斥和感染风险，而且供体来源有限；人工韧带通常为高分子有机材料，其降解产物会改变关节局部微环境，容易引起无菌性炎症。除此之外，肌腱、软骨等组织缺少血运，故组织再生困难，而移植物主要以功能替代为主，并无促进组织再生的能力，因此组织和移植物生物整合困难，长期植入依旧存在再断裂的风险。
因此，目前急需提供一种免疫排斥低、组织再生能力好的移植物来实现韧带损伤后膝关节的功能修复。
发明内容
为了提高临床重建移植物的组织再生能力、降低免疫排斥，本申请提供一种生长因子复合肌腱及其制备方法。
本申请提供一种生长因子复合肌腱，采用如下的技术方案：
一种生长因子复合肌腱，所述生长因子复合肌腱包括脱细胞肌腱和生长因子-PLGA微球，所述生长因子-PLGA微球负载于所述脱细胞肌腱表面。
本申请通过向脱细胞肌腱的表面负载生长因子-PLGA微球，从而获得了一种免疫排斥性小、感染风险低、修复性能优异的生长因子复合肌腱，该生长因子复合肌腱可用于前十字交叉韧带（ACL）的重建，帮助骨道愈合，促进肌腱软组织的再生，进而增加肌腱与骨组织之间的固定强度，提高肌腱与骨组织之间整合能力，避免韧带发生再次断裂。
在一些实施方案中，所述生长因子与所述PLGA微球的重量比可以为10000：（1-2）、10000：（1-3）、10000：（2-3）、10000：（2-4）或10000：（3-4）。
在一个具体的实施方案中，所述生长因子与所述PLGA微球的重量比还可以为10000：1、10000：2、10000：3或10000：4。
优选地，所述生长因子-PLGA微球中，所述生长因子与所述PLGA微球的重量比为10000：（2-3）。
本申请中，生长因子复合肌腱表面生长因子的释放速度对早期组织的再生能力存在一定影响，当生长因子的释放速度过慢时，软骨细胞与成骨细胞的分化与增殖速度缓慢，致使肌腱组织与骨组织的再生能力较差；而当释放速度过快时，一是生长因子的半衰期较短，扩散、细胞吸附和降解很难控制其局部浓度，因此不能达到理想的生物活性；二是细胞内吞生长因子受体复合物，导致细胞表面信号通路阻断，生长因子难以实现治疗效果。因此，本申请将生长因子负载于PLGA，从而获得了具有缓释性能的生长因子-PLGA微球；通过进一步将生长因子与PLGA微球的重量比控制在10000：（2-3）之间，能够延长生长因子的半衰期，使生长因子的释放速度与肌腱、骨组织的修复速率一致，进而缓慢促进肌腱与骨组织再生，提高肌腱与骨组织之间的结合力，有效避免重建后的韧带再次发生断裂。
本申请中，生长因子选自bFGF、BMP-2和BMP-7。
BMP-2和BMP-7能够诱导未分化间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖，促进成骨细胞分化成熟，实现骨和软骨的生长发育与重建；因此，本申请将BMP-2生长因子负载于脱细胞肌腱表面，所得生长因子复合肌腱用于ACL重建术中，能够加速骨道愈合，促进十字交叉韧带的修复，提高肌腱与骨组织之间的固定强度。bFGF是碱性成纤维细胞生长因子，能够刺激细胞增殖、促进肌腱软组织再生，将其负载于脱细胞肌腱表面，能够促进肌腱软组织再生，提高肌腱的使用性能，避免肌腱在使用过程中发生断裂。
优选地，所述生长因子-PLGA微球为bFGF-PLGA微球和BMP-2-PLGA微球。
优选地，所述生长因子复合肌腱一端开始依次划分为A段、B段、C段、D段、E段；其中，B段与D段长度相等，A段与E段长度相等；
所述生长因子复合肌腱表面：
A段、C段、E段负载BMP-2-PLGA微球；
B段、D段负载bFGF-PLGA微球。
根据临床ACL重建术的需要，通常将肌腱对折使用，对折后肌腱的端部（A段、C段、E段）会位于骨道内，中间部分（B段、D段）则连接于两关节之间。本申请向脱细胞肌腱的A段、C段、E段表面负载BMP-2-PLGA微球，脱细胞肌腱的B段、D段表面负载bFGF-PLGA微球，并将上述脱细胞肌腱用于交叉韧带修复，A段、C段、E段能够持续稳定释放BMP-2生长因子，促进骨道愈合，进而增加肌腱与骨组织的固定强度；而B段、D段会稳定释放bFGF生长因子，促进肌腱软组织再生，避免肌腱发生再次断裂。因此，本申请提供的生长因子复合肌腱能够在韧带修复早期，定向促进骨道愈合及肌腱软组织再生，提高ACL重建术后恢复速度与效果，降低再次断裂的风险。
优选地，所述脱细胞肌腱表面bFGF-PLGA微球的负载量为0.8-1.2ng/cm2、BMP-2-PLGA微球的负载量为0.8-1.2ng/cm2。
优选地，所述脱细胞肌腱来源于猪肌腱。
优选地，所述脱细胞肌腱来源于猪后肢指浅屈肌腱。
本申请中，采用猪后肢指浅屈肌腱作为生长因子复合肌腱，解决了同种异体肌腱来源有限的问题，并通过对猪后肢指浅屈肌腱进行处理，能有效去除肌腱中的细胞，解决了异种肌腱的免疫原性问题。因此，本申请提供的生长因子复合肌腱具有来源广泛、免疫排斥低、不会引起并发症等优点，具有很好的应用前景。
第二方面，本申请提供一种生长因子复合肌腱的制备方法，采用如下的技术方案：
一种生长因子复合肌腱的制备方法，包括制备生长因子复合肌腱：将所述脱细胞肌腱置于浸泡装置中，并向浸泡装置中加入生长因子-PLGA微球，浸泡20-30h，即可获得生长因子复合肌腱。
本申请通过将脱细胞肌腱置于含有生长因子-PLGA微球的浸泡装置中浸泡20-30h，能够使生长因子-PLGA微球充分且牢固地负载于脱细胞肌腱表面，从而获得生长因子负载量高的生长因子复合肌腱。
在一些实施方案中，所述浸泡时间可以为20-25h或25-30h。
在一个具体的实施方式中，所述浸泡时间还可以为20h、25h或30h。
优选地，所述生长因子复合肌腱的制备方法还包括生长因子-PLGA微球制备，具体步骤为：将PLGA、生长因子依次溶于氯仿中，获得氯仿溶液；然后将所述氯仿溶液加入到PVA17-88水溶液中，在7500-9000rpm下高速均质10-20s，然后在400-500rpm下低速搅拌3-4h，即可获得PLGA微球。
本申请将生长因子-PLGA微球制备步骤中，均质速率与搅拌速率控制在上述范围内，能够使生长因子分散地更加均匀，获得的PLGA微球的生长因子缓释效果更好。
优选地，所述浸泡装置为并排设置的3个容器，3个容器相接触的侧壁含有控孔洞，3个容器由控孔洞相连通。
本申请提供了一种特定的浸泡装置，该浸泡装置能够实现脱细胞肌腱表面生长因子的多段定向负载，进而能够获得特定的生长因子复合肌腱。
优选地，所述肌腱对折并位于所述控孔洞中；所述浸泡装置两侧的容器中加入BMP-2-PLGA微球，中间容器中加入bFGF-PLGA微球。
本申请向浸泡装置两侧的容器中加入BMP-2-PLGA微球，中间容器中加入bFGF-PLGA微球，能够使获得的脱细胞肌腱的A段、C段、E段表面负载BMP-2-PLGA微球，脱细胞肌腱的B段、D段表面负载bFGF-PLGA微球。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1. 本申请提供的生长因子复合肌腱表面含有生长因子，将其用于ACL重建术中，能够有效帮助骨道愈合，促进肌腱软组织的再生，进而增加肌腱与骨组织之间的固定强度，提高肌腱与骨组织之间整合能力，避免韧带发生再次断裂。
2. 本申请将生长因子与PLGA微球的重量比控制在10000：（2-3）之间，能够保证生长因子持续性稳定释放，生长因子能持续促进肌腱与骨组织再生，进而提高肌腱与骨组织之间的结合力。
3. 本申请提供的生长因子复合肌腱表面负载多种生长因子，其中A段、C段、E段表面负载BMP-2-PLGA微球，B段、D段表面负载bFGF-PLGA微球。将该生长因子复合肌腱用于交叉韧带中，A段、C段、E段位于骨道内，其表面的BMP-2生长因子能够促进骨道愈合，进而增加肌腱与骨组织的固定强度；B段、D段则处于两关节之间，保持关节的稳定性，其表面的bFGF能够促进肌腱软组织再生，避免肌腱再次发生断裂。
4. 本申请中，脱细胞肌腱表面bFGF-PLGA微球的负载量为0.8-1.2ng/cm2、BMP-2-PLGA微球的负载量为0.8-1.2ng/cm2。
5. 本申请将生长因子复合肌腱的制备方法中，浸泡时间控制20-30h，能够使生长因子-PLGA微球充分且牢固地负载于脱细胞肌腱表面，从而获得生长因子负载量高的生长因子复合肌腱。
附图说明
图1是本申请提供的生长因子复合肌腱的制备方法流程图。
图2是脱细胞肌腱的划分示意图。
图3是浸泡装置示意图。
具体实施方式
本申请提供一种生长因子复合肌腱，该生长因子复合肌腱包括脱细胞肌腱和生长因子-PLGA微球，生长因子-PLGA微球负载于脱细胞肌腱表面；进一步地，生长因子-PLGA微球中，生长因子与PLGA微球的重量比为10000：（2-3），生长因子选自bFGF、BMP-2和BMP-7；再进一步地，生长因子-PLGA微球为bFGF-PLGA微球和BMP-2-PLGA微球。
上述生长因子复合肌腱的制备方法如图1所示，具体为：
（1）肌腱预处理：对猪后肢指浅屈肌腱进行前处理与酶处理，获得脱细胞猪肌腱。
（2）生长因子-PLGA微球制备：将PLGA（LA/GA=50/50，分子量5.5万）、生长因子依次溶于氯仿中，获得氯仿溶液；然后将所述氯仿溶液加入到PVA17-88水溶液中，在7500-9000rpm下高速均质10-20s，然后在400-500rpm下低速搅拌3-4h，即可获得PLGA微球；其中，所述生长因子为bFGF生长因子、BMP-2生长因子或BMP-7生长因子。
（3）制备生长因子复合肌腱：将浸泡装置清理、杀菌，将脱细胞猪腱对折并置于浸泡装置的控孔洞中，并向浸泡装置中加入生长因子-PLGA微球，浸泡20-30h，即可获得生长因子复合肌腱。
本申请中，浸泡装置可以为并排设置的3个容器，3个容器相接触的侧壁含有控孔洞，3个容器由控孔洞相连通；控孔洞的大小刚好能够使对折后的脱细胞肌腱穿过。
本申请具体的实施例中，生长因子bFGF、BMP-2、BMP-7购自赛业（广州）生物科技有限公司；PLGA购自广州创赛生物医用材料有限公司；浸泡装置为自制；其余原料、试剂、溶剂等也均可通过商购获得。
以下结合制备例、实施例、附图说明及性能检测试验对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1
制备例1提供一种脱细胞猪肌腱。
上述脱细胞猪肌腱的获取方法为：
（1-1）前处理：取检疫合格的猪后肢指浅屈肌腱做为原材料，剔除表面多余软组织，使用0.2%~0.4%的过氧乙酸溶液按照每克肌腱20毫升溶液的比例在100r/min的摇床速度下、室温浸泡1h；浸泡结束后，使用等体积的纯化水超声清洗3遍，每遍不少于15min；然后使用0.5%曲拉通和0.5%十二烷基硫酸混合溶液（体积比为1：1）按照每克肌腱20毫升混合溶液的比例在室温、120r/min下清洗12h；
（1-2）酶处理：使用0.75%胰酶-EDTA溶液室温下超声清洗2h，接着使用酶活力5~15U/ml的α-GaL抗原酶溶液清洗4~5h，最后使用酶活力5~15U/ml的核酸酶溶液清洗3~8h，清洗完毕后使用纯化水超声清洗，清洗结束后使用质量浓度0.5%的氢氧化钠清洗1h，清洗结束后采用纯化水清洗，获得（长度为20cm，直径d为6mm）的脱细胞猪肌腱。
制备例2-5
制备例2-5分别提供一种bFGF-PLGA微球。
上述制备例的不同之处在于：bFGF的添加量，具体如表1所示。
制备例2提供的bFGF-PLGA微球的之制备方法为：将100mgPLGA（LA/GA=50/50，分子量5.5万）、20ng bFGF生长因子溶于1mL氯仿中，获得氯仿溶液；然后将氯仿溶液逐滴加入到25mL、浓度为1%的PVA17-88水溶液中；依次在8000rpm下高速均质20s，在400rpm下低速搅拌4h，即可获得bFGF-PLGA微球。
表1 制备例2-5提供的bFGF-PLGA微球中bFGF生长因子的添加量
Figure 778530DEST_PATH_IMAGE001
制备例6
制备例6提供一种BMP-2-PLGA微球。
BMP-2-PLGA微球的制备方法为：将100mgPLGA（LA/GA=50/50，分子量5.5万）、20ngBMP-2生长因子溶于1mL氯仿中，获得氯仿溶液；然后将氯仿溶液逐滴加入到25mL、浓度为1%的PVA17-88水溶液中；依次在8000rpm下高速均质20s，在400rpm下低速搅拌4h，即可获得BMP-2-PLGA微球。
制备例7
制备例7提供一种BMP-7-PLGA微球。
上述BMP-7-PLGA微球的之制备方法为：将100mgPLGA（LA/GA=50/50，分子量5.5万）、20ng BMP-7生长因子溶于1mL氯仿中，获得氯仿溶液；然后将氯仿溶液逐滴加入到25mL、浓度为1%的PVA17-88水溶液中；依次在8000rpm下高速均质20s，在400rpm下低速搅拌4h，即可获得BMP-7-PLGA微球。
对比制备例
对比制备例1
对比制备例1提供一种bFGF-PLGA微球。
上述制备例与制备例2的不同之处在于：制备方法中的搅拌转速。
制备例2提供的bFGF-PLGA微球的制备方法为：将100mgPLGA（LA/GA=50/50，分子量5.5万）、20ng bFGF生长因子溶于1mL氯仿中，获得氯仿溶液；然后将氯仿溶液逐滴加入到25mL、浓度为1%的PVA17-88水溶液中；依次在6000rpm下高速均质20s，在300rpm下低速搅拌4h，即可获得bFGF-PLGA微球。
对比制备例2
对比制备例2提供了一种bFGF-明胶微球。
上述bFGF-明胶微球的制备方法为：
（1）明胶微球制备：称取4.5g明胶，加入15mL去离子水，在50℃条件下在磁力搅拌器上溶解明胶，约30min后得到澄清黄色明胶溶液；量取50mL液体石蜡和1mL Tween-20加入到100mL三口烧瓶中，利用数显型混合顶置式机械搅拌器进行搅拌，搅拌速度为400r，搅拌30min得到澄清溶液；在50℃水浴条件下将明胶溶液逐滴加入到油相（液体石蜡）中，保持50℃水浴20min；用冰块冰浴使体系降温至0℃，加入2mL 50%戊二醛进行交联1h；静置，倒掉上清液；向烧杯中加入石油醚洗去多余的液体石蜡，静置，倒掉上层白色乳液；再加入去离子水洗涤5次，直至上层没有油滴为止，得到淡黄色明胶微球悬浊液，置于50L离心管中放在负80℃冰箱中冷冻，然后将冷冻样品置于低温真空干燥机中干燥，得到黄色干燥的明胶微球。
（2）bFGF-明胶微球的制备：将20ng bFGF生长因子溶于1mL水中，获得bFGF生长因子水溶液；取100mg明胶微球与上述bFGF生长因子水溶液搅拌共混，使bFGF生长因子吸附在明胶微球表面，从而制得bFGF-明胶微球。
缓释试验
对制备例2-7、对比制备例1获得的生长因子-PLGA微球（bFGF-PLGA微球、BMP-2-PLGA微球和BMP-7-PLGA微球）、对比制备例2获得bFGF-明胶微球的缓释性能进行检测，结果如表2所示。
试验方法：称取10mg生长因子-PLGA微球或bFGF-明胶微球，装于10mL离心管中，向离心管内加入3mLPBS缓冲液，置于水浴箱中恒温恒速振荡，分别在第5h、10h、15h、20h、25h取样，取样时吸取全部上清液，并补充等体积溶液；然后利用ELISA试剂盒分别测定各生长因子-PLGA微球、bFGF-明胶微球中的生长因子的浓度，并统计各生长因子的累计释放率。
表2 生长因子-PLGA微球和bFGF-明胶微球的缓释性能检测结果
Figure 617042DEST_PATH_IMAGE002
根据表2中制备例2-7、对比制备例2的检测结果可知，制备例2-7提供的生长因子-PLGA微球能够持续缓慢释放生长因子，40h时累计释放率为40-55%；而对比制备例2提供的bFGF-明胶微球在25h时已基本全部释放。因此，说明本申请采用PLGA制得的生长因子-PLGA微球的缓释效果更好，故利用该生长因子-PLGA微球制得的脱细胞肌腱能够在较长时间内持续促进早期组织再生，使韧带损伤修复有良好的恢复效果。
根据制备例2、对比制备例1的检测结果可知，对比制备例1提供的生长因子-PLGA微球中生长因子的释放速度较快，在20h时累计释放率已到达约50%，40h时累计释放率已到达70%以上，说明生长因子-PLGA微球的制备方法中，均质与搅拌速率较低时，获得的生长因子-PLGA微球的缓释效果较差。因此，本申请将生长因子-PLGA微球的制备方法中，均质速率控制在7500-9000rpm之间，低速搅拌速率控制在400-500rpm之间，制得的生长因子-PLGA微球的缓释效果更好。
根据制备例2-5的检测结果可知，制备例2提供的bFGF-PLGA微球中bFGF生长因子的添加量10ng时，bFGF生长因子的释放速度较缓慢，40h时累计释放率为41.85%；制备例3-4提供的bFGF-PLGA微球中bFGF生长因子的添加量分别为20ng、30ng时，bFGF生长因子的早期释放速度适中，40h累计释放率约为50%左右；而制备例5提供的bFGF-PLGA微球中bFGF生长因子的添加量为40ng时，bFGF生长因子的早期释放速度过快，在20h时累计释放率已经达到40%以上，说明其缓释效果较差。因此，本申请进一步将PLGA与生长因子的重量比控制在10000：（2-3）之间，获得的生长因子-PLGA微球的缓释性能更佳。
实施例
实施例1
实施例1提供一种生长因子复合肌腱。
上述生长因子复合肌腱的制备方法为：将制备例6提供的BMP-2-PLGA微球溶于25mL的蒸馏水中，获得BMP-2-PLGA微球水溶液；然后将制备例1获得的脱细胞肌腱置于浸泡盒中，并向浸泡盒中加入BMP-2-PLGA微球水溶液，浸泡25h，即可获得生长因子复合肌腱。
实施例2
实施例2提供一种生长因子复合肌腱。
上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例2提供的生长因子复合肌腱中的采用的生长因子-PLGA微球为制备例2提供的bFGF-PLGA微球。
实施例3
实施例3提供一种生长因子复合肌腱。
上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例3提供的生长因子复合肌腱中的采用的生长因子-PLGA微球为制备例11提供的BMP-7-PLGA微球。
实施例4
实施例4提供一种生长因子复合肌腱。
上述生长因子复合肌腱的制备方法为：
（1）取3个浸泡盒（浸泡盒I、浸泡盒II、浸泡盒III），依次并排摆放；然后在3个容器相接触的侧壁上，距离底部1cm的位置钻取控孔洞，使得3个容器由控孔洞相连通。
（2）将制备例1获得的脱细胞肌腱由一端开始依次划分为A段（2.5cm）、B段（5cm）、C段（5cm）、D段（5cm）、E段（2.5cm），如图2所示；将脱细胞肌腱对折并穿过通孔洞，置于浸泡装置中，并保证A段与E段位于浸泡盒I、B段与D段位于浸泡盒II、C段位于浸泡盒III，如图3所示。
（3）将制备例6提供的BMP-2-PLGA微球、制备例3提供的bFGF-PLGA微球分别溶于25mL的蒸馏水中，获得BMP-2-PLGA微球水溶液、bFGF-PLGA微球水溶液；然后向浸泡盒I、浸泡盒III中加入BMP-2-PLGA微球水溶液、浸泡盒II中加入bFGF-PLGA微球水溶液，将脱细胞肌腱浸泡25h，冻干即可获得生长因子复合肌腱。
实施例5
实施例5提供一种生长因子复合肌腱。
上述实施例与实施例4的不同之处在于：实施例5提供的生长因子复合肌腱的制备方法中，步骤（3）中的浸泡时间为20h。
实施例6
实施例6提供一种生长因子复合肌腱。
上述实施例与实施例4的不同之处在于：实施例6提供的生长因子复合肌腱的制备方法中，步骤（3）中的浸泡时间为30h。
实施例7
实施例7提供一种生长因子复合肌腱。
上述实施例与实施例4的不同之处在于：步骤（3），具体为：
（3）将制备例6提供的BMP-2-PLGA微球、制备例3提供的bFGF-PLGA微球分别溶于25mL的蒸馏水中，获得BMP-2-PLGA微球水溶液、bFGF-PLGA微球水溶液；然后向容器I、容器III中加入bFGF-PLGA微球水溶液、容器II中加入BMP-2-PLGA微球水溶液，将脱细胞肌腱浸泡25h，冻干即可获得生长因子复合肌腱。
对比例
对比例1
对比例1提供一种生长因子复合肌腱。
上述生长因子复合肌腱的制备方法为：
（1）将20ng BMP-2生长因子、20ng bFGF生长因子分别分散于10mL水中，获得BMP-2生长因子溶液及bFGF生长因子溶液；
（2）将制备例1获得的脱细胞肌腱由一端开始依次划分为A段、B段、C段、D段、E段；并保证B段与D段长度相等，A段与E段长度相等；
（3）再将BMP-2生长因子溶液涂布在A段、C段和E段，bFGF生长因子溶液涂布在B段和D段，涂布完毕冻干，即可获得生长因子复合肌腱。
对比例2
对比例2提供一种生长因子复合肌腱。
上述实施例与实施例4的不同之处在于：对比例2提供的生长因子复合肌腱的制备方法中，步骤（3）中的浸泡时间为10h。
对比例3
对比例3提供一种生长因子复合肌腱。
上述实施例与实施例4的不同之处在于：对比例3提供的生长因子复合肌腱的制备方法中，步骤（3）中的浸泡时间为40h。
性能检测试验
对实施例1-7、对比例1-3获得的生长因子复合肌腱的促成骨表达能力、生长因子复合肌腱表面的生长因子负载量进行检测，检测结果如表3所示。
1. 促成骨表达能力检测：将生长因子复合肌腱按0.2g/mL的比例加入含10%胎牛血清的αMEM培养基，37℃下浸提25h，得到浸提液；取细胞密度约80-90%的MC3T3-E1细胞系，弃去原培养基，加入浸提液，同时以原培养基做为对照组，继续培养72h后，采用ALP检测试剂盒（购自碧云天生物技术）检测浸提液中ALP含量及对照组原培养基中ALP含量（检测3次，取平均值），并计算ALP相对活性。ALP相对活性的计算方法为：
ALP相对活性=浸提液ALP含量/对照组原培养基ALP含量
注：碱性磷酸酶（ALP）是成骨早期标志物，ALP的含量反映成骨细胞的分化水平，ALP的相对活性越高，表明该生长因子复合肌腱的促成骨表达能力越强。
2. 生长因子负载量检测：用ELISA试剂盒对脱细胞肌腱浸泡前、后的浸泡装置中生长因子含量进行检测，浸泡前后生长因子含量差值即为生长因子复合肌腱表面的总生长因子负载量，并计算单位面积生长因子负载量。注：脱细胞肌腱长20cm，直径6mm。
表3 实施例1-7、对比例1-3获得的生长因子复合肌腱的性能检测结果
Figure 803304DEST_PATH_IMAGE003
根据表3中ALP相对活性的检测结果可知，利用实施例1-7提供的生长因子复合肌腱浸提获得的浸提液的ALP相对活性为1.47-1.85，说明实施例1-7提供的生长因子复合肌腱具备优异的成骨表达能力，能够有效促进骨组织再生。另外，实施例4-6获得的生长因子复合肌腱的临床使用效果更好，能够在韧带修复早期，定向促进骨道愈合及肌腱软组织再生，提高ACL重建术后恢复速度与效果，降低再次断裂的风险。
根据实施例1-3的检测可知，将实施例1、实施例3采用BMP-2-PLGA微球、BMP-7-PLGA微球制得的生长因子复合肌腱进行浸提，获得的浸提液的ALP相对活性分别为1.87、1.82；将实施例2采用bFGF-PLGA微球制得的生长因子复合肌腱进行浸提，获得的浸提液的ALP相对活性为1.46。因此，说明BMP-2与BMP-7的早期促成骨表达能力更强。
根据实施例4-6、对比例2-3的检测结果可知，随着浸泡时间的延长，生长因子复合肌腱浸提所得浸提液的ALP相对活性先逐渐升高后基本保持不变，生长因子的单位面积负载量为0.8-1.2ng/cm2。因此，基于节省时间的考虑，本申请将浸泡时间控制在20-30h之间，获得的生长因子复合肌腱的从促成骨表达能力更好。
根据实施例4、实施例7的检测结果可知，实施例4与实施例7获得的生长因子复合肌腱的浸提液的ALP相对活性相差不大，BMP-2与bFGF的负载量也相差不大；然而，实施例7获得的生长因子复合肌腱中，bFGF位于A段、C段与E段，BMP-2位于B段与D段，上述生长因子复合肌腱在韧带修复早期，对骨道愈合及肌腱软组织的促生能力相对较差；而实施例4获得的生长因子复合肌腱，BMP-2位于A段、C段与E段，能够定向促进骨道愈合，增强肌腱与骨组织的固定强度，bFGF位于B段与D段，定向促进肌腱软组织再生，避免肌腱发生再次断裂。
综上所述，本申请提供的一种生长因子复合肌腱，该生长因子复合肌腱由脱细胞肌腱和生长因子-PLGA微球制备而成，生长因子-PLGA微球负载于所述脱细胞肌腱表面。通过将生长因子与所述PLGA微球的重量比为10000：（2-3），脱细胞肌腱的浸泡时间控制在20-30h之间，能够获得一种表面生长因子负载量高、缓释效果好的生长因子复合肌腱。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种生长因子复合肌腱，其特征在于，所述生长因子复合肌腱包括脱细胞肌腱和生长因子-PLGA微球，所述生长因子-PLGA微球负载于所述脱细胞肌腱表面。
2.根据权利要求1所述的生长因子复合肌腱，其特征在于，所述生长因子-PLGA微球中，所述生长因子与所述PLGA微球的重量比为10000：（2-3）。
3.根据权利要求1所述的生长因子复合肌腱，其特征在于，所述生长因子选自bFGF、BMP-2和BMP-7。
4.根据权利要求3所述的生长因子复合肌腱，其特征在于，所述生长因子-PLGA微球为bFGF-PLGA微球和BMP-2-PLGA微球。
5.根据权利要求4所述的生长因子复合肌腱，其特征在于，所述生长因子复合肌腱由一端开始依次划分为A段、B段、C段、D段、E段；其中，B段与D段长度相等，A段与E段长度相等；
所述生长因子复合肌腱表面：
A段、C段、E段负载BMP-2-PLGA微球；
B段、D段负载bFGF-PLGA微球。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的生长因子复合肌腱，其特征在于，所述脱细胞肌腱表面生长因子的负载量为0.8-1.2ng/cm2。
7.根据权利要求1所述的生长因子复合肌腱，其特征在于，所述脱细胞肌腱来源于猪后肢指浅屈肌腱。
8.如权利要求1-7中任一项所述的生长因子复合肌腱的制备方法，其特征在于，包括制备生长因子复合肌腱：将所述脱细胞肌腱置于浸泡装置中，并向所述浸泡装置中加入所述生长因子-PLGA微球，浸泡20-30h，即可获得生长因子复合肌腱。
9.根据权利要求8所述的生长因子复合肌腱的制备方法，其特征在于，所述浸泡装置为并排设置的3个容器，3个容器相接触的侧壁含有控孔洞，3个容器由所述控孔洞相连通。
10.根据权利要求9所述的生长因子复合肌腱的制备方法，其特征在于，所述肌腱对折并置于所述控孔洞；所述浸泡装置两侧的容器中加入BMP-2-PLGA微球，中间容器中加入bFGF-PLGA微球。
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