CN105903078A - 一种3d打印制备生物支架的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种3D打印制备生物支架的方法，以同种异体骨或异种骨于冷冻研磨机低温研磨制得打印材料，通过计算机辅助建模3D打印，然后在京尼平溶液中后处理；制得的生物支架具有良好的生物相容性，骨移植材料在体内无毒性、无排斥反应、无诱变性、无抗原性，不干扰骨与组织再生；且制备的生物支架可逐渐降解而被自体骨组织吸收、替代，与正常骨皮质能承受的符合接近（20MPa），具有良好的初始力学性能；且弹性模量逐渐降低，不会产生应力遮挡，避免长期愈合过程中内置物骨折、塌陷及松动，可促进骨融合，最终完全转化为自体骨组织。

Description

一种3D打印制备生物支架的方法
技术领域
本发明涉及生物支架，具体涉及一种3D打印制备可吸收生物支架的方法。
背景技术
对于发生了病变或损伤的骨组织，需使用替代骨材料进行骨修复以促进骨融合。使用自体骨移植是公认的融合率最高的“金标准”。但自体骨材料取材难度高，取材量有限，增加额外创伤，支撑强度不足。因此，探索理想的骨移植替代材料是本领域重要的研究课题。
目前常用的骨移植材料包括同种异体骨、金属材料及聚醚醚酮(PEEK)树脂材料。同种异体骨虽然具有较好的可降解、吸收与替代性，但速率控制困难，导致机械性能不可靠，过快易发生植骨块骨折致椎间隙塌陷，过慢则产生应力遮挡，影响骨融合。金属材料如不锈钢、钛合金、钴-铬-钼合金等，虽然初始稳定性和固定效果满意，但金属材料弹性模量远远大于骨组织，应力遮挡现象显著，长期随访发现Wolff氏现象，影响骨融合；且金属材料腐蚀会引发非细菌性炎症，术后持续疼痛、植入物松动等并发症并不少见。PEEK材料较金属材料优势明显，具有较好的生物相容性，骨接触面未见明显的骨吸收现象，但其弹性模量较骨组织仍然太高，在长期生长中也无法被降解、吸收和替代。因此，寻找一种满足临床需求的骨移植材料，必将为广大患者带来福音。
3D打印是一种以数字模型文件为基础，结合计算机辅助，通过逐层打印各种材料来构造物体的新型增材制造技术。自问世以来，在航空航天、机械制造领域广泛应用，并取得了巨大成功。和传统制作工艺相比，3D打印技术具有快速成型的特点。目前在医疗行业，该技术主要用于外用支具和手术导板制备，在内置物方面研究较少。制约3D打印技术发展的关键是打印材料，而生物支架，尤其是作为骨代替材料的生物支架，作为内置物直接与人体内部器官相接触，需要具有良好生物相容性、可降解、吸收与替代性以及适当递减的机械性能。一旦解决了3D打印生物支架的材料问题，该技术将快速运用到骨科疾病的治疗中。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种3D打印制备生物支架的方法，该方法制备的生物支架具有良好的生物相容性、可降解、吸收与替代性以及适当递减的机械性能。
除特殊说明外，本发明所述百分比均为质量百分比。
本发明的目的是这样实现的：
一种3D打印制备生物支架的方法，包括制备打印材料、3D打印和生物支架后处理步骤，其特征在于：所述制备打印材料为将同种异体骨或异种骨于冷冻研磨机中，液氮环境下撞子粉碎研磨2～4小时，常温干燥后用40～80目分筛得到骨粉体；然后以胶原蛋白凝胶、聚己内酯或者聚乙烯醇水溶液为粘结剂，以重量百分比为40～80wt%骨粉体和20～60wt%的粘结剂混合后球磨制备得到浆料原料；将浆料原料于2～10℃用离心机离心3～5min，转速2000～3000转/min，制得3D打印材料。
根据本发明的一个实施方案，上述生物支架为骨代替材料。
根据本发明的一个实施方案，上述异种骨包括各种异种骨材料，尤其包括小牛骨。
根据本发明的一个实施方案，上述胶原蛋白凝胶、聚己内酯或者聚乙烯醇水溶液的浓度为3～10wt%。
根据本发明的一个实施方案，上述液氮环境温度为-30～-75℃，撞子粉碎时间为2～4小时；上述常温干燥时间为10～60分钟；上述分筛的骨粉体直径为1～200μm。
根据本发明的一个实施方案，上述粘结剂为胶原蛋白凝胶时，可加入3-10wt%的醋酸溶液作为助粘剂，所述醋酸溶液的浓度为5～20% 。
根据本发明的一个实施方案，上述3D打印为采用三维CT或MRI扫描植骨部位，用计算机建模设计植骨支架形态，用上述制备的打印材料打印生物支架。
根据本发明的一个实施方案，上述后处理为将打印好的生物支架于1～5%的京尼平溶液中浸泡4～10分钟，取出后在温度为2～10℃，湿度80～90%的条件下自然晾干20～28小时；然后用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
一种3D打印制备生物支架材料的方法，采用如下步骤：
（1）将同种异体骨或异种骨放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮，于-30～-75℃中撞子粉碎研磨2～4小时，常温干燥后，采用40～80目分样筛筛选出直径1～200μm的骨粉体备用；
（2）以步骤（1）得到的骨粉体为原料，采用浓度为3～5%的胶原蛋白凝胶水溶液或者聚乙烯醇水溶液作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为40～80wt%骨粉体和重量百分比为20～60wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30～60min制作成浆料原料；
（3）将步骤（2）得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为2～10℃，湿度80～90%条件下离心机离心3～5min，转速2000～3000转/min，得到打印浆料备用；
（4）三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
（5）将步骤（3）得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤（d）中得到的个体化植骨支架形态打印植骨支架；
（6）将步骤（5）得到的植骨支架放入1～5%的京尼平溶液中浸泡4～10分钟后取出，于温度为2～10℃，湿度80～90%条件下自然晾干24小时；
（7）将步骤（6）得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
根据本发明的一个实施方案，上述3D打印可吸收生物支架孔隙直径为2～500μm，孔隙率0～80%。
根据本发明的一个实施方案，上述3D打印可吸收生物支架，其表面和或孔隙间可粘附一层促进骨形成的细胞或因子覆盖，如骨髓间充质干细胞、骨形态发生蛋白（BMP）、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，增骨融合概率以及促进成骨替代。
有益效果
1、本发明采用同种异体骨或异种骨作为植骨支架的基础材料，通过冷冻研磨机低温研磨成特定大小的骨粉体，与生物相容性良好的粘结剂相配合，充分利用自然骨的理化性质，制备的骨组织具有良好的生物相容性，骨移植材料在体内无毒性、无排斥反应、无诱变性、无抗原性，不干扰骨与组织再生。
2、本发明制备的生物支架可逐渐降解而被自体骨组织吸收、替代，与正常骨皮质能承受的符合接近（20MPa），具有良好的初始力学性能；且弹性模量逐渐降低，不会产生应力遮挡，避免长期愈合过程中内置物骨折、塌陷及松动，可促进骨融合，最终完全转化为自体骨组织。
3、本发明具有适当递减的机械性能，骨移植材料具有足够的初始力学强度以维持早期力量支撑，随着逐渐降解吸收，力学强度与骨融合同步衰减，至完全被自身骨组织替代，到达正常骨组织的力学强度。
4、本发明采用3D打印技术制作骨移植支架，可在计算机辅助下，根据每个患者影像学结果定制个体化支架，以完全符合骨缺损或医生需求的支架形态，而且具有速度快、可调整孔隙率以及可粘附各种促骨形成细胞或因子的优势。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。以下实施例所用计算机辅助设计软件及3D生物打印机均由西安点云先进材料科技有限公司提供。
实施例1
小牛骨3D打印制备骨移植支架实施例
采用如下步骤：
（1）.将小牛骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮（-30～-50℃），撞子粉碎研磨2小时，常温干燥60min后，采用80目分样筛筛选出直径<180μm的骨粉体备用；
(2).以步骤（1）得到的骨粉体为原料，采用胶原蛋白凝胶水溶液（5wt%）作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为50wt%骨粉体和重量百分比为50wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成浆料原料；
(3).将步骤（2）得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为8℃，湿度90%条件下离心机离心5min，转速3000转/min，得到打印浆料备用；
(4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤（3）得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤（4）中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(6).将步骤（5）得到的植骨支架放入3%的京尼平溶液中浸泡10分钟后取出，于温度为8℃，湿度90%条件下自然晾干24小时；
(7).将步骤（6）得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为200um，孔隙率为20%。
实施例2
对实施例1制备的生物支架进行性能测试，包括生物相容性、吸收降解性能以及力学性能等。
生物形容性：按实施例1的方法制备10×10×1mm的生物支架薄片，置于96孔培养皿的底部，用α-MEM浸润24小时。取兔骨髓间充质干细胞（温度37℃，CO2浓度5%，湿度95%条件下）传代培养至第三代，调节细胞密度3×105个/ml，将细胞接种于底部有支架薄片的培养孔，设无膜片的对照培养孔，5 个平行培养孔，培养基为α-MEM 培养基加10% 新生牛血清，每孔800 μl，于37° C，5% CO2，95%湿度条件下培养，定期换液。24小时后加入CKK8溶液，于37℃孵育1小时。酶标仪测量450nm处的标本吸光值（n=5），计算相对增殖率（RGR）。实验结果显示，细胞在小牛骨支架薄片上的相对增值率为94.18 ± 5.25%，增值率大于75%，不显示细胞毒性，表明小牛骨支架的细胞相容性好。
吸收降解性：按实施例1的方法制备直径5mm×长度10mm的圆柱体小牛骨支架，以雄性12周龄新西南大白兔为实验动物（体重3.12±2.3kg），在股骨髁无菌制取直径5mm×长度10mm的圆柱体骨缺损，将制备的小牛骨支架植入缺损中，骨蜡封闭，缝合伤口。抗生素处理，继续培养至2、4、8、12周后处死。取出小牛骨支架（n=5），扫描电镜观察植入支架的降解吸收情况。实验结果显示，小牛骨植入大白兔皮下，未见明显的毛细血管充血等组织炎症反应，骨生物相容性良好。支架材料在各时间节点骨体积分数（BV/TV）逐渐减少，表明支架材料被逐渐吸收。
逐渐递减机械性能：按实施例1的方法制备直径5mm×长度10mm的圆柱体小牛骨支架，以雄性12周龄新西南大白兔为实验动物（体重3.12±2.3kg），在股骨髁无菌制取直径5mm×长度10mm的圆柱体骨缺损，将制备的小牛骨支架植入缺损中，骨蜡封闭，缝合伤口。抗生素处理，继续培养至0、2、4、8、12周后处死。取出小牛骨支架（n=5），材料试验机测试各标本的最大压缩强度。实验结果显示，支架材料在各时间节点，最大压缩强度逐渐降低，0、2、4、8、12周最大压缩强度分别20.5±3.2mPa，18.4±1.5mPa，15.3±2.1mPa，10.5±1.2mPa，9.5±1.1mPa，表明支架材料在体内的机械性能呈逐渐递减的趋势。
按实施例1制备小牛骨支架，同时在制备的支架表面和/或孔隙间粘附一层骨髓间充质干细胞、骨形态发生蛋白（BMP）、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等促进骨形成的细胞或因子。重复以上三个实验，实验结果表明，小牛骨支架粘附促骨形成的细胞或因子，不与人体及生物支架产生排斥，可促进支架吸收降解并促进骨融合与替代速率。
实施例3
同种异体骨3D打印骨移植支架实施例
采用如下步骤：
（1）.将同种异体骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮（-50～-65℃），撞子粉碎研磨4小时，常温干燥30分钟后，采用分样筛筛选出直径小于150μm的骨粉体备用；
(2).以步骤（1）得到的骨粉体为原料，采用聚己内酯水溶液（10wt%）作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为70wt%骨粉体和重量百分比为30wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成浆料原料；
(3).将步骤（2）得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为4℃，湿度85%条件下离心机离心5min，转速2500转/min，得到打印浆料备用；
(4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤（3）得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤（4）中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(6).将步骤（5）得到的植骨支架放入5%的京尼平溶液中浸泡6分钟后取出，于温度为4℃，湿度85%条件下自然晾干24小时；
(7).将步骤（6）得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为100um，孔隙率为30%。
实施例4
小牛骨3D打印骨移植支架实施例
采用如下步骤：
（1）.将小牛骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮（-65～-75℃），撞子粉碎研磨3小时，常温干燥60分钟后，采用分样筛筛选出直径小于80μm的骨粉体备用；
(2).以步骤（1）得到的骨粉体为原料，采用聚乙烯醇水溶液（3wt%）作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为60wt%骨粉体和重量百分比为40wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成浆料原料；
(3).将步骤（2）得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为6℃，湿度85%条件下离心机离心5min，转速2000转/min，得到打印浆料备用；
(4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤（3）得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤（4）中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(6).将步骤（5）得到的植骨支架放入4%的京尼平溶液中浸泡6分钟后取出，于温度为6℃，湿度85%条件下自然晾干28小时；
(7).将步骤（6）得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为50um，孔隙率为60%。
参照实施例2，测定实施例3和实施例4制备的生物支架性能，实验结果显示，细胞在支架薄片上的增值率均大于75%，且未见明显的毛细血管充血等组织炎症反应，骨生物相容性良好。而且支架材料在各时间节点骨体积分数（BV/TV）逐渐减少，表明支架材料均被逐渐吸收。同时支架材料在体内的机械性能也均呈逐渐递减的趋势。
按实施例3、4制备的生物支架，同时在制备的支架表面和/或孔隙间粘附一层骨髓间充质干细胞、骨形态发生蛋白（BMP）、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等促进骨形成的细胞或因子。重复实验，实验结果表明，支架粘附促骨形成的细胞或因子，不与人体及生物支架产生排斥，可促进支架吸收降解并促进骨融合与替代速率。
对比实施例1
小牛骨3D打印骨移植支架实施例
采用如下步骤：
（1）. 小牛骨常温、常规方式研磨直径为800μm的骨粉体备用；
(2).以步骤（1）得到的骨粉体为原料，采用胶原蛋白凝胶水溶液（5wt%）作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为50wt%骨粉体和重量百分比为50wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成浆料原料；
(3).将步骤（2）得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为8℃，湿度90%条件下离心机离心5min，转速3000转/min，得到打印浆料备用；
(4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤（3）得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤（4）中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(6).将步骤（5）得到的植骨支架放入3%的京尼平溶液中浸泡10分钟后取出，于温度为8℃，湿度90%条件下自然晾干24小时；
(7).将步骤（6）得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为200um，孔隙率为20%。
参照实施例2的方法检测对比实施例1制得的生物支架性能，实验结果显示，支架薄片生物相容性好，但吸收降解速率慢，力学强度递减慢。
对比实施例2
小牛骨3D打印骨移植支架实施例
采用如下步骤：
（1）.将小牛骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮，撞子粉碎研磨2小时，常温干燥后，采用80目分样筛筛选出直径<180μm的骨粉体备用；
(2).以步骤（1）得到的骨粉体为原料，采用胶原蛋白凝胶水溶液（5wt%）作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为50wt%骨粉体和重量百分比为50wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成打印浆料；
(3).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(4).将步骤（2）得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤（4）中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(5).将步骤（4）得到的植骨支架放入3%的京尼平溶液中浸泡10分钟后取出，于温度为8℃，湿度90%条件下自然晾干24小时；
(6).将步骤（5）得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
结果显示，3D打印连续性不好，废品率较高。
对比实施例3
小牛骨3D打印骨移植支架实施例
采用如下步骤：
（1）.将小牛骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮，撞子粉碎研磨2小时，常温干燥后，采用80目分样筛筛选出直径<180μm的骨粉体备用；
(2).以步骤（1）得到的骨粉体为原料，采用胶原蛋白凝胶水溶液（5wt%）作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为50wt%骨粉体和重量百分比为50wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成浆料原料；
(3).将步骤（2）得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为8℃，湿度90%条件下离心机离心5min，转速3000转/min，得到打印浆料备用；
(4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤（3）得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤（4）中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(6).将步骤（5）得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为200um，孔隙率为20%。
参照实施例2的方法检测对比实施例1制得的生物支架性能，实验结果显示，细胞相容性较好，可吸收降解，但是力学强度较低，易崩毁，并且不利于支架材料吸收替代过程中力学强度的维持。

Claims (8)

1.一种3D打印制备生物支架的方法，包括制备打印材料、3D打印和生物支架后处理步骤，其特征在于：所述制备打印材料为将同种异体骨或异种骨于冷冻研磨机中，液氮环境下撞子粉碎研磨2～4小时，常温干燥后用40～80目分筛得到骨粉体；然后以胶原蛋白凝胶或者聚乙烯醇水溶液为粘结剂，以重量百分比为40～80wt%骨粉体和20～60wt%的粘结剂混合后球磨制备得到浆料原料；所述胶原蛋白凝胶或者聚乙烯醇水溶液的浓度为3～10wt%；将浆料原料于2～10℃用离心机离心3～5min，转速2000～3000转/min，制得3D打印材料。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物支架为骨替代材料。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述异种骨为小牛骨。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述液氮环境温度为-30～-75℃，撞子粉碎时间为2～4小时；所述常温干燥时间为10～60分钟；所述分筛的骨粉体直径为1～200μm。
5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述后处理为将打印好的生物支架于1～5%的京尼平溶液中浸泡4～10分钟，取出后在温度为2～10℃，湿度80～90%的条件下自然晾干20～28小时；然后用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
6.一种3D打印制备生物支架材料的方法，采用如下步骤：
将同种异体骨或异种骨放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮，于-30～-75℃中撞子粉碎研磨2～4小时，常温干燥后，采用40～80目分样筛筛选出直径1～200μm的骨粉体备用；
（2）以步骤（1）得到的骨粉体为原料，采用浓度为3～5%的胶原蛋白凝胶水溶液作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为40～80wt%骨粉体和重量百分比为20～60wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30～60min制作成浆料原料；
（3）将步骤（2）得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为2～10℃，湿度80～90%条件下离心机离心3～5min，转速2000～3000转/min，得到打印浆料备用；
（4）三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
将步骤（3）得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤（d）中得到的个体化植骨支架形态打印植骨支架；
将步骤（5）得到的植骨支架放入1～5%的京尼平溶液中浸泡4～10分钟后取出，于温度为2～10℃，湿度80～90%条件下自然晾干24小时；
将步骤（6）得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
7.如权利要求1或6所述方法，其特征在于：所述生物支架孔隙直径为2～500μm，孔隙率0～80%。
8.如权利要求1或6所述方法，其特征在于：所述生物支架，其表面和/或孔隙间可粘附一层骨髓间充质干细胞、骨形态发生蛋白（BMP）或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
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