JP2624553B2 - ウシ心膜材料の調製方法およびその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、優れた生体適合性および増大した安定性を
有するウシ心膜材料の調製方法、およびこのようにして
調製された材料のヒト医療および動物医療における移植
片またはインプラントとしての使用に関する。

今世紀初頭から、外科において、膠原性結合組織の移
植片によって大きな組織欠損を補うことが試みられてき
た［1901年、マルシャン（Marchant）;1914年、クライ
ンシュミット（Kleinschmidt）］。1954年から凍結乾燥
させた状態で、1973年からは溶媒乾燥させた状態で、ヒ
ト硬膜が同種移植片として用いられてきた。多くの場
合、ヒト硬膜は、その良好な組織適合性のために免疫反
応が起こらないことおよび臨界引張力があまり高くなら
ないことが、それ自身の価値を証明してきた。そのた
め、その生体材料は今日もうまく用いられている。残念
なことに、硬膜は、ヒト移植片としては、限られた範囲
にのみ適用可能であり、外科の要求には全く対応ができ
ない。さらに、種々の指摘がある。例えば神経外科や耳
鼻咽頭科においては、硬膜移植片は、多少固く、厚みに
おいて最適ではないことがしばしば証明されてきた。

ドイツ特許公開公報第30 34 273号には、天然の不
溶性コラーゲンをアルカリ硫酸塩および／またはアルカ
リ水酸化物の水溶液で処理し、得られた無脂肪コラーゲ
ンをアルカリ硫酸塩を含有する水溶液中で処理し、所望
により水で洗浄し、該コラーゲンを水溶液に溶解させ
て、所望により、この水溶液に抗生物質、ホルモンまた
はスペルミジド（spermizide）のような生理活性物質を
少量添加し、この水溶液を冷凍させ、該生成物を真空中
で乾燥させることを特徴とするコラーゲンの調製方法が
開示されている。

しかしながら、上記の公開公報は、本発明の課題を予
見するもの、および本発明の課題を当業者に明白にする
もののいずれでもない。

U.S.特許第4,006,083号には、外科において有用な、
フェルト製または織編製のイミテーション毛皮構造を持
つ無菌コラーゲン製品が開示されており、これは、止血
作用を発揮し、体液に対して高い吸収能を有し、細胞再
生を促進し、高い再吸収性を有し、実質的に体組織によ
り拒絶されず、最適な機械的特性を有しており、この特
性が、該生成物を皮膚損傷のケアにおいて、または皮膚
病変や骨内腔において用いることを可能にするものであ
る。

しかしながら、上記U.S.特許の開示は、本発明の課題
を予見したもの、および本発明の課題を当業者に明白に
するもののいずれでもよい。

U.S.特許第4,502,159号には、例えば血管プロテーゼ
（prosthesis）または尿管プロテーゼなどの管状プロテ
ーゼの製造が開示されている。上記プロテーゼは、生体
適合性を有する縫合材料を用いて心膜組織の対向する角
を縫合することで形成される。縫合手順の正確な説明は
以下の通りである。ヒト組織と同様の伸張特性を有する
ウシ心膜を用いることが好ましい。管状組織は縫合され
た後、グルタルジアルデヒドの0.5％溶液中で７日間な
めされる。心膜材料の滑らかな面が内側に向けられ、一
方、基底膜が外側になる。滅菌は、ホルマリン中での保
存によって、または、心膜を含有する生理食塩水の放射
線照射滅菌によって、行われる。

しかしながら、上記U.S.特許には、単離、精製および
／または、そうして調製された管状プロテーゼの物理的
および化学的特性については何の情報も開示されていな
い。したがって、このU.S.特許は、本発明の課題を明白
にすることができるものではない。

これらの従来技術の状況から、実質的に制限なしに入
手可能であり、硬膜の好ましい特性の全てをできる限り
有しており、さらに、取り扱い時にいくつかのさらなる
利点を提供する移植片またはインプラントが必要とされ
ている。さらにまた、確実に、ヒト移植片について基本
的に起こりうるようなヒトにとって危険な微生物（HIV
ウイルス、肝炎ウイルス等）が生材料によって侵入およ
び導入しないようにすべきである。

製造に係るすべての要因を考慮して、以下単に心膜と
も称されるウシ心膜において、最適な方法でヒト組織欠
損をカバーするためのインプラントについて設定された
要求を満たした生体材料が見いだされた。

本発明の目的は、生体適合性および安定性が改良され
たウシ心膜材料の調製方法を提供することである。本発
明の今一つの目的は、上記製品の新しい可能な使用を提
供することである。

今、驚くべきことに、U.S.特許第4,502,159号、WO84/
04669号、U.S.特許第4,456,589号に開示されているよう
なホルムアルデヒドまたはグルタルジアルデヒドを用い
たアルデヒドなめし法を用いない場合でさえウシ心膜に
含有される硬蛋白質の生物学的分解に対する耐性および
該ウシ心膜の生体適合性が増強されることを見いだし
た。

本発明は、未処理のウシ心膜組織を、湿式化学処理、
酸化漂白、洗浄、脱脂、乾燥および殺菌の操作に付すこ
とによるウシ心膜材料の調製方法であって、該ウシ心膜
組織の湿式化学処理が、 ａ）ウシ心膜組織を浸漬し、 ｂ）該ウシ心膜組織表面から脂肪組織および基底膜を機
械的に取り除き、 ｃ）該組織を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸
化リチウムおよび炭酸ナトリウムからなる群から選択さ
れる化合物のアルカリ水溶液と接触させて、該組織を膨
潤させ、次いで、水ですすぎ、 ｄ）該ウシ心膜組織を脱塩水ですすいで残留塩基を除去
し、 ｅ）該ウシ心膜組織を希塩化ナトリウム水溶液で処理
し、 ｆ）該ウシ心膜組織を脱塩水ですすいで残留塩化ナトリ
ウムを除去し、 ｇ）該ウシ心膜を錯化剤で処理し、 ｈ）該ウシ心膜組織を脱塩水ですすいで残留錯化剤を除
去し、 ｉ）該ウシ心膜組織を酸性緩衝剤系で処理し、 ｊ）該ウシ心膜組織を脱塩水ですすいで残留酸性緩衝剤
系を除去する 工程からなることを特徴とするウシ心膜材料の調製方法
に関する。

本発明の好ましい実施例においては、工程ｅ）に先立
って、工程ｄ）の次に工程ｂ）が繰り返される。

上記の湿式化学処理による方法は、室温より高くても
低くても容易に行えるが、本発明の範囲内では、15℃〜
25℃の室温で全ての湿式化学処理工程を行うことが好ま
しい。

工程ｃ）における処理は、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化リチウムおよび／または炭酸ナトリウ
ムの希塩基性水溶液中で行われるのが好ましい。一般に
16時間までの間、ウシ心膜組織に作用する２〜2.5重量
％の水酸化ナトリウム水溶液の使用が特に好ましく、ウ
シ心膜組織100g当たり該希塩基性水溶液0.50〜1.00リッ
トルが用いられる。これによって、一方では、酵素や潜
在的微生物のできる限り完全な非活性化を含む良好な精
製効果が得られ、他方では、コラーゲン含有組織の損傷
が防げる。

希塩基性水溶液で処理した後、心膜組織は、一般に、
初期体積の２〜５倍まで、非常に膨潤する。

工程ｅ）の処理は、好ましくは10〜11重量％塩化ナト
リウム水溶液中で行われ、これにより、以後の処理に適
するようにコラーゲンの膨潤状態が制御させる。これに
対して、該塩化ナトリウム水溶液の濃度が低いと、アル
カリ処理後に非常に膨潤したコラーゲンが充分には解膨
潤されないだけであろう。また、該溶液中の塩化ナトリ
ウム濃度が高いと、不必要な蓄積を生じて、ウシ心膜組
織中に塩残存物が生じ、この理由のためにすでに有意義
ではなくなっている。

工程ｇ）の処理は、好ましくは、蛋白質と部分的に結
合する多価金属錯体イオンを錯体形成するために当業者
に知られている錯化剤を用いて行われる。この場合、例
えば濃度0.3ないし0.5重量％で存在する、EDTA二ナトリ
ウム溶液を用いるのが特に好ましいことが証明された。
上記錯化剤は、その完全な錯体形成作用を示すことがで
きるように、塩基性pH値が11を超えるように調整されな
ければならない。錯化剤による処理は、通常、0.5〜２
時間以上行われる。

工程ｈ）によるすすぎ処理は、pH値が最大8.5の弱ア
ルカリ性になるまで続けるのが好ましい。

工程ｉ）の処理のために、pH値が4.5ないし6.0の酢酸
緩衝剤系のような酸性緩衝剤系を使用するのが好まし
い。

湿式化学処理操作後、それに続く酸化漂白工程は、2.
0重量％よりも少ない、特に、約1.5重量％の量の過酸化
水素を含有する水溶液でウシ心膜材料を漂白することに
よって行われるのが好ましい。上記の過酸化水素漂白
は、コラーゲンそのものを破壊せずに、コラーゲンの付
随物質を酸化により破壊する目的を持っている。2.0重
量％を超える過酸化水素濃度は、コラーゲン含有ウシ心
膜組織に著しい損傷を与えるので、本発明の範囲内であ
っても好ましくないことが判明した。過酸化水素処理
は、通常、ウシ心膜組織100g当たり0.5〜1.0リットルの
過酸化水素水溶液中で0.5〜２時間行われる。

この酸化漂白処理操作に続いて、水で完全にすすぐこ
とによる自体公知の方法で残留過酸化水素を除去する。

ウシ心膜組織の脱脂および乾燥は、まず、切片を充分
量のアセトンに浸漬し、該溶媒を12〜24時間の範囲内で
新しいバッチと２〜６回取り替えるような方法で行われ
る。そうして脱水されたウシ心膜組織をソックスレー装
置に移し、残りの水分と脂肪分とを徹底的な抽出によっ
て除去する。該抽出後、ウシ心膜片を風乾し、次いで、
脱塩水中で再び水化（膨潤）させる。

その後、ウシ心膜材料を自動制御凍結乾燥器内で凍結
乾燥させ、殺菌する。

本発明に係る上記の調製工程は、医療分野で使用する
ための矛盾のない品質の製品を作り出すのに適した特別
な方法においてである。

本発明により得られたウシ心膜は、当業者によく知ら
れている動物医療やヒト医療の種々の分野での移植片ま
たはインプラントとして使用することができる。これに
関係して、本明細書中では、ベー・ブラウン・メルズン
ゲン・アクチエンゲゼルシャフト社が1978年に発行した
会社パンフレット「人体構造の同種形成性代替材として
のリオデュラ（Lyodura、登録商標）」やその中で触れ
られている多数の文献を参照する。

皮下移植試験における臨界引張力の評価 第１図は、本発明に係る工程によって効果が達成され
得る実施例として示すものである。

第１図は、ラットの背部皮下の移植片について、市販
の一般に広く用いられているリオデュラ（Lyodura、登
録商標）10mm幅片と比較して、本発明に従って得られた
心膜材料10mm幅片の臨界引張力−時間関係を示す（いず
れも10匹の試験動物の平均値である）。試験では、どち
らの場合も50片が移植され、種々の経過時間後に手術に
より取り出して、臨界引張力を測定したものである。曲
線Ａは、本発明に係る工程により調製された心膜につい
て測定された。曲線Ｂは、比較対象のリオデュラについ
て測定されたものであった。

21日にわたる観察の結果、本発明に従って調製した異
種材料心膜と同種材料リオデュラ（Lyodura、登録商
標）との間で臨界引張力に関して有意な差異を全く測定
できない；これにより、異種材料が同種材料についての
優れた代替品を構成することが判明した。

皮下移植試験による生体適合性の評価 I.心膜の皮下移植をウサギ58匹とラット220匹に対して
行った。研究のパラメーターは、７日間から12月間まで
の効果的な期間の後、インプラントの病理解剖学上観察
と組織学的試験であった。

本発明に係る心膜インプラントを、凍結乾燥させた硬
膜、リオデュラ（Lyodura、登録商標）およびアセトン
乾燥させた硬膜（テュートプラスト（Tutoplast、登録
商標））と比較した。炎症反応および移植状態について
は顕微鏡による評価を行った。試料は、４％ホルマリン
溶液で固定され、組織学的試験に付した。

コラーゲン骨格の微細構造を、移植を行っていない対
照と比較した。

インプラントの組織学的評価は、細胞（結合組織細
胞、免疫適格細胞）の浸潤反応、インプラントと受容体
の結合状態（内殖能力）、異種材料の吸収および／また
は賦活化（vitalization）、ならびに、起こり得る拒絶
反応に及ぶ。

結果： 移植前の失活（devitalized）試料を試験した結果、
該試料は、細胞または細胞構成要素の残部を完全に含ま
ないものとなっているのが確認された。他方、凍結乾燥
させた、より特別には、溶媒乾燥させた硬膜は、ある程
度単離された核材料を示した。

ａ）インプラントの微細構造 コラーゲン繊維構造の配列が結合組織細胞の移入作用
に重要であることが確認された。

真っすぐ密に配列されたコラーゲン繊維束は（溶媒−
乾燥硬膜では）、再賦活化を妨げる。分離された繊維と
して主として存在する心膜およびリオデュラ（Lyodur
a、登録商標）においては、結合組織系由来の細胞によ
る再増殖が促進される。

ｂ）インプラントの活力 心膜のインプラントは、細胞が移入する間隙における
ガイドレールとして作用した。

一週間後、多数の細胞は、インプラントに移入し、該
細胞は、広く拡散していた。これらは、線維芽細胞およ
び組織球性素子である。第１週から第６週までに活力指
数は増加する。

ｃ）リンパ球、マクロファージ、異物（alien body）巨
細胞のような結合組織系に属さない細胞によるインプラ
ントの浸潤 硬膜試料におけるよりも少数が思いもかけずに心膜に
おいて生じる上記細胞の発生は、初期の拒絶反応と見な
すのではなく、免疫的に有効なプロセスであると理解す
べきである。線維芽細胞および組織球による侵入と比べ
て、これらのリンパ球、マクロファージおよび巨細胞
は、インプラントに深く浸透することはめったにない。
マクロファージは、出血が創傷床中で起こる場合に非常
によく発生した。細胞（リンパ球、マクロファージ、巨
細胞）の数を数え、発生率を計算した。この医療用の心
膜試料における発生率（1.43）は、硬膜試料におけるも
の（凍結乾燥させたもの:2.2、アセトン乾燥させたも
の:2.32）よりもかなり低い。この現象は、おそらく、
心膜が非常によく失活されていて、免疫原性作用を示す
細胞や細胞核残渣を全く含んでいないからであろう。

ｄ）急性炎症および拒絶反応 心膜試料において免疫反応は、全く検出されなかっ
た。

結果として、心膜試料の良好な能力は、拒絶反応が起
こらないだけではなく、より良好な活力によるものであ
る一方、心膜のいくらかの薄さもある種の役割を果たす
ことが確かめられた。

II.イヌにおける脳硬膜の代用としての心膜の生体適合
性および機能性の評価 移植後３ケ月および６ケ月たったインプラントは、よ
く一体化しており、もはや自生の硬膜と見分けが付かな
かった（線維細胞により再賦活化され、境界部には血管
が通っていた）。インプラントの内部には、自家組織の
硬膜と同じ型の細胞で覆われている。大脳皮質との融合
は見られなかった。

市販の硬膜材料と比較して、本発明の調製方法により
調製されたウシ心膜材料のこの効果を添付の第２図〜第
５図を参照して説明する。

第２図は、ラットに対して皮下移植を施して６週間経
過した心膜を示す。リンパ球を含まない生活線維芽細胞
により良好に再賦活化された完全に無刺激性のインプラ
ント；コラーゲンの新しい形成。

第３図は、ラットに対して皮下移植を施して６週間経
過した溶媒乾燥させた硬膜を示す（比較）。リンパ球の
局所的な蓄積；中央部では、線維芽細胞による賦活化は
ない。

第４図は、ラットに対して皮下移植を施して12週間経
過した心膜を示す。インプラントおよび宿主組織の良好
な一体化；免疫適格細胞は、存在しない。

第５図は、皮下移植を施して12週間経過した溶媒乾燥
させた硬膜を示す（比較）。リンパ球の局所的な蓄積；
インプラントは、密な繊維構造のために殆ど失活してい
る。

本発明の調製方法について、ウシ心膜調製のための実
施例により以下に説明する。

実施例 1.未処理材料の回収 屠殺場で公認の獣医による標準食肉検査の後、まず、
出発材料として用いられるウシ心膜を、付着している器
官部分から分離し、大体の脂肪および結合組織を取り除
く。これにより、１片がほぼ30cm×15cmのサイズで約1k
gのシート状片を得る。こうして調製されたウシ心膜
を、氷を詰めた冷蔵バッグに入れて、屠殺場から製造所
まで輸送し、回収した未処理材料の量に依存して、後の
調製工程まで、−20℃以下で中間保存される。

2.湿式化学処理 未処理心膜片をまず精製水で個々にすすぎ（通常、流
水中に浸漬する）、付着血液および水溶性蛋白質部分を
除去する。

浸漬後、顕微鏡で確認できる程度の全ての脂肪組織と
基底膜の残存物を除去する。次に、室温で２％水酸化ナ
トリウム水溶液により処理する。該心膜片（5,000g）を
アルカリ液浴（37.5リットル）中に合計16時間放置す
る。上記の除去工程に続いて、脱塩水中で約10分間すす
ぎ、すすぎ水のpHが８以下に低下するまで、該工程を繰
り返す。これには約１時間かかるであろう。基底膜およ
び脂肪残存物が少しでもまだ観察される場合、これら
は、最終的にこの工程で除去される。

非常に膨潤した心膜片を10％食塩水37.5リットル中に
移し、以降の工程の必要に応じて膨潤状態（局所的な解
膨潤）を調節する。このNaCl処理は、室温で行われる。
次に、脱塩水によるすすぎ処理を行う。

心膜から邪魔な貴金属イオンや起こり得る石灰封入体
を除去するために、次に、該材料を濃度0.3g/100mlの弱
アルカリに調節したEDTA溶液37.5リットルで処理する。
次いで、該材料を前記工程に従って脱塩水ですすいで、
過剰の錯化剤を除去し、同時にpH値を8.5にする。酢酸
緩衝剤（pH4.8、組成（100mlにつき）:100ml中酢酸ナト
リウム・三水和物0.01モル溶液59容量部および100ml中
酢酸0.01モル41容量部）37.5リットルで行う一回の処理
は、たとえば心膜組織中に残存物があるとしてもその全
てを緩衝化する目的にかない、以下の漂白処理のための
弱酸性媒質を調製するのに役立つ。いずれの過剰の緩衝
剤も、脱塩水ですすぐことにより前記のとおり除去され
る。

3.酸化漂白処理 湿式化学処理に続いて、該心膜片を濃度1.5％過酸化
水素水溶液37.5リットル中で１時間酸化漂白処理に付
す。該酸化漂白処理は、前記処理と同様に室温で行われ
る。これにより、一方では、浄化処理の効果が確実にな
り、他方では、膠原組織の変質が防止される。

4.洗浄処理 続いて、過剰の試薬を除去するために、慣用の方法に
従って、心膜片を脱塩水ですすぐ。

5.脱脂処理 すすいだウシ心膜片を、該ウシ心膜がアセトンで完全
に覆われるような量のアセトン中に置く。

該溶媒は、８時間以内に３回交換した。こうして脱水
されたウシ心膜片をソックスレー装置に移し、約８時
間、アセトンで抽出した。該抽出後、該心膜片を風乾さ
せ、次いで、輸送管内で脱塩水で再含水させた。

6.凍結乾燥処理 自動制御凍結乾燥器内で乾燥を行った。凍結乾燥の詳
細は、以下の通りである。

温度を＋１℃に下げ、さらに、温度を−40℃に下げ、
真空状態にし、次いで、該トレイを＋40℃に加熱し、完
全な真空中で乾燥させる。

7.滅菌処理 2.5Mradの放射線滅菌によって殺菌を行う。

フロントページの続き (72)発明者 ベイヤー，ヘルムート ドイツ連邦共和国 3507 バウナタル、 アン・デン・シュタイネッケルン５番 (56)参考文献 特開 昭50−43794（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−75152（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−97365（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−84161（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502588（ＪＰ，Ａ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生物学的分解に対する耐性が増強されるよ
   うにウシ心膜組織を調製する方法であって、 （ａ）実質的に以下の工程： （ｉ）該心膜組織の表面から付着脂肪および基底膜を分
   離し、 （ii）該組織を、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
   水酸化リチウムおよび炭酸ナトリウムからなる群から選
   択される化合物のアルカリ水溶液と接触させて、該組織
   を膨潤させ、次いで、水ですすぎ、 （iii）膨潤した組織を塩化ナトリウム水溶液と接触さ
   せて、膨潤を制御し、次いで、水ですすぎ、 （iv）該組織をpH11以上の金属イオン錯化剤の溶液と接
   触させ、次いで、水ですすぎ、 （ｖ）該組織をpH4.5〜6.0の水性緩衝液と接触させ、次
   いで、水ですすぐ工程 からなるプロセスにより心膜組織を湿式化学処理し； （ｂ）該心膜組織を乾燥させ；次いで、 （ｃ）該心膜組織を滅菌すること からなることを特徴とするウシ心膜組織の調製方法。
2. 【請求項２】接触工程が室温で行われる請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】塩化ナトリウム水溶液が10〜11％塩化ナト
   リウムを含有する請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】金属イオン錯化剤溶液と接触させた後のす
   すぎが、pHが8.5以下に低下するまで続けられる請求項
   １記載の方法。
5. 【請求項５】該組織を酸化漂白水溶液と接触させること
   を含む請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】該組織を脱脂することを含む請求項１記載
   の方法。
7. 【請求項７】接触工程が室温で行われ、アルカリ水溶液
   が２〜2.5％水酸化ナトリウムからなり、塩化ナトリウ
   ム溶液が10〜11％塩化ナトリウムを含有し、金属錯化剤
   がEDTAナトリウムからなり、金属イオン錯化剤溶液との
   接触に続くすすぎが、pHが8.5以下に低下するまで続け
   られる請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】ヒトおよび動物医療において移植片および
   インプラントとして使用するための請求項１〜７のいず
   れか１項記載の調製方法で得られるウシ心膜材料。