CN106880872B - 天然细胞外基质生物膜及其制备方法与应用 - Google Patents

天然细胞外基质生物膜及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种天然细胞外基质生物膜，其是以经过去抗原处理的天然细胞外基质为材料，将2‑10层规格相同的单层材料交错或平行叠加放置，使用夹具使各层紧密贴合，在真空条件下冻干处理，然后放入真空烘箱中进行热交联处理，最后将细胞外基质生物膜经钴60辐照或环氧乙烷灭菌制成。本发明的天然细胞外基质材料通过一系列的去抗原处理，得到具有一定三维空间结构的生物膜基质材料，并对其进行冻干和热交联处理，使其发生分子内脱水交联，对其空间结构进行了加固，这样得到的材料具有更强的复水稳定性，在手术操作上更方便。同时，材料在体内的降解时间变长，疏水性及机械强度增大，这在隔离防粘连及修复周期较长的应力性组织上具有重要意义。

Description

天然细胞外基质生物膜及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医用生物材料领域，具体地说，涉及一种天然细胞外基质生物膜及其制备方法与应用。
背景技术
细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)材料常被用于制成各种外科生物补片，如硬脑膜补片、疝补片、胸膜补片、尿道补片等。常用的细胞外基质材料包括真皮基质、小肠黏膜下层、膀胱粘膜下层及心包膜等。这些材料主要有胶原纤维组成，富含生物活性因子且具有特殊的三维孔隙结构，相比其他高分子合成的生物材料，有着更好的生物相容性和促进组织修复再生的作用。但是由天然的细胞外基质材料制成的生物补片过于柔软，机械性能差，为手术操作带来很多不便；在多种组织的修复上，细胞外基质材料很难实现降解速度与组织再生速度相一致，往往因材料降解过快而导致移植失败。
目前用来提高细胞外基质材料机械强度及延长降解时间的方法通常是对材料进行化学交联处理，常用的化学交联剂有戊二醛、京尼平、甲醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)等，化学交联是目前比较常用的方法，具有反应速度快及可控性强等优势，但是一般的交联试剂都具有很大毒性，如果去除不彻底会对产品的安全性带来更多的隐患，降解产物一般也会有一定的细胞毒性。另外还可以对多层细胞外基质材料进行加压干燥来增强材料稳定性、机械强度和延长降解时间，但是材料复水后容易再次分层，无法长期维持机械强度并提高降解时间。
热交联处理(dehydrothermal treatment,DHT)是一种物理交联方法，通过对胶原基质材料进行热处理，能使其中的亲水自由基团氨基和羧基发生分子内脱水缩合形成稳定的缩氨酸键。这样材料层内与层间分子链相互连接成三维网状结构，使材料的整体形态更加稳定。此处理方法，可以在不添加任何有毒化学交联剂的基础上实现材料性能的改善。但是，一些经过特定工艺处理的细胞外基质材料自由亲水基团暴露并不充分，导致单独使用热交联技术只在一定程度上实现了材料层层之间的加固，而对热处理后材料的亲水性、降解时间和力学强度影响并不大。
因此，为进一步提高细胞外基质材料的降解时间，并改善材料的整体性能，亟待开发新的技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于冻干和热交联联用技术制备天然细胞外基质生物膜及其应用。
为了实现本发明目的，本发明提供一种制备天然细胞外基质生物膜的方法，以经过去抗原处理的天然细胞外基质为材料，将2-10层规格相同的单层材料交错或平行叠加放置，使用夹具使各层紧密贴合，在真空条件下冻干处理，然后放入真空烘箱中进行热交联处理，然后取下夹具，得到的细胞外基质生物膜经钴60辐照或环氧乙烷灭菌，即得。
所述去抗原处理的具体操作如下：取新鲜的天然细胞外基质，依次经消毒、机械剥除、脱细胞和去垢处理。
前述的方法，对新鲜的天然细胞外基质进行消毒处理，将新鲜的天然细胞外基质在消毒剂中浸泡45-65min(优选60min)，每隔10min搅拌一次；然后用纯化水清洗上述消毒后的天然细胞外基质直至pH为6.0-7.0。
所述消毒剂为双氧水、过氧乙酸溶液或乙醇等中的至少一种。优选过氧乙酸溶液，浓度为0.5-1％，最佳浓度为0.5％。
前述的方法，天然细胞外基质经消毒后进行机械剥除，然后置于脱细胞液中浸泡10-15min(优选10min)，然后于水中浸泡，并用水冲洗进行去垢处理。
所述脱细胞液为高渗盐溶液、SDS溶液、碱溶液或酶液。优选碱溶液，包括氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钠或氨水溶液；更优选氢氧化钠溶液，浓度为0.01-0.5M，最佳浓度为0.05M。
本发明所述天然细胞外基质来自于同种异体或异种生物的组织材料，包括牛真皮基质、牛心包基质、牛腹膜基质、猪膀胱粘膜下层基质、猪小肠粘膜下层基质、猪腹膜基质、人真皮基质；优选猪小肠粘膜下层基质等。
前述的方法，将上述天然细胞外基质在不锈钢板上铺平重叠，将4层规格相同的单个材料交错或平行叠加放置，用夹具夹紧。
前述的方法，真空条件下冻干处理具体操作如下：在-40～-80℃条件下预冻2-6h，然后进行真空干燥处理，干燥时间16-24h，最终温度上升到4-20℃。优选-80℃预冻4h。
前述的方法，热交联处理具体操作如下：冻干的材料在真空烘箱中热处理1-8h，真空度≤100Pa，温度为100-140℃(优选100-120℃)。更优选120℃热处理4h。
本发明还提供按上述方法制备的天然细胞外基质生物膜。
本发明进一步提供所述天然细胞外基质生物膜在生物医用材料领域中的应用。
本发明首先对去抗原的多层细胞外基质材料进行冷冻干燥，再通过热交联处理，来提高其复水稳定性、疏水性、力学强度并延长降解时间。相对于非冷冻干燥处理的材料，冻干处理后可以使材料更加疏松多孔，胶原基质中的自由水及结合水含量降低，暴露出更多的自由羧基和氨基，将材料再进行热交联处理后，大量的自由亲水性基团氨基和羧基发生分子内脱水缩合形成稳定的化学键。通过冷冻干燥和热交联联合处理后的多层细胞外基质材料，不但总体上维持了稳定的分子空间结构，并在很大程度上加固了原有的三维空间结构，消除了更多的亲水性基团，复水稳定性和疏水性明显增加，体内降解时间变长，机械强度变大，可应用于长时间组织隔离和应力性组织修复的手术上。
附图说明
图1为本发明实施例9中天然细胞外基质生物膜的复水测试结果；a.热处理前；b.热处理后。
图2为本发明实施例10中天然细胞外基质生物膜的疏水性测试结果；a.未经过热处理；b.热处理。
图3为本发明实施例11中天然细胞外基质生物膜的生物降解时间测试结果；a、b、c、d分别为热处理的生物膜在1周、3周、8周及12周的HE染色图，e、f、g、h分别为未经过热处理的生物膜在1周、3周、8周及12周的HE染色图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 天然细胞外基质生物膜及其制备方法
肉联厂采购新鲜猪小肠1副，前处理清洗去除肠内食糜，截成长度为1米左右的肠段；配制浓度为0.5％的过氧乙酸溶液3L，将上述肠段放入过氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min搅拌一次；清洗上述消毒后的肠段5-8次直到pH为6.0-7.0为止；用剥肠机将肠段剥离肠内组织得到小肠粘膜下层；配制浓度为0.05M的氢氧化钠溶液，将上述小肠粘膜下层放入碱溶液浸泡10min，然后纯化水浸泡10min，反复3次；将上述小肠粘膜下层用纯化水重复清洗10次；将清洗后小肠粘膜下层进行重叠铺4层，夹具夹紧，冻干(在-80℃条件下预冻4h，然后进行真空干燥处理，干燥时间20h，最终温度上升到15℃)；将冻干后得到的生物膜放入真空烘箱中热处理4h，温度为120℃，真空度为100Pa；然后取下夹具，进行环氧乙烷灭菌，封装保存。
实施例2 天然细胞外基质生物膜及其制备方法
肉联厂采购新鲜猪小肠1副，前处理清洗去除肠内食糜，截成长度为1米左右的肠段；配制浓度为0.5％的过氧乙酸溶液3L，将上述肠段放入过氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min搅拌一次；清洗上述消毒后的肠段5-8次直到pH为6.0-7.0为止；用剥肠机将肠段剥离肠内组织得到小肠粘膜下层；配制浓度为0.25％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，将上述小肠粘膜下层放入SDS溶液浸泡10min，反复4次；将上述小肠粘膜下层用纯化水重复清洗10次；将清洗后小肠粘膜下层进行重叠铺4层，夹具夹紧，冻干(在-40℃条件下预冻6h，然后进行真空干燥处理，干燥时间16h，最终温度上升到4℃)；将冻干后得到的生物膜放入真空烘箱中热处理4h，温度为120℃，真空度为100Pa；然后取下夹具，进行环氧乙烷灭菌，封装保存。
实施例3 天然细胞外基质生物膜及其制备方法
肉联厂采购新鲜猪小肠1副，前处理清洗去除肠内食糜，截成长度为1米左右的肠段；配制浓度为0.5％的过氧乙酸溶液3L，将上述肠段放入过氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min搅拌一次；清洗上述消毒后的肠段5-8次直到pH为6.0-7.0为止；用剥肠机将肠段剥离肠内组织得到小肠粘膜下层；配制浓度为0.05M的氢氧化钠溶液，将上述小肠粘膜下层放入碱溶液浸泡10min，然后纯化水浸泡10min，反复3次；将上述小肠粘膜下层用纯化水重复清洗10次；将清洗后小肠粘膜下层进行重叠铺4层，夹具夹紧，冻干(在-50℃条件下预冻5h，然后进行真空干燥处理，干燥时间24h，最终温度上升到20℃)；将冻干后得到的生物膜放入真空烘箱中热处理4h，温度为100℃，真空度为100Pa；然后取下夹具，进行环氧乙烷灭菌，封装保存。
实施例4 天然细胞外基质生物膜及其制备方法
肉联厂采购新鲜猪小肠1副，前处理清洗去除肠内食糜，截成长度为1米左右的肠段；配制浓度为0.5％的过氧乙酸溶液3L，将上述肠段放入过氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min搅拌一次；清洗上述消毒后的肠段5-8次直到pH为6.0-7.0为止；用剥肠机将肠段剥离肠内组织得到小肠粘膜下层；配制浓度为0.05M的氢氧化钠溶液，将上述小肠粘膜下层放入碱溶液浸泡10min，然后纯化水浸泡10min，反复3次；将上述小肠粘膜下层用纯化水重复清洗10次；将清洗后小肠粘膜下层进行重叠铺2层，夹具夹紧，冻干(在-60℃条件下预冻2h，然后进行真空干燥处理，干燥时间18h，最终温度上升到4℃)；将冻干后得到的生物膜放入真空烘箱中热处理8h，温度为100℃，真空度为100Pa；然后取下夹具，进行环氧乙烷灭菌，封装保存。
实施例5 天然细胞外基质生物膜及其制备方法
肉联厂采购新鲜猪小肠1副，前处理清洗去除肠内食糜，截成长度为1米左右的肠段；配制浓度为0.5％的过氧乙酸溶液3L，将上述肠段放入过氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min搅拌一次；清洗上述消毒后的肠段5-8次直到pH为6.0-7.0为止；用剥肠机将肠段剥离肠内组织得到小肠粘膜下层；配制浓度为0.05M的氢氧化钠溶液，将上述小肠粘膜下层放入碱溶液浸泡10min，然后纯化水浸泡10min，反复3次；将上述小肠粘膜下层用纯化水重复清洗10次；将清洗后小肠粘膜下层进行重叠铺6层，夹具夹紧，冻干(在-70℃条件下预冻3h，然后进行真空干燥处理，干燥时间22h，最终温度上升到10℃)；将冻干后得到的生物膜放入真空烘箱中热处理8h，温度为120℃，真空度为100Pa；然后取下夹具，进行环氧乙烷灭菌，封装保存。
实施例6 天然细胞外基质生物膜及其制备方法
肉联厂采购新鲜猪小肠1副，前处理清洗去除肠内食糜，截成长度为1米左右的肠段；配制浓度为0.5％的过氧乙酸溶液3L，将上述肠段放入过氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min搅拌一次；清洗上述消毒后的肠段5-8次直到pH为6.0-7.0为止；用剥肠机将肠段剥离肠内组织得到小肠粘膜下层；配制浓度为0.05M的氢氧化钠溶液，将上述小肠粘膜下层放入碱溶液浸泡10min，然后纯化水浸泡10min，反复3次；将上述小肠粘膜下层用纯化水重复清洗10次；将清洗后小肠粘膜下层进行重叠铺4层，夹具夹紧，冻干(在-80℃条件下预冻4h，然后进行真空干燥处理，干燥时间24h，最终温度上升到4℃)；将冻干后得到的生物膜放入真空烘箱中热处理4h，温度为140℃，真空度为100Pa；然后取下夹具，进行环氧乙烷灭菌，封装保存。
实施例7 天然细胞外基质生物膜及其制备方法
肉联厂采购新鲜猪小肠1副，前处理清洗去除肠内食糜，截成长度为1米左右的肠段；配制浓度为0.5％的过氧乙酸溶液3L，将上述肠段放入过氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min搅拌一次；清洗上述消毒后的肠段5-8次直到pH为6.0-7.0为止；用剥肠机将肠段剥离肠内组织得到小肠粘膜下层；配制浓度为0.05M的氢氧化钠溶液，将上述小肠粘膜下层放入碱溶液浸泡10min，然后纯化水浸泡10min，反复3次；将上述小肠粘膜下层用纯化水重复清洗10次；将清洗后小肠粘膜下层进行重叠铺4层，夹具夹紧，抽干(设定温度为4℃，进行真空干燥处理，干燥时间24h，最终温度上升到10℃)；将抽干后得到的生物膜放入真空烘箱中热处理4h，温度为120℃，真空度为100Pa；然后取下夹具，进行环氧乙烷灭菌，封装保存。
实施例8 天然细胞外基质生物膜的体外力学测试实验
对实施例1、实施例3、实施例6(冻干)和实施例7(非冻干)热处理前后制备的生物膜进行体外拉伸强度测试(参考标准ASTMD882-09)，结果见表1。实验结果表明，冻干的生物膜样品在100～120℃温度范围内进行热处理，膜的拉伸强度明显增大(P<0.05)。但是当温度超过此范围，达到140℃时，膜的强度会下降，与未处理组相比变化不明显(P>0.05)，温度控制在100～120℃为宜；对于非冻干的样品，热处理前后拉伸强度变化不明显(P>0.05)。
对实施例2、实施例4和实施例5的热处理前生物膜样品进行了体外缝合强度测试(参考标准GB/T 3903.43--2008)，结果见表2。实验结果表明，随着层数的增加，膜的缝合强度明显增大(P<0.05)。但对于可吸收降解材料而言，植入量过大将导致其免疫排斥反应增大。因此，综合考虑，既要保证一定的力学强度，同时又能够保证较低的免疫风险，以4层材料制备的生物膜为宜。
表1生物膜拉伸强度测试结果(单位，牛顿)
注：分别与未处理组相比，*P值<0.05；**P值<0.01。表1和表2中数据均为4次取样测试的平均值。
表2生物膜缝合强度测试结果(单位，牛顿)
2层材料 4层材料 6层材料
2.00±0.63 4.32±0.35* 7.54±0.95*
注：与2层材料相比，*P值<0.05。
实施例9 天然细胞外基质生物膜的复水测试实验
实施例1热交联处理前后的生物膜(猪小肠黏膜下层)复水后状态见图1，a.热处理前；b.热处理后。复水后，未经过热交联处理的生物膜质软不易成型，热交联处理的生物膜挺实且原有形状保持度较高。
实施例10 天然细胞外基质生物膜的疏水性测试实验
用接触角测试仪对实施例1中热处理前后的的生物膜进行接触角测试，结果见图2，其中a.未热处理；b.热处理。在膜表面滴水，30s后观察记录接触角。实验结果表明，未经过热处理的生物膜接触角变化较大，热处理的生物膜接触角变化较小，说明热处理使材料疏水性增加。接触角测亲疏水性的原理参考许岗等(疏水复合薄膜接触角的测定，西安工业大学学报，2004，24(1):65-69)。
实施例11 天然细胞外基质生物膜的生物降解时间测试实验
用新西兰白兔对实施例1制备的生物膜进行肌肉埋植实验，结果如图3所示，图3中a、b、c、d分别为热处理的生物膜在1周、3周、8周及12周的HE染色图，e、f、g、h分别为未经过热处理的生物膜在1周、3周、8周及12周的HE染色图。实验结果表明，进行了热处理的生物膜在12周还未降解，而未经过热处理的生物膜在8周已经开始逐步降解，12周完全降解。(箭头指向为SIS区)
本发明通过对天然细胞外基质材料进行一系列的去抗原处理，得到了具有一定三维空间结构的生物膜基质材料，并经过冷冻干燥和热交联联合处理，使胶原基质中暴露出的大量亲水性基团发生分子内脱水缩合，实现了对其空间结构的加固，这样得到的材料具有更强的复水稳定性，在手术操作上更方便。同时，材料在体内的降解时间变长，疏水性及机械强度增大，这在隔离防粘连及修复周期较长的应力性组织上具有重要意义。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (18)

1.天然细胞外基质生物膜的制备方法，其特征在于，以经过去抗原处理的天然细胞外基质为材料，将2-10层规格相同的单层材料交错或平行叠加放置，使用夹具使各层紧密贴合，在真空条件下冻干处理，然后放入真空烘箱中进行热交联处理，然后取下夹具，得到的细胞外基质生物膜经钴60辐照或环氧乙烷灭菌，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去抗原处理的具体操作如下：取新鲜的天然细胞外基质，依次经消毒、机械剥除、脱细胞和去垢处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对新鲜的天然细胞外基质进行消毒处理，将新鲜的天然细胞外基质在消毒剂中浸泡45-65min，每隔10min搅拌一次；然后用纯化水清洗上述消毒后的天然细胞外基质直至pH为6.0-7.0；
其中，所述消毒剂为双氧水、过氧乙酸溶液或乙醇中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消毒剂为过氧乙酸溶液，浓度为0.5-1％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，过氧乙酸溶液的浓度为0.5％。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，天然细胞外基质经消毒后进行机械剥除，然后置于脱细胞液中浸泡10-15min，然后于水中浸泡，并用水冲洗进行去垢处理；
所述脱细胞液为高渗盐溶液、SDS溶液、碱溶液或酶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脱细胞液为碱溶液，包括氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钠或氨水溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述脱细胞液为氢氧化钠溶液，浓度为0.01-0.5M。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.05M。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天然细胞外基质来自于同种异体或异种生物的组织材料，包括牛真皮基质、牛心包基质、牛腹膜基质、猪膀胱粘膜下层基质、猪小肠粘膜下层基质、猪腹膜基质、人真皮基质。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述天然细胞外基质为猪小肠粘膜下层基质。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将4层规格相同的单个材料交错或平行叠加放置。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其特征在于，真空条件下冻干处理具体操作如下：在-40～-80℃条件下预冻2-6h，然后进行真空干燥处理，干燥时间16-24h，最终温度上升到4-20℃。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，真空条件下冻干处理具体操作如下：-80℃预冻4h。
15.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其特征在于，热交联处理具体操作如下：冻干的材料在真空烘箱中热处理1-8h，真空度≤100Pa，温度为100-140℃。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，热交联处理具体条件如下：120℃热处理4h。
17.根据权利要求1-16任一项所述方法制备的天然细胞外基质生物膜。
18.权利要求17所述天然细胞外基质生物膜在生物医用材料领域中的应用。
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