CN104436318B - 一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法 - Google Patents
一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104436318B CN104436318B CN201410671874.XA CN201410671874A CN104436318B CN 104436318 B CN104436318 B CN 104436318B CN 201410671874 A CN201410671874 A CN 201410671874A CN 104436318 B CN104436318 B CN 104436318B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen fiber
- bone
- membrane
- fiber membrane
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明提供一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法，属于生物医用材料领域。首先采用反复冻融和表面活性剂TritonX‑100方法获得脱细胞的牛心包胶原纤维膜，或采用EDTA脱钙和表面活性剂TritonX‑100方法获得脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜；再采用三偏磷酸钠处理获得磷酸化的胶原纤维膜；然后在直流电场辅助下，在含有钙磷的琼脂水凝胶中矿化，获得有一定硬度的具有类骨结构的矿化胶原膜；最后将其浸入米诺环素溶液中，利用米诺环素与羟基磷灰石结合的特性，获得抗菌的类骨结构的复合膜材料。本发明获得的引导再生膜具有类骨结构、可维持骨缺损空间、良好的操作成型性、抗菌性能。可应用于牙周科、种植牙修复、颌面等部位骨缺损修复重建的临床实践。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料技术，一种可吸收性膜材料的制备方法。用于口腔临床中引导骨组织、牙周组织再生，修复重建外科骨组织再生。
背景技术
膜引导骨组织再生技术(guided bone regeneration,GBR)：指在骨缺损区域建立一物理屏障，使骨缺损区域与对骨生长有干扰作用的周围软组织相隔离，以促进新骨生长的新技术。1957年《American Joural of Surgery》首次报道：将一硬性塑料覆盖于狗的胫骨实验性缺损处，10周后，发现新骨长入硬性塑料覆盖的骨创处，骨的长入量决定于膜状物下的空间大小。由此认为阻止软组织长入骨缺损处，并保持骨缺损的空间大小，是骨再生不可缺少的条件。20世纪80年代膜引导再生理论技术在医学临床上得到广泛接受和应用。目前膜引导骨组织再生技术已广泛应用于口腔颌面外科、牙周科、种植修复外科、修复重建外科等临床实践。大量前瞻性研究和多中心研究都证明了膜引导再生术在种植牙外科应用中的意义。
膜引导组织再生的机理可分为：(1)物理屏障膜，通过阻止快速生长的纤维细胞、上皮细胞长入骨缺损区域，从而促使骨生成细胞从邻近的骨缺损边缘或骨髓迁移进入骨缺损区，在无干扰的情况下完成骨的再生。(2)生物屏障，组织引导再生膜消除了纤维细胞分泌的抑制骨形成的细胞因子，起到聚集骨生长因子作用。(3)膜本身可能就具有引导骨生长的性能。
理想的组织引导再生膜应满足以下需求：(1)膜作为植入性生物材料必须满足生物安全性、生物相容性要求。与骨组织和周围组织都具有良好的生物相容性。(2)膜材料必须具有阻止周围组织细胞特别是成纤维细胞、上皮细胞长入所覆盖区域的功能。同时又能允许组织体液大分子通过的功能。(3)膜材必须具有保持所设计的骨再生空间(几何尺寸和体积)的能力。即膜必须具有一定硬度，保持一定的形状，防止周围软组织压力导致塌陷。(4)材料和组织具有一定结合功能，或组织能够长入，保持创口稳定和抑制牙龈上皮迁移。(5)良好的操作性能，良好的成型性，易于修剪和固定，必要时易于取出。
目前还没有一种膜材料完全满足上述需求，临床上应用的以及实验研究性的组织引导再生膜主要分为不可吸收性膜和可吸收性膜两类。
不可吸收性膜材料在整个过程中，可以保持其结构的完整性和内在性质，使整个过程易于控制，减少了膜性质不稳定的不可控因素，但必须二次手术取出。不可吸收膜多为惰性聚四氟乙烯(PTFE或e-PTFE)，其典型代表是Core-Tex(WL.Core 82Associates，InC.Hagstaff.AZ.)。它由两部分结构所组成：①外围是厚约1mm的“项圈”，致密度较低，孔隙率为90％，孔隙大小100-300μm，有利于结缔组织长入，保持膜的稳定性，同时也阻止上皮迁移。②中间为物理屏障部分，厚仅0.15mm，较致密，空隙率为30％，空隙大小小于8μm。Core-Tex有不同大小和形状的制品供临床选择。Core-Tex e-PTFE是用钛加强的改进型，钛加强支架置于两层膜之间，既保持了较理想的表面性质，又增加了刚性，有利于保持缺损空间。PTFE常作为评价其它膜引导材料的金标准。另外，钛膜也是一种应用较广的不可吸收性膜引导再生材料。
可吸收性组织引导再生膜材料，由于不需要第二次手术取出备受青睐。目前可吸收性膜屏障材料可分为天然可吸收性屏障和人工合成可吸收屏障。天然材料：①胶原膜：代表有：Bio-Gide membrane(Ed.Geistlich.Sohne.AG.Wolhusen，Switzerland)，其有两层结构，主要由Ⅰ型和Ⅱ型胶原构成。保持屏障功能可达24周。BioMend Extend胶原膜(Integra Life ScienceCorp.for SuLzerCalcitek Inc.Carlsbad CA)来源于中深部肌腱，是纯Ⅰ型胶原，在4-8周内完全吸收。②骨基质：层状骨的脱矿冻干骨片Lambone(Pacific Coast TISSUSE Bank,LosAngeles CA)厚度为20-100μ或100-300μm。③硫酸钙：制品有Capset(Liyecone Biomaterial，Chaska，MN)，用于覆盖于其它骨移植材料表面，4周后吸收。④其它：牛的心包膜等。合成材料：合成可吸收的膜材料主要是聚α-羟基羧酸，如聚乳酸、聚羧基乙酸以及它们的共聚物。主要制品有：①Polygiomesh膜(Vicryl，Ethicon，Inc,somerville,NJ)为聚羟基乙酸和聚乳酸的共聚物。植入后6周有轻微吸收，在60-90天后仍保持完整。②Core Resolute XT膜(W L CoreAssociates)由聚羟基乙酸，聚乳酸，三甲基碳酸乙烯组成，可保持8-10周的屏障作用。③Core sosseoguest膜(WL，Core&Associates)组成同上，可提供6个月的功能屏障作用，在12-14月后明显吸收，用于较大的骨缺损修复部位。因为膜的强度不够，在应用可吸收性膜时，推荐使用支撑材料来维持体积，防止膜塌陷。
膜引导组织再生材料的发展方向：可降解吸收膜材料代表了引导骨组织再生技术的发展方向，在GBR促进骨组织再生的理论上，除强调机械屏障的同时，更加重视生物化学的刺激作用。(1)提高膜的生物活性。目前可降解性膜材料活性有限。有研究显示合成的可吸收性GBR膜只能修复缺损<5mm的下颌骨，缺损<10mm的长骨。人工合成材料聚乳酸在降解中产生酸性产物，可以导致炎症发生；(2)提高膜的硬度和机械强度。目前胶原膜机械强度不足，常常引起塌陷，对骨缺损的空间维持不足；(4)进行膜的抗菌性能改性，防止膜暴露等导致细菌感染。
发明内容
针对目前临床上应用的骨组织引导再生胶原膜所存在机械性能较差不能维持骨缺损空间，没有抗菌性能，骨诱导活性不足的问题，本发明提供一种类骨结构的装载抗菌药物的矿化胶原膜的制作方法：
本发明首先获得脱细胞的牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜；然后在直流电场辅助下，在含有钙磷的琼脂水凝胶中矿化，获得有一定机械强度的矿化胶原膜(“胶原-羟基磷灰石”的类骨结构)；最后将其浸入到一定浓度的米诺环素溶液中，利用米诺环素与羟基磷灰石结合的特性，获得抗菌的类骨结构(“胶原-羟基磷灰石-米诺环素”)的复合膜材料。
具体的技术解决方案如下：
一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜制作方法，包括以下操作步骤：
(1)脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞牛层状骨胶原纤维膜的制备：
1)脱细胞牛心包胶原纤维膜制备方法
A：获取新鲜牛心包膜，选取均匀前壁，去除脂肪组织，用PBS缓冲液清洗3遍后，置于液氮中保存待用；
B：将修剪一定大小的牛心包膜用PBS缓冲液浸泡，然后置入-20℃冰箱，4h，最后置入37℃水浴箱中30min，再超声处理2min，反复冻融3次；
C：将B步骤处理的心包膜用100ml PBS缓冲液漂洗24h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
D：将C步骤处理的心包膜浸入0.25％TritonX-100的PBS缓冲液中，37℃震荡24h，期间超声处理2min；
E：将D步骤处理的心包膜，PBS缓冲液漂洗48h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
F：将E步骤处理的心包膜，冷冻干燥，获得脱细胞的牛心包胶原纤维膜；
2)脱矿脱细胞牛层状骨胶原纤维膜的制备
G：获得牛新鲜四肢管状骨，去除骨膜和其他软组织，在冷却的条件下锯成一定大小形状，去除明显的骨髓组织，置入液氮中保存备用；
H：将一定大小的骨块，置入200mL的含有0.5M EDTA和0.25％TritonX-100的混合溶液中，上述EDTA溶液的pH值8.0,室温持续搅拌下，脱钙1周，直至骨块变软，大头针可以轻易刺入，溶液每天更换一次；
I：将H处理的脱矿骨片，置入-20℃冰箱冷冻，然后用冰冻组织切片机切成200μm厚的膜片；
J：将I步骤处理的脱矿骨浸入0.25％TritonX-100的PBS缓冲液中，37℃震荡24h，期间超声处理2min；
K：将J步骤处理的脱矿骨，PBS缓冲液漂洗48h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
L：将K步骤处理的脱矿骨，冷冻干燥，获得脱矿脱细胞牛层状骨胶原纤维膜，备矿化用；
(2)脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜的制备：
M：将F步骤获得的脱细胞的牛心包胶原纤维膜，或L步骤脱矿脱细胞的牛层状骨胶原纤维膜，浸入新鲜配制的pH值为11.5的0.2M偏磷酸钠溶液中24h，然后PBS缓冲液漂洗5min×3次，获得磷酸化的胶原膜，备矿化使用；
(3)矿化的脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜制备：
N：将18.46g Na2HPO4和0.5528gNaF置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.26mol/LNa2HPO4+500ppm NaF的复合溶液，溶液pH值为6.5；
O：将9.5565g CaCl2·2H2O置于500ml的去离子水中，配置浓度为0.13mol/L，溶液pH值为6.5；
P：各取1g琼脂粉分别置于N步骤、O步骤的100ml的Na2HPO4和NaF的复合溶液、CaCl2溶液中，煮开，形成琼脂浓度为1％的Na2HPO4琼脂凝胶、CaCl2琼脂凝胶；
Q：将P步骤凝胶熔融按照从电源的正极到负极的连接方向，依次在聚乙烯塑料圆管中装载浓度为0.13mol/L CaCl2琼脂凝胶——M步骤获得的磷酸化胶原膜——0.26mol/LNa2HPO4琼脂凝胶，装载凝胶的聚乙烯塑料圆管两端分别连接0.9％的生理盐水塑料池，将上述凝胶电泳装置连接上电泳仪，电泳仪的电压设置为50V，电流为20mA，每两个小时更换一次凝胶装置，更换凝胶装置时，取出胶原纤维膜，超声清洗5min；总共12次，完成矿化；
R：将Q步骤处理的胶原纤维膜冷冻干燥，获得矿化的胶原纤维膜；
(4)矿化的脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜装载米诺环素抗菌剂制备：
S：将R步骤获得矿化胶原纤维膜浸入50mL的1mg/mL米诺环素溶液，室温下保持24h，取出膜材料，置入500mL的PBS缓冲溶液中，漂洗30min×3次；
T：将S步骤获得膜材料冷冻干燥，然后密封包装，γ-射线消毒备用，获得抗菌类骨结构的矿化胶原纤维膜。
本发明的有益技术效果体现在以下几个方面：
1.本发明获得的脱细胞牛心包胶原纤维膜和脱细胞脱钙牛层状骨胶原纤维膜，具有天然自组装结构，可以起到生物屏障功能；
2.使用本发明技术，可使胶原纤维矿化，形成胶原内磷灰石和胶原外磷灰石，从而具有矿化的骨基质结构，因而具有更好的生物活性，具有更强的骨再生能力(图-2)；
3.本发明获得的矿化胶原纤维膜机械强度加强，特别是硬度极大提高，克服了目前使用的胶原膜易塌陷的缺陷，从而特别有利于骨修复空间的获得；
4.本发明获得的矿化胶原纤维膜机械强度加强，且有一定硬度，成型操作方便；
5.本发明获得的矿化胶原纤维膜装载了米诺环素抗菌剂，赋予了其具有缓释米诺环素的功能，从而具有优良的抗菌性能。并且米诺环素还可以抑制骨的吸收；
6.本发明的制备方法操作简单，控制性好，生产环境友好(室温条件，无污染)。
附图说明
图1本发明牛心包脱细胞胶原纤维膜的扫描电子显微镜照片
图2本发明脱矿脱细胞的牛层状骨胶原纤维膜的扫描电子显微镜照片
图3本发明设计的直流电场辅助凝胶基质矿化胶原膜装置示意图
图4本发明脱细胞牛心包胶原纤维膜在本发明设计的直流电场辅助凝胶基质矿化6个循环后的胶原膜表面扫描电镜观察，可见将胶原的矿化。X光衍射图谱(XRD)证明为羟基磷灰石晶体。
图5本发明脱细胞牛心包胶原纤维膜在本发明设计的直流电场辅助凝胶基质矿化12个循环后的胶原膜表面做扫描电镜观察，见沉积的羟基磷灰石晶体完全包绕覆盖胶原纤维形成类骨结构。
图6为本发明脱细胞牛心包胶原纤维膜在本发明设计的直流电场辅助凝胶基质矿化6个循环后的胶原膜内部断面的扫描电镜观察，可见胶原纤维的矿化。
图7本发明获得的装载米诺环素的类骨结构的脱细胞牛心包胶原纤维膜体外释放米诺环素情况。显示缓释米诺环素的特征(上面曲线)。1～3d有一个爆发释放现象，释放药物浓度较高为；在3～5d之间，又有一个小突释现象。第5d以后还有少量的释放，在这之后米诺环素的释放浓度逐渐降低，释放量基本保持稳定。从第7d开始到第14d，溶液中的米诺环素释放维持在一个相同水平。
图8显示装载米诺环素的矿化脱细胞牛心包胶原纤维膜的浸提液在1d(左图)，14d(右图)都显示较强的对口腔菌群牙龈卟啉单胞菌的抑制作用(有明显抑菌环)。
图9对照组显示没有装载米诺环素的矿化脱细胞牛心包胶原纤维膜的浸提液在1d(左图)，14d(右图)对口腔菌群牙龈卟啉单胞菌的无抑制作用(无明显抑菌环)
下面通过实施例对本发明作进一步地描述。
实施例1：具有矿化类骨结构的脱细胞牛心包胶原纤维组织再生引导膜制备
A：获取新鲜牛心包膜，选取均匀前壁，去除脂肪组织，用PBS缓冲液清洗3遍后，置于液氮中保存待用；
B：将修剪一定大小的牛心包膜用PBS缓冲液浸泡，然后置入-20℃冰箱4h，最后置入37℃水浴箱中30min，再超声处理2min，反复冻融3次；
C：将B步骤处理的心包膜用100ml PBS缓冲液漂洗24h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
D：将C步骤处理的心包膜浸入0.25％TritonX-100的PBS缓冲液中，37℃震荡24h，期间超声处理2min；
E：将D步骤处理的心包膜，PBS缓冲液漂洗48h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行，获得脱细胞牛心包胶原纤维膜；
F：将E步骤获得的脱细胞的牛心包胶原纤维膜，浸入新鲜配制的pH值为11.5的0.2M偏磷酸钠溶液中24h，然后PBS缓冲液漂洗5min×3次，获得磷酸化的胶原膜；
G：将18.46g Na2HPO4和0.5528gNaF置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.26mol/LNa2HPO4+500ppm NaF的复合溶液，溶液pH值为6.5；
H：将9.5565g CaCl2·2H2O置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.13mol/L，pH值为6.5的溶液；
I：各取1g的琼脂粉分别置于G步骤、H步骤的100ml的Na2HPO4和NaF的复合溶液、CaCl2溶液中，煮开，形成琼脂浓度为1％的Na2HPO4琼脂凝胶、CaCl2琼脂凝胶；
J：将I步骤凝胶熔融按照从电源的正极到负极的连接方向，依次在聚乙烯塑料圆管中装载浓度为0.13mol/L CaCl2琼脂凝胶——F步骤获得的磷酸化胶原膜——0.26mol/L Na2HPO4琼脂凝胶。装载凝胶的聚乙烯塑料圆管两端分别连接0.9％的生理盐水塑料池。将上述凝胶电泳装置连接上电泳仪，电泳仪的电压设置为50V，电流为20mA。每两个小时更换一次凝胶装置，更换凝胶装置时，取出胶原纤维膜，超声清洗5min。总共12次，完成矿化；
K：将J步骤处理的胶原纤维膜，冷冻干燥，获得矿化的胶原纤维膜。γ-射线消毒备用。
实施例2：具有抗菌矿化类骨结构的脱细胞牛心包胶原纤维组织再生引导膜制备
A：获取新鲜牛心包膜，选取均匀前壁，去除脂肪组织，用PBS缓冲液清洗3遍后，置于液氮中保存待用；
B：将修剪一定大小的牛心包膜用PBS缓冲液浸泡，然后置入-20℃冰箱4h，最后置入37℃水浴箱中30min，再超声处理2min，反复冻融3次；
C：将B步骤处理的心包膜用100ml PBS缓冲液漂洗24h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
D：将C步骤处理的心包膜浸入0.25％TritonX-100的PBS缓冲液中，37℃震荡24h，期间超声处理2min；
E：将D步骤处理的心包膜，PBS缓冲液漂洗48h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行，获得脱细胞牛心包胶原纤维膜；
F：将E步骤获得的脱细胞的牛心包胶原纤维膜，浸入新鲜配制的pH值为11.5的0.2M偏磷酸钠溶液中24h，然后PBS缓冲液漂洗5min×3次，获得磷酸化的胶原膜；
G：将18.46g Na2HPO4和0.5528gNaF置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.26mol/LNa2HPO4+500ppm NaF的复合溶液，溶液pH值为6.5；
H：将9.5565g CaCl2·2H2O置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.13mol/L，pH值为6.5的溶液；
I：各取1g的琼脂粉分别置于G步骤、H步骤的100ml的Na2HPO4和NaF的复合溶液、CaCl2溶液中，煮开，形成琼脂浓度为1％的Na2HPO4琼脂凝胶、CaCl2琼脂凝胶；
J：将I步骤获得的凝胶熔融按照从电源的正极到负极的连接方向，依次在聚乙烯塑料圆管中装载浓度为0.13mol/L CaCl2琼脂凝胶——F步骤获得的磷酸化胶原膜——0.26mol/LNa2HPO4琼脂凝胶。装载凝胶的聚乙烯塑料圆管两端分别连接0.9％的生理盐水塑料池。将上述凝胶电泳装置连接上电泳仪，电泳仪的电压设置为50V，电流为20mA。每两个小时更换一次凝胶装置，更换凝胶装置时，取出胶原纤维膜，超声清洗5min。总共12次，完成矿化；
K：将J步骤获得矿化胶原纤维膜浸入50mL的1mg/mL米诺环素溶液，室温下保持24h，取出膜材料，置入500mL的PBS缓冲溶液中漂洗30min×3次；
L：将K步骤获得膜材料，冷冻干燥，然后密封包装，γ-射线消毒备用，获得抗菌类骨结构的矿化胶原纤维膜。
实施例3：具有矿化类骨结构的脱细胞脱矿牛层状骨胶原纤维组织再生引导膜制备
A：获得牛新鲜四肢管状骨，去除骨膜和其他软组织，在冷却条件下锯成一定大小形状，去除明显骨髓组织，置入液氮中保存备用；
B：将一定大小的骨块置入200mL的含有0.5M EDTA和0.25％TritonX-100的混合溶液中，上述EDTA溶液的pH值8.0,室温持续搅拌下，脱钙1周，直至骨块变软，大头针可以轻易刺入。溶液每天更换一次；
C：将B处理的脱矿骨片，置入-20℃冰箱冷冻，然后用冰冻组织切片机切成200μm厚的膜片；
D：将C步骤处理的脱矿骨浸入0.25％TritonX-100的PBS缓冲液中，37℃震荡24h，期间超声处理2min；
E：将D步骤处理的脱矿骨，PBS缓冲液漂洗48h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
F：将E步骤处理的脱矿骨胶原纤维膜，浸入新鲜配制的pH值为11.5的0.2M偏磷酸钠溶液中24h，然后PBS缓冲液漂洗5min×3次；
G：将F步骤处理的脱矿骨，冷冻干燥，获得磷酸化的脱矿脱细胞的牛层状骨胶原纤维膜，备矿化用；
H：将18.46g Na2HPO4和0.5528gNaF置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.26mol/LNa2HPO4+500ppm NaF的复合溶液，溶液pH值为6.5；
I：将9.5565g CaCl2·2H2O置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.13mol/L，pH值为6.5的溶液；
J：各取1g的琼脂粉分别置于上述H步骤、I步骤的100ml的Na2HPO4和NaF的复合溶液、CaCl2溶液中，煮开，形成琼脂浓度为1％的Na2HPO4琼脂凝胶、CaCl2琼脂凝胶；
K：将J步骤凝胶熔融按照从电源的正极到负极的连接方向，依次在聚乙烯塑料圆管中装载浓度为0.13mol/L CaCl2琼脂凝胶——G步骤获得的磷酸化胶原膜——0.26mol/L Na2HPO4琼脂凝胶。装载凝胶的聚乙烯塑料圆管两端分别连接0.9％的生理盐水塑料池。将上述凝胶电泳装置连接上电泳仪，电泳仪的电压设置为50V，电流为20mA。每两个小时更换一次凝胶装置，更换凝胶装置时，取出胶原纤维膜，超声清洗5min。总共6次，完成矿化；
L：将K步骤处理的胶原纤维膜，冷冻干燥，获得矿化的胶原纤维膜。γ-射线消毒备用。
实施例4：具有抗菌矿化类骨结构的脱细胞脱矿牛层状骨胶原纤维组织再生引导膜制备
A：获得牛新鲜四肢管状骨，去除骨膜和其他软组织，在冷却条件下锯成一定大小形状，去除明显骨髓组织，置入液氮中保存备用；
B：将一定大小的骨块置入200mL的含有0.5M EDTA和0.25％TritonX-100的混合溶液中，上述EDTA溶液的pH值8.0,室温持续搅拌下，脱钙1周，直至骨块变软，大头针可以轻易刺入。溶液每天更换一次；
C：将B处理的脱矿骨片，置入-20℃冰箱冷冻，然后用冰冻组织切片机切成200μm厚的膜片；
D：将C步骤处理的脱矿骨浸入0.25％TritonX-100的PBS缓冲液中，37℃震荡24h，期间超声处理2min；
E：将D步骤处理的脱矿骨，PBS缓冲液漂洗48h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
F：将E步骤处理的脱矿骨胶原纤维膜，浸入新鲜配制的pH值为11.5的0.2M偏磷酸钠溶液中24h，然后PBS缓冲液漂洗5min×3次；
G：将F步骤处理的脱矿骨，冷冻干燥，获得磷酸化的脱矿脱细胞的牛层状骨胶原纤维膜，备矿化用；
H：将18.46g Na2HPO4和0.5528gNaF置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.26mol/LNa2HPO4+500ppm NaF的复合溶液,溶液的pH值为6.5；
I：将9.5565g CaCl2·2H2O置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.13mol/L，pH值为6.5的溶液；
J：各取1g的琼脂粉分别置于H步骤、I步骤100ml的Na2HPO4和NaF的复合溶液、CaCl2溶液中，煮开，形成琼脂浓度为1％的Na2HPO4琼脂凝胶、CaCl2琼脂凝胶；
K：将J步骤凝胶熔融按照从电源的正极到负极的连接方向，依次在聚乙烯塑料圆管中装载浓度为0.13mol/L CaCl2琼脂凝胶——G步骤获得的磷酸化胶原膜——0.26mol/LNa2HPO4琼脂凝胶。装载凝胶的聚乙烯塑料圆管两端分别连接0.9％的生理盐水塑料池。将上述凝胶电泳装置连接上电泳仪，电泳仪的电压设置为50V，电流为20mA。每两个小时更换一次凝胶装置，更换凝胶装置时，取出胶原纤维膜，超声清洗5min。总共6次，完成矿化；
L：将K步骤获得矿化胶原纤维膜浸入50mL的1mg/mL米诺环素溶液，室温下保持24h，取出膜材料，置入500mL的PBS缓冲溶液中漂洗30min×3次；
M：将L步骤获得膜材料，冷冻干燥，然后密封包装，γ-射线消毒备用，获得抗菌类骨结构的矿化胶原纤维膜。
Claims (1)
1.一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜制作方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞牛层状骨胶原纤维膜的制备：
1)脱细胞牛心包胶原纤维膜制备方法
A：获取新鲜牛心包膜，选取均匀前壁，去除脂肪组织，用PBS缓冲液清洗3遍后，置于液氮中保存待用；
B：将修剪一定大小的牛心包膜用PBS缓冲液浸泡，然后置入-20℃冰箱，4h，最后置入37℃水浴箱中30min，再超声处理2min，反复冻融3次；
C：将B步骤处理的心包膜用100ml PBS缓冲液漂洗24h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
D：将C步骤处理的心包膜浸入0.25％TritonX-100的PBS缓冲液中，37℃震荡24h，期间超声处理2min；
E：将D步骤处理的心包膜，PBS缓冲液漂洗48h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
F：将E步骤处理的心包膜，冷冻干燥，获得脱细胞的牛心包胶原纤维膜；
2)脱矿脱细胞牛层状骨胶原纤维膜的制备
G：获得牛新鲜四肢管状骨，去除骨膜和其他软组织，在冷却的条件下锯成一定大小形状，去除明显的骨髓组织，置入液氮中保存备用；
H：将一定大小的骨块，置入200mL的含有0.5M EDTA和0.25％TritonX-100的混合溶液中，上述EDTA溶液的pH值为8.0，室温持续搅拌下，脱钙1周，直至骨块变软，大头针可以轻易刺入，溶液每天更换一次；
I：将H处理的脱矿骨片，置入-20℃冰箱冷冻，然后用冰冻组织切片机切成200μm厚的膜片；
J：将I步骤处理的脱矿骨浸入0.25％TritonX-100的PBS缓冲液中，37℃震荡24h，期间超声处理2min；
K：将J步骤处理的脱矿骨，PBS缓冲液漂洗48h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；
L：将K步骤处理的脱矿骨，冷冻干燥，获得脱矿脱细胞牛层状骨胶原纤维膜，备矿化用；
(2)脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜的制备：
M：将F步骤获得的脱细胞的牛心包胶原纤维膜，或L步骤脱矿脱细胞的牛层状骨胶原纤维膜，浸入新鲜配制的pH值为11.5的0.2M偏磷酸钠溶液中24h，然后PBS缓冲液漂洗5min×3次，获得磷酸化的胶原膜，备矿化使用；
(3)矿化的脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜制备：
N：将18.46g Na2HPO4和0.5528gNaF置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.26mol/LNa2HPO4+500ppmNaF的复合溶液，溶液pH值为6.5；
O：将9.5565g CaCl2·2H2O置于500ml的去离子水中，配置浓度为0.13mol/L，溶液pH值为6.5；
P：各取1g琼脂粉分别置于N步骤、O步骤的100ml的Na2HPO4和NaF的复合溶液、CaCl2溶液中，煮开，形成琼脂浓度为1％的Na2HPO4琼脂凝胶、CaCl2琼脂凝胶；
Q：将P步骤凝胶熔融按照从电源的正极到负极的连接方向，依次在聚乙烯塑料圆管中装载浓度为0.13mol/L CaCl2琼脂凝胶——M步骤获得的磷酸化胶原膜——0.26mol/LNa2HPO4琼脂凝胶，装载凝胶的聚乙烯塑料圆管两端分别连接0.9％的生理盐水塑料池，将上述凝胶电泳装置连接上电泳仪，电泳仪的电压设置为50V，电流为20mA，每两个小时更换一次凝胶装置，更换凝胶装置时，取出胶原纤维膜，超声清洗5min；总共12次，完成矿化；
R：将Q步骤处理的胶原纤维膜冷冻干燥，获得矿化的胶原纤维膜；
(4)矿化的脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜装载米诺环素抗菌剂制备：
S：将R步骤获得矿化胶原纤维膜浸入50mL的1mg/mL米诺环素溶液，室温下保持24h，取出膜材料，置入500mL的PBS缓冲溶液中，漂洗30min×3次；
T：将S步骤获得膜材料冷冻干燥，然后密封包装，γ-射线消毒备用，获得抗菌类骨结构的矿化胶原纤维膜。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410671874.XA CN104436318B (zh) | 2014-11-21 | 2014-11-21 | 一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410671874.XA CN104436318B (zh) | 2014-11-21 | 2014-11-21 | 一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104436318A CN104436318A (zh) | 2015-03-25 |
| CN104436318B true CN104436318B (zh) | 2016-08-17 |
Family
ID=52883568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410671874.XA Active CN104436318B (zh) | 2014-11-21 | 2014-11-21 | 一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104436318B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108355171B (zh) * | 2018-04-09 | 2021-05-14 | 青岛海洋生物医药研究院 | 脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料及其制备方法和应用 |
| CN108635623A (zh) * | 2018-08-07 | 2018-10-12 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质 |
| CN110227182B (zh) * | 2019-01-17 | 2020-12-15 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 一种梯度矿化骨细胞外基质材料的制备方法 |
| CN114425104B (zh) * | 2021-12-21 | 2023-03-03 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种载药骨引导/诱导复合结构及其制备方法和应用 |
| CN115852590B (zh) * | 2022-09-28 | 2023-10-10 | 青岛德冠超导材料制造有限公司 | 天然抗菌防静电纳米纤维膜及其制备方法和用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102172334A (zh) * | 2011-03-18 | 2011-09-07 | 南京医科大学 | 体外诱导牙本质再矿化的方法 |
| CN102225217A (zh) * | 2011-06-23 | 2011-10-26 | 天津世纪康泰生物医学工程有限公司 | 脱细胞干燥活性羊膜的制备方法 |
| CN103961752A (zh) * | 2013-02-02 | 2014-08-06 | 深圳兰度生物材料有限公司 | 组织再生引导膜及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080026198A (ko) * | 2005-06-30 | 2008-03-24 | 안트로제네시스 코포레이션 | 태반 유도된 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막의 복원 |
-
2014
- 2014-11-21 CN CN201410671874.XA patent/CN104436318B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102172334A (zh) * | 2011-03-18 | 2011-09-07 | 南京医科大学 | 体外诱导牙本质再矿化的方法 |
| CN102225217A (zh) * | 2011-06-23 | 2011-10-26 | 天津世纪康泰生物医学工程有限公司 | 脱细胞干燥活性羊膜的制备方法 |
| CN103961752A (zh) * | 2013-02-02 | 2014-08-06 | 深圳兰度生物材料有限公司 | 组织再生引导膜及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "新型骨组织引导再生膜的研制";张玉媛等;《中华口腔医学会口腔材料专业委员会第九次全国口腔材料学术交流会论文集》;20141010;第122页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104436318A (zh) | 2015-03-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104436318B (zh) | 一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法 | |
| CN102302804B (zh) | 羟基磷灰石基生物复合支架及组织工程骨 | |
| CN101564553B (zh) | 人源化活性煅烧骨的制备方法 | |
| CN103028145B (zh) | 一种丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架及其制备与应用 | |
| CN101474430A (zh) | 一种生物活性组织再生膜及其制备方法 | |
| CN106362216B (zh) | 一种钙镁硅酸盐多孔陶瓷球义眼座及其制备方法 | |
| CN101274108B (zh) | 一种复合多孔支架及其制备方法 | |
| CN103341206B (zh) | 磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石三级仿生骨组织工程支架及其制备方法 | |
| CN109954167A (zh) | 一种骨修复材料及其应用 | |
| CN105251050B (zh) | 一种磷酸钙‑丝素蛋白‑氧化锌复合涂层的制备方法 | |
| CN106310368B (zh) | 用于肋骨结构特征缺损的修复材料及制备方法和制造模具 | |
| CN102764450B (zh) | 墨鱼骨转化系列多孔复相生物陶瓷及其制备方法、应用 | |
| CN101176798B (zh) | 一种硫酸钙与冻干骨复合多孔支架及其制备方法 | |
| CN109529119A (zh) | 一种生物型骨修复材料及其制备方法 | |
| CN104548206A (zh) | 一种骨修复材料 | |
| CN104587529A (zh) | 一种牙槽骨修复材料的制备方法 | |
| CN114601971A (zh) | 一种诱导骨再生的天然复合骨填充材料及其制备方法和用途 | |
| CN101954122A (zh) | 具有预塑性天然骨修复材料的制备方法 | |
| EP3111967A1 (en) | High strength synthetic bone for bone replacement for increasing compressive strength and facilitating blood circulation, and manufacturing method therefor | |
| CN104307047B (zh) | 一种双梯度仿生修复支架及其制备方法 | |
| CN109371443A (zh) | 一种电解质溶液的制备方法和钛植入物表面镁/二氧化钛微孔陶瓷涂层及其制备方法 | |
| CN108283732A (zh) | 一种用于牙槽骨骨增量的植骨复合材料 | |
| ES2922210T3 (es) | Sustitución osteotrópica de hueso | |
| CN115212348B (zh) | 一种peek基复合植入体及其制备方法和应用 | |
| CN115006607B (zh) | 一种修复膜及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |