CN103961752B - 组织再生引导膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组织再生引导膜及其制备方法,该方法包括:前处理步骤,收集哺乳动物腹膜,流动水洗涤及脱毛、初步脱脂后备用;去抗原处理步骤,依次采用酶处理工艺、碱处理工艺、酸处理工艺和高渗处理工艺对备用的腹膜进一步脱脂,去除免疫原性;胶原纤维收缩处理步骤,对去抗原处理后的腹膜依次进行脱水、去除非亲水性物质和水洗处理,使腹膜的胶原纤维收缩;干燥步骤,将收缩处理后的腹膜平铺于培养皿表面,使腹膜的致密层接触培养皿,迅速转移至-60到-80℃冰箱中预冻1-8小时,再放入冻干机中冻干24-36小时后得到可引导组织再生的胶原膜。本发明的引导膜具有致密层和疏松层,还具有良好的生物相容性、亲水性和骨诱导能力,体内降解时间长。

Description

组织再生引导膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,具体涉及一种组织再生引导膜及其制备方法。
背景技术
在治疗重度牙周病方面已开始广泛应用组织再生引导膜(guidedtissueregeneration,GTR),GTR膜材料可分为不可吸收膜材料和可吸收膜材料。
不可吸收的膜材料(如用聚四氟乙烯制备的GTR膜)由于必须进行二次手术取出,而给病人带来极大痛苦,并且因其无生物活性,不能用于较大缺损面积的再生,因此,市场上绝大多数不可降解吸收的膜材料基本已被淘汰。
目前,市场上可降解吸收的组织再生引导膜材料产品很少,并且都存在一些缺陷。由胶原蛋白制备的GTR膜,在体内降解后不会产生任何有害物质,生物相容性优于人工合成高分子聚合物,已逐渐成为制备GTR膜的主要原料。但因其机械性能较差,遇水结构易塌陷,降解过快、与骨组织生长速度不匹配。为克服胶原材料降解的缺陷,也有使用戊二醛等化学交联剂来延长其在体内的降解时间,但它们在产品中的残留会引起患者机体对产品的排斥,加上其制备方法复杂,因此规模化生产难度大。另外,异种胶原植入物最关键的问题的是材料的抗原性问题,动物抗原可能激发免疫反应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种组织再生引导膜,能具有适当的降解速度、良好的生物相容性、亲水性和骨诱导能力。
本发明所进一步要解决的技术问题在于,提供一种组织再生引导膜制备方法,以便能便捷地制备出具有适当降解速度、良好的生物相容性、亲水性和骨诱导能力的组织再生引导膜。
为解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:一种组织再生引导膜制备方法,其包括如下步骤:
前处理步骤,收集哺乳动物的腹膜,流动水洗涤及脱毛后采用流动水洗的机械法进行初步脱脂,再储存在0-4℃环境中备用;
去抗原处理步骤,依次采用酶处理工艺、碱处理工艺、酸处理工艺和高渗处理工艺对初步脱脂后备用的腹膜进一步脱脂,去除免疫原性;
胶原纤维收缩处理步骤,对经去抗原处理后的腹膜依次进行脱水、去除非亲水性物质和水洗处理,使腹膜的胶原纤维收缩,提升膜组织的致密度;
干燥步骤,将收缩处理后的腹膜平铺于培养皿表面,使腹膜的致密层接触培养皿,迅速转移至-60到-80℃冰箱中预冻1-8小时,再放入冻干机中冻干24-36小时后得到具有致密层和疏松层的可引导组织再生的胶原膜。
进一步地,在前处理步骤中,收集是的刚刚被宰杀的猪、牛或羊的腹膜。
进一步地,去抗原处理步骤中采用的酶处理工艺的具体操作为:将备用的腹膜先在质量比浓度为0.1%-3.0%且温度控制在30-40℃的脂肪酶中浸泡5-10小时,去除组织中的脂肪,然后再放入质量比浓度为0.2%-3%且温度控制在30-40℃的胰蛋白酶或胃蛋白酶或中性蛋白酶中浸泡10-24小时。
进一步地,去抗原处理步骤中采用的碱处理工艺的具体操作为:在2-8℃的温度条件下用无机碱性试剂进行碱处理,溶解和去除腹膜上的体毛和大部分具有免疫原性的蛋白聚糖和酶处理后残余的微量脂肪,并软化胶原纤维结构防止胶原变性,所述无机碱性试剂为质量比浓度为0.3-10%的氢氧化钠或氢氧化钾溶液,pH为13-14。
进一步地,去抗原处理步骤中采用的酸处理工艺具体操作为:在2-8℃的温度条件下,采用酸性试剂处理,发生酸不稳定的交联水解,去除对酸敏感的污染物和非胶原物质,且促使组织吸水膨胀,胶原纤维结构松开,胶原纤维结构进一步打开,胶原束变得松散,然后将材料进行水洗直至pH达到2.0到3.5范围,获得具有一个光滑面以及一个松散的纤维质面的腹膜组织,所述酸性试剂为质量比浓度为1-8%且pH为0.5-1.5的无机酸或有机酸,所述无机酸为盐酸或硫酸,所述有机酸为乳酸、柠檬酸或乙酸。
进一步地,去抗原处理步骤中的高渗处理工艺具体操作为:将腹膜组织置入pH为3.0-3.5,质量体积比为5g/L-10g/L的NaCl溶液中,将温度控制为2-8℃,搅拌处理4-18小时后用NaHCO3溶液中和并用水冲洗,得到去抗原的天然腹膜组织。
进一步地,胶原纤维收缩处理步骤的具体操作如下:
脱水处理,将去抗原的腹膜组织置入丙酮或酒精溶液中,在脱色摇床上以60-80r/min的速度进行摇晃5-30分钟后,夹在两个医用不锈钢板中间通过抽真空进行干燥;
去除非亲水性物质处理,使用烃溶剂、链烷醇溶剂或醚溶剂中的一种或几种的混合物对脱水处理后的腹膜进行非亲水性物质萃取,同时去除组织中残留的微量脂肪;
水洗处理,去除非亲水性物质后,再将腹膜组织放入去离子水中,震荡处理3-5次,每次10-30分钟,直至样品变透明柔软。
进一步地,在干燥步骤后还进行交联处理步骤,将干燥处理后的胶原膜在80~120℃下高温交联12-36小时,即得到双层胶原基引导膜。
进一步地,交联处理步骤后,还进一步进行复合步骤,取两片交联处理后的双层胶原基引导膜,将其中一片双层胶原基引导膜经高温交联24小时处理,将该膜的疏松层朝上致密层朝下作为上层膜,另一片双层胶原基引导膜置于压片机中以10-30MPa的压力保压5-50小时后作为下层膜,然后将0.5%的胶原溶液涂覆在下层膜的疏松层外表面,将上层膜的致密层贴合于下层膜的疏松层外侧表面后进行冷冻及冻干,使两层结构紧密附着在一起,获得双层胶原基引导膜。
另一方面,本发明还提供一种组织再生引导膜,其采用如上任一项所述的方法制备而得,具有致密层和疏松层,而且所述组织再生引导膜的成分主要包括质量百分比不低于90%的Ⅰ型胶原以及0.5-5%的Ⅲ型胶原。
采用上述技术方案后,本发明至少具有如下有益效果:本发明组织再生引导膜具有理想的组织再生所需的致密层和疏松层双层结构,具有较高的弹性和较好的稳定性,还具有良好的生物相容性、亲水性和骨诱导能力,具有较长的体内降解时间,且降解产物对人体无害。此外,还可没有热原和其它的微生物代谢量,而且不需要用化学交联剂处理。本发明组织再生引导膜由于温和的加工过程,具有较高的等电点,可减少引导膜在中性范围水的吸收,从而稳定性更高、延展性更好。
本发明组织再生引导膜所含的Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原成分特别适用于口腔中的软骨缺损修复,也适用于其它类型的组织再生。经过对材料的致密处理,所制备的引导膜具有隔离细胞长入作用和缓慢降解的特点,比现有的可降解引导膜在体内留存时间长,能够为牙周缺损生长提供充足的时间和空间。在外科植入时,可与骨粉联合使用,从而有效促进牙周病损组织再生。
本发明制备方法简单,原料来源广泛且低廉,适合规模化产业生产,有利于降低医疗成本,减轻患者的负担。
附图说明
图1是本发明组织再生引导膜制备方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互结合。
如图1所示,本发明提供一种组织再生引导膜制备方法,包括如下步骤:
一、前处理步骤
收集哺乳动物的腹膜,流动水洗涤及脱毛后采用流动水洗的机械法进行初步脱脂,然后储存在-20-4℃环境中备用;本步骤中,优选收集的刚刚被宰杀的猪、牛或羊的腹膜,尤其是6-7周龄的幼猪腹膜。哺乳动物的天然胶原膜本身就具备一个光滑面和一个纤维面,相应提取的胶原基质在体内不仅与周围的结缔组织相隔离,而且与软骨缺陷相隔离。
由于随后的加工步骤的场所和屠宰场一般不在同一地点,因此,通常采用-20~4℃的冷藏方式将腹膜从屠宰场运送至后续步骤的加工场所。从腹膜离开动物到制备胶原膜的时间间隔一般应当不超过两天。采用这样的方式可有利地提供高质量的膜原料、避免化学物质和微生物污染物污染原料、避免原料未控制的化学分解和微生物分解。
在进行前处理时,将腹膜用流动水冲洗,去除表面血污及脂肪组织,用刮刀清除附着在腹膜表面的肥肉,用镊子清除显见的体毛,用生理盐水震荡清洗腹膜至少30分钟。这种流动水洗的机械法脱脂可以除去超过原始脂肪总量15%的脂肪。
二、去抗原处理步骤
依次采用酶处理工艺、碱处理工艺、酸处理工艺和高渗处理工艺对初步脱脂后备用的腹膜进一步脱脂,去除免疫原性。
酶处理工艺的具体操作为:将备用的腹膜先在质量比浓度为0.1%-3.0%且温度控制在30-40℃的脂肪酶中浸泡5-10小时,去除组织中的脂肪,然后再放入质量比浓度为0.2%-3%且温度控制在30-40℃的胰蛋白酶或胃蛋白酶或中性蛋白酶中浸泡10-24小时。蛋白酶可以去除腹膜的抗原成分,并能保留膜组织的天然结构。
碱处理工艺的具体操作为:在2~8℃的温度条件下用无机碱性试剂进行碱处理后再漂洗,从而溶解和去除腹膜上的体毛和大部分具有免疫原性的蛋白聚糖和酶处理后残余的微量脂肪,并软化胶原纤维结构防止胶原变性,所述无机碱性试剂为质量比浓度为0.3-10%的氢氧化钠或氢氧化钾溶液,pH为13-14。相对而言非腐蚀性的碱处理可以防止胶原的变性改变。另外,中等温度和非腐蚀性的漂洗步骤可以保护胶原。对这样得到的胶原材料,可以减少或避免后续处理中交联剂的引入。相反,降解的胶原需要使用交联剂以得到所需的拉伸强度。
酸处理工艺具体操作为:在2~8℃的温度条件下,采用酸性试剂处理,发生酸不稳定的交联水解,去除对酸敏感的污染物和非胶原物质,且促使组织吸水膨胀,胶原纤维结构松开,胶原纤维结构进一步打开,胶原束变得松散,所述酸性试剂为质量比浓度为1-8%且pH为0.5-1.5的无机酸或有机酸,所述无机酸为盐酸或硫酸,所述有机酸为乳酸、柠檬酸或乙酸。
高渗处理工艺具体操作为:将腹膜组织置入pH为3.0-3.5,质量体积比为5g/L-10g/L的NaCl溶液中,将温度控制为2~8℃,搅拌处理4-18小时后用NaHCO3溶液中和并用水冲洗,得到去抗原的天然腹膜组织。胶原主要抗原位点位于分子的N末端和C末端区域。这两个肽端具有很大的种属差异性,起到主要免疫作用。进行碱处理和酸处理后,胶原这两个区域被选择性地水解或去除而失活,从而大大降低了胶原的抗原性,但为完全去除抗原性,则需要采用高渗处理工艺作进一步的处理。高渗处理时,采用高渗的盐溶液使膜组织收缩,可使膜组织的三维空间结构更加紧凑。
由于脂肪具有很强的免疫原性,应去除彻底。而直接利用动物源材料进行膜制备的优点是其本身就含有葡萄糖胺聚糖。在胶原组织中,至少有一部分葡萄糖胺聚糖(GAGs)是以蛋白多糖(PGs)组分形式存在。由于PGs中的蛋白质成分可以引起潜在的免疫学问题,使用PGs形式的GAGs是不符合要求的。因此,在现有的医用生物组织的处理技术中,已有相当成熟的去抗原处理工艺。而本步骤的目的是去除腹膜材料的免疫原性,上述酶处理工艺、酸处理工艺、碱处理工艺和高渗处理工艺在其他材料的去抗原处理方面早已得到广泛应用,本发明将其用于对腹膜进行去抗原处理,获得相当好的处理效果。步骤e到f中GAGs与Ⅰ型胶原及发生反应而完成某些交联作用并生成一种不可溶的GAGs和I型胶原交联产物。葡萄糖胺聚糖与胶原间的反应可在室温(25℃左右)及pH值为2.5-3.5的条件下进行。葡萄糖胺聚糖在整个引导膜中的含量可达到质量比在1%-10%之间。在上述处理之后必须对材料进行冷冻及冻干处理。
三、胶原纤维收缩处理步骤
对经去抗原处理后的腹膜依次进行脱水、去除非亲水性物质和水洗处理,使腹膜的胶原纤维收缩,提升膜组织的致密度。本步骤的具体操作如下:
脱水处理,将去抗原的腹膜组织置入丙酮或酒精溶液中,在脱色摇床上以60-80r/min的速度进行摇晃5~30分钟后,夹在两个医用不锈钢板中间通过抽真空进行干燥。由于膜组织中胶原纤维之间的空隙结合有大量的水,丙酮或酒精能够使组织脱水,引起胶原纤维收缩,提高膜组织的致密程度,加强膜的屏障作用。
去除非亲水性物质处理,使用烃溶剂、链烷醇溶剂或醚溶剂中的一种或几种的混合物对脱水处理后的腹膜进行非亲水性物质萃取,同时去除组织中残留的微量脂肪;
水洗处理,去除非亲水性物质后,再将腹膜组织放入去离子水中,震荡处理3-5次,每次10~30分钟,直至样品变透明柔软。
四、干燥步骤
将收缩处理水洗后的腹膜平铺于培养皿表面,使腹膜的致密层接触培养皿,迅速转移至-60到-80℃冰箱中预冻1-8小时,再放入冻干机中冻干24-36小时后得到具有致密层和疏松层的可引导组织再生的胶原膜。冷冻干燥方式不会引起胶原纤维的变性,使所制备膜组织同时具备致密层和疏松层。为了得到非常小的微孔,材料必须在低的温度突然冻结。
干燥后所得的胶原膜厚度约在0.1-3.0mm之间,但当将其暴露于潮湿环境中可能会影响其支撑性能,因此,一般保存在干燥的常温环境中。直接冻干所得的胶原膜已经形成了一面致密一面疏松的结构,可以用作对降解性能要求不高的产品。而为提高致密层的密度,以提升整体降解性能,而还可进一步进行如下的交联处理步骤。
五、交联处理步骤
将干燥处理后的胶原膜在80~120℃下高温交联12-36小时,即得到双层胶原基引导膜。将干燥后引导膜进行进一步高温交联可使其更稳定,从而增加机械稳定性并降低其被周围组织再吸收降解的速率。由于理想的交联程度应使引导膜的降解速率与组织的再生速率相匹配,因此,优选加热到100-120℃,保持24小时的物理作用来实施交联。
进行交联处理后所得的双层胶原基引导膜也可直接使用,但由于其密度相对较小,为进一步提高膜片致密度,通常还可选择进行如下的复合步骤。
六、复合步骤
取两片交联处理后的双层胶原基引导膜,将其中一片双层胶原基引导膜经高温交联24小时处理,将该膜的疏松层朝上致密层朝下作为上层膜,另一片双层胶原基引导膜置于压片机中以10-30MPa的压力保压5-50小时后作为下层膜,然后将0.5%的胶原溶液涂覆在下层膜的疏松层外表面,将上层膜贴合于下层膜的疏松层外侧表面后进行冷冻及冻干,具体实施时,是以上层膜的致密层贴合于下层膜的疏松层上,经过冷冻和冻干使两层结构紧密附着在一起,获得双层胶原基引导膜。贴合后的双层复合膜,整体上是上层较为疏松,下层较为致密。经过压片处理的下层膜,即便是疏松层也比较致密,与上层膜的致密层基本相当。
通过采用上述制备方法,本发明还提供一种组织再生引导膜,其具有致密层和疏松层,而且所述组织再生引导膜的成分主要包括质量百分比不低于90%的Ⅰ型胶原以及0.5-5%的Ⅲ型胶原。
所述致密层主要由长胶原纤维构成,此种纤维之间连接紧密,形成相对不透性结构的光滑屏障面,能阻止成纤维细胞的长入。另外,长纤维提高了引导膜的抗张强度及抗撕裂强度,使得该材料便于缝合。这种膜无论在湿态还是干态都具有特别高的撕裂强度,便于外科缝合。在潮湿的情况下这种材料弹性非常大,可在不规则成型的骨缺损上伸展。在外科手术中很重要的一点是复合膜植入物应能缝合或钉在相应的位置上,许多现有的引导膜都不具有这一性能,而本发明的引导膜具有足够的机械稳定性而适于外科植入。
本发明引导膜的疏松层由胶原纤维相互交错构成多孔结构的纤维面,利于成骨细胞在其上生长,在植入缺损位点后能够快速血管化,加速组织愈合。疏松层孔的大小取决于制造Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原基质的冻干工艺,预期孔大小在20到100微米之间。通过在-60℃~-80℃温度下冷冻约1-8小时后进行冻干,或者是在冻干之前向薄膜中加入微量低浓度盐酸溶液的方法很容易得到这样的微孔尺寸。
在具体应用本发明组织再生引导膜时,该引导膜的取向要保证起到阻挡作用的致密层能防止不符合要求的组织类型向内生长到骨再生区域内。具体应用于牙周病损区修复时,先将骨粉填埋在牙周病损区,然后将一片本发明的组织再生引导膜裁至适当的大小缝合在病损区,疏松层面向骨缺损,这样的方式可使具有不透性的致密层能有效防止任何周围牙龈组织向内生长到骨再生区域。
以下通过几个实施例来进一步说明本发明组织再生引导膜的制备方法。在以下实施例中,所有步骤都在百级洁净的房间内实施。
实施例1
步骤1:原料预处理
取自猪龄为6-7周的猪腹膜,4℃环境下储存和运输至引导膜加工地点,去除表面血污和肌肉组织,去毛,去附着肥肉,流动水冲洗半小时后,用生理盐水震荡清洗3次,每次15分钟。
步骤2:脱脂
将腹膜先浸置于含有质量比为1%的碳酸氢钠和质量比为0.1%脂肪酶的混合液中均匀搅拌10小时,然后用质量比为0.2%胃蛋白酶溶液均匀搅拌10小时,整个过程在室温下保持pH=7,中间进行2-4次漂洗。
步骤3:碱处理
除去腹膜上残留的脂肪和皮肤中毛发的根部和毛囊。将腹膜在质量比为0.3%的NaOH溶液中处理12小时,处理时需要对薄膜进行很好的搅动。然后,将碱从膜组织中洗出,pH值从起始的14降至11。将腹膜放入混合器中加水,反复震荡搅拌,共进行三次,每次15分钟。使得已溶解的杂质被洗出而与膜组织分离。
步骤4:酸化
将腹膜放入体积比为1%的盐酸中,起始pH为0.5,处理5小时,洗涤。然后,使用冷水对膜组织进行充分洗涤,使膜组织在去离子水中反复震荡搅拌,每次10分钟。重复该步骤,直至pH值达到3。
步骤5:高渗处理及收缩
将膜组织用质量比为10g/L的氯化钠溶液浸泡4小时,然后用质量比为1%的NaHCO3溶液调节pH=6.0,并在流动水中充分洗涤;然后将材料用丙酮脱水24小时再用正己烷浸泡48小时,最后用去离子水充分洗涤。至此,所有杂质被去除,产品成为一个无盐的胶原基薄膜。
步骤6:冻干、交联与复合
将步骤5制备好的胶原膜冻干后,在120℃下高温交联12小时;然后将该膜的疏松层朝上致密层朝下作为上层膜,另一片胶原膜在压片机下以50Mpa的压力保压5小时作为下层膜,再将下层膜在光滑玻璃板上摊平,在其上表面上涂覆一层薄的0.5%的胶原溶液,并将上层膜均匀的摊铺在上;随后将其放入-80℃冰箱内急冻3小时。
最后,对复合膜进行冻干,冻干时间24小时,从而形成具有致密层和疏松层的双层胶原基引导膜。
实施例2
步骤1:原料预处理
取自牛龄为2-3个月的腹膜-20℃环境储存和运输至引导膜加工地点,去除表面血污和肌肉组织,去毛,去附着肥肉,流动水冲洗半小时后,用生理盐水震荡清洗3次,每次15分钟。
步骤2:脱脂
将腹膜先浸置于含有质量比为1%的碳酸氢钠和质量比为1%脂肪酶的混合液中均匀搅拌5小时,然后用质量比为2%中性蛋白酶溶液均匀搅拌3小时,整个过程在室温下保持pH=7,,中间进行2-4次漂洗。
步骤3:碱处理
除去腹膜上残留的脂肪和皮肤中毛发的根部和毛囊。将腹膜在质量比为5%的NaOH溶液中处理10小时,处理时需要对薄膜进行很好的搅动。然后,将碱从膜组织中洗出,pH值从起始的14降至11。将腹膜放入混合器中加水,反复震荡搅拌,共进行三次,每次10分钟。使得已溶解的杂质被洗出而与膜组织分离。
步骤4:酸化
将腹膜放入体积比为7%的乙酸中,起始pH为1.0,处理3小时,洗涤。然后,使用冷水对膜组织进行充分洗涤,使膜组织在去离子水中反复震荡搅拌,每次10分钟。重复该步骤,直至pH值达到3。
步骤5:高渗处理及收缩
将膜组织用质量比为8g/L的氯化钠溶液浸泡10小时,然后用质量比为1%的NaHCO3溶液调节pH=6.0,并在流动水中充分洗涤;然后将材料用丙酮脱水24小时再用正己烷浸泡48小时,最后用去离子水充分洗涤。
步骤6:冻干、交联与复合
将步骤5制备好的胶原膜在80℃下高温交联36小时;然后将该膜的疏松层朝上致密层朝下作为上层膜,另一片胶原膜在压片机下以50Mpa的压力保压5小时作为下层膜,再将下层膜在光滑玻璃板上摊平,在其上表面上涂覆一层薄的0.5%的胶原溶液,并将上层膜均匀的摊铺在上;随后将其放入-80℃冰箱内急冻3小时。
最后,对复合膜进行冻干,冻干时间24小时,从而形成具有致密层和疏松层的双层胶原基引导膜。
实施例3
步骤1:原料预处理
取自羊龄为2-3个月周的腹膜-10℃环境储存和运输至引导膜加工地点,去除表面血污和肌肉组织,去毛,去附着肥肉,流动水冲洗半小时后,用生理盐水震荡清洗3次,每次15分钟。
步骤2:脱脂
将腹膜先浸置于含有质量比为1%的碳酸氢钠和质量比为3%脂肪酶的混合液中均匀搅拌3小时,然后用质量比为3%胰蛋白酶溶液均匀搅拌2小时,整个过程在室温下保持pH=7,中间进行2-4次漂洗。
步骤3:碱处理
从腹膜除去残留的脂肪和皮肤中毛发的根部和毛囊。将腹膜在质量比为10%的氢氧化钾溶液中处理12小时,处理时需要对薄膜进行很好的搅动。然后,将碱从膜组织中洗出,pH值从起始的14降至11。将腹膜放入混合器中加水,反复震荡搅拌,共进行三次,每次10分钟。使得已溶解的杂质被洗出而与膜组织分离。
步骤4:酸化
将腹膜放入体积比为8%的柠檬酸中,起始pH为1.5,处理3小时,洗涤。然后,使用冷水对膜组织进行充分洗涤,使膜组织在去离子水中反复震荡搅拌,每次10分钟。重复该步骤,直至pH值达到3。
步骤5:高渗处理及收缩
将膜组织用质量比为5g/L的氯化钠溶液浸泡4小时,然后用质量比为1%的NaHCO3溶液调节pH=6.0,并在流动水中充分洗涤;然后将材料用丙酮脱水24小时再用正己烷浸泡48小时,最后用去离子水充分洗涤。
步骤6:冻干
将步骤5制备好的胶原膜放入-60℃冰箱内急冻3小时。随后对胶原膜进行冻干,冻干时间36小时,从而形成具有致密层和疏松层的双层胶原基引导膜。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同范围限定。

Claims (9)

1.一种组织再生引导膜制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
前处理步骤,收集哺乳动物的腹膜,流动水洗涤及脱毛后采用流动水洗的机械法进行初步脱脂,再储存在0-4℃环境中备用;
去抗原处理步骤,依次采用酶处理工艺、碱处理工艺、酸处理工艺和高渗处理工艺对初步脱脂后备用的腹膜进一步脱脂,去除免疫原性;其中采用的酶处理工艺的具体操作为:将备用的腹膜先在质量比浓度为0.1%-3.0%且温度控制在30-40℃的脂肪酶中浸泡5-10小时,去除组织中的脂肪,然后再放入质量比浓度为0.2%-3%且温度控制在30-40℃的胰蛋白酶或胃蛋白酶或中性蛋白酶中浸泡10-24小时;
胶原纤维收缩处理步骤,对经去抗原处理后的腹膜依次进行脱水、去除非亲水性物质和水洗处理,使腹膜的胶原纤维收缩,提升膜组织的致密度;
干燥步骤,将收缩处理后的腹膜平铺于培养皿表面,使腹膜的致密层接触培养皿,迅速转移至-60到-80℃冰箱中预冻1-8小时,再放入冻干机中冻干24-36小时后得到具有致密层和疏松层的可引导组织再生的胶原膜。
2.如权利要求1所述的组织再生引导膜制备方法,其特征在于,在前处理步骤中,收集是的刚刚被宰杀的猪、牛或羊的腹膜。
3.如权利要求1所述的组织再生引导膜制备方法,其特征在于,去抗原处理步骤中采用的碱处理工艺的具体操作为:在2-8℃的温度条件下用无机碱性试剂进行碱处理,溶解和去除腹膜上的体毛和大部分具有免疫原性的蛋白聚糖和酶处理后残余的微量脂肪,并软化胶原纤维结构防止胶原变性,所述无机碱性试剂为质量比浓度为0.3-10%的氢氧化钠或氢氧化钾溶液,pH为13-14。
4.如权利要求1所述的组织再生引导膜制备方法,其特征在于,去抗原处理步骤中采用的酸处理工艺具体操作为:在2-8℃的温度条件下,采用酸性试剂处理,发生酸不稳定的交联水解,去除对酸敏感的污染物和非胶原物质,且促使组织吸水膨胀,胶原纤维结构松开,胶原纤维结构进一步打开,胶原束变得松散,然后将材料进行水洗直至pH达到2.0到3.5范围,获得具有一个光滑面以及一个松散的纤维质面的腹膜组织,所述酸性试剂为质量比浓度为1-8%且pH为0.5-1.5的无机酸或有机酸,所述无机酸为盐酸或硫酸,所述有机酸为乳酸、柠檬酸或乙酸。
5.如权利要求4所述的组织再生引导膜制备方法,其特征在于,去抗原处理步骤中的高渗处理工艺具体操作为:将腹膜组织置入pH为3.0-3.5,质量体积比为5g/L-10g/L的NaCl溶液中,将温度控制为2-8℃,搅拌处理4-18小时后用NaHCO3溶液中和并用水冲洗,得到去抗原的天然腹膜组织。
6.如权利要求1所述的组织再生引导膜制备方法,其特征在于,胶原纤维收缩处理步骤的具体操作如下:
脱水处理,将去抗原的腹膜组织置入丙酮或酒精溶液中,在脱色摇床上以60-80r/min的速度进行摇晃5-30分钟后,夹在两个医用不锈钢板中间通过抽真空进行干燥;
去除非亲水性物质处理,使用烃溶剂、链烷醇溶剂或醚溶剂中的一种或几种的混合物对脱水处理后的腹膜进行非亲水性物质萃取,同时去除组织中残留的微量脂肪;
水洗处理,去除非亲水性物质后,再将腹膜组织放入去离子水中,震荡处理3-5次,每次10-30分钟,直至样品变透明柔软。
7.如权利要求1所述的组织再生引导膜制备方法,其特征在于,在干燥步骤后还进行交联处理步骤,将干燥处理后的胶原膜在80~120℃下高温交联12-36小时,即得到双层胶原基引导膜。
8.如权利要求7所述的组织再生引导膜制备方法,其特征在于,交联处理步骤后,还进一步进行复合步骤,取两片交联处理后的双层胶原基引导膜,将其中一片双层胶原基引导膜经高温交联24小时处理,将该膜的疏松层朝上致密层朝下作为上层膜,另一片双层胶原基引导膜置于压片机中以10-30MPa的压力保压5-50小时后作为下层膜,然后将0.5%的胶原溶液涂覆在下层膜的疏松层外表面,将上层膜的致密层贴合于下层膜的疏松层外侧表面后进行冷冻及冻干,使两层结构紧密附着在一起,获得双层胶原基引导膜。
9.一种组织再生引导膜,其特征在于,其采用如权利要求1~8中任一项所述的方法制备而得,具有致密层和疏松层,而且所述组织再生引导膜的成分主要包括质量百分比不低于90%的Ⅰ型胶原以及0.5-5%的Ⅲ型胶原。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104436318B (zh) * 2014-11-21 2016-08-17 李柏霖 一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法
CN105381504B (zh) * 2015-11-17 2018-08-21 浙江星月生物科技股份有限公司 一种胶原基软骨支架
CN105749357A (zh) * 2016-04-29 2016-07-13 陕西瑞盛生物科技有限公司 一种乳房补片及其制备方法
CN107029296B (zh) * 2017-03-03 2020-09-29 北京博辉瑞进生物科技有限公司 一种引导骨再生的骨膜修补片、制备方法和应用
CN107281552A (zh) * 2017-07-12 2017-10-24 上海白衣缘生物工程有限公司 一种用于引导骨再生的复合膜及其制备方法
CN111840647B (zh) * 2019-04-25 2022-10-21 深圳兰度生物材料有限公司 可吸收屏障膜及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837278A (en) * 1994-01-06 1998-11-17 Ed Geistlich Sohne Ag Fur Chemische Industrie Resorbable collagen membrane for use in guided tissue regeneration
CN102225219A (zh) * 2011-06-01 2011-10-26 陕西博鸿生物科技有限公司 一种骨组织再生引导膜及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837278A (en) * 1994-01-06 1998-11-17 Ed Geistlich Sohne Ag Fur Chemische Industrie Resorbable collagen membrane for use in guided tissue regeneration
CN102225219A (zh) * 2011-06-01 2011-10-26 陕西博鸿生物科技有限公司 一种骨组织再生引导膜及其制备方法

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