JPH04501077A - ウシ心膜材料の調製方法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウシ心膜材料の調製方法およびその用途朔偏番 本発明は、優れた生体適応性と安定性を有するラン８膜材料の調製方法と、人間 医療および動物医療における移植用に調製された上記材料の用途に関する。

今世紀初頭から、外科においてコラーゲン結合組織の移植により大きな組織欠陥 をなくすことが試みられてきた（１９０１年、マルシャン（Ｍａｒｃｈａｎｉ） 　；　１９１４年、クラインシュミット（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ））　ｏ　 ｌ−９５４年からは凍結乾燥させた状態で、１９７３年からは溶媒乾燥させた状 態でヒト硬膜が相同性移植片として用いられてきた。多くの場合、ヒト硬膜は、 その組織適応性が良好なために拒絶反応が起こらないことと臨界張力があまり高 くならないことが、それ自身の価値を証明してきた。そのため、この生体材料は 今日もうまく用いられている。残念なことに、硬膜は、ヒトに対する移植片とし ては、限られた範囲にのみ適用可能であり、外科の要求には全く対応ができない 。

さらに、種々の指摘がある。倒えば神経外科や耳鼻咽喉科においては、硬膜は多 少固く厚みがあるとしばしば言われてきている。

ドイツ特許公開公報第３０３４２７３号は、コラーゲンの調製方法に関するもの で、この方法というのは、天然の不溶性コラーゲンをアルカリ硫酸塩および／ま たはアルカリ水酸化物の水溶液で処理し、得られた低脂肪コラーゲンをアルカリ 水酸化物の水溶液で処理し、任意により水で洗浄し、水溶液中に溶かして、この 水溶液に任意に抗生物質、ホルモンあるいはスペルミジド（ｓｐｅｒｍ　ｉｚ　 １ｄｅ）のような生体活性化物質を少量添加して、この水溶液を凍結、真空中で 乾燥させることである。

しかし、上記の公開公報は本願が解決する課題を予見したものでも、本願発明者 の参考となったもののいずれでもない。

アメリカ合衆国特許第４．００６，０８３号は、外科に用いることが可能で、フ ェルトまたはイミテーションの毛皮構造を持つ殺菌したコラーゲン製品に関する ものであり、これは、止血作用を有し、体液に対して高い吸収性を示し、細胞分 裂を促進し、再吸収性に優れ、体組織による拒絶反応は殆ど無く、最適の機械的 特性を備えているものである。この特性は、皮膚損傷や皮膚障害や骨内腔の手当 に用いることを可能とするものである。

しかし、上記アメリカ合衆国特許の開示は、本願が解決する課題を予見したもの でも、本願発明者の参考となったもののいずれでもない。

アメリカ合衆国特許第４，５０２，１５９号は、例えば代用血管や代用尿管のよ うな管状プロテーゼについて述べられている。上記プロテーゼは、生体適応性を 有する縫合材料を用いて８膜組織の対向する端部を縫合することで形成される。

縫合手順の正確な説明は以下の通りである。人体組織と同様の伸張特性を有する ウシ心膜を用いることが好ましい。管状組織は縫合された後、蛋白質固定のため に０．５％グルタルジアルデヒド溶液中に７日間浸けられる。８膜の滑らかな面 が内側に向けられる一方、外側に基底膜がくる。ホルマリンへの浸漬または放射 線照射により８膜を含む生理食塩水の殺菌が行われる。

しかし、上記アメリカ合衆国特許は、隔離や浄化の方法、および／まｌ；は、そ うして形成された管状プロテーゼの物理的および化学的特性については何の情報 も開示してはいない。従って、このアメリカ合衆国特許の構成は、本発明にとっ て何等の参考ともなり得ない。

これらの従来技術の状況から、事実上の制限なしに適用可能で、硬膜の好ましい 特性を出来る限りすべてを有し、その上、使用時により多くの利点を提供する移 植片の要求が必然的に生まれてきた。

さらには、ヒト移植材料に伴って基本的に起こりうる、ヒトにとって危険な微生 物（ＨＩ　Ｖウィルス、肝炎ウィルス等）の生体材料による侵入を確実に防がね ばならない。

製造に係るすべての要因を考慮すれば、生体材料としてのウシ心腹−以下、単に ８膜ということもある−に、要求を満たす最適な方法における、人体組織の欠陥 をカバーする移植片が見いだされた。

本発明の目的は、優れた生体適応性と安定性を有するウシ心膜材料の調製方法を 提供することである。本発明の今一つの目的は、上記製品の使用上の新たな可能 性を提供することである。

アメリカ合衆国特許第４，５０２，１５９号、国際公開番号笥８４１０４６６９ 号、アメリカ合衆国特許第４．４５６，５８９号に開示されているように、ホル マリンまたはグルタルジアルデヒドを用いたアルデヒド浸漬法を利用せず、改良 された調製方法によって、ウシ心膜に含まれる硬蛋白質やその生体適応性の生物 学的地位の低下に対する抵抗は続けられていることが実験的調査によって明らか になっｔ；のは驚くべきことである。

本発明は、新鮮なウシ心膜を、湿式化学処理、酸化漂白処理、洗浄処理、脱脂処 理、乾燥殺菌処理を行うことによる、ウシ心膜材料の調製方法に関するものであ り、ウシ心膜組織の湿式化学処理は以下の工程からなることを特徴としている。

ａ）ウシ心膜組織を湿らせ、 ｂ）ラン心腹組織表面から脂肪組織および基底膜を機械的に取り除き、 Ｃ）希釈塩基性水溶液でつ／８膜組織を処理し、ｄ）鉱物質除去水でウシ心膜組 織をすすいで残留基底膜を除去し、ｅ）希釈した塩化ナトリウム水溶液でウシ心 膜組織を処理し、ｆ）鉱物質除去水でウシ心膜組織をすすいで残留塩化ナトリウ ムを除去し、 ｇ）錯体促進剤でウシ心膜を処理し、 ｈ）鉱物質除去水でウシ心膜組織をすすいで残留錯体促進剤を除去し、 ｉ）酸性緩衝剤システムでウシ心膜組織を処理し、」）ウシ心膜組織をすすいで 残留酸性緩衝剤システムを除去する。

本発明の好ましい実施例においては、工程ｅ）に先立って、工程ｄ）の次に工程 ｂ）が繰り返される。

上記の湿式化学処理による方法は室温より高くても低くても容易に行えるが、本 発明の範囲内では１５℃から２５°Ｃの室温で湿式化学処理のすべての工程を行 うことが好ましい。

工程Ｃ）における処理は、水酸化すトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム および／または炭酸ナトリウムの希釈塩基性水溶液中で行われるのが好ましい。

ラン心腹１００ｇにつき２ないし２．５重量％の水酸化ナトリウム水溶液０．５ ないし１リツトルに１６時間浸漬すれば、なお好ましい。こうすると、一方では 、全くの非生体的作用であるにもかかわらず、酵素や生菌と同様の良好な浄化効 果が得られ、他方では、コラーゲンを含む組織の損傷が防げる。

希釈塩基性水溶液での処理が終われば、６膜組織は非常に膨張し、一般的には初 、めの２ないし５倍にもなる。

工程ｅ）の処理は好ましくはＩＯないし１１重量％塩化ナトリウム水溶液中で行 われる。そうすると、以後の処理に適するようにコラーゲンの膨張状態が調整で きる。これに対して、塩化ナトリウム水溶液濃度が低すぎると、膨張したコラー ゲンはアルカリ処理を行っても十分に収縮しなし１゜また、濃度が高すぎると、 ウシ心膜組織に塩分が不必要に蓄積するので、処理の意味がなくなってしまう。

工程ｇ）の処理は好ましくは蛋白質と部分的に結合する多価金属錯体イオンとし て知られる錯体促進剤で行われる。この場合、例えば濃度０．３ないし０．５重 量％ＥＤＴＡジナトリウム溶液を用いるのが特に好ましい。上記錯体促進剤は、 その完全な作用が目視できるように、基準ｐＨ値が１１を超えるように調整され なければならない。錯体促進剤による処理は通常０．５ないし２時間以上行われ る。

工程ｈ）によるすすぎ処理はｐＨ値が最大８．５の弱アルカリ性になるまで続け るのが好ましい。

工程ｉ）の処理のために、ｐｏ値が４．５ないし６，０の酢酸緩衝剤システムの ような酸性緩衝剤システムを使用するのが好ましい。

湿式化学処理後、２．０重量％以下、特別には約１．５重量％の過酸化水素水溶 液でウシ心膜材料を漂白する酸化漂白処理工程が行われる。

上記の過酸化水素漂白は、コラーゲンそのものを破壊せずに、コラーゲンの付随 物質を酸化によって破壊する目的を持っている。濃度が２．Ｏ！量％を超える過 酸化水素は、コラーゲンを含有するウシ心膜組織に著しい損傷を与えるので、本 発明の範囲内であっても好ましくない。過酸化水素処理は通常、ウシ６膜１００ ｇにつき０．５ないし１゜０リツトルの過酸化水素水溶液中で０．５ないし２時 間行われる。

この酸化漂白処理に続いて、水で完全に洗い流す本来の公知の方法で残留過酸化 水素を除去する。

ウシ心膜組織の脱脂および乾燥は、新しいものに２ないし６回交換しながら十分 な量のアセトンに１２ないし２４時間心８を浸すことで行う。そうして脱水され ｌ；ウシ心膜組織はソクスレノト装置（５ｏｘｈｌｅｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ） に移され、残りの水分と油分とを徹底的に除去する。水分と油分の除去の後、ウ シ心膜組織は空気乾燥して、鉱物質除去水中で再び含水（膨張）させられる。

その後、ラン８膜材料を自動調節フリーズドライヤ内で凍結乾燥し、殺菌する。

本発明に係る上記の調製工程は、医療分野で使用するための一定の品質の製品を 作り出すのに適した特別な方法である。

本発明に係るラン６膜は、動物医療や人間医原の種々の公知分野での移植片とし て使用することができる。本明細書中では、ベー・ブラウン・メルズンゲン・ア クチェンゲゼルシャフト社が１９７８年に発行した会社パンフレット［人体構造 の同種形成性代替材と１．てのりオデュラ（Ｌｙｏｄｕｒａｘ登録商標）」やそ の中で触れられている多数の文献を参照する。

皮下移植試験における臨界張力の評価 第１図は本発明に係る工程による実施例を示すものである。

第１図は、不ズミの背部皮下の移植片として、本発明に係るｌＱｍｍ幅の８膜材 料と、比較用の１０ｍｍ幅の一般に広く用いられているリオデュラ（登録商標） とを使用しｌ；場合の臨界張力一時間関係を示す（いずれも１０個体の平均値で ある）。試験では、どちらの場合も５０片か移植され、それぞれ異なった経過時 間後手術で取り除いて、臨界張力を測定したものである。曲線Ａは本発明に係る 工程により調製されｔ；８膜の場合を示す。曲線Ｂは比較対象のりオデュラの場 合を示す。

２１日にわたる観察の結果、異種材料である本発明による８膜と相同材料である リオデュラ（登録商標）との間に、臨界張力に顕著な差は見られなかった。これ によって、上記の異種材料は、相同材料のすぐれた代替品となることが示された 。

移植における１０北幅の心腹片と硬膜片の臨界張力（１０回測定）８　２５．９ ±　９．４　２３　±１０．０１００％　±３８９２％　±４０ １　２４．１±　７．９　２２．８±　９．１９６％　±３２９１％　±３６ ４　１９．０±　９．０　１９．２±　８．５７６％　±３６７７％　±３４ ７　１８．８±　６．３　１４　±　５．１７５％　±２５５６％　±２０ １４　１０．０　±　４．５　１０．１　±　４．５４０％　±１８４０％　± １８ ２１　６．５±　３．０　７．０±　４．５２６％　±１２２８％　±１８ ＊第２行目は％によ・る値であり、６膜の０日間の値を１００％とした 皮下移植試験による生体適応性の評価 １．６膜の皮下移植をウサギ５８匹とネズミ２２０匹に対して行っｔ；。

７日ないし１２月間病理解剖学上観察と組織学上検討を行った。

本発明に係る心腹片を、凍結乾燥させた硬膜、リオデュラ（登録商標）およびア セトン乾燥させた硬膜（チュードプラスト（Ｔｕｔｏｐｌａｓｔ）　、登録商標 ）と比較した。炎症反応および移植状態については顕微鏡による評価を行った。

試料は４％ホルマリン溶液で固定され、組織学上検討を行った。

コラーゲン組織の微細構造を移植を行っていない対照と比較した。

移植片の組織学上評価は、細胞（接合組繊細胞、免疫適格細胞）の浸潤反応、移 植片と受容者の結合状態（内部増殖能力）、異種材料の吸収および／または生体 化、および、拒絶反応にわたる。

懸 移植前の非生体試料を検討しｔ；結果、試料は細胞または細胞構成要素の残りの ものからは完全に独立したものとなっているのが確認された。その一方、凍結乾 燥させた、より特別には、溶媒乾燥させた硬膜はある程度独立した細胞核材料を 示しｊ：。

ａ）移植片の微細構造 コラーゲン繊維構造の配列は結合組繊細胞の移入作用に重要であることが確認さ れた。

真っすぐ密に配列されたコラーゲン繊維束は（溶媒−乾燥硬膜では）再生体化を 妨げる。分離された繊維としては最も知られた６膜およびリオデュラ（登録商標 ）においては、結合組織から細胞への再移入作用が促進される。

ｂ）移植片の生体化 ６膜の移植片は、細胞が移入する間隙におけるガイドレールとして作用しＩ；。

一週間後、多数の細胞が移植片に移入し、拡散していった。これらは線維芽細胞 および組織法である。初めから６週間で生体化指数は増加する。

Ｃ）　リンパ球、マクロファージ、異物巨細胞のような結合組織に属さない細胞 による移植片への浸潤 硬膜試料におけるよりも少ない６膜における上記細胞の予想しない発生は、初期 の拒絶反応と見なすのではなく、免疫的に有効なプロセスであると理解すべきで ある。線維芽細胞および球細胞と比べて、これらのリンパ球、マクロファージお よび巨細胞は移植片に侵入することはめったにない。マクロファージは、創傷床 で起こる出血箇所に非常によく発生した。細胞（リンパ球、マクロファージ、巨 細胞）の数が数えられ、発生率が計算された。この医療用の心膜試料における発 生率（１，４３）は、硬膜試料におけるもの（凍結乾燥させたもの＋　２．２、 アセトン乾燥させたもの：　２．３２）よりもかなり低い。この現象はおそらく 、６膜は非常によく非生体化されていて、免疫抗原性を示す細胞や細胞核を全く 含んでいないからであろう。

ｄ）急性炎症および拒絶反応 心膜試料には免疫反応は見られなかった。

結果として、心膜試料のすばらしい能力は、拒絶反応が起こらないだけではなく 、より良好な生体性によるものである一方、６膜のいくらかの薄さもある種の役 目を果たしていることが確かめられた。

＋＋、イヌにおける脳硬膜の代用としての６膜の生体適応性および機能の評価 移植後３ケ月および６ケ月たっＩ；移植片はよく一体化しており、もはやもとの 硬膜と見分けが付かなかっｔ；（線維細胞により再生体化され、境界部には血管 が通っていた）。移植片の内部にはもとの硬膜と同じ型の細胞が入り込んでいる 。大脳皮質との融合は見られなかった。

一般に出回っている硬膜材料と比較して、本発明に係る工程により調製されたウ シ心膜材料の効果を添付の第２図から第５図を参照して述べる。

第２図はネズミに対して皮下移植を施して６週間経過した６膜を示す。良好に再 生体化して完全に落ち着いた移植片が、リンパ球のない生線維芽細胞とともに見 られ、新しい形態のコラーゲンとなっている。

第３図はネズミに対して皮下移植を施して６週間経過した溶媒乾燥させた硬膜（ 比較のため）を示す。リンパ球の局所的な蓄積が見られ、中央部の線維芽細胞内 では生体化されていない。

第４図はネズミに対して皮下移植を施して１２週間経過しｔ；６膜を示す。移植 片ともとの細胞との良好な一体化が見られ、免疫適格細胞は発生していない。

第５図はネズミに対して皮下移植を施して１２週間経過しｔ；溶媒乾燥させた硬 膜（比較のため）を示す。リンパ球の局所的な蓄積が見られ、移植片は密な繊維 構造のために殆ど生体化していない。

本発明に係る工程は、ウシ心腹調製のための実施例により以下に説明する。

寒臭堡 １、生材料の回復 はじめの材料として用いられるウシ心膜は、層殺場で獣医により所定の検査の後 、まず結着している器官から分離し、大体の脂肪および結合組織を取り除く。こ うして、１片がほぼ３ＱｃｍＸ　１５ｃＩＩｌ大で約１ｋｇのものが得られる。

こうして調製されたウシ心膜は層殺場から製造所に氷の詰められｔ；冷蔵バッグ で輸送される。これは、生材料の量にもよるが、以降の調製工程まで一２０℃以 下で中間保存される。

２、湿式化学処理 生の心腹片をまず精製水で個々にすすぎ（通常は流水に浸けておき）、付着血液 と水溶性蛋白質を除去する。

浸漬の後、顕微鏡で確認できる程度のすべての脂肪組織と基底膜とが除去される 。次に、室温で２％水酸化ナトリウム水溶液による処理が行われる。心腹片（５ ０００ｇ）はアルカリ液槽（３７，５す７トル）に合計１６時間漬けられる。上 記の除去工程に続いて、鉱物質除去水中ですすぎが１０分間行われ、すすぎ水の ｐＨが８以下になるまで繰り返される。これには約１時間かかる。基底膜および 残留脂肪が少しでもまだ観察されるならば、この工程で完全に除去される。

非常に膨張した心腹片は３７，５リツトルの１０％食塩水中に移され、膨張状態 （局所的な不完全膨張）を以降の工程で必要なように調節される。この食塩処理 は室温で行われる。次に、鉱物質除去水によるすすぎ処理が行われる。

６膜から邪魔な重金属イオンや石灰分を除去するためｌこ、心腹片は、濃度が０ ．３ｇ／　１００ｍ１の弱アルカリに調節されたＥＤＴＡ溶液３７゜５りントル 中で処理される。そして、心腹片は次の工程として鉱物質除去水ですすがれ、残 留錯体促進剤を除去し、同時にｐＨ値を８．５にする。３７．５！Ｊツトルの酢 酸緩衝剤（ｐＨ４，８、組成：５９容量部の酢酸ナトリウム・３水和物０．０１ モルおよび４１容量部の酢酸０．０１モル（１００ｍ　ｌにつき））で行う一回 の処理は、もし６膜組織中に残留物があれば、すべてを緩衝する働きをなし、以 下の漂白処理のための弱酸溶媒を調製する。どんなに緩衝剤が多くとも、上記の 鉱物質除去水のすすぎ処理により除去される。

３、酸化漂白処理 湿式化学処理に続いて、心腹片は濃度１．５％過酸化水素水３７．５リツトル中 で１時間の酸化漂白処理が施される。酸化漂白処理は、前述の処理と同様に室温 で行われる。そのため、一方では浄化処理の効果が確実になり、他方ではコラー ゲン組織の質感化は防止される。

４、洗浄処理 続いて、残留試薬を除去するＩ；めに、心腹片は従来の方法に従つて鉱物質除去 水ですすがれる。

５．脱脂処理 すすぎの終わった心腹片は、十分な量のアセトンに完全に浸なされる。

アセトンは８時間に３回交換された。こうして脱水された心腹片はンクスレット 装置（Ｓｏｘｈｌｅｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）に移され、８時間はど°　アセト ンが除去された。その後、心腹片は空気乾燥され、輸送管内で鉱物質除去水で再 含水させられた。

６、凍結乾燥処理 乾燥は、自動調節フリーズドライヤ内で行われた。凍結乾燥の詳細は次の通りで ある。

温度を＋１℃に下げ、さらに、温度を一４０°Ｃに下げ、真空状態にして、＋４ ０℃に熱して、完全な真空中で乾燥させる。

７、殺菌処理 ２．５Ｍｒａｄの放射線を照射して殺菌を行う。

ＦＩ６．１ Ｆｉｇ、２ Ｆｉｇ、３ ｍ静調査報告 ＳＡ　３２００３

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．生のウシ心膜組織に湿式化学処理、酸化漂白処理、洗浄処理、脱脂処理、乾 燥処理および殺菌処理を施すことによって、ウシ心膜材料を調製する方法であっ て、 ウシ心膜組織の湿式化学処理は以下のステップからなることを特徴とするウシ心 膜材料調製方法。 ａ）ウシ心膜組織を湿らせ、 ｂ）ウシ心膜組織表面から脂肪組織および基底膜を機械的に取り除き、 ｃ）希釈塩基性水溶液でウシ心膜組織を処理し、ｄ）鉱物質除去水でウシ心膜組 織をすすいで残留基底膜を除去し、ｅ）希釈した塩化ナトリウム水溶液でウシ心 膜組織を処理し、ｆ）鉱物質除去水でウシ心膜組織をすすいで残留塩化ナトリウ ムを除去し、 ｇ）錯体促進剤でウシ心膜を処理し、 ｈ）鉱物質除去水でウシ心膜組織をすすいで残留錯体促進剤を除去し、 ｉ）酸性緩衝剤システムでウシ心膜組織を処理し、ｊ）ウシ心膜組織をすすいで 残留酸性緩衝剤システムを除去する。
2. ２．ステップｅ）に先立って、ステップｄ）の次にステップｂ）に従う工程を繰 返すことを特徴とする請求項１に記載の調製方法。
3. ３．ステップａ）およびステップｃ）からステップｊ）までの湿式化学処理は、 １５℃ないし２５℃の室温で行われることを特徴とする請求項１または２のいず れかに記載の調製方法。
4. ４．ステップｃ）における処理は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化 リチウムおよび／または炭酸ナトリウムの希釈塩基性水溶液中、好ましくは、２ ないし２．５重量％水酸化ナトリウム水溶液中で１６時間行われることを特徴と する請求項１から３のいずれか一に記載の調製方法。
5. ５．ステップｅ）における処理は１０ないし１１重量％塩化ナトリウムで行われ ることを特徴とする請求項１から３のいずれか−に記載の調製方法。
6. ６．ステップｇ）における処理は好ましくはｐＨ１１以上のアルカリ溶媒を用い た０．３ないし０．５重量％である希釈ＥＤＴＡジナトリウム溶液中で行われる ことを特徴とする請求項１から３のいずれか−に記載の調製方法。
7. ７．ステップｈ）におけるすすぎ処理はｐＨ値が８．５の弱アルカリになるまで 続けられることを特徴とする請求項１から３のいずれか−に記載の調製方法。
8. ８．ステップｉ）における処理はｐＨ値が４．５ないし６、好ましくは、４．８ の酢酸緩衝材システム中で行われることを特徴とする請求項１から３のいずれか −に記載の調製方法。
9. ９．酸化漂白処理は２重量％以下、好ましくは、約１．５重量％の過酸化水素水 でお子縄えることを特徴とする請求項１から８のいずれか−に記載の調製方法。
10. １０．脱脂処理および乾燥処理は室温でのアセトン処理、アセトンのソウスレッ ト除去処理、再含水処理および凍結乾燥処理により行われることを特徴とする請 求項１から９のいずれか−に記載の調製方法。
11. １１．人間および動物医療における移植材料としての請求項１から１０のいずれ か一の記載の調製方法で得られたウシ心膜の用途。