CN109621009A - 一种脱抗原肌腱处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脱抗原肌腱处理方法，包括如下步骤：(1)取离体新鲜肌腱，使用生理盐水洗净血污、杂质；(2)将肌腱浸泡于PBS缓冲液中，震荡过夜，生理盐水清洗；(3)将肌腱浸泡于含有羟乙基淀粉和硫酸软骨素的浸泡液中，进行阶段性加压处理1‑2次；(4)对加压处理后的肌腱进行脱抗原处理；(5)对肌腱进行辐照灭菌。本发明通过PBS预处理、阶段性加压处理、脱抗原处理及辐照灭菌过程中各参数的相互配合，有效去除肌腱所附抗原物质，并且保证了肌腱的力学强度、生物相容性，降低了肌腱的细胞毒性。

Description

一种脱抗原肌腱处理方法
技术领域
本发明涉及医用材料领域，更具体的说是涉及一种脱抗原肌腱处理方法。
背景技术
肌腱是肌腹两端的索状或膜状致密结缔组织，用于肌肉附着和固定。一块肌肉的肌腱分附在两块或两块以上的不同骨上，通过肌腱的牵引作用使肌肉的收缩带动不同骨的运动。
年老、血液损伤均会导致组成肌腱的胶原纤维发生退变，而高强度运动也可能导致肌腱损伤，进而影响人的正常运动，因此，临床上需要大量的肌腱修复材料对受损部位进行重建修复。然而，人工合成材料往往达不到天然组织来源的耐用性标准，而同种肌腱来源受限，因此，研究人员逐渐关注于异种肌腱的研究。而异种肌腱的抗原性是研究过程中最难克服的问题，脱抗原过程往往会影响肌腱力学性能、生物相容性，增加细胞毒性；因此，如何提供一种脱抗原效果好，且对力学强度、生物相容性、细胞毒性影响较小的肌腱处理方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种脱抗原肌腱处理方法，其脱抗原效果好，获得的脱抗原肌腱与成骨细胞具有良好的相容性，且细胞毒性低。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种脱抗原肌腱处理方法，包括如下步骤：
(1)取离体新鲜肌腱，使用生理盐水洗净血污、杂质；
(2)将肌腱浸泡于PBS缓冲液中，震荡过夜，生理盐水清洗；
(3)将肌腱浸泡于含有羟乙基淀粉和硫酸软骨素的浸泡液中，进行阶段性加压处理1-2次；
(4)对加压处理后的肌腱进行脱抗原处理；
(5)对肌腱进行辐照灭菌。
先使用PBS缓冲液对肌腱进行浸泡处理，脱除部分抗原物质，有利于后续浸泡液成分的浸入，并且可提高后续脱抗原处理的效率；将PBS预处理后的肌腱浸泡于浸泡液中，并进行阶段性加压，一方面促进抗原物质的脱除，一方面将浸泡液成分浸入肌腱胶原纤维结构内部，进而降低脱抗原过程中肌腱的力学损伤，提高肌腱的生物相容性，促进后续肌腱修复过程中的快速愈合。
优选地，步骤(2)中震荡过夜条件为37℃，200-400rpm，进而保证预处理的效果。
优选地，步骤(3)中肌腱与浸泡液的比例为10-20g肌腱/100ml浸泡液，保证浸泡液成分的充分浸入，并且减少浸泡液成分的浪费。
进一步优选地，进行第2次阶段性加压处理之前需更换浸泡液。
优选地，阶段性加压过程控制温度为4℃，进而降低加压过程对肌腱结构的影响。
优选地，阶段性加压处理程序如下：
1)0.5-5MPa，2-4h；
2)15-25MPa，10-15min；
3)35-40MPa，2-5min。
阶段性加压对肌腱的结构损伤较小，且浸泡液成分浸入效果好。
进一步优选地，阶段性加压处理程序如下：
1)1.5MPa，2.5h；
2)20MPa，10min；
3)35MPa，3min。
优选地，浸泡液中含羟乙基淀粉40-60g/L，硫酸软骨素35-45g/L。
进一步优选地，羟乙基淀粉分子量15-60万Da。
进一步优选地，羟乙基淀粉分子量40万Da。
适宜分子量的羟乙基淀粉浸入肌腱胶原纤维结构之间，形成微型交联结构，进而有利于增加肌腱的力学强度，并且使浸泡液中其他组份在肌腱修复愈合过程中缓慢释放，促进损伤部位愈合。
进一步优选地，浸泡液中还包括胶原蛋白10-20g/L，维生素C 5-10g/L，维生素E5-10g/L，IGF-Ⅰ100-200mg/L。
各种组分协同促进脱抗原肌腱与成骨细胞的结合，进而促进损伤部位的愈合。
优选地，脱抗原处理步骤如下：
1)将肌腱置于含0.1％TritonX-100，0.1％胰蛋白酶的PBS缓冲液中，37℃，100-150rpm消化2h；
2)使用含0.1％TritonX-100的乙醇溶液清洗肌腱2-3次；
3)使用1/2浸泡液清洗肌腱1-2次。
由于脱抗原步骤之前已对肌腱进行了不同形式的脱抗原处理，因此，在脱抗原步骤中所使用的试剂浓度较低，处理时间较短，但仍能够取得良好的脱抗原效果，并且获得的脱抗原肌腱具有较低的细胞毒性。
优选地，辐照剂量为35-45kGy。
由于阶段性加压处理及脱抗原步骤对肌腱的损伤较小，并且浸入肌腱的浸泡液成分对肌腱形成了三维结构的保护，进而降低辐照过程中的肌腱损伤。
进一步优选地，辐照剂量为40kGy。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种脱抗原肌腱处理方法，通过PBS预处理、阶段性加压处理、脱抗原处理及辐照灭菌过程中各参数的相互配合，有效去除肌腱所附抗原物质，并且保证了肌腱的力学强度、生物相容性，降低了肌腱的细胞毒性。
附图说明
下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为PBS预处理前后的肌腱H&E染色比对；
其中，图A为PBS预处理前；图B为PBS预处理后。
图2附图为本发明肌腱处理方法处理前后肌腱状态对比；
其中，图A为处理前；图B为处理后。
图3附图为不同处理方法获得的肌腱H&E染色比对；
其中，图A为实施例1处理肌腱；图B为对比例1处理肌腱；图C为对比例2处理肌腱；图D为对比例3处理肌腱。
图4附图为不同处理方法获得的肌腱与成骨细胞复合的电镜图；
其中，图A为实施例1处理肌腱；图B为对比例1处理肌腱；图C为对比例2处理肌腱；图D为对比例3处理肌腱。
图5附图为不同辐照剂量对肌腱生物力学的影响。
图6附图为兔子背部注射孔排列示意图；
其中，A：生理盐水浸提液，B：生理盐水，C：棉籽油浸提液，D：棉籽油。
图7附图为皮内刺激试验结果；
其中，图1为实施例1组；图2为对比例1组；图3为对比例2组；图4为对比例3组。
具体实施方式
下面将结合本实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种脱抗原肌腱处理方法，包括如下步骤：
(1)取兔子离体新鲜肌腱，使用生理盐水洗净血污、杂质。
(2)将肌腱浸泡于PBS缓冲液中，37℃，300rpm，震荡过夜，生理盐水清洗。
取PBS预处理前后的肌腱进行H&E染色，结果如图1所示，肌腱在PBS中浸泡震荡时，内部细胞会自然降解，且降解效果较为明显。
(3)以10g肌腱/100ml浸泡液的比例将肌腱浸于浸泡液中，4℃下于低温高压釜内进行阶段性加压处理，阶段性加压处理程序如下：
1)1.5MPa，2.5h；
2)20MPa，10min；
3)35MPa，3min。
浸泡液成分如下：羟乙基淀粉(分子量40万Da)60g/L，硫酸软骨素40g/L，胶原蛋白15g/L，维生素C 10g/L，维生素E 5g/L，IGF-Ⅰ150mg/L，溶于水中，调节pH 6.8-7.2。
(4)对加压处理后的肌腱进行脱抗原，步骤如下：
1)将肌腱置于含0.1％TritonX-100，0.1％胰蛋白酶的PBS缓冲液中，37℃，150rpm消化2h；
2)使用含0.1％TritonX-100的乙醇溶液清洗肌腱2-3次；
3)使用1/2浓度的浸泡液清洗肌腱1-2次。
(5)对肌腱进行60Co辐照灭菌，辐照剂量为40kGy。
如图2所示，经本实施例方法处理后，肌腱颜色、质地无明显变化，长度略有缩短。
实施例2
一种脱抗原肌腱处理方法，包括如下步骤：
(1)取兔子离体新鲜肌腱，使用生理盐水洗净血污、杂质。
(2)将肌腱浸泡于PBS缓冲液中，37℃，200rpm，震荡过夜，生理盐水清洗。
(3)以20g肌腱/100ml浸泡液的比例将肌腱浸于浸泡液中，4℃下于低温高压釜内进行阶段性加压处理，阶段性加压处理程序如下：
1)0.5MPa，4h；
2)15MPa，15min；
3)35MPa，5min。
处理后更换浸泡液，重复上述程序1次。
浸泡液成分如下：羟乙基淀粉(分子量60万Da)50g/L，硫酸软骨素35g/L，胶原蛋白10g/L，维生素C 5g/L，维生素E 8g/L，IGF-Ⅰ100mg/L，溶于水中，调节pH 6.8-7.2。
(4)对加压处理后的肌腱进行脱抗原，步骤如下：
1)将肌腱置于含0.1％TritonX-100，0.1％胰蛋白酶的PBS缓冲液中，37℃，100rpm消化2h；
2)使用含0.1％TritonX-100的乙醇溶液清洗肌腱2-3次；
3)使用1/2浓度的浸泡液清洗肌腱1-2次。
(5)对肌腱进行60Co辐照灭菌，辐照剂量为35kGy。
实施例3
一种脱抗原肌腱处理方法，包括如下步骤：
(1)取兔子离体新鲜肌腱，使用生理盐水洗净血污、杂质。
(2)将肌腱浸泡于PBS缓冲液中，37℃，400rpm，震荡过夜，生理盐水清洗。
(3)以15g肌腱/100ml浸泡液的比例将肌腱浸于浸泡液中，4℃下于低温高压釜内进行阶段性加压处理，阶段性加压处理程序如下：
1)5MPa，2h；
2)25MPa，10min；
3)40MPa，2min。
浸泡液成分如下：羟乙基淀粉(分子量15万Da)40g/L，硫酸软骨素45g/L，胶原蛋白20g/L，维生素C 8g/L，维生素E 10g/L，IGF-Ⅰ200mg/L。
(4)对加压处理后的肌腱进行脱抗原，步骤如下：
1)将肌腱置于含0.1％TritonX-100，0.1％胰蛋白酶的PBS缓冲液中，37℃，120rpm消化2h；
2)使用含0.1％TritonX-100的乙醇溶液清洗肌腱2-3次；
3)使用1/2浓度的浸泡液清洗肌腱1-2次。
(5)对肌腱进行60Co辐照灭菌，辐照剂量为45kGy。
实施例4
设置对比例1-3，其中，对比例1未设置阶段性加压处理步骤，肌腱PBS预处理后直接置于含1％TritonX-100，0.5％胰蛋白酶的PBS缓冲液中，37℃，120rpm消化6h；然后使用含1％TritonX-100的乙醇溶液清洗肌腱2-3次，再使用纯化水清洗肌腱1-2次，其余步骤同实施例1；
对比例2阶段性加压处理步骤中未使用浸泡液浸泡肌腱，其余步骤同实施例1；
对比例3加压过程不进行分阶段处理，直接40MPa处理30min，其余步骤同实施例1；
分别使用实施例1、对比例1-3方法处理肌腱，并且对处理后的肌腱进行H&E染色，结果如图3所示。
由图3可知，实施例1处理的肌腱已将细胞去除干净；对比例1肌腱内部腱细胞基本去除干净，外部脂肪层仍有部分细胞残留；对比例2肌腱外部脂肪层仍有较多细胞残留；对比例3去细胞效果最差，且对肌腱形态影响极大。
实施例5
培养MC3T3细胞，制备成细胞密度为1×105/mL细胞悬液，备用；分别将实施例1、对比例1-3处理方法下获得的肌腱切成0.2g的小块，置于6孔板中，使用MC3T3细胞悬液浸泡肌腱，37℃培养，24h后扫描电镜观察细胞复合情况；电镜结果如图4所示，实施例1处理肌腱粘附细胞多且细胞状态良好；对比例1、2处理肌腱细胞粘附数量较多，但细胞状态不好，较为扁平，类似细胞碎片；对比例3处理肌腱与成骨细胞的复合效果最差。
实施例6
将实施例1、对比例1-3处理方法下获得的肌腱切成0.2g的若干小块，分别置于15mL离心管中，按0.2g/mL比例添加RPMI1640培养基或DMEM培养基，浸提24h，备用。
分别使用L929细胞和MC3T3细胞验证肌腱浸提液的细胞毒性，将两种细胞分别接入96孔板，L929组每孔加入100μL RPMI1640培养基浸提液，细胞密度2×104/mL；MC3T3组每孔加入100μL DMEM培养基浸提液，细胞密度1×105/mL；以未浸提培养基作为对照，培养48h进行MTT检测，试验结果如表1所示。
表1
由上表可知，四种方法处理的肌腱细胞毒性为：对比例1>对比例2>对比例3>实施例1。
实施例7
以实施例1为基础，调整不同辐照剂量，使用夹具夹持辐照处理后的肌腱，通过检测肌腱撕裂时的施力强度验证不同辐照强度对肌腱力学强度的影响，试验结果如图5所示；其中，辐照剂量40kGy抗张强度最好。
实施例8
取一根人源肌腱分为4份，使用实施例1、对比例1-3方法处理，每种方法处理的肌腱分为2份，分别用极性试剂(生理盐水)和非极性试剂(棉籽油)进行浸提，浸提比例为0.2g/mL。两种浸提液分别按0.2mL/孔注射到兔子背部，并且设置生理盐水注射、棉籽油注射的空白对照。
如图6所示，每只兔子20个注射孔，共设实施例1、对比例1、对比例2、对比例3四组，每组2只兔子，注射后24h、48h、72h观察刺激程度，是否有红肿、红斑等，结果如图7所示，其中，对比例1组棉籽油浸提液有1孔明显红肿。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取离体新鲜肌腱，使用生理盐水洗净血污、杂质；
(2)将肌腱浸泡于PBS缓冲液中，震荡过夜，生理盐水清洗；
(3)将肌腱浸泡于含有羟乙基淀粉和硫酸软骨素的浸泡液中，进行阶段性加压处理1-2次；
(4)对加压处理后的肌腱进行脱抗原处理；
(5)对肌腱进行辐照灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，所述步骤(2)中震荡条件为37℃，200-400rpm。
3.根据权利要求1所述的一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中肌腱与浸泡液的比例为10-20g肌腱/100ml浸泡液。
4.根据权利要求1所述的一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，所述阶段性加压过程控制温度为4℃。
5.根据权利要求1所述的一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，所述阶段性加压处理程序如下：
1)0.5-5MPa，2-4h；
2)15-25MPa，10-15min；
3)35-40MPa，2-5min。
6.根据权利要求5所述的一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，所述阶段性加压处理程序如下：
1)1.5MPa，2.5h；
2)20MPa，10min；
3)35MPa，3min。
7.根据权利要求1所述的一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，所述浸泡液中含羟乙基淀粉40-60g/L，硫酸软骨素35-45g/L。
8.根据权利要求7所述的一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，所述浸泡液中还包括胶原蛋白10-20g/L，维生素C 5-10g/L，维生素E 5-10g/L，IGF-Ⅰ100-200mg/L。
9.根据权利要求1所述的一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，所述脱抗原处理步骤如下：
1)将肌腱置于含0.1％TritonX-100，0.1％胰蛋白酶的PBS缓冲液中，37℃，100-150rpm消化2h；
2)使用含0.1％TritonX-100的乙醇溶液清洗肌腱2-3次；
3)使用1/2浸泡液清洗肌腱1-2次。
10.根据权利要求1所述的一种脱抗原肌腱处理方法，其特征在于，所述辐照剂量为35-45kGy。
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