CN115029298A - 一种去抗原肌腱及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及肌腱/韧带损伤修复的技术领域，具体公开了一种去抗原肌腱及其制备方法。本申请提供的去抗原肌腱的制备方法包括以下步骤：步骤1：首先依次采用75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇对肌腱进行清洗；步骤2：然后对上述步骤1清洗后的肌腱依次采用曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液、胰酶‑EDTA溶液进行清洗；步骤3：最后对上述步骤2清洗后的肌腱依次采用核酸酶溶液、氢氧化钠溶液进行清洗，清洗完毕即可获得去抗原肌腱；以及利用上述去抗原肌腱的制备方法获得的去抗原肌腱。本申请提供的去抗原肌腱的制备方法能够快速、有效去除肌腱中的抗原，并获得一种细胞毒性小、拉伸强度优异的去抗原肌腱。

Description

一种去抗原肌腱及其制备方法

技术领域

本申请涉及肌腱/韧带损伤修复的技术领域，具体涉及一种去抗原肌腱的制备方法。

背景技术

交叉韧带是稳定膝关节的重要结构，在膝关节各韧带中也最容易受损，当交叉韧带断裂后不加以治疗，将会严重影响人们日常活动和运动。为了恢复膝关节的功能，往往需要进行重建手术，当前临床重建移植物有自体肌腱，同种异体肌腱和人工韧带三种。其中自体肌腱取自患者腘绳肌、股薄肌等，自体肌腱移植会对患者造成二次损伤，不利于后期康复，同时肌腱的长度和直径受取材部位的限制；同种异体肌腱在临床使用中存在免疫排斥和感染的风险，而且供体来源有限；人工韧带通常为高分子有机材料，其降解产物会改变关节局部微环境，容易引起无菌性炎症。

近年来，异种肌腱因其来源广泛、与人体肌腱成分相似等特点获得了业界的广泛关注，但异种肌腱的临床使用一直被受到限制，一是由于种属的差异，导致异种肌腱存在免疫原性，二是异种肌腱经去抗原处理的时间较长，导致其力学性能明显下降，则在使用时需采用多股肌腱同时移植，但这会对患者的损伤加重，不利于术后的康复和功能的重建。

因此，如何提供一种去抗原效果好、速度快、肌腱力学性能佳的肌腱处理方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

为了快速、有效去除肌腱中的抗原，并保证肌腱的力学性能，本申请提供一种去抗原肌腱及其制备方法。

第一方面，本申请提供一种去抗原肌腱的制备方法，采用如下的技术方案：

一种去抗原肌腱的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：首先依次采用75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇对肌腱进行清洗；

步骤2：然后对上述步骤1清洗后的肌腱依次采用曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液、胰酶-EDTA溶液进行清洗；

步骤3：最后对上述步骤2清洗后的肌腱依次采用核酸酶溶液、氢氧化钠溶液进行清洗，清洗完毕即可获得去抗原肌腱。

本申请提供的去抗原肌腱的制备方法包括以上步骤，通过采用上述步骤能够在25-35h内有效去除肌腱中的抗原，包括脂质、蛋白及核酸等物质，并且利用上述制备方法获得的去抗原肌腱的细胞毒性小、拉伸强度优异。

上述制备方法的步骤1中，首先依次利用75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇对肌腱进行清洗，采用浓度梯度增加的乙醇，可以使肌腱中的脂质逐渐提取出来，并引起组织脱水，使得细胞膜增溶及细胞裂解。该步骤既能去除肌腱中的脂质，还能脱去肌腱中的部分细胞，能够后续处理节省大量的时间与溶剂用量。

在上述制备方法的步骤2中，采用曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液对肌腱进行清洗，通过两者的协同作用，既能减少脱细胞处理的时间，保证获得的去抗原肌腱的力学性能，还能降低两种溶液各自的用量，减少溶液残留物对肌腱带来的细胞毒性风险。

由于抗原中包含核酸物质，而通过上述两步骤难以将其去除，因此本申请制备方法中的步骤3中，采用了核酸酶及氢氧化钠对肌腱进行清洗，能够在短时间内进一步将肌腱中的核酸物质彻底去除，同时保留了肌腱的天然结构，使其维持更好的力学性能。

优选的，所述75％乙醇、所述95％乙醇、所述无水乙醇与所述肌腱的重量比均为(18-22)：1。

优选的，所述曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液、所述胰酶-EDTA溶液与所述肌腱的重量比均为(18-22)：1。

在一个具体的实施方案中，所述75％乙醇、所述95％乙醇、所述无水乙醇与所述肌腱的重量比均为20：1。

在一个具体的实施方案中，所述曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液、所述0.25％胰酶-EDTA溶液与所述肌腱的重量比均为20：1。

曲拉通是一种非离子洗涤剂，能过通过分解脂质-脂质、脂质-蛋白质、DNA-蛋白质的相互作用将细胞膜溶解，进而将细胞的内容物清除，但曲拉通不会影响蛋白质-蛋白质的相互作用，因此保证了肌腱中胶原蛋白的基本的结构与取向，但正是因为曲拉通比较温和，故不能够彻底去除细胞核和DNA。十二烷基硫酸钠是一种离子洗涤剂，能够破坏脂质-脂质、脂质-蛋白质、DNA-蛋白质以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用，从而将细胞核膜与细胞质膜溶解，进而脱除细胞。而在十二烷基硫酸钠脱除肌腱细胞的过程中，十二烷基硫酸钠的用量对肌腱的性能会造成一定影响，若十二烷基硫酸钠的用量过低，肌腱中的细胞残留越多，肌腱的免疫原性越高；若是十二烷基硫酸钠的用量过高，肌腱中剩余的DNA含量则越低，肌腱的力学性能越差，而且十二烷基硫酸钠会与细胞外基质蛋白发生强相互作用，诱导细胞毒性增强。因此，本申请采用曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液对肌腱进行处理，通过两者的协同作用，既能减少脱细胞处理的时间，还能降低两种溶液各自的用量，便于后期将十二烷基硫酸钠从肌腱中去除，从而减少十二烷基硫酸钠残留带来的细胞毒性风险。

在一个具体的实施方案中，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸钠的体积比可以为1：0.5、1：0.8、1：1、1：1.2或1：1.5。

在一些实施方案中，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸钠的体积比还可以为1：(0.5-0.8)、1：(0.5-1)、1：(0.5-1.2)、1：(0.5-1.5)、1：(0.8-1)、1：(0.8-1.2)、1：(0.8-1.5)、1：(1-1.2)、1：(1-1.5)或1：(1.2-1.5)。

优选的，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸钠的体积比为1：(0.8-1.2)。

优选的，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间10-14h。

在一个具体的实施方案中，所述曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间可以为10h、12h或14h。

在一些实施方案中，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间还可以为10-12h或12-14h。

在一些实施方案中，所述曲拉通的浓度为0.05-0.15％，所述十二烷基硫酸钠的浓度为0.05-0.15％。

优选的，所述曲拉通的浓度为0.1％，所述十二烷基硫酸钠的浓度为0.1％。

本申请进一步将曲拉通和十二烷基硫酸钠的体积比、曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间以及曲拉通和十二烷基硫酸钠的浓度控制在上述范围内，能够使两种溶液在各自用量较少的情况下，发挥两者的协同作用，实现细胞的快速、彻底清除，既减少了十二烷基硫酸钠对肌腱可能造成的细胞毒性潜在风险，又能避免曲拉通和十二烷基硫酸钠与肌腱的长时间接触，以使最终获得的去抗原肌腱能够维持很好的力学性能。

优选的，所述胰酶-EDTA溶液的清洗时间为1.5-2.5h。

在一个具体的实施方案中，所述胰酶-EDTA溶液的清洗时间可以为1.5h、2h或2.5h。

在一些实施方案中，所述胰酶-EDTA溶液的清洗时间还可以为1.5-2h或2-2.5h。

优选的，所述胰酶-EDTA溶液为0.25％胰酶-EDTA溶液。

胰蛋白酶能够将细胞从细胞外基质(ECM)中分离出来，且不诱导细胞毒性作用，但是胰蛋白酶的长时间处理会切割ECM内的蛋白质，导致ECM损伤以及肌腱的力学性能下降。因此本申请采用0.25％胰酶-EDTA溶液，并将胰酶-EDTA溶液的清洗时间控制在1.5-2.5h内，能够最大程度地去除细胞，同时保留肌腱的力学性能。

优选的，所述核酸酶溶液的清洗时间为2-4h。

在一个具体的实施方案中，所述核酸酶溶液的清洗时间可以为2h、3h或4h。

在一些实施方案中，所述核酸酶溶液的清洗时间还可以为2-3h或3-4h。

具体的，所述核酸酶为脱氧核糖核酸酶，浓度为4-6U/mL。

本申请将核酸酶溶液的处理设置在最后一步，这是由于肌腱在经过步骤1与步骤2的处理后，其内部间距与孔隙率增大，因此有利于核酸酶溶液更快地渗入组织中，核酸酶溶液能够促进DNA链和RNA链的水解，从而进一步去除残余的核酸与细胞碎片，若核酸酶溶液的处理时间过短，肌腱中的核酸去除不彻底；但是核酸酶溶液的处理时间过长，可能会改变ECM的结构，造成ECM成分(如GAG、层粘连蛋白和胶原IV)的丢失，降低肌腱的力学性能。因此，本申请将核酸酶溶液的清洗时间控制在2-3h，能够彻底去除核酸，并最大限度地保护肌腱的天然结构，以维持其较好的力学性能。

优选的，所述去抗原肌腱的制备方法还包括预处理步骤；

所述预处理步骤为：首先剔除肌腱表面多余的软组织，然后将其浸泡于过氧乙酸溶液中，浸泡完毕用水清洗即可。

具体的，所述预处理步骤为：首先剔除肌腱表面多余的软组织，然后将其置于含有0.2％-0.4％过氧乙酸溶液的摇床中，在90-110r/min频率下浸泡1-2h，浸泡完毕再用水清洗2-4遍，每次清洗不少于15min，清洗完毕即可获得预处理肌腱。

在一个具体的实施方案中，所述肌腱为猪前肢指浅屈肌腱或猪后肢指浅屈肌腱。

优选的，所述肌腱为猪后肢指浅屈肌腱。

本申请优选的肌腱为猪后肢指浅屈肌腱，其相对于猪前肢指浅屈肌腱具有弹性较大，张力较高，力学性能好等优点，因此可用于制备临床使用的重建移植物。利用该猪后肢指浅屈肌腱获得的去抗原肌腱对患者的损伤部位进行修复，会对患者造成的损伤较小，更有利患者的术后修复。

第二方面，本申请提供一种去抗原肌腱。

一种去抗原肌腱，利用上述去抗原肌腱的制备方法获得。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1.本申请提供的去抗原肌腱的制备方法能够在25-35h内有效去除猪肌腱中的细胞，并且获得的去抗原肌腱的DNA含量在15-48ng之间，拉伸强度均＞900N。

2.本申请将去抗原肌腱的制备方法中，曲拉通和十二烷基硫酸钠的体积比控制在1：(0.8-1.2)之间，将曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间控制在10-12h之间，能够使两种溶液在各自用量较少的情况下，发挥两者的协同作用，实现细胞的快速、彻底清除，既减少了十二烷基硫酸钠对肌腱可能造成的细胞毒性潜在风险，又能避免曲拉通和十二烷基硫酸钠与肌腱的长时间接触，以使最终获得的去抗原肌腱的拉伸强度＞1000N，相对增长率≥95％。

3.本申请将胰酶-EDTA溶液的清洗时间控制在1.5-2.5h范围内，核酸酶溶液的清洗时间控制在2-4h范围内，能够在短时间内彻底清除肌腱中残留的细胞及核酸，并保证肌腱的力学性能。

4.本申请提供的去抗原肌腱的制备方法适用于猪后肢指浅屈肌腱，利用猪后肢指浅屈肌腱获得的去抗原肌腱的拉伸性能好，利用其对患者的损伤部位进行修复，会对患者造成的损伤小，更有利于患者的术后修复。

附图说明

图1是本申请实施例3获得的去抗原肌腱的H&E染色结果(a为横截面；b为矢状面)。

图2是L929细胞在本申请实施例3获得的去抗原肌腱表面的粘附效果图。

具体实施方式

本申请提供一种去抗原肌腱的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将猪肌腱置于摇床中，设置摇床的频率为90-110r/min，然后依次用75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇进行清洗，各溶液的清洗的时间为30min-1h；最后用纯化水清洗；

其中，75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇与肌腱的重量比均为(18-22)：1。

步骤2：将上述步骤1清洗后的肌腱置于摇床中，然后采用体积比为1：(0.8-1.2)的0.05-0.15％曲拉通和0.05-0.15％十二烷基硫酸钠的混合溶液对肌腱进行清洗，摇床的频率为110-130r/min，清洗时间为10-14h；清洗完毕后用纯化水清洗4-6遍；然后将肌腱置于胰酶-EDTA溶液中，超声清洗1.5-2.5h；清洗结束后再用纯化水清洗2-4遍；

其中，0.1％曲拉通和0.1％十二烷基硫酸钠的混合溶液、胰酶-EDTA溶液与肌腱的重量比均为(18-22)：1。

步骤3：将上述步骤2清洗后的肌腱使用4-6U/mL的核酸酶清洗2-4h；清洗完毕后再用纯化水超声清洗；然后使用0.5％氢氧化钠溶液清洗30min-1h，最后用纯化水清洗，即可获得去抗原肌腱。

进一步的，所述去抗原肌腱的制备方法还包括预处理步骤；

所述预处理步骤为：首先取检疫合格的猪肌腱，剔除其表面多余的软组织，然后将其置于含有0.2％-0.4％过氧乙酸溶液的摇床中，在90-110r/min频率下浸泡1-2h，浸泡完毕再用水清洗2-4遍，每次清洗不少于15min，清洗完毕即可获得预处理肌腱。

所述猪肌腱可以为猪前肢指浅屈肌腱或猪后肢指浅屈肌腱；优选的，所述猪肌腱为猪后肢指浅屈肌腱。

本申请实施例中的曲拉通的型号为曲拉通X-100，CAS号为9002-93-1；十二烷基硫酸钠的CAS号为151-21-3；0.25％胰酶-EDTA溶液购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；核酸酶为脱氧核糖核酸酶，CAS号为9025-64-3；其余原料、试剂、溶剂等也均可通过商购获得。

以下结合实施例、对比例、附图说明及性能检测试验对本申请作进一步详细说明。

实施例

实施例1-5

实施例1-5分别提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述实施例的不同之处在于：曲拉通和十二烷基硫酸钠的体积比，具体如表1所示。

实施例3提供的去抗原肌腱的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)首先取检疫合格的猪肌腱10g，剔除其表面多余的软组织，然后将其置于含有0.2％-0.4％过氧乙酸溶液的摇床中，在90-110r/min频率下浸泡1-2h，浸泡完毕再用水清洗2-4遍，每次清洗不少于15min，清洗完毕即可获得预处理肌腱；其中，所述猪肌腱为猪后肢指浅屈肌腱。

(2)取上述预处理肌腱置于摇床中，设置摇床的频率为110r/min，然后依次用75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇进行清洗，各溶液的清洗的时间为1h；最后用纯化水清洗；

其中，75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇的用量均为200mL。

(3)将上述步骤1清洗后的肌腱置于摇床中，然后采用体积比为1：1的0.1％曲拉通和0.1％十二烷基硫酸钠的混合溶液对肌腱进行清洗，摇床的频率为120r/min，清洗时间为12h；清洗完毕后用纯化水清洗5遍；然后将肌腱置于0.25％胰酶-EDTA溶液中，超声清洗2h；清洗结束后再用纯化水清洗3遍；

其中，0.1％曲拉通和0.1％十二烷基硫酸钠的混合溶液、0.25％胰酶-EDTA溶液的用量均为200mL。

(4)将上述步骤2清洗后的肌腱使用5U/mL的核酸酶清洗3h；清洗完毕后再用纯化水超声清洗；然后使用0.5％氢氧化钠溶液清洗1h，最后用纯化水清洗，即可获得去抗原肌腱。

表1实施例1-5提供的制备方法中的曲拉通和十二烷基硫酸钠的体积比

实施例6-9

实施例6-9分别提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述实施例与实施例3的不同之处在于：曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间，具体如表2所示。

表2实施例3、实施例6-9中曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间

实施例	清洗时间(h)
		3	12
6	8
		7	10
8	14
		9	15

实施例10-13

实施例10-13分别提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述实施例与实施例3的不同之处在于：0.25％胰酶-EDTA溶液的清洗时间，具体如表3所示。

表3实施例3、实施例10-13提供的制备方法中0.25％胰酶-EDTA溶液的清洗时间

实施例	清洗时间(h)
		3	2
10	1
		11	1.5
12	2.5
		13	3

实施例14-17

实施例14-17分别提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述实施例与实施例3的不同之处在于：核酸酶溶液的清洗时间，具体如表4所示。

表4实施例3、实施例14-17提供的制备方法中核酸酶溶液的清洗时间

实施例	清洗时间(h)
		3	3
14	1
		15	2
16	4
		17	5

实施例18

实施例18提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述实施例与实施例3的不同之处在于：采用的猪肌腱。

实施例18采用的猪肌腱为猪前肢指浅屈肌腱。

对比例

对比例1

对比例1提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述对比例与实施例3的区别之处在于：步骤(3)，具体如下：

(3)将上述步骤1清洗后的肌腱置于摇床中，然后采用0.1％十二烷基硫酸钠对肌腱进行清洗，摇床的频率为120r/min，清洗时间为12h；清洗完毕后用纯化水清洗5遍；然后将肌腱置于0.25％胰酶-EDTA溶液中，超声清洗2h；清洗结束后再用纯化水清洗3遍；其中，0.1％十二烷基硫酸钠的用量为200g。

对比例2

对比例2提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述对比例与实施例3的区别之处在于：步骤(3)，具体如下：

(3)将上述步骤1清洗后的肌腱置于摇床中，然后采用0.1％曲拉通对肌腱进行清洗，摇床的频率为120r/min，清洗时间为12h；清洗完毕后用纯化水清洗5遍；然后将肌腱置于0.25％胰酶-EDTA溶液中，超声清洗2h；清洗结束后再用纯化水清洗3遍；其中，0.1％曲拉通的用量为200g。

对比例3

对比例3提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述对比例与实施例3的区别之处在于：步骤(2)，具体如下：

(2)取上述预处理肌腱置于摇床中，设置摇床的频率为110r/min，然后用无水乙醇进行清洗，各溶液的清洗的时间为1h；最后用纯化水清洗；

其中，无水乙醇的用量为200mL。

对比例4

对比例4提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述对比例与对比例3的区别之处在于：各步骤(3)与步骤(4)，具体如下：

(3)将上述步骤1清洗后的肌腱置于摇床中，然后采用体积比为1：1的1％曲拉通和1％十二烷基硫酸钠的混合溶液对肌腱进行清洗，摇床的频率为120r/min，清洗时间为24h；清洗完毕后用纯化水清洗5遍；然后将肌腱置于0.25％胰酶-EDTA溶液中，超声清洗12h；清洗结束后再用纯化水清洗3遍；

其中，1％曲拉通和1％十二烷基硫酸钠的混合溶液、0.25％胰酶-EDTA溶液的用量均为200mL。

(4)将上述步骤2清洗后的肌腱使用10U/mL的核酸酶清洗3h；清洗完毕后再用纯化水超声清洗；然后使用0.5％氢氧化钠溶液清洗1h，最后用纯化水清洗，即可获得去抗原肌腱。

对比例5

对比例5提供一种去抗原肌腱的制备方法，该制备方法为相关技术中制备去抗原肌腱的常规方法。

上述去抗原肌腱的制备方法如下：

(1)取猪肌腱原材料，采用纯化水清洗处理、剔除多余组织，然后采用1％triton摇床处理72h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；然后再采用1％triton摇床处理24h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；

(2)采用质量浓度为1％NaOH溶液摇床处理1h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；

(3)采用5mg/mLα-Gal抗原酶摇床处理16h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；

(4)采用1mg/mL DNA酶摇床处理16h，处理完毕后采用纯化水超声清洗，得到去抗原肌腱。

对比例6

对比例6提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述去抗原肌腱的制备方法与对比例5的不同之处在于：步骤(1)。具体如下：

(1)取猪肌腱原材料，采用纯化水清洗处理、剔除多余组织，然后采用体积比为1：1的0.1％曲拉通和0.1％十二烷基硫酸钠的混合溶液摇床处理72h，处理完毕后采用纯化水超声清洗。

对比例7

对比例7提供一种去抗原肌腱的制备方法。

上述去抗原肌腱的制备方法与对比例6的不同之处在于：步骤(1)。具体如下：

(1)取猪肌腱原材料，采用无水乙醇、纯化水清洗处理、剔除多余组织，然后采用体积比为1：1的0.1％曲拉通和0.1％十二烷基硫酸钠的混合溶液摇床处理72h，处理完毕后采用纯化水超声清洗。

性能检测试验

1.对实施例3获得的去抗原肌腱进行组织学检测及细胞相容性，各检测方法具体如下：

(1)组织学检测：将去抗原肌腱经过福尔马林固定48h后，选取去抗原肌腱的横截面和矢状面，依次进行脱水、石蜡包埋、病例切片、HE染色，然后在显微镜下观察，结果如图1所示。图1中，a为横截面，b为矢状面，放大倍数均为400倍。

由图1可以看出，实施例3获得的去抗原肌腱中无细胞残留，去抗原肌腱的组织保存完好，胶原纤维之间存在间隙，有利于修复过程中自体细胞的张入。

(2)细胞相容性检验：切取厚度为2mm的去抗原肌腱的横截面，放置于24孔板内，在其表面接种L929细胞悬液，于37℃培养箱培养8h，取出孔板，弃去培养基，使用甲醇固定细胞，然后根据FITC-Phalloidin染色试剂盒进行细胞免疫组化染色，并用荧光显微镜拍照观察，结果如图2所示。

由图2可以看出，L929细胞在实施例3获得的去抗原肌腱的表面生长良好，分布均匀且呈现梭形。

2.对实施例1-18及对比例1-7获得的去抗原肌腱进行DNA含量检测、细胞毒性检测与拉伸强度测试。

(1)DNA含量检测：取20mg去抗原肌腱，使用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，提取后的DNA采用光密度法测定DNA含量，使用分光光度记测定A260波长下，每毫克去抗原肌腱中的DNA含量。

根据相关技术可知，当抗原肌腱中的DNA含量＜50ng时，表明该抗原肌腱能够达到彻底脱除细胞的效果。

(2)细胞毒性检测：细胞毒性检测参考GB/T 16886.5-2017第5部分：体外细胞毒性试验。具体方法为：将去抗原肌腱按0.2g/mL的比例加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃下浸提24h，得到浸提液。取细胞密度约80％-90％的L929细胞系，弃去原培养基，加入浸提液，以原培养基做为对照，继续培养72h后，采用MTT法检测细胞活力，记录相对增长率(％)。

(3)拉伸强度测试：首先将去抗原肌腱裁剪成“哑铃状”，然后将两端固定在万能力学试验机的夹具上，预先施加20N的拉力进行预牵张1min，结束后恢复至原状态，30s后继续施加20N的拉力，反复10个循环，结束后恢复至原状态，2min后进行试验，试验过程中以10N/s的速度拉伸直至试样断裂，记录最终拉伸断裂力(N)。

注：本申请中，猪前肢指浅屈肌腱在去抗原处理前的拉伸强度为983.6±16.28N，猪后肢指浅屈肌腱在去抗原处理前的拉伸强度为1126.94±38.18N。

实施例1-18及对比例1-7获得的去抗原肌腱的拉伸强度检测结果如表5所示。

表5相对增长率及拉伸强度检测结果

根据表5的检测结果可知，本申请实施例1-18提供的去抗原肌腱的制备方法能够在25-35h内有效去除猪肌腱中的细胞，并且获得的去抗原肌腱的拉伸强度均＞900N，相对增长率≥90％；而对比例5获得的去抗原肌腱的拉伸强度仅为557.5±9.6N，而且该去抗原肌腱的其制备时间＞100h。因此，说明本申请提供的去抗原肌腱的制备方法既能获得高拉伸强度及细胞毒性较小的去抗原肌腱，同时还能节省大量试剂用量与制备时间。

对比实施例1-5的检测结果可知，随着曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液中十二烷基硫酸钠添加量的增加，去抗原肌腱的拉伸强度逐渐降低，但是相对增长率呈现先逐渐升高后逐渐降低趋势，说明十二烷基硫酸钠的添加量较少时，获得的去抗原肌腱的拉伸强度较高，但是去抗原肌腱中的细胞残留物较多，导致其免疫原性较高；若十二烷基硫酸钠的添加量较高时，与抗原肌腱的拉伸强度降低，而且十二烷基硫酸钠会与蛋白发生相互作用，会诱导细胞毒性增强。因此，本申请将去抗原肌腱的制备方法中，曲拉通和十二烷基硫酸钠的体积比控制在1：(0.8-1.2)之间时，能够减少去抗原肌腱的细胞毒性，并保留较大的拉伸强度。

根据实施例3、实施例6-9的检测结果可知，随着曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间延长，去抗原肌腱的拉伸强度略有降低，相对增长率明显呈现先先升高后降低的趋势；进一步对比发现，实施例3、实施例7-8提供的去抗原肌腱的拉伸强度在1030-1065N之间相对增长率≥95％。因此，说明本申请将曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间控制在10-12h之间，获得的去抗原肌腱能够具备优异的拉伸强度，且细胞毒性较小。

根据实施例3、实施例10-13的检测结果可知，随着0.25％胰酶-EDTA溶液的清洗时间延长，去抗原肌腱的拉伸强度明显降低，相对增长率先增加后保持不变，说明0.25％胰酶-EDTA溶液能够逐渐将肌腱中的细胞去除，并且在肌腱与0.25％胰酶-EDTA溶液的长时间接触过程中，0.25％胰酶-EDTA溶液不会诱导肌腱的细胞毒性，但会切割肌腱中的蛋白质，使得肌腱的拉伸强度降低。因此，本申请将0.25％胰酶-EDTA溶液的清洗时间控制在1.5-2.5h范围内，既能保证去抗原肌腱中的细胞彻底脱去，又能保证去抗原肌腱具有优异的拉伸强度。

根据实施例3、实施例14-17的检测结果可知，随着核酸酶清洗时间的延长，去抗原肌腱的拉伸强度明显降低，相对增长率基本保持不变，说明核酸酶与肌腱长时间接触，会导致肌腱的拉伸强度降低。因此，本申请将核酸酶的清洗时间控制在1.5-2.5h范围内，既能保证去抗原肌腱中的核酸彻底去除，又能保证去抗原肌腱具备优异的。

对比实施例1-18发现，本申请实施例1-17提供的采用猪后肢指浅屈肌腱获得的去抗原肌腱的拉伸强度均＞900N；而实施例18提供得到采用猪前肢指浅屈肌腱获得的去抗原肌腱的拉伸强度均为912.45±15.71N，而对比例4获得的去抗原肌腱的拉伸强度为557.5±9.6N，说明本申请采用猪后肢指浅屈肌腱制备的去抗原肌腱的力学性能更好，临床使用性能优异，对患者的损伤更小，更利于术后康复。

对比实施例1-17及对比例1-2的检测结果可以发现，实施例1-17获得的去抗原肌腱的拉伸强度均＞900N，相对增长率≥90％；而对比例1获得的去抗原肌腱的拉伸强度为874.16±75.59N，相对增长率为79％；对比例2获得的去抗原肌腱的拉伸强度为1035.24±97.41N，相对增长率为73％；说明采用曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液对肌腱进行清洗，能够保证去抗原肌腱具有优异的拉伸强度，且细胞毒性较小。

经检测，本申请实施例1-18获得的去抗原肌腱的DNA含量在15-48ng之间，说明上述去抗原肌腱的免疫原性低，将其应用于生物体内，不会引起与机体的不良反应；对比例1获得的去抗原肌腱的DNA含量为76ng；对比例2获得的去抗原肌腱的DNA含量为89ng。因此，说明本申请提供的去抗原肌腱的制备方法中仅采用十二烷基硫酸钠或曲拉通中的任意一种对肌腱进行清洗，并不能完全脱除肌腱中的细胞。

对比实施例3、对比例3-4的检测结果发现，对比例3获得的去抗原肌腱的DNA含量为102ng，其细胞脱除效果差，免疫原性高，不适合进行肌腱损伤修复；对比例4获得的去抗原肌腱的DNA含量为32ng，但是其拉伸强度与相对增值率均较低，说明该去抗原肌腱的力学性能较差，细胞毒性高，因此也不适用于肌腱损伤修复。因此，说明本申请采用75％、95％、无水乙醇依次清洗肌腱，能够节省后续溶剂的用量及清洗时间，进而降低溶剂对肌腱带来的力学性能影响及细胞毒性风险。

根据对比例5-7的检测结果可知，对比例5获得的去抗原肌腱的去抗原肌腱的DNA含量为37ng，拉伸强度仅为557.5±9.6N，；对比例6获得的去抗原肌腱的DNA含量为34ng，拉伸强度仅为514.56±75.45N，相对增长率为93％；对比例7获得的去抗原肌腱的DNA含量为30ng，拉伸强度仅为536.33±8.43N，相对增长率为88％；而且上述对比例6-7获得的去抗原肌腱的其制备时间均＞100h。

综上所述，本申请提供的去抗原肌腱的制备方法能够在25-35h内有效去除猪肌腱中的脂肪、蛋白及核酸，并进一步将去抗原肌腱的制备方法中，曲拉通和十二烷基硫酸钠的体积比控制在1：(0.8-1.2)范围内，曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间控制在10-12h范围内，0.25％胰酶-EDTA溶液的清洗时间控制在1.5-2.5h范围内，核酸酶的清洗时间控制在1.5-2.5h范围内，能够使获得的去抗原肌腱的拉伸强度＞1000N，相对增长率≥95％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种去抗原肌腱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：首先依次采用75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇对肌腱进行清洗；

步骤2：然后对上述步骤1清洗后的肌腱依次采用曲拉通和十二烷基硫酸钠的混合溶液、胰酶-EDTA溶液进行清洗；

步骤3：最后对上述步骤2清洗后的肌腱依次采用核酸酶溶液、氢氧化钠溶液进行清洗，清洗完毕即可获得去抗原肌腱。

2.根据权利要求1所述的去抗原肌腱的制备方法，其特征在于，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸钠的体积比为1：（0.8-1.2）。

3.根据权利要求1所述的去抗原肌腱的制备方法，其特征在于，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸钠的混合溶液的清洗时间为10-14h。

4.根据权利要求1所述的去抗原肌腱的制备方法，其特征在于，所述胰酶-EDTA溶液的清洗时间为1.5-2.5h。

5.根据权利要求1所述的去抗原肌腱的制备方法，其特征在于，所述核酸酶溶液的清洗时间为2-4h。

6.根据权利要求1所述的去抗原肌腱的制备方法，其特征在于，所述去抗原肌腱的制备方法还包括预处理步骤；

所述预处理步骤为：首先剔除肌腱表面多余的软组织，然后将其浸泡于过氧乙酸溶液中，浸泡完毕用水清洗即可。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的去抗原肌腱的制备方法，其特征在于，所述肌腱为猪后肢指浅屈肌腱。

8.利用权利要求1-7中任一项所述的去抗原肌腱的制备方法获得的去抗原肌腱。

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