CN110433340B - 脱细胞基质尿道悬吊修复材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种脱细胞基质尿道悬吊修复材料及其制备方法和应用，包括以下步骤预处理；胰酶浸泡待；碱溶液脱脂；Triton x‑100脱细胞；交联；灭菌。本发明所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料由于采取较为温和的脱细胞工艺使得胶原微观结构得以保存完整，具备良好的生物相容性，低免疫的优势，并且其具备良好的力学性能，可以满足长期存在于体内环境的条件。本发明所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料可以有效地解决聚丙烯材料的生物相容性欠佳，长期刺激易侵蚀周围软组织甚至穿透尿道或阴道的可能，体内无法降解甚至需要二次手术取出的可能，可以很好的作为尿道悬带进行应用。

Description

脱细胞基质尿道悬吊修复材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于组织工程医用生物材料技术领域，具体涉及一种脱细胞基质尿道悬吊修复材料及其制备方法和应用。
背景技术
压力性尿失禁(Stress Urinary Incontinence,SUI)指喷嚏或咳嗽等腹压增高时出现不自主的尿液自尿道外口渗漏，是妇女常见疾病,国内及国外的流行病学调查发现,尿失禁在妇女中的发病率高达20％～40％,并且发病率随年龄的增长而增长。但是大多数患病妇女由于对疾病本身缺乏正确的认识又羞于就诊,无论国外还是国内,患病妇女的就诊率不及三分之一。有的患者甚至出现了严重并发症,长期干扰和影响了广大患病妇女的身体健康和生活质量。国际控尿协会(intemational continence society，ICS)定义其为“构成社会和卫生问题，且客观上能被证实和不自主的尿液流出”。SUI在中老年妇女中比较常见，全球约26.8％妇女有不同程度的尿失禁，40岁以后达40％，约4％患者需要治疗，国外报道65岁以上女性发病率高达50％～83％，严重影响患者的心理健康和生活质量。治疗SUI方法较多，但均有其不足。随着人们对SUI发病机制的深入了解，Delancey的“吊床学说”已被广泛接受，1996ULMSTEN报道了利用闭孔尿道中段无张力悬吊术(Transobturator Tense-free Vaginal Tape Inside-out，TVT-O)治疗SUI。与其他类型治疗尿失禁的手术相比，TVT手术更强调悬吊的稳定性和可靠性，在加强尿道括约肌闭合力量的同时，还具有防止尿道、膀胱颈过度活动的作用，目前已成为许多发达国家治疗女性SUI的主要方法。
目前国内外研究的尿道悬吊带及补片的类型分为两大类：一是天然材料，包括自体组织、同种异体植入材料及异种植入材料；二是人工合成材料，包括聚丙烯和聚四氟乙烯等。合成材料提供了更高的抗张强度和耐用性,但其也带来了更高的感染、腐蚀、尿道瘘的发生率。合成材料生物相容性差，长期异物刺激易引起周围组织结硬块，甚至会发生磨损蚀穿组织，侵蚀膀胱及阴道产生并发症,成为潜在的感染源。相对于合成材料，天然材料极少有侵蚀并发症发生，但自体组织取材于腹直肌筋膜或阔筋膜，手术复杂，并增加了术后疼痛及切口疝的发生；同种异体材料多取材于尸体阔筋膜，存在免疫排斥反应和病毒感染的风险，且取材来源受限。
目前美国强生、巴德及德国贝朗等公司推出的聚丙烯编织网的吊带及补片占领主要市场；但这些合成材料制成的吊带和补片组织相容性欠佳，患者有异物感，长期刺激易侵蚀周围软组织甚至穿透尿道或阴道导致补片暴露、感染，影响治疗效果，甚至需要再次手术移除吊带。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种脱细胞基质尿道悬吊修复材料的制备方法，制备得到的材料具有良好的力学性能，可以满足长期存在于体内环境的条件。
实现上述目的的技术方案如下。
一种脱细胞基质尿道悬吊修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(a)预处理：将待用组织器官预处理；所述的待用组织器官为异种或同种异体或自体组织器官；
(b)采取胰酶浸泡待用组织器官1-2小时，PBS清洗；
(c)脱脂：用碱溶液浸泡清洗对组织进行脱脂，获得脱脂后的生物组织；
(d)脱细胞：用0.1-0.2wt％的Triton x-100对脱脂后的生物组织进行物理搅拌清洗，获得脱细胞后的生物组织；
(e)交联：将脱细胞后的生物组织放入交联剂中交联2-4小时，交联后用PBS清洗；
(f)灭菌，保存，得到所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料。
在其中一些实施例中，所述待用组织器官为小肠粘膜下组织、心包膜、或猪、牛的真皮组织。
在其中一些实施例中，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液，其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度比为：2:1-4:1，进一步，在其中一个实施例中，为2:1。
在其中一些实施例中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.05-0.2mol/L，更优选为0.05-0.1mol/L。
在其中一些实施例中，所述交联剂为0.5％-0.75wt％浓度的戊二醛，优选为0.5-0.60wt％。
在其中一些实施例中，所述碱溶液为1.5-2wt％浓度的NaOH。
在其中一些实施例中，步骤(d)中所述物理搅拌为：在恒温摇床中进行持续振荡。
在其中一些实施例中，步骤(f)中所述灭菌保存为交联后的脱细胞基质先保存于PBS中后经γ辐照灭菌。
在其中一些实施例中，步骤(b)中所述胰酶的浓度为0.1±0.01wt％。
本发明的另一个目的是提供根据上述制备方法得到的脱细胞基质尿道悬吊修复材料。
在其中一些实施例中，所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料的长为350-400mm，宽为10-15mm和厚度为0.3-1.2mm。
本发明的另一个目的是提供上述脱细胞基质尿道悬吊修复材料在制备治疗压力性尿失禁的尿道悬吊带及补片中的应用。
本发明采用的异种材料通常为小肠粘膜下组织(SIS)、心包胶原基质组织或猪/牛真皮组织，来源广泛，但也存在动物异种免疫排斥的问题，如果能攻克去除异种免疫原物质，将免疫排斥风险降至临床应用可接收的安全水平，将为压力性尿失禁患者提供一种全新的尿道悬吊修复产品。我们通过使用合适浓度的碱溶液、表面活性剂浸泡清洗对组织进行脱脂、病毒灭活、脱细胞，随后对组织进行交联以加强组织的力学性能并延长其降解周期，其中交联剂为戊二醛、EDC/NHS等。最后将脱细胞后的动物组织保存于PBS溶液中，密封并于γ射线下灭菌。
本发明所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料由于采取较为温和的脱细胞工艺使得胶原微观结构得以保存完整，加之随后的交联作用使得我们制得的材料具备良好的生物相容性，低免疫的优势，并且其具备良好的力学性能，可以满足长期存在于体内环境的条件。而且，其具备可降解又不轻易降解的优势，无需手术二次取出。本发明所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料可以有效地解决聚丙烯材料的生物相容性欠佳，长期刺激易侵蚀周围软组织甚至穿透尿道或阴道的可能，体内无法降解甚至需要二次手术取出的可能。
附图说明
图1为实施例1-3所制备的脱细胞基质尿道悬吊修复材料的力学性能。
图2为实施例1中脱细胞基质尿道悬吊修复材料在不同观察倍数下的扫描电镜图，其中，A、B、C和D分别为放大100、1000、2000和5000倍。
图3为实施例1中脱细胞基质尿道悬吊修复材料的横截面的HE染色。
图4实施例1中脱细胞基质尿道悬吊修复材料的细胞毒性结果示意图。
图5不同类型的脱细胞基质尿道悬吊修复材料的DNA残留量。
图6为实施例5中术后一个月的标本结果。
图7为实施例5中术后六个月的标本结果。
图8为实施例5中术后一年的标本结果。
图9为实施例5中术后二年的标本结果。
具体实施方式
除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、细胞生物学、和免疫学传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下面将结合实施例对本发明进行进一步说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
所述生物组织指动物源或同种异体组织，包括猪小肠、猪皮、牛皮、心包膜、同种异体皮等。
实施例1：
1、取得完整的猪小肠粘膜下组织(SIS组织)，清洗并径向剪开，并使用PBS溶液反复冲洗以去除污染物；物理去除粘膜，使用木质刮板，小心均匀地刮去SIS膜内层的粘膜层；物理去除肌膜和浆膜，木质刮板和手术刀配合使用，去除SIS膜外层的肌膜和浆膜；
2、采取0.1％的胰酶浸泡SIS组织1-2小时，去除SIS组织内的核酸物质，随后用PBS(pH＝7.4)清洗3次；
3、使用1.8wt％浓度的NaOH溶液对SIS组织灭活处理30-50分钟以达到灭活SIS组织内的病毒的目的；随后用PBS(pH＝7.4)清洗SIS组织3次；
4、将SIS组织放进摇床中并加入0.1-0.2wt％的Triton x-100(聚乙二醇辛基苯基醚)对真皮组织进行搅拌清洗10小时，打破了脂质之间和脂质与蛋白间的联系；去除真皮组织内的残留细胞，随后用PBS(pH＝7.4)清洗3次；
5、取出SIS组织使用赖氨酸溶液漂洗三次，随后放入0.5％-0.60％浓度的戊二醛溶液中交联0.5-1小时；裁剪成长宽为400mm×11mm的形状后，使用PBS清洗三次；
6、用上述方法制备的脱细胞SIS基质保存于PBS(pH＝7.4)中并经γ辐照灭菌，得到脱细胞基质尿道悬吊修复材料1。
实施例2
1、选取健康的幼年小猪猪皮(含真皮组织)，对取皮区进行脱毛，苯扎溴铵消毒并使用片皮机把小猪真皮制成厚度为0.8-1.2mm的真皮；
2、采取0.1％的胰酶浸泡真皮2-3小时，去除真皮组织内的核酸物质，随后用PBS清洗3次；
3、使用1.5wt％浓度的NaOH溶液对真皮组织灭活处理40-60分钟灭活真皮组织内的病毒；随后用PBS清洗3次；
4、采取0.1-0.2％的Triton x-100(聚乙二醇辛基苯基醚)对真皮组织进行搅拌清洗16小时，打破了脂质之间和脂质与蛋白间的联系。去除真皮组织内的残留细胞，随后用PBS(pH＝7.4)清洗3次；
5、将真皮组织放入0.5wt％-0.60wt％浓度的戊二醛溶液中交联2-4小时，裁剪成长宽为400mm×11mm的形状，随后用PBS(pH＝7.4)清洗3次；
6、用上述方法制备的脱细胞真皮基质保存于PBS(pH＝7.4)中并经γ辐照灭菌，得到脱细胞基质尿道悬吊修复材料2。
实施例3
1、取牛的心包膜，并对其进行裁剪，长宽分别为35-40cm和1-1.5cm，并于PBS溶液中清洗3次；
2、采取0.1％的胰酶浸泡心包膜组织0.5-1小时，去除心包膜组织内的核酸物质，随后用PBS清洗3次；
3、使用2wt％浓度的NaOH溶液对心包膜组织灭活处理30-50分钟以达到灭活心包膜组织内的病毒的目的。随后用PBS(pH＝7.4)清洗SIS组织3次；
4、将心包膜组织放进摇床中并加入0.1-0.2wt％的Triton x-100(聚乙二醇辛基苯基醚)对心包膜组织进行搅拌清洗12小时，打破了脂质之间和脂质与蛋白间的联系。去除心包膜组织内的残留细胞，随后用PBS(pH＝7.4)清洗3次；
5、将心包膜组织放入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液中交联2-4小时，其中EDC/NHS的摩尔比为2：1,EDC的浓度为0.05-0.1mol/L，随后用PBS(pH＝7.4)清洗3次；
6、用上述方法制备的心包膜保存于PBS(pH＝7.4)中并经γ辐照灭菌，得到脱细胞基质尿道悬吊修复材料3。
实施例4性能测试
一、构成
以上三个实施例制备得到的脱细胞基质尿道悬吊修复材料经裁切工艺制得的生物型尿道悬带的主体结构，其长度、宽度和厚度分别在350-400mm、10-15mm和0.3-1.2mm。表面光滑无凸凹不平。
二、力学性能检测：取上述制得的生物型尿道吊带3条，将试样上下端分别夹在试验机上、下夹具内，松紧适宜，沿试样长度方向剥离，试验速度为(200±20)mm/min，记录各剥离力值。其中平均断裂拉伸强度为18.65Mpa，平均最大载荷为29.76N。表现出良好的拉伸性能，可以满足尿道悬带的应用要求。
图1和表1中的1，2，3分别代表实施例1-3所述的脱细胞基质尿道悬吊修复材料。
表1
Figure BDA0002144689890000081
三、扫描电镜：取制备的脱细胞基质尿道悬吊修复材料使用扫描电镜观察其表面微观结构。可以观察到膜片表面具备良好的纤维结构(请参见图2—来自于实施例1的脱细胞基质尿道悬吊修复材料)，这些取向一致的胶原纤维结构可以为材料提供良好的力学性能。
四、苏木精-伊红染色：取制备完成后的脱细胞基质尿道悬吊修复材料进行苏木精-伊红(HE)染色后，置于显微镜下观察其横截面的染色情况。试验结果表明，经过脱细胞工艺处理后的脱细胞基质尿道悬吊修复材料胶原纤维排列有序，松紧有序，无残留细胞(以实施例1所得的脱细胞基质尿道悬吊修复材料为例，请参见图3)。结果表明，本发明脱细胞工艺制备的脱细胞基质尿道悬吊修复材料具备良好的生物安全性。
五、细胞毒性检测：
1.细胞接种：将L929细胞(小鼠成纤维细胞)调整浓度为4×104/mL，接种于2块96孔平底培养板中，100μl/孔，放入37℃，5％CO2培养箱中培养24h。2.样品浸提液制备：以实施例所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料按双面面积6cm2/mL用DMEM完全培养基浸提；各离心管加好后放入37℃培养箱中浸泡约24h。
3.浸提液与细胞共培养：取接种L929细胞24h的96孔培养板，吸除每孔上清。试验样本每孔加入各样本浸提液200μl，每个样本设复孔。并同时设有空白对照孔、新鲜培养基对照孔和阳性对照孔(含5％DMSO的完全培养液)。各样本加好后，将培养板放入37℃，5％CO2培养箱中分别培养48h和72h。
4.细胞增殖MTT法检测。参见图4，实验结果表明，在24小时和48小时时，阴性对照组和样品组细胞生长良好，增值正常，表明本发明的脱细胞基质尿道悬吊修复材料具备良好的生物相容性。
六、DNA残留量测定：
取实施例1至3中小肠系、心包膜和真皮系列的三种脱细胞生物型悬带经蛋白酶K消化、DNA纯化、DNA含量测定经计算得到其DNA残留量分别为4.61±1.74ng/mg、8.89±4.89ng/mg、4.50±2.41ng/mg(测试方法按照YY0606.25-2014《组织工程医疗产品第25部分动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》)。目前，全世界关于DNA残留量的标准尚无一个统一的标准，但从脱细胞植入体在体内的免疫反应、热原反应来判定，认为脱细胞材料的DNA残留量低于100ng/mg是安全可靠的。经测定，上述三种脱细胞生物型悬带的DNA残留量均远远低于100ng/mg，说明其具备良好的生物安全性。
实施例5
为了检测我们制备的脱细胞基质尿道悬吊修复材料植入后的中长期外观效果以及转归情况。通过该植入实验，观察植入物周围的组织反应，评价植入物的组织相容性及排异反应等情况，为临床实验提供该实验品的安全性结果。
材料
实验动物山羊15只，雌性，体重20～30kg，分别于术后1月、3月、6月、1年、2年处死并取标本。
⒉手术方式
将动物备皮后，用2％戊巴比妥钠静脉注射作全身麻醉，并将动物仰卧位固定在手术台上，常规消毒铺巾。沿腹白线作一长约3cm的纵切口，逐层分离至肌层，向两侧钝性分离肌层，植入实施例1所述的脱细胞基质尿道悬吊修复材料(即以下所称生物型尿道吊带)，将吊带两端用4-0丝线固定，逐层关闭腹腔，缝合切口皮肤，再次消毒，并予纱布外敷固定。
⒊术后护理
术后3天内青霉素80万单位/次肌注bid；氯霉素0.5g/次肌注bid。
术后4～6天青霉素80万单位/次肌注qd；氯霉素0.5g/次肌注qd。
⒋术后护理及观察
动物苏醒后，按常规喂养。严密观察动物一般情况(精神状况、饮食、活动、伤口愈合情况等)，异常情况发生时，立即通知手术医生和值班护士，并作对症处理。
⒌解剖观察与标本取样
预定时间到后，处死动物，沿着腹白线切开皮肤，充分暴露植入物。大体观察植入部位的外观，植入材料与正常组织的融合情况。取出的部分标本进行简单修建和打制成标准样后，进行拉伸检测实验；其余标本装瓶浸泡于10％福尔马林溶液中，贴好标识后作病理(组织学)分析。
⒍病理标本
室温下福尔马林固定至少一周后，取实验动物标本，常规石蜡包埋，切片，HE染色。
结果分析：
⒈术后一般情况
所有动物术后均能正常饮食，术后均生长良好，手术部位无红肿、无渗液、无分泌物、无溃疡，切口愈合良好，无异常现象发生。
2.各时间段的检测结果
2.1一个月的标本结果
2.1.1大体观察：脱细胞基质尿道悬吊修复材料，外面形成完整的纤维包裹，周围组织无水肿、出血、感染征；材料完整，无降解。请参见图6中的A(植入物大体图)。
2.1.2组织学观察：植入物的固定头与正常组织分界较清楚，网片部分与周围纤维组织融合，可见纤维组织长入，植入物周围组织形成薄层轻度异物反应带，浸润的炎细胞较少，植入物无明显溶解。请参见图6中的B(HE，×200)。
2.1.3结果分析
请参见图6。植入一个月后，已可见植入物里有自体纤维组织长入，植入物与宿主组织融为一体，形成了稳定的结构，达到预期效果。
2.2六个月的标本结果
2.3.1大体观察：脱细胞基质尿道悬吊修复材料有完整的纤维组织包裹，可见固定头的存在，周围组织无水肿、出血、感染征。吊带的网片界限不够清晰，可能有轻微降解。请参见图7中的A(植入物大体图)。
2.3.2组织学观察：网片与周围纤维组织融合，可见大量成纤维细胞和纤维组织长入，植入物降解为片状或块状，新生组织的重建正在进行中。请参见图7中的B(HE，×200)。
2.3.3结果分析
植入物结构仍然较为稳定，植入物内有大量成纤维细胞和纤维组织长入，整个标本已进入新生组织重建过程。
一年的标本结果
2.4.1大体观察：脱细胞基质尿道悬吊修复材料的纤维包裹轻微，可见固定头的存在，周围组织无水肿、出血、感染征。吊带的网片界限已经不清晰了，疑似有新生组织生成。请参见图8中的A(植入物大体图)。
2.4.2组织学观察：网片与周围纤维组织融合较好，可见大量成纤维细胞和纤维组织长入，植入物已经与周围组织融合在一起，难以区分开，新生组织逐渐成熟和稳定。请参见图8中的B(HE，×200)。
2.5两年的标本结果
2.5.1大体观察：整条脱细胞基质尿道悬吊吊带的轮廓已经不清晰了，难与周围组织却分开来，新形成的组织韧性好、平整、结构稳定。请参见图9中的A(植入物大体图)。
2.5.2组织学观察：植入物内出现正常的纤维组织，且自身降解为碎粒，无明显炎症反应，从结构上看，新生组织的重建过程接近尾声。请参见图9中的B(HE，×200)。
2.5.4结果分析
植入物已经难以分辨，与周围组织融合为一体；植入物内出现正常的纤维组织，且自身降解为碎粒，无明显炎症反应。
通过本动物实验我们观察到，以SIS膜、真皮组织、心包膜为原料经去细胞工艺、胶原交联改性等生化技术处理制成的生物型尿道吊带，无免疫排斥性，能与自身组织紧密融合，具有较好的生物相容性，能够参与新生组织的再生和重建过程中，形成的新生组织结构稳定、力学性能较好。因此，该生物型尿道吊带是一种安全性和有效性较好的盆底组织修复材料。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种脱细胞基质尿道悬吊修复材料的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(a)预处理：将待用组织器官预处理，所述的待用组织器官为异种或同种异体组织器官，所述待用组织器官为小肠粘膜下组织、心包膜、或猪、牛的真皮组织；
(b)采取胰酶浸泡待用组织器官1-2小时，PBS清洗；
(c)脱脂：用碱溶液浸泡清洗对组织进行脱脂，获得脱脂后的生物组织，所述碱溶液为1.5-2wt％浓度的NaOH；
(d)脱细胞：用0.1-0.2wt％的Triton x-100对脱脂后的生物组织进行物理搅拌清洗，获得脱细胞后的生物组织；
(e)交联：将脱细胞后的生物组织放入交联剂中交联2-4小时，交联后用PBS清洗；
(f)灭菌，保存，得到所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料；所述交联剂为0.5wt％-0.75wt％戊二醛溶液。
2.根据权利要求1所述的所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料的制备方法，其特征是，所述交联剂为0.5wt％-0.6wt％的戊二醛溶液。
3.根据权利要求1所述的所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料的制备方法，其特征是，步骤(d)中所述物理搅拌为：在恒温摇床中进行持续振荡。
4.根据权利要求1或3所述的所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料的制备方法，其特征是，和/或步骤(f)中所述灭菌保存为交联后的脱细胞基质先保存于PBS中后经γ辐照灭菌。
5.根据权利要求1-3任一项所述的所述脱细胞基质尿道悬吊修复材料的制备方法，其特征是，步骤(b)中所述胰酶的浓度为0.1±0.01wt％。
6.根据权利要求1-5任一项所述制备方法得到的脱细胞基质尿道悬吊修复材料。
7.根据权利要求6所述的脱细胞基质尿道悬吊修复材料，其特征是，其长为350-400mm，宽为10-15mm和厚度为0.3-1.2mm。
8.权利要求6或7所述的脱细胞基质尿道悬吊修复材料在制备治疗压力性尿失禁的尿道悬吊带及补片中的应用。
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