CN109529119A - 一种生物型骨修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物型骨修复材料及其制备方法，特别是一种异种脱细胞骨修复材料及其制备方法、应用。该制备方法包括：(1)取哺乳动物的松质骨，粉碎成颗粒，冲洗至无可见骨髓，干燥；(2)将步骤(1)所得骨修复材料置于双氧水中浸泡，冲洗，干燥；(3)将步骤(2)所得骨修复材料置于氢氧化钠溶液中浸泡，冲洗，干燥；(4)将步骤(3)所得骨修复材料置于乙醇、丙酮的混合溶液中浸泡，冲洗，干燥，获得异种脱细胞骨修复材料。该工艺制备的异种脱细胞骨修复材料的抗压强度、弹性模量与人体松质骨的抗压强度、弹性模量一致，非常适合用于人体骨缺损修复。

Description

一种生物型骨修复材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物修复技术领域，涉及一种生物型骨修复材料及其制备方法，特别是涉及异种脱细胞骨修复材料及其制备方法、应用。
背景技术
近年来，生物合成材料在骨缺损修复中的应用成为研究的热点，随着分子生物学的深入研究，目前达成的共识就是骨缺损修复是一个组织学漫长过程并且伴随着极其复杂而又精确地的生物学调节。简单地说就是爬行替代理论，该理论认为：当骨替代生物修复材料填入待修复的骨缺损区时，先是被血液浸满，而后在血凝块所营造的环境下，填充的骨替代材料的骨引导性即为宿主骨修复骨缺损区时提供支架作用，而后其具有的骨诱导性使成骨细胞沿其表面爬行生长，诱导新骨形成，同时在新骨形成的过程中骨替代修复材料逐渐被溶解吸收，最后完全被宿主骨取代，整个过程，骨修复材料充当了一个牺牲自我而又不求回报的过渡角色。
骨修复材料琳琅满目，如煅石膏、羟基磷灰石、人骨形成蛋白复合物(bonemorphogenetic protein，BMP)、自体骨、异体骨等。而这些骨修复材料各有一定的长处与不足。煅石膏价格便宜，但成骨速度缓慢；羟基磷灰石不容易被机体溶解吸收，缺乏骨诱导性，只为新骨长入提供支架作用，且成骨速度较慢；人骨形成蛋白复合物的骨修复效果可与自体骨移植相媲美，但目前BMP低产高价，且容易被宿主溶解吸收，难以起到骨引导作用，临床应用受限；自体骨因其具有良好的骨引导、诱导性、组织生物相容性、修复速度快、无免疫原性、被认为是骨缺损修复材料的“经典模范”而得到较为广泛地认可应用，但是，它需要身体的其它部位作为供区，对供区部位造成额外创伤，增加病人的痛苦和潜在感染几率，同时可供使用的骨量有限，在临床实践中的应用受到限制。
目前来说，随着社会和科技的不断进步，材料学的研究和发展更是得到很大突破，同时具有高效的骨传导性、骨诱导性的骨修复材料在临床修复骨组织缺损中应用前景广泛。
异种骨修复材料的制备关键是脱除脂肪、蛋白质等易引起抗原性的有机物。目前，传统的异种骨修复材料的脱脂、脱蛋白主要采用化学浸泡处理、高温煅烧的方法。高温煅烧是指在高温条件下(＞600℃)对异种骨进行煅烧去除有机物，高温煅烧会破坏异种骨修复材料的弱结晶结构，且骨中的碳酸盐也会分解，使异种骨修复材料失去生物活性。化学浸泡处理通常使用乙二胺、丙酮、氯仿、甲醇、乙醚等有毒溶剂。大量使用有毒溶剂会造成较大的环境压力。此外，由于异种骨修复材料呈多孔结构，有毒溶剂很难通过清洗处理干净，会导致有毒化学试剂残留，破坏异种骨的生物活性。化学浸泡处理方法中氢氧化钠和双氧水联合处理法也常被使用，但其只能部分消除异种骨的抗原性，且随着浸泡时间的延长，处理后的材料毒性增加。例如：现有技术公开了一种异种脱蛋白骨支架材料及其制备方法，该技术方案包括：将异种骨置于双氧水中浸泡24小时；依次在叠氮钠溶液、1N氢氧化钠溶液、5％胰蛋白酶和20％双氧水中各浸泡12 小时；然后依次用1:1甲醇/氯仿混合物、无水乙醚、乙二胺和无水乙醇各浸泡 24、12、24、24小时。虽然采用上述传统的制备工艺确实能够制备出异种骨修复材料，但是，这些异种骨修复材料的机械性能与人体骨存在差别较大。
因此，亟待提供一种生物相容性好，与人体骨机械性能一致的骨修复材料。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一种生物型骨修复材料及其制备方法。该制备方法所得骨修复材料的抗压强度、弹性模量均与人体骨的抗压强度、弹性模量一致。另外，该制备方法所得骨修复材料的毒性小、与人体组织的生物相容性好、安全性高。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种异种脱细胞骨修复材料的制备方法，所述的制备方法包括：
(1)取哺乳动物的松质骨，粉碎成颗粒，冲洗至无可见骨髓，干燥；
(2)将步骤(1)所得骨修复材料置于双氧水中浸泡，冲洗，干燥；
(3)将步骤(2)所得骨修复材料置于氢氧化钠溶液中浸泡，冲洗，干燥；
(4)将步骤(3)所得骨修复材料置于乙醇、丙酮的混合溶液中浸泡，冲洗，干燥，获得异种脱细胞骨修复材料。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述双氧水的质量浓度为30％～65％，所述双氧水的温度为3℃～8℃，在所述双氧水中的浸泡时间为12h～24h；
步骤(2)中，所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.5M～4M，所述的氢氧化钠溶液的温度为5℃～70℃，在所述氢氧化钠溶液中浸泡的时间为12h～48h；
步骤(3)中，所述的乙醇、丙酮的混合溶液中乙醇、丙酮的体积比为1： (0.5～1.5)，所述混合溶液的温度为20℃～25℃，在所述混合溶液中浸泡的时间为3h～7h。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述双氧水的质量浓度为35％～45％，所述双氧水的温度为4℃～5℃，在所述双氧水中的浸泡时间为18h～20h；
步骤(2)中，所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.6M～1M，所述的氢氧化钠溶液的温度为40℃～50℃，在所述氢氧化钠溶液中浸泡的时间为20h～35h；
步骤(3)中，所述的乙醇、丙酮的混合溶液中乙醇、丙酮的体积比为1： (0.8～1)，所述混合溶液的温度为20℃～25℃，在所述混合溶液中浸泡的时间为4.5h～6h。
在其中一些实施例中，步骤(4)中，所述骨修复材料与所述乙醇、丙酮的混合溶液的体积比为1：(20～80)。
在其中一些实施例中，所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4) 中，所述的冲洗采用蒸馏水。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述的哺乳动物为牛。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述的颗粒的直径为0.1mm～5mm。
在其中一些实施例中，步骤(4)中，所述异种脱细胞骨修复材料采用钴60 辐射的方式进行灭菌。
本发明的另一目的是提供一种异种脱细胞骨修复材料，由上述的制备方法获得。
本发明的再一目的是提供一种上述的异种脱细胞骨修复材料作为修复材料在骨缺损修复中的应用。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明挑选哺乳动物的松质骨作为骨修复材料制备原料，通过将其依次置于双氧水、氢氧化钠溶液以及乙醇、丙酮的混合溶液中浸泡的方式制备异种脱细胞骨修复材料。该工艺制备的异种脱细胞骨修复材料的抗压强度、弹性模量与人体松质骨的抗压强度、弹性模量一致，非常适合用于人体骨缺损修复。并且，该工艺制备的异种脱细胞骨修复材料还具备：精细的骨小梁结构和内部空隙被保存下来，保留胶原结构，与人体骨组织结构非常相似，为成骨细胞的长入提供了支架，并保证了凝血块的稳定和血管的再生；复杂的内表面增强了宿主骨向移植材料内部的穿透能力，允许成骨细胞和间充质细胞与新植入材料充分接触，易于形成新骨沉积；在不进行交联工艺的情况下也能实现很好的生物修复性能，化学残留少，毒性小，生物安全性高；天然的、无抗原性，具有骨引导作用的移植材料，因此成为代替自体骨修复骨缺损理想的材料。
附图说明
图1为实施例提供的异种脱细胞骨修复材料用于骨缺损修复1个月、3个月的效果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例提供一种异种脱细胞骨修复材料及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：
(1)将牛的松质骨切成5mm颗粒状，用高压水枪反复冲洗，直到骨组织色泽白色偏黄，无可见骨髓组织为止，在干燥箱中干燥12小时。
(2)将经步骤(1)处理干燥后的松质骨用质量分数为65％的双氧水，在 8℃环境下浸泡24小时，浸泡后的松质骨用去离子水反复清洗，在干燥箱中干燥8小时。
(3)将步骤(2)干燥后的松质骨用浓度为0.6M氢氧化钠，在5℃环境下浸泡12小时，浸泡后的松质骨用蒸馏水反复清洗，在干燥箱中干燥8小时。
(4)将步骤(3)干燥后的松质骨和乙醇、丙酮的混合溶液一起置于密闭容器中3小时；松质骨与混合溶液的体积比为1∶20，混合溶液中乙醇与丙酮的体积比为50:25，混合溶液的温度为25℃。
(5)取出在步骤(4)干燥后的松质骨用蒸馏水反复清洗、干燥，重复1～ 4次。
(6)将松质骨用钴60辐射灭菌(辐照剂量20KGy～25KGy)，得到异种脱细胞骨修复材料。
实施例2
本实施例提供一种异种脱细胞骨修复材料及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：
(1)将牛的松质骨切成5mm颗粒状，用高压水枪反复冲洗，直到骨组织色泽白色偏黄，无可见骨髓组织为止，在干燥箱中干燥12小时。
(2)将经步骤(1)处理干燥后的松质骨用质量分数为30％的双氧水，在 3℃环境下浸泡12小时，浸泡后的松质骨用去离子水反复清洗，在干燥箱中干燥8小时。
(3)将步骤(2)干燥后的松质骨用浓度为4M氢氧化钠，在70℃环境下浸泡48小时，浸泡后的松质骨用蒸馏水反复清洗，在干燥箱中干燥8小时。
(4)将步骤(3)干燥后的松质骨和乙醇、丙酮的混合溶液一起置于密闭容器中7h，松质骨与混合溶液的体积比为1∶80，混合溶液中乙醇、丙酮的体积比为50:50，混合溶液的温度为25℃。
(5)取出在步骤(4)干燥后的松质骨用蒸馏水反复清洗、干燥，重复1～ 4次。
(6)将松质骨用钴60辐射灭菌(辐照剂量20KGy～25KGy)，得到异种脱细胞骨修复材料。
实施例3
本实施例提供一种异种脱细胞骨修复材料及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：
(1)将牛的松质骨切成5mm颗粒状，用高压水枪反复冲洗，直到骨组织色泽白色偏黄，无可见骨髓组织为止，在干燥箱中干燥12小时。
(2)将经步骤(1)处理干燥后的松质骨用质量分数为35％的双氧水，在4℃环境下浸泡18h，浸泡后的松质骨用去离子水反复清洗，在干燥箱中干燥8小时。
(3)将步骤(2)干燥后的松质骨用浓度为0.6M氢氧化钠溶液，在40℃环境下浸泡20h，浸泡后的松质骨用蒸馏水反复清洗，在干燥箱中干燥8小时。
(4)将步骤(3)干燥后的松质骨和乙醇、丙酮的混合溶液一起置于密闭容器中4.5h；松质骨与混合溶液的体积比为1∶20，混合溶液中乙醇与丙酮的体积比为1：0.8，混合溶液的温度为25℃。
(5)取出在步骤(4)干燥后的松质骨用蒸馏水反复清洗、干燥，重复1～ 4次。
(6)将松质骨用钴60辐射灭菌(辐照剂量20KGy～25KGy)，得到异种脱细胞骨修复材料。
实施例4
本实施例提供一种异种脱细胞骨修复材料及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：
(1)将牛的松质骨切成5mm颗粒状，用高压水枪反复冲洗，直到骨组织色泽白色偏黄，无可见骨髓组织为止，在干燥箱中干燥12小时。
(2)将经步骤(1)处理干燥后的松质骨用质量分数为45％的双氧水，在5℃环境下浸泡20h小时，浸泡后的松质骨用去离子水反复清洗，在干燥箱中干燥8 小时。
(3)将步骤(2)干燥后的松质骨用浓度为1M氢氧化钠溶液，在50℃环境下浸泡35h小时，浸泡后的松质骨用蒸馏水反复清洗，在干燥箱中干燥8小时。
(4)将步骤(3)干燥后的松质骨和乙醇、丙酮的混合溶液一起置于密闭容器中6h；松质骨与混合溶液的体积比为1∶20，混合溶液中乙醇与丙酮的体积比为1：1，混合溶液的温度为25℃。
(5)取出在步骤(4)干燥后的松质骨用蒸馏水反复清洗、干燥，重复1～ 4次。
(6)将松质骨用钴60辐射灭菌(辐照剂量20KGy～25KGy)，得到异种脱细胞骨修复材料。
对比例1
本对比例是实施例1的对比例，该对比例相对于实施例1的主要差别在于：步骤(4)中，采用体积比为50:25的甲醇、氯仿混合溶液代替体积比为50:25 的乙醇、丙酮混合溶液。
对比例2
本对比例是实施例1的对比例，该对比例相对于实施例1的主要差别在于：
步骤(1)中，所述双氧水的质量浓度为20％，所述双氧水的温度为25℃，在所述双氧水中的浸泡时间为10h；
步骤(2)中，所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.1M，所述的氢氧化钠溶液的温度为3℃，在所述氢氧化钠溶液中浸泡的时间为50h；
步骤(3)中，所述的乙醇、丙酮的混合溶液中乙醇、丙酮的体积比为1：2，温度为20℃，在所述混合溶液中浸泡的时间为2h。
性能测试
一、生物修复性能
对大耳白兔肌注速眠灵合剂进行全身麻醉(0.3mL/kg)，术区脱毛、消毒，按无菌原则实施手术。
颏下正中切口切开皮肤，皮下和骨膜至下颌骨骨面下缘，切口长5.0-6.0cm。于骨膜下钝性剥离，注意保护神经，分离附着在下颌骨体的咬肌。于双侧下颌骨体部下缘各造成1.0×1.0cm的全层骨缺损，用磨削机器将之磨削成骨修复材料，清洗后一侧缺损部全部填实施例1异种脱细胞骨修复材料，对侧(空白对照组)缺损旷置。止血可靠无误，严密缝合骨膜、皮下组织及皮肤，不进行外固定,从创缘打入庆大霉素(白云山制药厂)8万单位，
术毕。1和3个月后，分别截取颌骨修复部位标本，固定、脱钙、包埋、切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察新骨的生长情况。
结果：在1个月的时候，骨修复材料占据大部分的空间，一些成骨细胞包覆在骨修复材料的表面。随着骨修复材料的降解，胶原释放的部分可被重复利用的氨基酸分布于植入骨的周围，在胶原材料表面形成氨基酸库，为骨形成提供充足的营养成分。成骨细胞从周围环境中摄取所需的氨基酸，合成并分泌胶原蛋白及其他有机基质形成类骨质，汇集成胶原纤维作为模板为矿物质的沉淀提供三维纤维网架，在富含Ca、P离子的环境中发生类骨质的钙化，成骨细胞包埋其中成为骨细胞，进而形成骨组织。因此在3个月的时候，观察到大量新生成的骨组织和少量参与的骨修复材料。证明了生物骨在体内通过固有的机理完成无机部分(HA)和有机部分(胶原)的转归，实现植入体内的生物修复骨伴随着新骨的生成最终完全降解，参见图1，且植入后无不良反应，说明实施例 1异种脱细胞骨修复材料组织相容性好，植入动物体内后安全。对实施例2至4 的异种脱细胞骨修复材料在用做上述生物修复过程中也呈现较好效果。
二、机械性能测试
表1
抗压强度(MPa) 弹性模量(GPa)
实施例1 49.5±3.1 1.27±0.4
实施例2 48.6±2.6 1.22±0.3
实施例3 55.8±3.7 1.45±0.4
实施例4 59.1±4.7 1.57±0.5
对比例1 21.0±2.9 0.49±0.1
对比例2 37.8±3.5 0.87±0.2
根据表1可知，实施例的抗压强度、弹性模量整体与人体松质骨的抗压强度、弹性模量一致，非常适合用于人体骨缺损修复。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种异种脱细胞骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
(1)取哺乳动物的松质骨，粉碎成颗粒，冲洗至无可见骨髓，干燥；
(2)将步骤(1)所得骨修复材料置于双氧水中浸泡，冲洗，干燥；
(3)将步骤(2)所得骨修复材料置于氢氧化钠溶液中浸泡，冲洗，干燥；
(4)将步骤(3)所得骨修复材料置于乙醇、丙酮的混合溶液中浸泡，冲洗，干燥，灭菌获得异种脱细胞骨修复材料。
2.根据权利要求1所述的异种脱细胞骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述双氧水的质量浓度为30％～65％，所述双氧水的温度为3℃～8℃，在所述双氧水中的浸泡时间为12h～24h；
步骤(3)中，所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.5M～4M，所述的氢氧化钠溶液的温度为5℃～70℃，在所述氢氧化钠溶液中浸泡的时间为12h～48h；
步骤(4)中，所述的乙醇、丙酮的混合溶液中乙醇、丙酮的体积比为1：(0.5～1.5)，所述混合溶液的温度为20℃～25℃，在所述混合溶液中浸泡的时间为3h～7h。
3.根据权利要求2所述的异种脱细胞骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述双氧水的质量浓度为35％～45％，所述双氧水的温度为4℃～5℃，在所述双氧水中的浸泡时间为18h～20h；
步骤(3)中，所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.6M～1M，所述的氢氧化钠溶液的温度为40℃～50℃，在所述氢氧化钠溶液中浸泡的时间为20h～35h；
步骤(4)中，所述的乙醇、丙酮的混合溶液中乙醇、丙酮的体积比为1：(0.8～1)，所述混合溶液的温度为20℃～25℃，在所述混合溶液中浸泡的时间为4.5h～6h。
4.根据权利要求1至3任一项所述的异种脱细胞骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述骨修复材料与所述乙醇、丙酮的混合溶液的体积比为1：(20～80)。
5.根据权利要求1至3任一项所述的异种脱细胞骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中，所述的冲洗采用蒸馏水。
6.根据权利要求1至3任一项所述的异种脱细胞骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的哺乳动物为牛。
7.根据权利要求1至3任一项所述的异种脱细胞骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的颗粒的直径为0.1mm～5mm。
8.根据权利要求1至3任一项所述的异种脱细胞骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述异种脱细胞骨修复材料采用钴60辐照方式进行灭菌。
9.一种异种脱细胞骨修复材料，其特征在于，由权利要求1至8任一项所述的制备方法获得。
10.权利要求9所述的异种脱细胞骨修复材料在骨缺损修复中的应用。
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