CN102886075B - 人体硬组织修复材料及其制备方法 - Google Patents
人体硬组织修复材料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医学材料领域。主要适用于制取骨形态发生蛋白2活性肽与羟基磷灰石复合剂型。其中所述的骨形态发生蛋白2活性肽,其序列如SEQ ID N0:1~10所示。本发明所述的方法首先是将骨形态发生蛋白2活性肽溶于生理盐水溶解或5%葡萄糖溶液中,随后将羟基磷灰石支架也加入其中,使骨形态发生蛋白2活性肽结合在羟基磷灰石颗粒的表面,经离心分离,并清洗干燥后,获得所需的骨形态发生蛋白与羟基磷灰石复合剂型,即得到本发明所述的人体硬组织修复材料。
Description
技术领域
本发明涉及用来刺激骨骼生长的人体硬组织修复材料,属于医药生物发明领域。
背景技术
骨缺损在临床上发病率较高,其治疗仍缺乏满意的骨修复材料。理想的骨修复材料应具有生物相容性、骨传导性、骨诱导性及成骨性等特性,自体骨由于具有上述所有特性,所以目前临床上仍以自体骨移植治疗骨缺损为常见,自体骨移植是治疗骨缺损的“金标准”,但是自体骨移植供骨量有限,且手术时间长,对供区组织造成损害,供区损伤、疼痛等并发症高达25%~30%。异体骨移植尽管避免了自体骨移植对供区组织造成的损害,但感染率高,存在引起免疫排斥反应的危险。因此,自体骨和异体骨移植在临床上应用都存在一定的局限。人工合成骨修复材料在避免上述不利因素的同时,还具有易进行质量控制、可标准化批量生产等优点,成为生物医学材料研究的一个重点。其中多孔羟基磷灰石(HA)生物陶瓷与人体骨中的无机质的化学组成和晶体结构相类似,且具有良好的生物相容性、生物降解性和骨传导性,在作为人工骨修复材料和骨组织工程支架材料方面具有更大的应用潜力。然而,现有多孔HA生物陶瓷骨诱导性不足的缺点,使其的应用受到较多限制。
自体骨中含有的活性成分能够诱导新骨的形成。人们在纯化脱钙骨基质移植物活性成份的研究中发现了骨形态发生蛋白家族,其中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是已知的所有骨生长因子中对骨的形成作用最强的因子,可诱导间充质干细胞、成骨前体细胞、肌源性细胞等向骨细胞分化[1]。但BMP-2来源于动物组织,分离纯化难且数量有限。目前,采用基因工程技术制备的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)已获美国FDA批准并开始应用于临床,但是,用基因工程技术生产时工艺复杂,难以大规模生产,成本高,同时存在基因工程产品潜在的安全性问题[2]。最近,国内外一些学者根据BMP-2氨基酸序列中发挥骨诱导作用的核心功能区,合成了由20个氨基酸组成的小分子多肽,体内外实验发现该BMP-2活性肽的活性位点能充分暴露并与细胞表面受体结合,和BMP-2一样具有骨诱导作用,同时稳定性更好,生物活性更强,可用多肽合成仪大规模合成,费用较低[3-6]。如何把BMP-2活性肽通过结合载体、支架等释放系统,在骨缺损部位发挥骨诱导的作用,也引起了人们的关注。
参考文献
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发明内容
基于上述研究进展,我们设想将BMP-2活性肽结合于HA上,在植入体内后,BMP-2活性肽与HA协同作用,通过诱导骨组织在孔内形成,达到强化多孔HA种植体、尽早与宿主骨形成牢固结合的目的。
本发明的目的在于克服现有羟基磷灰石骨修复性能的不足,提供具有促进骨骼生长速率的磷酸钙复合材料。本发明首先根据BMP-2氨基酸序列中诱导成骨的核心功能区,合成了一条含24~28个氨基酸的BMP-2活性多肽。
该羟基磷灰石复合材料由羟基磷灰石和由SEQ ID NO:1~10所示的氨基酸序列的多肽组成。对于不同的骨缺损类型,可通过调节多肽与羟基磷灰石的质量比,来控制骨修复速率,在材料在植入部位的吸收速率与骨骼生长的速率相匹配。
多肽序列为:
1.EEEEE EEKIP KASSV PTELS AISTLYL(SEQ ID NO:1)
2.KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEEE EE(SEQ ID NO:2)
3.EEEE EEKIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO:3)
4.KIPKASSVPTELSAISTLYLEEEEEE(SEQ ID NO:4)
5.EEEEEE EEKIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO:5)
6.KIPKASSVPTELSAISTLYLEEEEEEEE(SEQ ID NO:6)
7.EEEEE KIPKASSVPTELSAISTLYL(SEQ IDNO:7)
8.KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEEE(SEQ ID NO:8)
9.EEEEKIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO:9)
10.KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEE(SEQ ID NO:10)
其中所述的BMP-2活性肽,其特征在于由SEQ ID NO:1~10所示的氨基酸序列组成。所述的羟基磷灰石为羟基磷灰石颗粒,线,块体,支架。
同时本发明提供一种人体硬组织修复材料的制备方法,其特征在于包括下述步骤:
1)将骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽干粉用生理盐水溶解或5%葡萄糖溶解;
2)将羟基磷灰石颗粒和步骤1)获得的多肽液相混合;
3)将上述混合物静置,取出支架材料,于超净工作台中快速风干,无菌封存。
其中所述步骤1)中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽溶液浓度为0.05-20mg/mL,优选为:0.5-15mg/ml;所述步骤2)中多肽与羟基磷灰石的质量比为10∶1-1∶1000,优选为1∶1-1∶10:所示步骤3)静置为于25-37℃下静置,其中静置时间可根据具体实验进行本领域常用选择范围内的调整,例如10-120min或更长,常用为60min。
其中所述骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽的序列由SEQ ID NO:1~10所示。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了上述羟基磷灰石复合材料在制备骨修复材料中的用途。
本发明创造性的将多肽和羟基磷灰石复合固化而成一种新的骨修复材料,动物实验结果证实通过模仿HA结合蛋白与HA的结合机制,在BMP-2活性肽序列的一端加上多聚谷氨酸多肽序列,形成的新多肽既包括BMP-2氨基酸序列中具有骨诱导作用的核心功能区,又包括多聚谷氨酸多肽序列,通过多聚谷氨酸多肽序列与多孔HA陶瓷孔壁表面的特异性生物结合,加强了骨诱导活性肽与多孔HA陶瓷的结合,从而达到提高多孔HA陶瓷的骨诱导活性肽的携带量并局部稳定释放骨诱导活性肽的目的。动物实验数据的统计学分析结果表明,组合物与现有的羟基磷灰石相比,克服了现有的羟基磷灰石不具有骨诱导性的缺点,骨修复能力更强,是一种安全高效的骨修复材料。
具体实施方式:
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不限于一下实施例。
下述实施例中,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中,所述百分含量如无特殊说明,均为质量百分含量。
实施例中使用的各种单位,统一采用国家标准。
实施例1本发明所述的骨修复材料的制备方法1
SEQ ID NO:1~10所示的多肽干粉用去离子水溶解,浓度为20mg/mL。取羟基磷灰石颗粒和多肽液,多肽与羟基磷灰石的质量比为10∶1,25摄氏度下匀调和60分钟,即得到本发明所述的骨修复材料。
实施例2本发明所述的骨修复材料的制备方法2
SEQ ID NO:1~10所示的多肽干粉用去离子水溶解,浓度为1mg/mL.取多肽液滴在羟基磷灰石片上,25摄氏度下静置60分钟,再用PBS溶液清洗掉未吸附的多肽,即得到本发明所述的骨修复材料。多肽与 羟基磷灰石的质量比为1∶1000。
实施例3本发明所述的骨修复材料的制备方法3
SEQ ID NO:1~10所示的多肽干粉用去离子水溶解,浓度为0.05mg/mL.将羟基磷灰石块体置于多肽液中,37摄氏度下负压吸附60分钟,即得到本发明所述的骨修复材料。多肽与羟基磷灰石的质量比为1∶10。
实施例4本发明所述的骨修复材料的制备方法4
SEQ ID NO:1~10所示的多肽干粉用去离子水溶解,浓度为0.5mg/mL.将羟基磷灰石多孔支架置于多肽液中,37摄氏度下负压吸附60分钟,即得到本发明所述的骨修复材料。多肽与羟基磷灰石的质量比为1∶5。
实施例5多肽与羟基磷灰石亲和力实验
以多肽B和多肽C为例,通过体外吸附试验来研究多肽与羟基磷灰石的亲和力。使用FITC标记多肽。
分组:多肽A:FITC-KIP KASSV PTELS AISTLYL(对照),多肽B:FITC-EEEEE EKIP KASSV PTELS AISTLYL(SEQ ID NO:3),多肽C:FITC-EEEEEEEE KIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO:5)。
方法:将100微克羟基磷灰石颗粒(直径10-15微米,比表面积为62m2/g),加入200微升pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液中,配置成悬浮液。将多肽加入悬浮液中,25摄氏度温度下搅拌1小时,然后将悬浮液于5000rpm转速下离心10分钟,收集上清液测量未吸附的多肽量。多肽量测量方法为荧光测定法,荧光激发波长为490nm,发射波长为520nm。
结果:多肽A的吸附量为0.02nmol,多肽B和C的吸附量为0.9nmol和0.8nmol,经修饰后,吸附量上升了3500%。
多肽与羟基磷灰石亲和力实验结果表明,多肽A在羟基磷灰石上的吸附量明显小于其它各组。多肽B和多肽C经多聚谷氨酸多肽序列修饰后,能够与羟基磷灰石特异性生物结合,而与多肽B和C相类似的其他7种经过优化的多肽也都具有相类似的特异性结合活性。通过上述实验结果,我们分析原因如下:多孔HA陶瓷与生长因子结合力的大小,决定了生长因子的携带量,释放速度和释放时间。在保持生长因子的活性前提下,可尝试采取各种手段,包括物理吸附,静电吸附,化学链接等各种手段来加强载体与生长因子的结合。目前通常采用物理吸附的方法使多孔HA生物陶瓷结合生长因子,临床研究发现,这种承载生长因子的方式,不仅载药量有限,而且生长因子的释放速率不易控制,存在初期释放过快,后期释放量太少的问题,无法实现持续释放,生长因子在早期超生理剂量释放,可能引起对其它组织和器官不必要的副作用,而在后期又很难维持其作用的效果。化学链接的方法可使生长因子通过强的化学结合力结合在HA基质上,但是对HA表面化学处理会干扰HA吸附有利的血液蛋白。研究发现,HA比其它材料植入体具有更高的骨传导性的原因之一在于其植入体内暴露于血液中具有优先吸附黏附蛋白的能力,有利于细胞在其表面的黏附,因此,采用化学链接的方法可能会影响其本身的骨传导性。我们模仿HA结合蛋白与HA的结合机制,在BMP-2活性肽序列的一端加上多聚谷氨酸多肽序列,形成的新多肽既包括BMP-2氨 基酸序列中具有骨诱导作用的核心功能区,又包括多聚谷氨酸多肽序列,通过多聚谷氨酸多肽序列与多孔HA陶瓷孔壁表面的特异性生物结合,加强了骨诱导活性肽与多孔HA陶瓷的结合,从而达到提高多孔HA陶瓷的骨诱导活性肽的携带量并局部稳定释放骨诱导活性肽的目的。
实施例6体内异位成骨实验
采用大鼠皮下异位成骨模型来评价本发明所述的骨修复材料的骨修复效果。
1、实验样品制备与分组
成年雌性Wistar大鼠36只,体重80~100g,随机分成3组,每组12只。按4周和8周2个时间点,每个时间点6只大鼠。
实验材料A组:通过FMOC/tBU固相多肽合成法(现有常规方法)合成多肽SEQ ID NO:1~10,所得粗肽经过凝胶层析初步纯化,最后经过高效液相色谱法纯化后浓度为98.5%,通过质谱仪对多肽鉴定其序列。所合成之多肽为干粉状,用去离子水溶解,浓度为5mg/mL,0.2μm滤膜过滤除菌后,注射入大鼠皮下。注射过程采用1mL注射器和26号针头。每个多肽序列每个时间点6只大鼠。
实验材料B组:按实施例4的方法用多肽SEQ ID NO:1~10制备骨修复材料,大小为直径10mm,厚2mm的多孔圆片。手术置入大鼠皮下。每个多肽序列每个时间点6只大鼠。
实验材料C组:取B组同样的羟基磷灰石多孔圆片手术置入大鼠皮下。每个时间点6只大鼠。
2、大体观察
观察术后动物饮食、活动及伤口愈合情况。取材时观察植入部位成骨情况和材料形貌。
3、观测新骨形成量
将植入材料和周围的组织取出,2.5%戊二醛固定,石蜡包埋,切片,苏木精一伊红染色(H&E),观察新骨的形成。
4、统计学分析
统计学分析通过origin8.0软件的统计学分析功能完成。p<0.05为差异有显著性。
5、结果
所有植入区伤口愈合良好,无红肿感染等术后并发症发生。
A组:术后4周和8周,皮下未见硬组织生成,未见炎性反应,组织正常。
B组:组织切片观察显示植入4周后,大量细胞长入材料,有小的新生骨小梁形成,材料部分降解。8周时材料部分降解,有小的新生骨小梁形成,大量成骨细胞贴附在新生骨小梁边缘。与4周时相比,8周时骨量明显增多,通过对连续组织切片的计算得到骨形成区占切片总面积的百分比分别为4周10%,8周25%。
C组:术后4周,植入材料周围组织内可见少量中性粒细胞和淋巴细胞浸润,材料未完全降解,被结构疏松的纤维囊包裹。术后8周,植入材料周围组织内未见炎性细胞浸润,纤维囊壁变薄。未见明显骨组 织生成。
异位成骨实验的结果表明,A组是单纯的多肽溶液,但注射入皮下后多肽溶液会扩散至周边组织,多肽失活,未起到异位成骨的效果。B组由多肽和羟基磷灰石支架复合而成,多肽随着羟基磷灰石基质的降解而逐步释放,诱导皮下组织细胞分化为成骨细胞,分泌骨基质,实验结果证实其具有异位成骨的效果。实验材料C是羟基磷灰石多孔圆片,与其它文献结果一致,不具有异位成骨作用。
实施例7骨缺损修复实验
采用兔股骨踝临界骨缺损模型来评价本发明所述的骨修复材料的骨修复效果。
1、动物模型新西兰兔桡骨中段临界骨缺损。
2、实验样品制备与分组
实验材料A组:通过FMOC/tBU固相多肽合成法(现有常规方法)合成多肽(KIPKA SSVPT ELSAI STLYL),所得粗肽经过凝胶层析初步纯化,最后经过高效液相色谱法纯化后浓度为98.5%,通过质谱仪对多肽鉴定其序列。所合成之多肽为干粉状,用去离子水溶解,浓度为5mg/mL,0.2μm滤膜过滤除菌后,注射入大鼠皮下。注射过程采用1mL注射器和26号针头。
实验材料B组:按实施例4的方法制备骨修复材料,大小为直径5mm,高15mm的多孔支架。
实验材料C组:取B组同样的羟基磷灰石多孔支架。
对照组D:骨缺损空置。
按4周,8周和12周3个时间点,每个时间点6只兔子,其中3只右下肢植入实验材料A,左下肢植入实验材料B;另外3只右下肢植入实验材料C,左下肢骨缺损空置。
3、观察指标
3.1大体观察
观察术后兔子的活动、饮食和二便情况,伤口有无肿胀,有无分泌物等。
3.2X线检查
术后4周,8周和12周连续X线摄片观察骨缺损修复情况,并参照Lane-Sandhu的X线评分标准评分。
3.3生物力学检查
术后12周处死动物,将样本平置于万能试验机操作台上进行生物力学实验。
3.4观测新骨形成量
标本取下后,经4%多聚甲醛固定后,用10%EDTA脱钙。标本常规脱水,浸蜡,包埋,石蜡切片,行HE染色,光镜观察材料及周围组织的变化和植入材料内新骨形成的情况。采用计算机多功能图像分析系统,对术后8周和12周的股骨植骨区的成骨情况进行定量分析,各组在不同时间点随机选取3个平面,每个平面随机选取3个不重叠的视野进行测量,计算新骨生成面积与骨缺损面积的百分比,取其平均数。
3.5统计学分析
统计学分析通过origin8.0软件的统计学分析功能完成。p<0.05为差异有显著性。
4结果
4.1术后兔子生命活动观察
术后1h兔子苏醒,3h后进水进食,创面无感染。在实验周期内,所有兔子都存活,无手术并发症发生。
4.2X线观察
实验材料A组12周内骨缺损未修复,仅在缺损区边缘有少量新骨形成。
实验材料B组骨缺损在术后4周时界面模糊,材料与缺损边缘处出现高密度的新生骨组织,术后8周时原有缺损部位被大量高密度新生骨组织填充,已无法分辨植入材料的轮廓及原有缺损部位,术后12周骨缺损完全修复,原有骨缺损的密度与正常骨组织密度接近。
实验材料C组骨缺损在术后4周时材料外形较易分辨,材料与骨界面处有高密度新生骨组织出现,术后8周有较多高密度新生骨组织生成,但其轮廓与骨缺损部位仍可分辨,术后12周,骨缺损区域被部分新生骨组织填充,其密度稍高于正常骨组织。
对照组D12周内骨缺损未修复,仅在缺损区边缘有少量新骨形成。
4.3Lane-Sandhu的X线评分结果
4.4压缩强度
术后12周各组骨缺损区压缩强度如表1,经统计学分析,实验材料B组显著高于实验材料C组(p<0.05),实验材料B组和C组均显著高于对照组D(p<0.05)。
表1术后12周各组骨缺损区压缩强度
4.5新骨形成率
术后8周,实验材料B组植入材料部分降解,并被新生骨组织修复;实验材料C组材料未被完全降解,骨缺损内可见新生骨形成,实验材料A组和对照组D仅在缺损区边缘有少量的新生骨组织,中央被骨髓组织和纤维组织填充。术后12周,实验材料B组可见成熟骨小梁,实验材料C组材料部分降解,可见新生骨小梁。实验材料A组和对照组D仅在缺损区边缘有少量的新生骨组织,中央被骨髓组织和纤维组织填充。术后8周,12周新骨形成率如下表,各时间点实验材料B组和C组新骨形成率均明显高于对 照组D(p<0.05),实验材料B组显著高于实验材料C组(p<0.05)。
表2各组骨缺损区新骨形成率
本实验的X线,生物力学和新生骨计量结果表明了按照本发明制备的实验材料B对于骨缺损有很好的修复作用,而且修复时间和修复效果均显著优于实验材料C和A。
实验结果证明:多肽经多聚谷氨酸多肽序列修饰后,能够有效与羟基磷灰石特异性生物结合,通过多聚谷氨酸多肽序列与多孔HA陶瓷孔壁表面的特异性生物结合,加强了骨诱导活性肽与多孔HA陶瓷的结合,从而达到提高多孔HA陶瓷的骨诱导活性肽的携带量并局部稳定释放骨诱导活性肽的目的,因此本发明的骨修复材料是一种安全,高效的骨修复材料,具有很好的应用前景。
序列表
<160>10
<210>1
<211>27
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-1
<400>1
EEEEE EEKIP KASSV PTELS AISTL YL
<210>2
<211>27
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-2
<400>1
KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEEE EE
<210>3
<211>26
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-3
<400>1
EEEE EEKIP KASSV PTELS AISTL YL
<210>4
<211>26
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-4
<400>1
KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEE EE
<210>5
<211>28
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-5
<400>1
EEEEEE EEKIP KASSV PTELS AISTL YL
<210>6
<211>28
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-6
<400>1
KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEE EEEE
<210>7
<211>21
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-7
<400>1
KIP KASSV PTELS AISTL YL E
<210>8
<211>21
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-8
<400>1
EKIP KASSV PTELS AISTL YL
<210>9
<211>22
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-9
<400>1
EEKIP KASSV PTELS AISTL YL
<210>10
<211>24
<212>氨基酸
<213>BMP-2活性肽-10
<400>1
KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEE
Claims (3)
1.一种人体硬组织修复材料的制备方法,其特征在于所述人体硬组织修复材料由羟基磷灰石与骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽组成,具有三维多孔的结构特征,所述的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽的序列由SEQ ID NO:1~10所示;所述的羟基磷灰石形态为:颗粒、线、块体、支架的一种或组合;
所述的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽的浓度为0.05-20mg/mL,其通过吸附结合到支架材料上所述方法包括下述步骤:
1)将骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽干粉用生理盐水溶解或5%葡萄糖溶解;
2)将羟基磷灰石颗粒和步骤1)获得的多肽液相混合;
3)将上述混合物静置,取出支架材料,于超净工作台中快速风干,无菌封存;
其中所述步骤1)中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽溶液浓度为0.5-2mg/mL;所述步骤2)中多肽与羟基磷灰石的质量比为10∶1-1∶1000;所示步骤3)静置为于25-37℃下静置;
所述骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽的序列由SEQ ID NO:1~10所示。
2.利用权利要求1所述的制备方法制备出的人体硬组织修复材料。
3.权利要求2所述的人体硬组织修复材料在制备骨修复材料中的用途。
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CN201210347179.9A CN102886075B (zh) | 2012-09-19 | 2012-09-19 | 人体硬组织修复材料及其制备方法 |
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