CN108310465B - 一种3d打印用骨修复材料及其制备骨修复支架的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种3D打印用骨修复材料，通过先将异种骨口明显研磨处理，之后加入聚己内酯作为粘合剂，最终得到修复支架材料，之后通过计算机模拟，设计出个体化植骨支架，通过3D打印得到最后的植骨支架，并且对植骨支架消毒后进行使用的过程。在本发明的方案中，采用聚己内酯作为粘结剂，能够形成较好的粘结效果，从而保证了整个材料以及植骨支架的力学性能，特别是对异种骨具有较好的粘结效果。

Description

一种3D打印用骨修复材料及其制备骨修复支架的方法
技术领域
本发明属于生物支架领域，具体涉及一种3D打印制备骨修复支架的方法及骨修复支架。
背景技术
骨修复一直是临床上面临的难题，目前治疗骨缺损的方法以自体和异体骨组织为主。自体骨移植存在取材难度大、创伤大等困难。异体骨修复存在抗原性强、免疫反应强、供体来源不足、操作复杂、周期长等问题。异种骨修复材料，既可以保留骨组织原有的天然基质，如其中包含使生物材料具有骨传导和骨诱导两类重要特性的细胞因子，又能改变供体奇缺的困境，是一种具有很大潜力的植入材料。以脱细胞骨粉与生物可降解高分子材料为原料，可制备复合材料支架用于骨修复。但是现有技术中的修复材料，都是将骨组织经过简单研磨，通过胶黏剂粘合，这种方式制备的材料其强度较低，无法达到真实骨头的效果。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种强度较高的一种3D打印制备骨修复支架的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种3D打印制备骨修复支架的方法，包括以下步骤：
步骤一：将异种骨冷冻研磨后，过筛筛出直径小于40微米的骨粉；
步骤二：对步骤一获得的骨粉进行脱细胞处理，得到脱细胞骨粉；
步骤三：以步骤二得到的骨粉为原料，选取聚己内酯PCL为粘结剂，按骨粉质量百分比为5％-65％均匀混合，制得3D打印材料；
步骤四：将步骤三制得的打印材料加热至75-85℃得到脱细胞骨粉-PCL复合材料。
作为本发明的进一步改进，步骤一中，所述异种骨为猪肋骨、脊椎骨或四肢骨。作为本发明的进一步改进，：
步骤一中，将异种骨放入超低温冷冻研磨机中，研磨时间为20-40分钟，研磨频率为18-28转每秒。
作为本发明的进一步改进，
步骤二中，脱细胞处理具体采用以下步骤：
a.在10mM的Tris-Hcl ph8.0溶液中在混合仪中，浸泡24h，之后至恒温45℃，浸泡24小时；
b.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
c.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次20-40分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、1ug/mL leupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟；
d.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
e.在浓度为50mM的Tris-Hcl ph7.5溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，所述氯化镁浓度为10mM，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml，DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为1U/ml，恒温37℃，浸泡3小时；
f.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。
作为本发明的进一步改进，
步骤b、c、d、e、f中，骨粉与浸泡液的体积比为1∶2-4。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤c和步骤f中的蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、1ug/mLleupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤三中还混合有改性剂，所述改性剂用量为骨粉重量的10％，所述改性剂包括下属重量份组成：
N-甲基-3-氨丙基三甲氧基硅烷：10份
2-(二苯基羟亚膦基)乙基三乙氧基硅烷：5份
六甲基二硅脲：2份
2-(乙酰氧基甲基)烯丙基三甲基硅烷：2份
亚甲基二磷酸四乙酯：5份。
作为本发明的另一目的，提供一种3D打印制备骨修复支架的方法，
步骤五：三维CT扫描骨缺损部位，采用计算机辅助设计软件，根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
步骤六：将步骤四得到的3D打印材料加入3D生物打印机中，根据步骤五得到的个体化支架形态打印植骨支架；
步骤七：将步骤六得到的支架灭菌。
作为本发明的进一步改进，
步骤七中，采用环氧乙烷灭菌。
作为本发明的另一目的，提供一种有上述方法制备的3D打印制备骨修复支架。
本发明的有益效果如下：
1.本发明制备的3D打印支架具有良好的生物相容性，骨移植材料在体内无毒性、无排斥反应；
2.本发明通过生物3D打印系统构建新型多孔骨修复材料支架，实现临床上对于骨缺损修复的个性化治疗，是对传统的手术医疗方案的扩展和补充；
3.本发明制备的可吸收支架具有足够的初始力学强度以支撑早期力量，随着支架的降解吸收，逐渐被自身骨组织替代，达到正常骨组织的力学强度。
附图说明
图1为本发明对实施例一的EDX分析图；
图2为本发明对实施例二的EDX分析图；
图3为本发明对实施例三的EDX分析图。
具体实施方式
下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
实施例一：
一种3D打印制备骨修复支架的方法，包括以下步骤：
步骤一：将异种骨冷冻研磨后，过筛筛出直径小于40微米的骨粉；
步骤二：对步骤一获得的骨粉进行脱细胞处理，得到脱细胞骨粉；
步骤三：以步骤二得到的骨粉为原料，选取聚己内酯PCL为粘结剂，按骨粉质量百分比为20％均匀混合，制得3D打印材料；
步骤四：将步骤三制得的打印材料加热至80℃得到脱细胞骨粉-PCL复合材料；
步骤五：三维CT扫描骨缺损部位，采用计算机辅助设计软件，根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
步骤六：将步骤四得到的3D打印材料加入3D生物打印机中，根据步骤五得到的个体化支架形态打印植骨支架；
步骤七：将步骤六得到的支架灭菌。
步骤一中，所述异种骨为猪肋骨、脊椎骨或四肢骨。
步骤一中，将异种骨放入超低温冷冻研磨机中，研磨时间为30分钟，研磨频率为18-28转每秒。
步骤二中，脱细胞处理具体采用以下步骤：
a.在10mM的Tris-Hcl ph8.0溶液中在混合仪中，浸泡24h，之后至恒温45℃，浸泡24小时；
b.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
c.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、lug/mL leupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟；
d.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
e.在浓度为50mM的Tris-Hcl ph7.5溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，所述氯化镁浓度为10mM，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml，DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为1U/ml，恒温37℃，浸泡3小时；
f.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。
步骤b、c、d、e、f中，骨粉与浸泡液的体积比为1∶2。
所述步骤c和步骤f中的蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、1ug/mLleupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟。
步骤七中，采用环氧乙烷灭菌。
实施例二：
一种3D打印制备骨修复支架的方法，包括以下步骤：
步骤一：将异种骨冷冻研磨后，过筛筛出直径小于40微米的骨粉；
步骤二：对步骤一获得的骨粉进行脱细胞处理，得到脱细胞骨粉；
步骤三：以步骤二得到的骨粉为原料，选取聚己内酯PCL为粘结剂，按骨粉质量百分比为35％均匀混合，制得3D打印材料；
步骤四：将步骤三制得的打印材料加热至75-85℃得到脱细胞骨粉-PCL复合材料；
步骤五：三维CT扫描骨缺损部位，采用计算机辅助设计软件，根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
步骤六：将步骤四得到的3D打印材料加入3D生物打印机中，根据步骤五得到的个体化支架形态打印植骨支架；
步骤七：将步骤六得到的支架灭菌。
步骤一中，所述异种骨为猪肋骨、脊椎骨或四肢骨。
步骤一中，将异种骨放入超低温冷冻研磨机中，研磨时间为30分钟，研磨频率为25转每秒。
步骤二中，脱细胞处理具体采用以下步骤：
a.在10mM的Tris-Hcl ph8.0溶液中在混合仪中，浸泡24h，之后至恒温45℃，浸泡24小时；
b.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
c.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、1ug/mL leupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟；
d.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
e.在浓度为50mM的Tris-Hcl ph7.5溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，所述氯化镁浓度为10mM，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml，DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为1U/ml，恒温37℃，浸泡3小时；
f.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。
步骤b、c、d、e、f中，骨粉与浸泡液的体积比为1∶2。
所述步骤c和步骤f中的蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、1ug/mLleupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟。
步骤七中，采用环氧乙烷灭菌。
实施例三
一种3D打印制备骨修复支架的方法，包括以下步骤：
步骤一：将异种骨冷冻研磨后，过筛筛出直径小于40微米的骨粉；
步骤二：对步骤一获得的骨粉进行脱细胞处理，得到脱细胞骨粉；
步骤三：以步骤二得到的骨粉为原料，选取聚己内酯PCL为粘结剂，按骨粉质量百分比为50％均匀混合，制得3D打印材料；
步骤四：将步骤三制得的打印材料加热至75-85℃得到脱细胞骨粉-PCL复合材料；
步骤五：三维CT扫描骨缺损部位，采用计算机辅助设计软件，根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
步骤六：将步骤四得到的3D打印材料加入3D生物打印机中，根据步骤五得到的个体化支架形态打印植骨支架；
步骤七：将步骤六得到的支架灭菌。
步骤一中，所述异种骨为猪肋骨、脊椎骨或四肢骨。
步骤一中，将异种骨放入超低温冷冻研磨机中，研磨时间为30分钟，研磨频率为18-28转每秒。
步骤二中，脱细胞处理具体采用以下步骤：
a.在10mM的Tris-Hcl ph8.0溶液中在混合仪中，浸泡24h，之后至恒温45℃，浸泡24小时；
b.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
c.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、lug/mL leupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟；
d.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
e.在浓度为50mM的Tris-Hcl ph7.5溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，所述氯化镁浓度为10mM，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml，DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为1U/ml，恒温37℃，浸泡3小时；
f.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。
步骤b、c、d、e、f中，骨粉与浸泡液的体积比为1∶2。
所述步骤c和步骤f中的蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、lug/mLleupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟。
步骤七中，采用环氧乙烷灭菌。
实施例四：
一种3D打印制备骨修复支架的方法，包括以下步骤：
步骤一：将异种骨冷冻研磨后，过筛筛出直径小于40微米的骨粉；
步骤二：对步骤一获得的骨粉进行脱细胞处理，得到脱细胞骨粉；
步骤三：以步骤二得到的骨粉为原料，选取聚己内酯PCL为粘结剂，按骨粉质量百分比为35％均匀混合，制得3D打印材料；
步骤四：将步骤三制得的打印材料加热至75-85℃得到脱细胞骨粉-PCL复合材料；
步骤五：三维CT扫描骨缺损部位，采用计算机辅助设计软件，根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
步骤六：将步骤四得到的3D打印材料加入3D生物打印机中，根据步骤五得到的个体化支架形态打印植骨支架；
步骤七：将步骤六得到的支架灭菌。
步骤一中，所述异种骨为猪肋骨、脊椎骨或四肢骨。
步骤一中，将异种骨放入超低温冷冻研磨机中，研磨时间为30分钟，研磨频率为25转每秒。
步骤二中，脱细胞处理具体采用以下步骤：
a.在10mM的Tris-Hcl ph8.0溶液中在混合仪中，浸泡24h，之后至恒温45℃，浸泡24小时；
b.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
c.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、1ug/mL leupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟；
d.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
e.在浓度为50mM的Tris-Hcl ph7.5溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，所述氯化镁浓度为10mM，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml，DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为1U/ml，恒温37℃，浸泡3小时；
f.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。
步骤b、c、d、e、f中，骨粉与浸泡液的体积比为1∶2。
所述步骤c和步骤f中的蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、1ug/mLleupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟。
步骤七中，采用环氧乙烷灭菌。
所述步骤三中还混合有改性剂，所述改性剂用量为骨粉重量的10％，所述改性剂包括下属重量份组成：
N-甲基-3-氨丙基三甲氧基硅烷：10份
2-(二苯基羟亚膦基)乙基三乙氧基硅烷：5份
六甲基二硅脲：2份
2-(乙酰氧基甲基)烯丙基三甲基硅烷：2份
亚甲基二磷酸四乙酯：5份。
实施例一至四均制得的3D打印支架孔隙直径约为600微米，孔隙率为60％。
对实施例进行力学测试：
表一：
最大抗拉应力(MPa) 杨氏模量(MPa)
实施例一 14.5 376
实施例二 13.2 383
实施例三 13.7 368
实施例四 20.1 385
表二：
实施例一 实施例二 实施例三 实施例四
压缩模量(MPa) 174.37 168.18 157.26 182.42
对实施例进行检测碱性磷酸酶：
表三：
碱性磷酸酶U/mg DNA 第1天 第7天 第21天
实施例一 0.026 0.191 1.004
实施例二 0.021 0.250 0.861
实施例三 0.022 0.210 0.964
实施例四 0.025 0.230 0.861
通过在本发明中，通过先将异种骨口明显研磨处理，之后加入聚己内酯作为粘合剂，最终得到修复支架材料，之后通过计算机模拟，设计出个体化植骨支架，通过3D打印得到最后的植骨支架，并且对植骨支架消毒后进行使用的过程。在本发明的方案中，采用聚己内酯作为粘结剂，能够形成较好的粘结效果，从而保证了整个材料以及植骨支架的力学性能，特别是对异种骨具有较好的粘结效果。此外在制备过程需要对异种骨进行脱细胞处理，在本发明中采用，先后经过Tris-Hcl ph8.0溶液、0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液浸泡、0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液浸泡、蛋白酶抑制剂清洗、0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液浸泡、氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶浸泡、0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗，蛋白酶抑制剂的作用主要是为了对细胞外基质的蛋白质进行一个保护。特别在蛋白酶抑制剂的选择上选用抑肽酶、亮抑蛋白酶肽、苯甲基磺酰氟，三种物质的联用，能够更加有效地对蛋白质起到一个保护作用，防止蛋白质被分解。
另外，在本发明中，加入N-甲基-3-氨丙基三甲氧基硅烷、2-(二苯基羟亚膦基)、乙基三乙氧基硅烷、六甲基二硅脲、2-(乙酰氧基甲基)烯丙基三甲基硅烷、亚甲基二磷酸四乙酯，在反应过程中可以与骨粉和胶黏剂形成三维网状的分子结构，从而进一步提高整体的力学效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种3D打印用骨修复材料，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将异种骨冷冻研磨后，过筛筛出直径小于40微米的骨粉；
步骤二：对步骤一获得的骨粉进行脱细胞处理，得到脱细胞骨粉；脱细胞处理具体采用以下步骤：
a.在10mM的Tris-Hcl ph8.0溶液中在混合仪中，浸泡24h，之后至恒温45℃，浸泡24小时；
b.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
c.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次20-40分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin抑肽酶、1ug/mL leupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟；
d.在浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温45℃，浸泡24小时，所述的Tris-Hcl溶液为10mM ph8.0；
e.在浓度为50mM的Tris-Hcl ph7.5溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，所述氯化镁浓度为10mM，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml，DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为1U/ml，恒温37℃，浸泡3小时；
f.在浓度为0.1％乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟；
其中，步骤b、c、d、e、f中，骨粉与浸泡液的体积比为1∶2-4；
步骤三：以步骤二得到的骨粉为原料，选取聚己内酯PCL为粘结剂，按骨粉质量百分比为5％-65％均匀混合，制得3D打印材料；
步骤四：将步骤三制得的打印材料加热至75-85℃得到脱细胞骨粉-PCL复合材料。
2.根据权利要求1所述的一种3D打印用骨修复材料，其特征在于：步骤一中，所述异种骨为猪肋骨、脊椎骨或四肢骨。
3.根据权利要求1所述的一种3D打印用骨修复材料，其特征在于：
步骤一中，将异种骨放入超低温冷冻研磨机中，研磨时间为20-40分钟，研磨频率为18-28转每秒。
4.根据权利要求1所述的一种3D打印用骨修复材料，其特征在于：所述步骤c和步骤f中的蛋白酶抑制剂为10KIU/mlaprotinin抑肽酶、lug/mL leupeptin亮抑蛋白酶肽、1mM PMSF苯甲基磺酰氟。
5.根据权利要求1所述的一种3D打印用骨修复材料，其特征在于：所述步骤三中还混合有改性剂，所述改性剂用量为骨粉重量的10％，所述改性剂包括下属重量份组成：
N-甲基-3-氨丙基三甲氧基硅烷：10份
2-(二苯基羟亚膦基)乙基三乙氧基硅烷：5份
六甲基二硅脲：2份
2-(乙酰氧基甲基)烯丙基三甲基硅烷：2份
亚甲基二磷酸四乙酯：5份。
6.通过权利要求1-5任一项所述的骨修复材料制备骨修复支架的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
步骤五：三维CT扫描骨缺损部位，采用计算机辅助设计软件，根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
步骤六：将步骤四得到的3D打印材料加入3D生物打印机中，根据步骤五得到的个体化支架形态打印植骨支架；
步骤七：将步骤六得到的支架灭菌。
7.根据权利要求1所述的3D打印制备骨修复支架的方法，其特征在于：步骤七中，采用环氧乙烷灭菌。
8.权利要求6-7任一项所述的3D打印制备骨修复支架的方法所制备的骨修复支架。
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