CN109395166A - 一种新的脱细胞羊膜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的脱细胞羊膜的制备方法，涉及生物材料的技术领域。该方法包括将羊膜超声处理，然后物理刮除羊膜上的细胞，得到脱细胞羊膜。该方法采用超声处理和物理刮除的方式去除羊膜表面的细胞，避免了胰酶等化学试剂的使用，制备得到的脱细胞羊膜产品更安全，降低了羊膜中对机体有害的化学物质的残留，同时最大限度的保留了羊膜基质的完整性。

Description

一种新的脱细胞羊膜的制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其是涉及一种新的脱细胞羊膜的制备方法。
背景技术
应用于组织工程中的支架材料是指具备支撑特定细胞，引导组织再生和控制组织结构，能植入生物体且与组织活体细胞结合的材料。组织工程中的支架材料在组织工程中扮演着极其重要的角色，它可调控细胞在支架中的生长及发挥生物学功能，同时促进搭载在支架中的细胞向目标组织或器官分化，支架为接种的细胞提供初步支撑，将细胞定位在合适的空间中，为细胞的黏附、迁移、增殖和分化提供物理和生物学提示，并繁殖细胞和将其分泌的细胞外基质组装到功能性组织和器官中。在组织再生期间，支架逐渐被细胞自身及周围组织分泌的基质溶解取代。
支架材料主要包括生物型支架、可降解复合材料支架及天然材料支架。细胞外基质支架属于天然材料型支架，是一种理想的组织工程支架，由于基质蛋白是体内细胞的主要成分，细胞外基质支架不仅对细胞起到支撑作用，同时也对细胞生长、增殖、体态及分化起到调控作用。
细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)是指由细胞合成并分泌到胞外，分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖及各种纤维。这些物质构成网架结构，支持并连接组织结构，调节组织和细胞的生理活动。细胞外基质是人体或者动物组织的重要组成成分，虽然不属于任何细胞，但它是细胞生命代谢活动的分泌产物，也构成了组织细胞整体生存和功能活动的直接微环境，还决定了结缔组织的特性，是细胞功能活动的参与者。
细胞外基质支架和细胞外基质仿生支架可促进动物和人体许多不同组织的重塑。为了获得天然的细胞外基质仿生支架，常常将组织中的细胞通过脱细胞处理而去除，但其自身结构、功能蛋白质和糖胺聚糖的复杂基质却被可保留下来。
脱细胞羊膜作为细胞外基质支架，因其优越的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性等众多优点，可作为保持干细胞多能分化特性的培养环境，也直接充当了组织工程支架材料的优先选择。
羊膜是胎膜最里层厚约0.02～0.05mm、具有一定韧性、无血管、神经和淋巴管的半透明组织。羊膜具有低抗原性、抗纤维化、抗炎、抗新生血管生成作用，作为一种生物材料已广泛应用于临床。
脱细胞羊膜不含羊膜上皮细胞，保留了羊膜基底膜与致密层，它的主要成分是III、Ⅳ、V型胶原蛋白、蛋白多糖和糖蛋白，是一种特殊的细胞外基质。脱细胞羊膜作为一种特殊的细胞外基质，取材较易，数量较多，广泛的应用于各部位损伤修复，如角膜移植、皮肤缺损、软骨损伤后的修复及外周神经再生等领域，获得良好的治疗效果。供体羊膜的可用性，同种异体或异种异体羊膜由于其有效性已被广泛应用，但是却不能不考虑炎症和免疫排斥反应发生的可能性，因此彻底移除细胞成分的方法就变得十分重要。
现有的脱细胞羊膜的制备方法主要有酶消法，使用的酶主要由胰酶、DNase酶和透明质酸酶等；戊二醛+TritonX-100交联法；以及酶消法与物理刮除相结合的方法。现有方法在制备脱细胞羊膜的时候都无法避免经过化学处理。化学处理一般通过使用碱、酸、洗涤剂、有机溶剂、螯合剂、低渗溶液或高渗溶液来破坏细胞膜和负责细胞间和细胞外连接的化学键，达到脱细胞的目的。虽然化学处理能够去除细胞组分，但是化学处理对剩余细胞外基质的组成、生物活性和生物力学性质也有一些不利影响。因此，一种改进的脱细胞羊膜的制备方法是目前需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种脱细胞羊膜的制备方法，该制备方法操作简单，制备得到的脱细胞羊膜安全性和完整性高。
本发明的第二目的在于提供一种使用上述脱细胞羊膜的制备方法制备得到的脱细胞羊膜。
本发明的第三目的在于提供一种上述脱细胞羊膜的制备方法或上述脱细胞羊膜在制备生物材料中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种包含上述脱细胞羊膜的生物材料。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
本发明提供了一种脱细胞羊膜的制备方法所述制备方法包括将羊膜超声处理，然后物理刮除所述羊膜上的细胞，得到脱细胞羊膜。
优选地，所述制备方法还包括在超声处理前去除羊膜中的血液。
优选地，所述制备方法还包括在超声处理前用水浸泡羊膜；
优选地，浸泡时间为6～24h，优选为12～24h；更优选为12h。
优选地，所述超声处理包括将羊膜铺展于密封的容器内，然后将所述密封的容器置于超声装置中超声；
优选地，所述超声处理的功率为500～800W；优选为550～700W；更优选为600W；
优选地，所述超声处理的频率为35～50kHz；优选为35～45kHz；更优选为40kHz；
优选地，所述超声处理的时间为1～4h；优选为1.5～3.5h；更优选为2h。
优选地，所述物理刮除所述羊膜上的细胞包括使用细胞刮子刮去羊膜表面的细胞。
优选地，重复至少一次羊膜超声处理至物理刮除所述羊膜上的细胞的步骤。
优选地，该制备方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水去除羊膜中的残留血液，然后用水浸泡羊膜；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声；
(c)用细胞刮子刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜铺展晾干。
本发明还提供了上述脱细胞羊膜的制备方法制备得到的脱细胞羊膜。
本发明还提供了上述脱细胞羊膜的制备方法或上述脱细胞羊膜在制备生物材料中的应用。
本发明还提供了一种包含上述脱细胞羊膜的生物材料；
优选地，所述生物材料包括组织工程中的支架材料。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的脱细胞羊膜的制备方法包括将羊膜超声处理，然后物理刮除所述羊膜上的细胞，得到脱细胞羊膜。本发明提供的脱细胞羊膜的制备方法采用超声处理和物理刮除的方式去除羊膜表面的细胞，避免了胰酶化学试剂的使用，制备得到的脱细胞羊膜产品更安全，降低了羊膜中对机体有害的化学物质的残留，同时最大限度的保留了羊膜基质的完整性。
基于上述发明构思，本发明还提供了一种使用上述脱细胞羊膜的制备方法制备得到的脱细胞羊膜。该脱细胞羊膜安全性高，脱细胞羊膜中对机体有害的化学物质的残留低，羊膜基质的完整性高。
本发明还提供了上述脱细胞羊膜的制备方法或上述脱细胞羊膜在制备生物材料中的应用。以脱细胞羊膜作为生物材料可以为细胞的增殖、分化提供合适的细胞外基质与丰富的营养成分，有利于细胞的生长、繁殖与分化；以脱细胞羊膜作为生物材料还能够促进细胞上皮化，通过加速上皮化维持正常上皮表型，减轻炎症反应，减轻血管化及瘢痕形成等方式，促进组织伤口愈合，在组织损伤修复与重建中具有广阔的应用前景。基于上述发明构思，本发明还提供了包含脱细胞羊膜的生物材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为未经处理的羊膜；
图2为使用实施例1提供的制备方法制备得到的脱细胞羊膜；
图3为使用对比例1提供的制备方法制备得到的脱细胞羊膜；
图4为HE染色未经处理的羊膜；
图5为HE染色使用实施例1提供的制备方法制备得到的脱细胞羊膜；
图6为HE染色使用对比例1提供的制备方法制备得到的脱细胞羊膜。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是：
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供了一种脱细胞羊膜的制备方法，该制备方法包括将羊膜超声处理，然后物理刮除所述羊膜上的细胞，得到脱细胞羊膜。本发明提供的脱细胞羊膜的制备方法采用超声处理和物理刮除的方式去除羊膜表面的细胞，避免了胰酶化学试剂的使用，制备得到的脱细胞羊膜产品更安全，降低了羊膜中对机体有害的化学物质的残留，同时最大限度的保留了羊膜基质的完整性。
在一些优选的实施方式中，所述制备方法还包括在超声处理前去除羊膜中的残留血液。可选的，可使用磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液等能够维持细胞渗透压和pH的缓冲液冲洗浸泡细胞以去除细胞中的残留血液，也可以使用生理盐水将羊膜冲洗中的残留血液清洗干净，为了减少脱细胞羊膜中化学物质的残留，优选使用化学成分简单的生理盐水清洗羊膜。
在一些优选的实施方式中，所述制备方法还包括在超声处理前用水浸泡羊膜，水的渗透压低于细胞内液，可改变细胞渗透压使细胞破裂，达到破坏羊膜基质上的上皮细胞的目的，裂解的细胞在超声处理羊膜的步骤中更容易脱落。在本实施方式中使用水浸泡细胞使其裂解的方法可以避免使用酶、去污剂等潜在的具有免疫原性的物质或对机体有害的化学物质；同时使用水浸泡羊膜只会使羊膜上的细胞裂解，而不会破坏羊膜基质层中的天然的致密结构。本实施方式中使用的水包括但不限于为蒸馏水、去离子水或纯水，由于脱细胞羊膜通常用于制备生物材料，对脱细胞羊膜的生物安全性要求较高，因此优选使用纯水浸泡羊膜。
在一些优选的实施方式中，浸泡时间为6～24h，例如可以为但不限于为6h、8h、9h、10h、12h、14.5h、15h、17.5h、20h、22h或24h；优选为12～24h；更优选为12h。通过调整和优化浸泡时间可以进一步提高羊膜上细胞的裂解效果。
在一些优选的实施方式中，所述超声处理包括将羊膜铺展于密封的容器内，然后将所述密封的容器置于超声装置中超声。超声处理的目的是让羊膜上的细胞脱落，直接将羊膜置于超声装置中超声虽然可以充分破坏羊膜表面上的细胞，但是不利于羊膜的基底膜与致密层维持其自身的结构；将羊膜铺展在密封的容器中再超声，超声波通过容器的壁使羊膜震荡，促使羊膜上的细胞脱落的同时又避免了基底膜与致密层受到过于剧烈的震荡，提高了脱细胞羊膜的生物活性和生物力学性质。
在一些优选的实施方式中，所述超声处理的功率为500～800W，例如可以为但不限于为500W、510W、525W、550W、575W、580W、600W、625W、650W、680W、700W、750W或800W；优选为550～700W；更优选为600W。
在一些优选的实施方式中，所述超声处理的频率为35～50kHz，例如可以为但不限于为35kHz、37kHz、38.5kHz、40kHz、42kHz、43.5kHz、45kHz、47kHz或50kHz；优选为35～45kHz；更优选为40kHz。
在一些优选的实施方式中，所述超声处理的时间为1～4h；例如可以为但不限于为1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h或4h；优选1.5～3.5h，更优选2h。
合适的声功率、超声频率和超声时间可以在保证羊膜上的细胞充分脱落的同时尽量避免超声对羊膜基质的伤害，因此通过调整超声功率、超声频率和超声时间可以进一步优化羊膜超声的效果。
在一些优选的实施方式中，所述物理刮除所述羊膜上的细胞包括使用细胞刮子刮去羊膜表面的细胞，使用细胞刮子刮去羊膜表面的细胞，操作简单，不需要特殊的设备即可完成。
为了更充分的去除羊膜上的细胞，在一些优选的实施方式中，重复至少一次羊膜超声处理至物理刮除所述羊膜上的细胞的步骤，多次的对羊膜进行超声处理和物理刮除可以更充分的去除羊膜上的细胞。
在一些优选的实施方式中，按照如下方法实施脱细胞羊膜的制备方法，效果更佳：
(a)使用生理盐水去除羊膜中的残留血液，然后用纯水浸泡羊膜；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封后置于超声波清洗仪中超声；
(c)用细胞刮子刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜铺展晾干。
该实施方式中，除去使用生理盐水清洗羊膜并采用纯水浸泡羊膜，羊膜未接触其他化学试剂，该实施方式减小了在制备过程中引入过多的化学物质，避免了脱细胞羊膜的二次污染。该实施方式采用将羊膜密封在培养皿内超声，促使羊膜上的细胞脱落的同时又避免了基底膜与致密层受到过于剧烈的震荡，因此为了避免羊膜密封在培养皿内超声不彻底，在超声前先用纯水浸泡羊膜使羊膜上的细胞裂解破坏细胞，由于细胞结构在浸泡时被破坏，因此在超声时更容易与羊膜基质分离。
基于上述发明构思，本发明还提供了一种使用上述脱细胞羊膜的制备方法制备得到的脱细胞羊膜。该脱细胞羊膜安全性高，脱细胞羊膜中对机体有害的化学物质的残留低，羊膜基质的完整性高。
本发明还提供了上述脱细胞羊膜的制备方法或上述脱细胞羊膜在制备生物材料中的应用。生物材料有时也称为生物医用材料，一般是指以医疗为目的，用于与活体组织接触并能实现某种功能的无生命材料，包括具有良好的生物相容性材料、生物降解性材料和非生物降解性材料三大类。生物材料是能够用于人工器官、外科修复、理疗康复、诊断、检查等医疗保健领域，而对人体组织和体液无不良影响的材料。
以脱细胞羊膜作为生物材料可以为细胞的增殖、分化提供合适的细胞外基质与丰富的营养成分，有利于细胞的生长、繁殖与分化；以脱细胞羊膜作为生物材料还能够促进细胞上皮化，通过加速上皮化维持正常上皮表型，减轻炎症反应，减轻血管化及瘢痕形成等方式，促进组织伤口愈合，在组织损伤修复与重建中具有广阔的应用前景。
基于上述发明构思，本发明还提供了包含脱细胞羊膜的生物材料，该生物材料中的脱细胞羊膜使用上述脱细胞羊膜的制备方法制备而成，无胰酶和化学试剂的污染，羊膜基质完整，能够使生物材料充分发挥其效果。由于包含该脱细胞羊膜的生物材料安全性和完整性均较好，该生物材料优选为组织工程中的支架材料，可以对细胞起到良好的支撑作用，并且对细胞生长、增殖、体态及分化起到调控作用。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
本实施例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余后，然后用水浸泡羊膜12h；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声2h，超声功率为600W，超声频率为40kHz；
(c)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
实施例2
本实施例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余后，然后用水浸泡羊膜6h；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声4h，超声功率为500W，超声频率为50kHz；
(c)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
实施例3
本实施例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余后，然后用水浸泡羊膜24h；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声1h，超声功率为800W，超声频率为35kHz；
(c)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
实施例4
本实施例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余后，然后用水浸泡羊膜12h；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声1.5h，超声功率为550W，超声频率为45kHz；
(c)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
实施例5
本实施例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余后，然后用水浸泡羊膜12h；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声3.5h，超声功率为700W，超声频率为35kHz；
(c)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
实施例6
本实施例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余后，然后用水浸泡羊膜36h；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声30min，超声功率为1kW，超声频率为30kHz；
(c)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
实施例7
本实施例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声6h，超声功率为400W，超声频率为100kHz；
(c)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复两遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
实施例8
本实施例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余后，然后用水浸泡羊膜12h；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声2h，超声功率为600W，超声频率为40kHz；
(c)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞，然后将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
实施例9
本实施例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余后，然后用水浸泡羊膜12h；
(b)将羊膜置于超声波清洗仪中超声15min，超声功率为600W，超声频率为40kHz；
(c)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
对比例1
本对比例提供了一种脱细胞的羊膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)使用生理盐水洗尽羊膜中血液残余后，浸泡于生理盐水中，放入恒温孵育箱，反复震荡摇晃4h，然后至于0.25％-EDTA胰蛋白酶中再震荡摇晃4h取出，PBS冲洗；
(b)用细胞刮子轻轻刮去残存在羊膜表面的细胞，将制备得到的脱细胞羊膜置于干净的培养皿表面铺展晾干。
效果例1
比较实施例1、对比例1和未经处理的羊膜，如图1、图2和图3所示，可以看出本发明提供的脱细胞羊膜的制备方法和传统的胰酶消化的方法都可以制得完整度高的脱细胞羊膜。使用HE将实施例1、对比例1和未经处理的羊膜染色后，如图4、图5和图6所示，可以看出实施例1和对比例1均可以将脱细胞羊膜上的细胞去除干净。
效果例2
取实施例1-9和对比例1脱细胞羊膜至培养基中，检品表面积30cm2，加细胞培养液5mL，在37℃下浸泡24h，收集浸提培养液后滤膜过滤；
空白对照为细胞培养液，阳性对照为含5g/L苯酚的细胞培养液；
将浓度为1×104cells/mL正常传代的L-929细胞接种于96孔板，每孔100μL，每组6孔，37℃，5％CO2培养24h后弃培养基，空白组使用细胞培养液培养，阳性对照组使用含5g/L苯酚的细胞培养液培养，实验组使用脱细胞羊膜浸提液培养，置于37℃，5％CO2培养72h；
每孔加入20μL MTT溶液继续培养4h后弃去孔内液体，加入150μL DMSO，置震荡器上震荡10min，在酶标仪570nm和630nm测定吸光度，测定结果如表1所示：
表1脱细胞羊膜浸提培养液培养细胞后的吸光度
效果例3
将实施例1-9和对比例1制备得到的脱细胞羊膜制成与96孔板大小，置于96孔板底部，加入1×104cells/mL L-929细胞，培养4d后每孔加入20μL MTT溶液继续培养4h后弃去孔内液体，加入150μL DMSO，置震荡器上震荡10min，在酶标仪570nm测定吸光度，结果如表2所示：
表2脱细胞羊膜的组织相容性
OD(570nm)
实施例1 1.265
实施例2 1.124
实施例3 1.165
实施例4 1.273
实施例5 1.196
实施例6 1.295
实施例7 1.206
实施例8 1.143
实施例9 1.251
对比例1 0.957
空白对照 1.219
效果例4
HE染色后统计实施例1-9和对比例1制备得到的脱细胞羊膜上残余细胞的数量，结果如表3所示。
效果例5
使用智能电子拉力试验机，用50N传感器，速度20mm/min，测定实施例1-9和对比例1制备得到的脱细胞羊膜的拉伸长度和断裂长度，结果如表3所示：
表3脱细胞羊膜上残余细胞的数量和脱细胞羊膜的机械强度
组别 细胞数/cm<sup>2</sup> 拉伸强度(Mpa) 断裂伸率(％)
实施例1 1.65 1.639 20.485
实施例2 3.58 1.383 17.284
实施例3 3.26 1.596 19.954
实施例4 2.58 1.442 18.026
实施例5 2.12 1.381 17.265
实施例6 4.72 1.368 17.095
实施例7 5.25 1.477 18.463
实施例8 3.56 1.714 21.432
实施例9 3.25 1.312 16.485
对比例1 1.45 1.347 16.844
从上述效果例可以看出，优化脱细胞羊膜的制备工艺可以优化制备得到的脱细胞羊膜的性能，从效果例1可以看出，由于本发明提供的脱细胞羊膜的制备在制备过程中没有使用化学试剂，因此实施例1-实施例9制备得到的脱细胞羊膜中无化学试剂残留，制备得到的脱细胞羊膜的毒性更低，组织相容性更好；而对比例1提供的制备方法由于使用了TritonX-100以及胰蛋白酶，其制得的脱细胞羊膜中残留的化学物质和胰蛋白酶对细胞的生长具有一定的毒副作用，也进一步影响了其组织相容性。
由效果例4和效果例5可以看出，本发明提供的脱细胞羊膜的制备方法基本可以达到传统的酶消化法的效果，脱细胞羊膜上基本无细胞残留；并且本发明提供的制备方法制备得到的脱细胞羊膜的机械强度由于对比例1。
效果例6
将实施例1提制备得到的脱细胞羊膜剪成1.5cm×1.5cm，在麻醉的实验家兔背部切长2cm长切口，将样品置入皮下，5组重复。术后每天观察动物状态，脱细胞羊膜植入家兔皮下4周后，家兔全部成活，无伤口红肿、出血、渗出等炎症反应。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种脱细胞羊膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将羊膜超声处理，然后物理刮除所述羊膜上的细胞，得到脱细胞羊膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在超声处理前去除羊膜中的血液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在超声处理前用水浸泡羊膜；
优选地，浸泡时间为6～24h，优选为12～24h；更优选为12h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理包括将羊膜铺展于密封的容器内，然后将所述密封的容器置于超声装置中超声；
优选地，所述超声处理的功率为500～800W；优选为550～700W；更优选为600W；
优选地，所述超声处理的频率为35～50kHz；优选为35～45kHz；更优选为40kHz；
优选地，所述超声处理的时间为1～4h；优选为1.5～3.5h；更优选为2h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述物理刮除所述羊膜上的细胞包括使用细胞刮子刮去羊膜表面的细胞。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，重复至少一次羊膜超声处理至物理刮除所述羊膜上的细胞的步骤。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)使用生理盐水去除羊膜中的残留血液，然后用水浸泡羊膜；
(b)将羊膜铺展在培养皿底部，密封培养皿后置于超声波清洗仪中超声；
(c)用细胞刮子刮去残存在羊膜表面的细胞；
(d)重复一遍步骤(b)至步骤(c)，然后将制备得到的脱细胞羊膜铺展晾干。
8.使用权利要求1-7中任一项所述的脱细胞羊膜的制备方法制备得到的脱细胞羊膜。
9.权利要求1-7中任一项所述的脱细胞羊膜的制备方法或权利要求8所述的脱细胞羊膜在制备生物材料中的应用。
10.一种包含权利要求8所述的脱细胞羊膜的生物材料；
优选地，所述生物材料包括组织工程中的支架材料。
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