CN1951964A - 长链型重组人骨形态发生蛋白－2及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链型重组人骨形态发生蛋白－2及其制备方法和应用。本发明利用基因工程技术在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等表达系统中制备长链型重组人骨形态发生蛋白－2。本发明以人骨肉瘤细胞mRNA逆转录得到的cDNA为模板，扩增出编码羧基端自然结构成熟肽完整114个氨基酸的核苷酸序列，并在正向引物5’端第一个密码子之前增加一段核苷酸，使其对应的氨基酸序列在N端增加一段多肽，得到长链型rhBMP－2基因，分子量约为30KD，纯度达95％以上。该长链型rhBMP－2具有活性高、体内稳定性好，利于重组蛋白的表达、复性和分离纯化，利于活性蛋白在体内的稳定及活性的稳定发挥，适合于骨缺损填充、融合植骨等，尤其适合于椎体融合、骨折延迟愈合、骨不连、大段骨缺损的填充修复。

Description

长链型重组人骨形态发生蛋白-2及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组人骨形态发生蛋白-2及其基因工程制备方法。

背景技术

骨折延迟愈合及骨不连、骨缺损的修复一直是骨科领域悬而未决的重大问题。长期以来，骨缺损的修复主要采用自体骨移植、同种异体骨移植和采用生物材料和制品进行替换、修复三种治疗方法。自体骨受来源数量限制，且取骨手术至少存在10％的外科并发症，植入后需要较长时间的爬行替代过程；异体骨存在不同程度的免疫排异反应及潜在的病源传播危险。因此，具有特殊功能的生物材料和制品在临床上备受关注。尽管目前已经有不少的生物材料在临床上获得使用，但传统生物材料的活性和降解性的不足严重影响了其在临床上的使用效果。

对骨生长和修复有明显生物活性的细胞因子——骨形态发生蛋白(BoneMorphogenetic Protein，BMP)，为骨不连、骨缺损的治疗提供了新的方法。BMP既是多功能形态发生因子，同时又具有突出的诱骨成骨活性，具有巨大的基础研究价值和广阔的临床应用前景。

早在1965年，美国医师Urist首先发现脱钙的骨基质中存在着具有异位诱导成骨作用的物质，即骨形态发生蛋白BMP。到目前为止，已发现二十种BMP，分别命名为BMP-1，BMP-2，...。BMPs(除BMP-1以外)属于转化生长因子(transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族。BMP在胚胎发育时就存在，不仅在胚胎早期参与调节多种器官的发育和细胞的定向分化，在生后仍能诱导机体内的间充质细胞不可逆地分化为软骨和骨细胞，在骨和牙齿的生成发育和创伤修复中发挥重要作用。骨折后骨愈合过程中局部BMP的表达水平明显增高，并且局限于骨折骨痂形成区。将BMP植入软组织内，可异位诱导新骨的形成，这已被用作考察BMP活性的一个依据。

BMP-2是所有骨生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，对其结构与功能的研究也最为深入。天然人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是一种疏水性非胶原酸性糖蛋白，不溶于水，易溶于高浓度的尿素和盐酸胍。由于BMP-2蛋白的非水溶性特性，给其分离、提取以及基因工程制备带来困难。BMP-2分子上有一疏水核，有30％的酸性氨基酸，其pI为5.0左右。BMP-2蛋白一级结构中含有非常保守的七个半胱氨酸残基，组成三对链内二硫键和一对链间二硫键桥，这对于维持分子的天然活性构像具有重要作用。若使用还原剂将二硫键打开，其骨诱导活性将完全丧失。成熟的BMP-2分子以二聚体形式存在，由2个单体通过二硫键结合而成，每个活性单体均由114个氨基酸构成，分子量约13KDs，含有糖基化位点。Sampath等对直接从牛骨基质中提取的一种具有诱骨活性的蛋白质进行结构分析，发现经去糖基后，由16KD和14KD多肽组成的二聚体仍有诱骨活性，说明糖基化对活性并非必需。这使采用原核表达系统制备BMP-2成为可能。

在体内，BMP-2首先被合成为分子量较大的前体，前体由信号肽和100-125个氨基酸组成的羧基端(C-端)组成。BMP-2在其羧基C-端部分包括特征性的7个高度保守的半胱氨酸残基，这些残基对于前体互相正确结合成二聚体具有重要作用。当BMP-2的C-端被裂解释放后，2个单体以二硫键相结合发生二聚作用，有活性的同链或异链二聚体BMP-2即被分泌出来。BMP-2前体没有TGF-β1和TGF-β2前体序列所含的Arg-Gly-Asp潜隐性组织识别序列，成熟肽N端富含碱性氨基酸，可使其易于吸附于细胞外基质上，以延长其生物半衰期，充分发挥其诱骨活性或在发育和分化阶段使其形成hBMP-2信号梯度[Biochem Biophys Res Commun，2004；318(3)：704]。

BMP-2可从动物组织内提纯(p-BMP2)，也可用基因工程构建重组细胞表达合成(rhBMP-2)。早在1979年Urist[UAnn Thorac Surg，1990；49(6)：864-5]领导的小组率先从兔脱钙骨中成功地分离纯化了兔的BMP-2，于1982年从牛骨中提取出牛骨形态发生蛋白(bBMP)，1987年Urist[Clin Orthop Relat Res.，1987(214)：295-304]建立了一套从人及牛骨中提取BMP的标准步骤。目前，pBMP-2大多从牛、猪、羊、马、兔、鼠等动物的正常骨中提取。天津中津药业股份有限公司生产的金世植骨灵^重组合异种骨(RBX)中的成骨诱导因子就是从牛骨中提取，然后再同牛骨复合而成，用于治疗骨折延迟连接、不连接和骨缺损治疗。

自然界中BMP虽然广泛存在于各种动物的骨组织中，但其含量甚微，每公斤湿重新鲜骨仅含有几微克BMP，且不同来源BMP在理化性质及分子结构上存在较大差别，诱导成骨活性和稳定性也都有所不同，。由于骨组织中各种BMP与不溶性非胶原蛋白(insoluble noncollagenous protein，iNCP)紧密结合，很难从中分离出单一的任何一种BMP分子。因此，从动物骨组织中分离BMP，过程繁杂，重复性差，收率低，蛋白纯度不高并且不可避免地存在差异；对BMP的复性要求高，蛋白活性难以维持稳定。同时，这种动物来源的蛋白在人体使用，会引起不同程度的免疫排斥反应和潜在的病源传播危险。因此，完全依靠动物骨提取，难以满足实验和临床应用中的需求量。

利用基因工程方法生产人BMP-2，不仅可保证大量生产，还可避免免疫排斥反应，是极具发展前景和吸引力的方法。自1988年Wozney等以牛骨为来源的BMP-2基因，并在重组大肠杆菌中成功表达后，基因工程大量生产人的BMP-2也就成为可能(WozneyJM，Rosen V，Celeste AJ，etal，Novel regulators of bone formation：molecular clones andactivities，science，1988；242(4885)：1525-34)。

目前，用于表达BMP-2基因的系统既有真核，也有原核细胞，两种表达系统各有优缺点。Wozney JM(Wozney JM，Overview of bone morphogeneticproteins，Spine.2002，15；27(16 Suppl 1)：S2-8)认为hBMP-2在COS-1细胞中的表达产物具有诱导生成软骨能力，但无诱导成骨的能力。赵明在真核细胞COS和CHO中已经获得具有诱导生物活性的重组人BMP-2。Genetics Institute的Wozney等从人U-20s细胞的eDNA文库中克隆了hBMP-2，结果显示hBMP-2的cDNA全长为1587bp，编码有396个氨基酸的多肽，可在蛋白酶作用下生成有活性的成熟肽[Sugiura T.，Biochem J.1999，338(Pt2)：433-40]，其长度为114个氨基酸。专利US Appl.No.118363用COS、CHO等哺乳动物细胞表达人rhBMP-2。

由于使用哺乳动物细胞的真核表达系统的表达产物多为分泌型的，有更好的翻译后修饰，可以糖基化，活性相对较高，是BMP基因较理想的表达体系。真核细胞表达的BMP-2是第一个在体内实验中证明具有诱骨活性的BMP分子。如将未经纯化的细胞培养液直接植入肌肉内，并不表现诱导活性，必须在纯化后才能显示出与剂量相关的诱骨活性。目前，由Medtromic Sofamor Danek公司采用真核表达系统生产的BMP-2产品——Infuse^TM Bone Graft已用于脊柱融合和骨缺损填充修复。由Stryker Biotech公司采用CHO细胞培养生产的OP-1^TmImplant(OP-1，又称rhBMP-7)已被FDA批准并开始应用于临床。但真核表达系统的缺点是表达率低，生产成本很高，产品价格昂贵，无法满足科研和临床的大量需要。

与真核表达系统相比，原核表达系统易于进行基因操作，表达效率高，细胞外有细胞壁，不如哺乳动物细胞娇嫩，营养要求低，对培养环境的耐受性强，易于培养，生产成本低，具有很强的竞争力。尽管原核表达系统不能使BMP糖基化，表达产物多以包涵体形式出现，且受复性过程难控制、制备工艺相对复杂等问题困扰，但对于BMP的表达，由于糖基化并不是BMP活性的必需条件，无糖基化修饰并不影响它们的生物活性[J.M.Wozney，Science，1988，24 2：15 28-15]。因此，原核表达系统也被用于BMP的表达和生产。

在国外，Kubler NP[Int J oral Maxillofac Surg，1998，27：30]和Ruppert R[Eur J Biochem，1996；237：295-302]均在E.Coli中成功表达了hBMP-2完整成熟肽基因，表达量达30％。在国内，不同长短的hBMP-2成熟肽基因在E.Coli中也获得成功表达，而且重组hBMP-2具有一定的异位诱导成骨活性。但是国内外的研究机构却因无法进一步进行可重复性的复性和纯化大肠杆菌产生的人全长成熟肽BMP-2，使工作停留在实验室水平(只能得到毫克量)，无法实现产业化。林松等[生物化学与生物物理学报，1996，28(1)：8]发现hBMP-2愈接近完整成熟肽的长度，其成骨活性愈好。专利CN 01116754.8利用基因重组技术在大肠杆菌中表达制备了具生物活性的截短型rhBMP-2-108蛋白。表达的基因长324bp，编码的截短型的rhBMP-2由108个氨基酸组成。该发明虽能实现rhBMP-2的产业化生产，但因生物半衰期短、体内稳定性差而限制了应用。可见，相对于完整成熟肽基因长度的rhBMP-2而言，截短型的rhBMP-2-108蛋白总体生物活性相对较低，影响其对骨折延迟愈合及骨不连、骨缺损等的重建修复效果。

对蛋白进行结构修饰是基因工程领域经常采用的一种方法，包括天然蛋白内氨基酸序列的改变、截短型的构建和长链型的构建等，目的是提高目标蛋白的表达、活性和稳定性等，如长链型IGF-1(insulin-like growth factors-1)等。虽然已经有天然型hBMP-2和截短型hBMP-2的基因工程构建研究和专利报道，但到目前为止还没有长链型rhBMP-2的报道。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于公开一种长链型重组人骨形态发生蛋白-2及其制备方法和应用，以克服现有技术中复性难、分离难、蛋白活性低且在体内不稳定等造成难以产业化的问题。

本发明的技术构思是这样的：采用原核表达系统制备rhBMP-2，可克服真核表达系统中表达率低，生产成本高的缺点，但复性过程难控制、制备工艺相对复杂。rhBMP-2的活性、复性等制备过程的难易在一定程度上取决于肽链的长度和组成。因此，本发明在hBMP-2的成熟肽全长114个氨基酸的基础上，针对hBMP-2自身分子结构的特征和原核表达系统的特点，在其N端设计增加一段特定的氨基酸序列结构，实现对hBMP-2的氨基酸肽段的一级结构修饰，形成长链型rhBMP-2；采用原核表达系统制备该长链型rhBMP-2。所设计的肽链段的引入，可使rhBMP-2具有良好的活性和稳定性，并提高其表达，促进蛋白复性时正确折叠，延长生物半衰期，以克服非长链型rhBMP-2复性难、分离难、活性低及难以产业化等问题。

本发明所说的长链型重组人骨形态发生蛋白-2，是由人骨形态发生蛋白-2成熟肽的114个氨基酸和连接在所述的氨基酸的N端的氨基酸的多肽链构成，形成长链型重组人骨形态发生蛋白-2(Recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)；

所说的多肽链的特征为不干扰BMP-2二聚体的形成，不影响BMP-2活性中心的空间三维结构。

所说的多肽链为Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu LysArg，或以以上肽链为基础的较短的多肽链，以所列的多肽链为最优。

蛋白单链分子量约为13-15KD，经复性后该活性蛋白为二聚体，分子量约为25-30KD；

优选的长链型重组人骨形态发生蛋白-2的氨基酸序列如SEQ ID：NO：1或SEQ ID：NO：2或SEQ ID：NO：3所示：

SEQ ID：NO：1：

长度：131aa

类型：氨基酸序列

链型：单链

几何结构：线性

来源：基因工程合成。

Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys

 1               5                  10                  15                  20

His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe

                25                  30                  35                  40

Ser Asp val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys

                45                  50                  55                  60

His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val

                65                  70                  75                  80

Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu

                85                  90                  95                  100

Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr

               105                  110                  115                120

Gln  Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg End

SEQ ID：NO：2：

长度：125aa

类型：氨基酸序列

链型：单链

几何结构：线性

来源：基因工程合成。

Met Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg

 1               5                   10                  15                 20

Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn

                25                  30                  35                  40

Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe

                45                   50                 55                  60

Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser

                65                  70                  75                  80

Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met

                85                  90                  95                  100

Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu

                105                  110                 115               120

Gly Cys Gly Cys Arg End

SEQ ID：NO：3：

长度： 119aa

类型： 氨基酸序列

链型：单链

几何结构：线性

来源：基因工程合成。

Met Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys

 1               5                  10                  15                  20

Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Tsp Ile Val Ala Pro

                25                  30                  35                  40

Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu

                45                  50                  55                  60

Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro

                65                  70                  75                  80

Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn

                85                  90                  95                  100

Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg End

                105                 110                 115

本发明所设计的长链型重组人骨形态发生蛋白-2，由hBMP-2的成熟肽全长114个氨基酸以及连接在氨基酸残基的N端的一个多肽链构成；

分子量为28～32KD。

编码所说的长链型重组人骨形态发生蛋白-2的基因序列如SEQ ID：NO：4或SEQ ID：NO：5或SEQ ID：NO：6所示：

SEQ ID：NO：4

长度：396bp

类型：脱氧核糖核酸

链型：双链

几何结构：线性

来源：人工合成。

ATG AAA AGA CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT 51

M    K   R   H   D   G   K   G   H   P   L   H   K   R   E   K   R  17

CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC 102

 Q    A   K    H   K   Q   R   K   R   L   K   S   S   C   K  R  H  34

CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT 153

 P    L  Y   V   D   F   S   D   V   G   W   N  D    W  I    V  A   51

CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG 204

 P   P   G   Y   H    A   F  Y   C   H    G   E   C   P   F   P   L 68

GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC 255

 A   D   H   L   N   S   T   N   H   A   I   V   Q    T  L   V   N  85

TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT 306

 S    V  N   S   K   I   P   K   A   C    C  V   P   T   E   L  S   102

GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC 357

 A   I   S   M   L   Y    L  D   E    N  E   K   V  V    L   K  N   119

TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG  3’            396

 Y   Q   D   M   V   V   E   G   C   G   C   R  ^*                   132

SEQ ID：NO：5：

长度：378bp

类型：脱氧核糖核酸

链型：双链

几何结构：线性

来源：人工合成。

                       ATG GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT   33

                        M   G   H   P   L   H   K   R   E   K   R    11

 CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC 84

  Q  A   K   H   K   Q   R   K    R   L  K   S   S   C   K   R   H   28

CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT  135

P    L   Y   V   D   F   S   D  V   G   W   N   D   W   I   V   A    45

CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG  186

P    P G    Y   H   A   F   Y   C  H   G    E  C   P    F   P   L    62

GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC  237

A    D  H   L   N   S  T   N   H    A  I    V   Q   T  L    V   N    79

TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT  288

 S  V    N  S   K   I    P   K  A   C   C    V   P  T    E  L   S    96

GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC  339

 A   I  S   M   L   Y   L   D   E   N   E  K    V   V   L   K   N    113

TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG      3’         378

 Y   Q   D   M   V   V   E   G   C   G   C   R   ^*                   126

SEQ ID：NO：6

长度：360bp

类型：脱氧核糖核酸

链型：双链

几何结构：线性

来源：人工合成。

                                               ATG AGA GAA AAA CGT   15

                                                M   R   E   K   R    5

CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC  66

 Q   A  K   H   K    Q   R  K    R   L   K   S  S   C    K  R   H    22

CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT  117

 P   L  Y   V    D   F   S  D   V    G   W   N   D   W   I  V   A    39

CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG  168

 P  P   G   Y   H   A   F   Y   C   H   G   E   C   P    F   P   L   56

GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC  219

 A   D   H   L   N   S   T   N   H   A   I   V   Q   T   L   V   N   73

TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT  270

 S    V   N   S   K  I    P   K   A  C   C   V   P   T   E   L   S   90

GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC  321

 A  I   S   M   L   Y   L   D    E  N    E   K  V   V   L    K  N    107

TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG     3’          360

 Y   Q   D   M   V   V   E  G   C   G   C   R   ^*                    120

本发明的长链型重组人骨形态发生蛋白-2的制备方法，包括步骤如下步骤：

①培养人骨肉瘤细胞系U20S(购自美国ATCC)，收集细胞，裂解细胞提取mRNA，以Oligo(dT)为引物逆转录得到cDNA，再以cDNA为模板，以BMP-F和BMP-R为引物，扩增出编码羧基端自然结构成熟肽完整114个氨基酸的核苷酸序列，并在正向引物5’端第一个密码子之前增加一段核苷酸，使其对应的氨基酸序列在N端增加一段多肽，得到长链型rhBMP-2基因。得到一条大小为不大于396bp的DNA片段，回收上述片段，构建成长链型的人BMP-2基因，在多克隆位点将其插入载体pBV220中，得到rhBMP-2表达质粒pBV220-hBMP-2，扩增后经酶切和测序验证插入片段与设计一致；

所说的引物的DNA序列为：

BMP-F：5’GGGGAATTCATGCAAGCCAAACACAAACAG 3’

BMP-R：5’CCCGGATCCATACTAGCGACACCCACAA 3’；

②采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备感受态表达系统后，用①步所得的表达质粒pBV220-BMP2进行转化，在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒，进行酶切验证，最后测序，证实表达载体序列正确；

所说的表达系统为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、草生欧文菌或谷氨酸棒杆菌；

所说的常规的氯化钙法B.R.格利克，J.J.帕斯捷尔纳克编，陈丽珊、任大明主译，分子生物技术，化学工业出版社，2005年p71中有详细的描述；

③从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在25-38℃的条件下以100-300rpm的转速在气浴振荡器中培养2-3小时，再按体积比为1∶8-12的比例将培养物接种到LB培养基中，在100-300rpm、25-38℃的条件下将基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1.2-1.4，培养时间为10-12小时；

所说的LB培养液为为10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，5g/l NaCl；

所说的抗生素选自氨苄青霉素、链霉素或卡那霉素；

LB培养液中，抗生素的含量为10～100μg/ml；

然后接入LB培养基中继续培养，接种量为0.1～2.0∶5，种子液：培养液，体积比，pH7.0±0.2，培养温度为25-38℃，搅拌速度100-600rpm。然后，升温至40～42℃，继续培养4-6小时，培养结束后，在7500-10000rpm 4±2℃条件下，离心分离，收集菌体，菌体裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在15KD分子量处，与诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌相比，有清晰条带增加，说明已经表达产生了目标蛋白质。

④菌体破碎、洗涤：将步骤③收集的菌体，与TE溶液，按1g∶5-15ml的比例混合，再按1g∶0.3-5mg的比例，与溶菌酶混合，采用细胞破碎技术进行菌体破碎，然后在6000-10000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗涤液的比例加入洗涤液，搅拌2～4h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用洗涤液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物∶20mlTris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；

所说的TE溶液为6mM的Tris，和10mM的EDTA，pH7.50；

洗涤液为磷酸盐缓冲液、尿素水溶液、曲拉通水溶液等；

所说的细胞破碎技术包括反复冻融法、超声波破碎法或高压均质法，在李宏军等人的文献(黑龙江医药，2002，15(2)：124)中有详细的报道；

⑤包涵体裂解、复性和纯化：以1g包涵体∶5～20ml裂解液的比例加入裂解液，在4±2℃下，搅拌裂解8～12小时，离心，离心转速6000～12000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为20～30分钟，弃沉淀，取离心上清液，稀释至蛋白含量为0.1-1mg/ml的样品，按体积比为1∶10～100的比例加入复性液中进行复性2-20天，然后经过疏水柱、亲和层析柱和凝胶色谱柱等进行层析纯化，并经过无菌过滤后，在-30～7℃下冻干，得到长链型重组人骨形态发生蛋白-2，经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％，分子量约为30KD；HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。

所说的包涵体裂解液可为6M Gu-HCl或8M尿素、20mM PBS、10mM DTT等。

所说的复性液为20mMNa₂HPO₄·12H₂O、1.5mMNaH₂PO₄·2H₂O、140mMNaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。

采用本发明上述的方法，获得的蛋白，电泳结果表明，条带清晰，基本无杂带，其纯度达95％以上。

试验证明，本发明的蛋白，具有较高的诱导成骨活性，可单独使用或与载体材料复合使用；

将本发明研制的长链型rhBMP-2植入到昆明种小白鼠的大腿肌肉内，并以空白组作为对照，通过测定不同剂量rhBMP-2植入相同时间和相同剂量rhBMP-2植入不同时间的碱性磷酸酶(AKP)活性和成骨量，以检测rhBMP-2的异位成骨活性。结果表明，植入本发明方法制备的长链型rhBMP-2后，组织的AKP活性约为空白对照组的10倍；异位成骨量随rhBMP-2植入量和时间的增加而增加，具有剂量和时间呈正相关，而空白组并没有新骨生成。

将本发明研制的长链型rhBMP-2填充到新西兰白兔的去骨膜的1.5cm桡骨节段缺损内，并以空白组作为对照，考察了骨缺损区域新骨形成、骨密度、骨痂生长、骨愈合情况。结果显示，采用本发明方法制备的长链型rhBMP-2具有优异的原位成骨活性，rhBMP-2植入12周后1.5cm的桡骨骨缺损即能完全为新生骨质所充填，基本恢复正常骨形态，并形成正常的骨皮质。

采用物理吸附法、均相包埋法或非均相包埋法将本发明研制的长链型rhBMP-2或其微囊与载体材料进行复合制备活性硬组织修复材料；结果表明，制备的活性硬组织修复材料能延缓蛋白的释放，且释放速度易控制。

所述的载体材料包括无机生物材料(如羟基磷灰石HAP，磷酸三钙，磷酸钙骨水泥，聚合磷酸钙，天然珊瑚，生物玻璃或微晶玻璃等或其复合物)、高分子材料(包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚β-羟基丁酸酯，聚原酸酯、聚碳酸酯等或其复合物)、天然生物材料(包括胶原、明胶等天然蛋白，壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、糖胺聚糖等天然多糖等)或相互间的复合物。以rhBMP-2的重量计，所述的载体的含量为rhBMP-2的0-3000倍。

本发明采用原核表达制备的长链型rhBMP-2不仅具有较强的骨诱导成骨能力，而且稳定性好、表达率高、生产成本低，是一种理想的骨生长因子。可单独或与载体复合后应用于脊柱外科、整形外科、口腔科、骨科(尤其在骨不连、骨延迟愈合方面)等领域。

本发明的特色和优点在于：

1、与现有的专利和文献报道不同的是，本发明设计制备出的是长链型rhBMP-2，即在人BMP-2成熟肽的114个氨基酸的基础上，在N末端增加一段多肽链，对人BMP-2进行结构修饰，形成长链型重组人骨形态发生蛋白-2。该多肽片段的引入，具有很多优点：①不影响BMP-2的C端保守区活性的发挥，又可提高其表达量；②复性时能促进蛋白正确折叠；③增加了目标蛋白的亲和结合位点，有利于蛋白的分离纯化；④延长体内生物半衰期，增加其体内的使用效果。总之，长链型rhBMP-2可以克服非长链型rhBMP-2(包括天然型和截短型)异源表达时存在的复性难、分离难、活性低及难以产业化等问题。此结构是在创新思路下构建的完全不同于现有的rhBMP-2的新蛋白；

2、该蛋白在原核表达系统中表达制备。此长链型结构是针对hBMP-2自身分子结构的特征和原核表达系统的特点设计的，蛋白可以高表达，原核表达形成的包涵体裂解后复性时易正确折叠复性，易于后续的分离纯化。即此长链蛋白与此原核表达系统的制备工艺是相互关联的，该蛋白在原核表达系统中表达制备具创新性。

3、采用E.Coli.发酵制备长链型rhBMP-2时采用LB培养基，省却了采用真核表达系统培养时需要的含动物血清培养基，即避免使用动物源性物质。经过分离、纯化后得到的样品纯度高(可达95％以上)，消除了潜在的病源传播危险：降低了生产成本。

4、制备出的长链型rhBMP-2易于生成、质量易控制，优于天然提取的BMP：

附图说明

图1为长链型rhBMP-2的单链蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2为长链型rhBMP-2的复性后的双链蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3为纯化的长链型rhBMP-2的毛细管电泳分析(PDA-280nm)，表明其纯度超过98％，横坐标为时间(分钟)，纵坐标为吸光度。

图4制备的长链型rhBMP-2的HPLC图。

图5不同植入量长链型rhBMP-2植入小鼠异位成骨量的组织照片

图6小鼠异位成骨组织的组织切片照片。图7为图6的放大图。

图8为500 g的长链型rhBMP-2植入小鼠在不同时间内新骨组织的碱性磷酸酶(AKP)活性图。

图9和10分别为桡骨节段缺损模型中4周、12周对照组的X线。

图11和12分别为桡骨节段缺损模型中4周、12周实验组的X线。

图13和14分别为桡骨节段缺损模型中12周对照组和实验组的组织形态照片。

图15为长链型rhBMP-2的可控释放图。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1长链型rhBMP-2及其制备方法

①培养人骨肉瘤细胞系U20S(购自美国ATCC)，收集细胞，裂解细胞提取mRNA，以Oligo(dT)为引物逆转录为cDNA，人工合成引物，并在正向引物5’端第一个密码子之前加上一段编码所设计氨基酸残基序列(Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro LeuHis Lys Arg Glu Lys Arg)的核苷酸序列，然后进行以cDNA为模板进行PCR扩增，得到一条大小为396bp的DNA片段，回收上述片段，将其插入表达载体pBV220中，构建成长链型的重组人BMP-2基因表达载体，经测序验证，其基因编码序列如SEQ ID：NO：4所示。长链型重组人BMP-2的氨基酸残基序列如SEQ ID：NO：1所示。

②采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞。再将①步所得的表达载体转化大肠杆菌，在含有相应抗生素的LB平板上，挑选阳性转化子，培养后抽提质粒，进行酶切和测序验证，证实长出的菌落含有①步所构建的表达质粒，至此完成大肠杆菌工程菌的构建。

③在含葡萄糖和相应抗生素的LB培养液中培养长链型重组人BMP-2的基因工程菌：按3％的接种量将基因工程菌接入一定量的LB培养基中，以转速200rpm培养2-3小时，培养温度为25℃。

④长链型重组人BMP-2的基因的诱导表达：按10％的比例将培养物接种到含有2000ml的LB培养基的三角烧瓶中，以300rpm、25℃的条件下将基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1.2，培养时间为12小时。然后，升温至42℃诱导，继续培养6小时。最后在10000rpm、4℃离心5分钟收集菌体，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定说明已经表达产生了目标蛋白。(见附图1)。

⑤菌体破碎、洗涤：将离心菌体按1g∶5ml的TE溶液比例搅拌均匀，再按1g∶0.3mg溶菌酶比例，加入溶菌酶，搅拌均匀，并放入4℃冰箱冷藏过夜。在80MPa压力下采用高压均质法破碎细胞，均质次数为5次。然后在6000rpm离心30分钟收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗涤溶液的比例，加入洗涤溶液，均匀搅拌3h后4℃离心30分钟，收集沉淀物；再用洗涤溶液进行二次洗涤，之后再往洗涤溶液中再加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗二次，收集沉淀，得包涵体。冷冻保存。

⑥包涵体裂解、复性和纯化：以1g包涵体：20ml裂解液(6M Gu-HCl、20mM PBS、10mM DTT)的比例在4℃下搅拌裂解过夜。对裂解溶液离心，离心转速12000rpm，离心温度为4℃，离心时间为20分钟，弃沉淀取离心上清液。将稀释后蛋白含量为1mg/ml样品按1∶10的比例倒入复性液中，复性2天，然后经过疏水柱、阳离子柱、亲和层析柱和凝胶柱进行层析纯化，并经过无菌过滤后，在-20℃下进行无菌冻干，得到长链型重组人骨形态发生蛋白-2，记为rhBMP-2-L1。经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过98％(见附图2)。毛细管电泳鉴定其纯度超过98％(见附图3)。HPLC鉴定其纯度超过95％(见附图4)。经测定，其等电点PI约为8.2，N末端与C末端测定均与理论值一致。

实施例2长链型rhBMP-2及其制备方法

①培养人骨肉瘤细胞系U20S(购自美国ATCC)，收集细胞，裂解细胞提取mRNA，以Oligo(dT)为引物逆转录为cDNA，人工合成引物，并在正向引物5’端第一个密码子之前加上一段编码所设计氨基酸残基序列(Met Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu LysArg)的核苷酸序列，然后进行以cDNA为模板进行PCR扩增，得到一条大小为378bp的DNA片段，回收上述片段，将其插入表达载体pBV220中，构建成长链型的重组人BMP-2基因表达载体，经测序验证，基因编码序列如SEQ ID：NO：5所示。长链型重组人BMP-2的氨基酸残基序列如SEQ ID：NO：2所示。

②采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞。再将①步所得的表达载体转化大肠杆菌，在含有相应抗生素的LB平板上，挑选阳性转化子，培养后抽提质粒，进行酶切和测序验证，证实长出的菌落含有①步所构建的表达质粒，至此完成大肠杆菌工程菌的构建。

③在含葡萄糖和相应抗生素的LB培养液中培养长链型重组人BMP-2的基因工程菌：按5％的接种量将基因工程菌接入一定量的LB培养基中，以转速200rpm培养2-3小时，培养温度为32℃。

④长链型重组人BMP-2的基因的诱导表达：按10％的比例将培养物接种到含有2000ml的LB培养基的三角烧瓶中，以300rpm、32℃的条件下将基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1.2，培养时间为10小时。然后，升温至42℃诱导，继续培养6小时。最后在10000rpm、4℃离心5分钟收集菌体，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定说明已经表达产生了目标蛋白。(见附图1)。

⑤菌体破碎、洗涤：将离心菌体按1g∶5ml的TE溶液比例搅拌均匀，再按1g∶0.3mg溶菌酶比例，加入溶菌酶，搅拌均匀，并放入4℃冰箱冷藏过夜。在80MPa压力下采用高压均质法破碎细胞，均质次数为6次。然后在6000rpm离心30分钟收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗涤溶液的比例，加入洗涤溶液，均匀搅拌3h后4℃离心30分钟，收集沉淀物；再用洗涤溶液进行二次洗涤，之后再往洗涤溶液中再加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗二次，收集沉淀，得包涵体。冷冻保存。

⑥包涵体裂解、复性和纯化：以1g包涵体：20ml裂解液(6M Gu-HCl、20mM PBS、10mM DTT)的比例在4℃下搅拌裂解过夜。对裂解溶液离心，离心转速12000rpm，离心温度为4℃，离心时间为20分钟，弃沉淀取离心上清液。将稀释后蛋白含量为0.5mg/ml样品按1∶10的比例倒入复性液中，复性10天，然后经过疏水柱、阳离子柱、亲和层析柱和凝胶柱进行层析纯化，并经过无菌过滤后，在-20℃下进行无菌冻干，得到长链型重组人骨形态发生蛋白-2，记为rhBMP-2-L2。经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过97％。毛细管电泳鉴定其纯度超过96％。HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。

实施例3长链型rhBMP-2及其制备方法

①培养人骨肉瘤细胞系U20S(购自美国ATCC)，收集细胞，裂解细胞提取mRNA，以Oligo(dT)为引物逆转录为cDNA，人工合成引物，并在正向引物5’端第一个密码子之前加上一段编码所设计氨基酸残基序列(Met Arg Glu Lys Arg)的核苷酸序列，然后进行以cDNA为模板进行PCR扩增，得到一条大小为360bp的DNA片段，回收上述片段，将其插入表达载体pBV220中，构建成长链型的重组人BMP-2基因表达载体，经测序验证，基因编码序列如SEQ ID：NO：6所示。长链型重组人BMP-2的氨基酸残基序列如SEQ ID：NO：3所示。

②采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备枯草杆菌的感受态细胞。再将①步所得的表达载体转化枯草杆菌，在含有相应抗生素的LB平板上，挑选阳性转化子，培养后抽提质粒，进行酶切和测序验证，证实长出的菌落含有①步所构建的表达质粒，至此完成枯草杆菌工程菌的构建。

③在含葡萄糖和相应抗生素的LB培养液中培养长链型重组人BMP-2的基因工程菌：按7％的接种量将基因工程菌接入一定量的LB培养基中，以转速200rpm培养2-3小时，培养温度为37℃。

④长链型重组人BMP-2的基因的诱导表达：按10％的比例将培养物接种到含有2000ml的LB培养基的三角烧瓶中，以300rpm、37℃的条件下将基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1.2，培养时间为8小时。然后，升温至42℃诱导，继续培养6小时。最后在10000rpm、4℃离心5分钟收集菌体，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定说明已经表达产生了目标蛋白。(见附图1)。

⑤菌体破碎、洗涤：将离心菌体按1g∶5ml的TE溶液比例搅拌均匀，再按1g∶0.3mg溶菌酶比例，加入溶菌酶，搅拌均匀，并放入4℃冰箱冷藏过夜。在80MPa压力下采用高压均质法破碎细胞，均质次数为4次。然后在6000rpm离心30分钟收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗涤溶液的比例，加入洗涤溶液，均匀搅拌3h后4℃离心30分钟，收集沉淀物；再用洗涤溶液进行二次洗涤，之后再往洗涤溶液中再加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗二次，收集沉淀，得包涵体。冷冻保存。

⑥包涵体裂解、复性和纯化：以1g包涵体∶20ml裂解液(6M Gu-HCl、20mM PBS、10mM DTT)的比例在4℃下搅拌裂解过夜。对裂解溶液离心，离心转速12000rpm，离心温度为4℃，离心时间为20分钟，弃沉淀取离心上清液。将稀释后蛋白含量为0.1mg/ml样品按1∶10的比例倒入复性液中，复性20天，然后经过疏水柱、阳离子柱、亲和层析柱和凝胶柱进行层析纯化，并经过无菌过滤后，在-20℃下进行无菌冻干，得到长链型重组人骨形态发生蛋白-2，记为rhBMP-2-L3。经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％。毛细管电泳鉴定其纯度超过95％。HPLC鉴定其纯度超过96％。经测定(见图4)，N末端与C末端测定均与理论值一致。

实施例4长链型rhBMP-2的中试放大

①同实施例1的①

②同实施例1的②

③同实施例1的③

④长链型重组人BMP-2的基因的诱导表达：按10％的比例将培养物接种到含有2000ml的LB培养基的三角烧瓶中，以300rpm、32℃的条件下将基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1.2，培养时间为8小时。然后，接入100L反应器中的LB培养基中继续培养。接种量为5∶1(培养液∶种子液)，pH7.0，继续培养10小时，然后将培养温度迅速升到为42℃，搅拌速度调到500rpm，继续培养4小时。最后在10000rpm、4℃离心5分钟收集菌体。

⑤同实施例1的⑤

⑥同实施例1的⑥，得到长链型重组人骨形态发生蛋白-2，记为rhBMP-2-L4，电泳结果同图3相似，表明用于制备长链型rhBMP-2的本发明工艺产量高，可成功实现过程进行100升发酵规模的中试放大。

实施例5长链型rhBMP-2的异位成骨活性

检测实施例1合成的长链型rhBMP-2-L1的AKP活性。取不同剂量的rhBMP-2-L1植入小鼠后，分别在1周、2周、3周、4周和8周取出植入部位的新生鲜骨，剔除软组织后，进行拍照，显示异位成骨量同剂量的依赖关系(见图5)。取1000

g植入的样品所形成的骨组织组织进行切片，观察其形成的组织情况，结果见图6，图7为图6的放大图。表明周边骨组织已类似骨皮质，内有骨髓腔，间有骨小梁和脂肪空泡及大量的成骨细胞，表明异位成骨活性高。样品经4℃的生理盐水中漂洗。37℃烘干后称重。取植入500

g的rhBMP-2的加入1ml生理盐水，进行匀浆和离心，然后用分光光度计测定其蛋白含量和碱性磷酸酶活性(AKP)，并将AKP与蛋白含量的比值(AKP/Protein)以及AKP与骨组织重量的比值(AKP/Weight)作图，见附图8。结果表明，材料植入后，无论是以骨组织重量还是以蛋白含量为计算标准，含rhBMP-2植入物组织的AKP活性均在1周内迅速达到最高，且全都为碱性磷酸酶(AKP)，然后逐渐降低。由此进一步证实，采用该法制备的rhBMP-2具有较高的成骨活性。

实施例6长链型rhBMP-2植入兔骨内原位成骨实验研究

通过动物实验对实施例1制备的长链型rhBMP-2植入兔原位成骨性能进行评价。

①评价方法

实验动物：新西兰白兔，平均2.5kg，清洁级(上海第二医科大学实验动物中心提供)。

对照组：空白，对骨缺损不进行处理。

实验方法：对受试动物进行麻醉后，取侧卧位固定于手术台，在双侧前肢剃毛备皮，常规消毒铺巾，无菌单包裹双前足。在桡骨中下三分之一皮肤做2cm切口，分离软组织，直达骨面。充分暴露，使用牙科钻在桡骨中下制造长1.5cm包含骨膜在内的骨节段性缺损，止血，然后植入rhBMP-2或不处理。术后4周、12周进行兔双侧前肢正位X线摄影和组织形态学，观察骨缺损区域新骨形成、骨密度、骨痂生长和骨愈合情况。

②评价结果

x线检查结果见图9(空白组4周)、图10(空白组12周)、图11(实验组4周)和图12(实验组12周)。由图可见，空白组：4周骨创缘稍模糊，骨缺损中心位置为低密度软组织影像。12周骨缺损有所缩小，但主要为软组织影像，断端处皮质呈各自融合影像。实验组：4周可见到缺损中心为充填材料桥连，缺损外侧可见到壳状不透射影像，跨越在缺损上方。12周骨缺损皮质骨桥连而得到修复，中央髓腔再通，皮质骨完整，外形基本恢复正常。

组织形态学结果见图13(空白组)和图14(实验组)。由图可见，空白组12周缺损中心为大量的纤维组织和肌肉组织所覆盖，缺损未愈合。实验组12周骨缺损修复基本完成，新的骨皮质和骨髓腔形成，骨改建已完成，骨皮质基本恢复正常形态。

由此可见，本发明制备的rhBMP-2原位成骨活性好，对1.5cm节段性骨缺损有良好的修复效果。

实施例7长链型rhBMP-2/CPC的复合及其可控释放

取2％的壳聚糖溶解在1％醋酸溶液中，加入5mg实施例1合成的长链型rhBMP-2，按1ml∶10ml的比例逐滴滴加到聚电解质溶液中，反应一定时间后，过滤得到载rhBMP-2壳聚糖微球；分别将载有1mg、3.2mg和5mg的rhBMP-2的壳聚糖微球混入1g CPC骨水泥粉末中，使之充分混合均匀，加入固化液，调和成浆，稍干后将其充入D＝12mm的有机玻璃模具中，待变硬后将其顶出，放置在37℃100％湿度环境的恒温箱内固化24小时；用756MC紫外可见光分光光度计测定1d、2d、4d、7d、14d和30d时rhBMP-2的缓释量。结果表明，采用该法制备的rhBMP-2不影响CPC载体材料的固化和水化产物的形成；CPC能延缓rhBMP-2的释放，从而使蛋白得以有效利用，结果见附图15。

                             序列表

<110>上海瑞邦生物材料有限公司

<120>长链型重组人骨形态发生蛋白-2及其制备方法和应用

<130>SPI068325

<160>6

<170>Patent In versinon 3.1

<210>1

<211>131

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>单链

<222>(1～17)

<223>mutation

<400>1

Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu

1               5                   10                  15

Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser

                20                  25                  30

Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp

                 35                  40                  45

Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys

                  50                  55                  60

His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr

                65                  70                  75

Ser Asp Val Gly Trp Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys

                  80                85                  90

Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser

                95                  100                 105

Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr

1               10                  115                 120

Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

                125                 130

<210>2

<211>125

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>单链

<222>(1～15)

<223>mutation

<400>2

Met Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His

 1               5                   10                  15

Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu

                 20                  25                 30

Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala

                 35                   40                 45

Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe

                50                  55                  60

Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln

                65                  70                  75

Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys

                80                  85                  90

Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu

                95                  100                 105

Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu

                 110                 115               120

Gly Cys Gly Cys Arg

                125

<210>3

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>单链

<222>(1～8)

<223>mutation

<400>3

Met Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu

1                5                  10                  15

Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp

                20                 25                   30

Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala

                35                  40                  45

Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu

                50                  55                   60

Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val

                65                  70                  75

Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser

                 80                 85                    90

Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu

               95                100                 105

Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

                110                 115

<210>4

<211>396bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<400>4

ATG AAA AGA CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT 51

CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC 102

CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT 153

CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG 204

GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC 255

TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT 306

GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC 357

TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG                 396

<210>5

<211>378bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<400>5

                      ATG GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT    33

CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC  84

CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT  135

CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAATGC CCT TTT CCT CTG   186

GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC  237

TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT  288

GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC  339

TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG                  378

<210>6

<211>360bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<400>6

                                               ATG AGA GAA AAA CGT   15

CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC  66

CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT  117

CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG  168

GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC  219

TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT  270

GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC  321

TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG                  360

Claims (10)

1.一种长链型重组人骨形态发生蛋白-2，其特征在于，是由人骨形态发生蛋白-2成熟肽的114个氨基酸和连接在所述的氨基酸的N端的氨基酸的多肽链构成，所说的多肽链为Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg，或以以上肽链为基础的较短的多肽链。

2.根据权利1要求所述的长链型重组人骨形态发生蛋白-2，其特征在于，所说的多肽链的特征为不干扰BMP-2二聚体的形成，不影响BMP-2活性中心的三维空间结构。

3.根据权利1要求所述的长链型重组人骨形态发生蛋白-2，其特征在于，蛋白单链分子量约为13-15KD，经复性后该活性蛋白为二聚体，分子量约为25-30KD。

4.根据权利1要求所述的长链型重组人骨形态发生蛋白-2，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID：NO：2或SEQ ID：NO：4或SEQ ID：NO：6所示。

5.编码权利要求4所述的长链型重组人骨形态发生蛋白-2的基因序列如SEQ ID：NO：1或SEQ ID：NO：3或SEQ ID：NO：5所示。

6.制备权利要求1所述的长链型重组人骨形态发生蛋白-2的方法，包括如下步骤：

①培养人骨肉瘤细胞系U20S，收集细胞，裂解细胞提取mRNA，以Oligo(dT)为引物逆转录得到cDNA，再以cDNA为模板，以BMP-F和BMP-R为引物，扩增出编码羧基端自然结构成熟肽完整114个氨基酸的核苷酸序列，并在正向引物5’端第一个密码子之前增加一段核苷酸，使其对应的氨基酸序列在N端增加一段多肽，得到长链型rhBMP-2基因，得到一条大小为不大于396bp的DNA片段，回收，构建成长链型的人BMP-2基因，在多克隆位点将其插入载体pBV220中，得到rhBMP-2表达质粒pBV220-hBMP-2；

所说的引物的DNA序列为：

BMP-F：5’GGGGAATTCATGCAAGCCAAACACAAACAG3’

BMP-R：5’CCCGGATCCATACTAGCGACACCCACAA3’。

②以氯化钙法制备感受态表达系统后，用①步所得的表达质粒pBV220-BMP2进行转化，在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒；

③从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在25-38℃的条件下以100-300rpm的转速在气浴振荡器中培养2-3小时，再按体积比为1∶8-12的比例将培养物接种到LB培养基中，在100-300rpm、25-38℃的条件下将基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1.2-1.4，培养时间为10-12小时；

然后接入LB培养基中继续培养，接种量为0.1～2.0∶5，种子液∶培养液，体积比，pH7.0±0.2，培养温度为25-38℃，搅拌速度100-600rpm。然后，升温至40～42℃，继续培养4-6小时，培养结束后，在7500-10000rpm 4±2℃条件下，离心分离，收集菌体；

④菌体破碎、洗涤：将步骤③收集的菌体，与TE溶液，按1g∶5-15ml的比例混合，再按1g∶0.3-5mg的比例，与溶菌酶混合，采用细胞破碎技术进行菌体破碎，然后在6000-10000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗涤液的比例加入洗涤液，搅拌2～4h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用洗涤液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物∶20mlTris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；

⑤包涵体裂解、复性和纯化：以1g包涵体∶5～20ml裂解液的比例加入裂解液，在4±2℃下，搅拌裂解8～12小时，离心，离心转速6000～12000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为20～30分钟，弃沉淀，取离心上清液，稀释至蛋白含量为0.1-1mg/ml的样品，按体积比为1∶10～100的比例加入复性液中进行复性2-20天，然后经过疏水柱、亲和层析柱和凝胶色谱柱等进行层析纯化，并经过无菌过滤后，在-30～7℃下冻干，得到长链型重组人骨形态发生蛋白-2。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所说的表达系统为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、草生欧文菌或谷氨酸棒杆菌，所说的抗生素选自氨苄青霉素、链霉素或卡那霉素；LB培养液中，抗生素的含量为10～100μg/ml。

8根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所说的TE溶液为6mM的Tris，和10mM的EDTA，pH7.50；洗涤液为磷酸盐缓冲液、尿素水溶液、曲拉通水溶液。

9.根据权利要求1所述的长链型重组人骨形态发生蛋白-2的应用，其特征在于，用于诱导成骨，可单独使用或与载体材料复合使用。

10.根据权利要求9所述的长链型重组人骨形态发生蛋白-2的应用，其特征在于，所述的载体材料包括无机生物材料(如羟基磷灰石HAP，磷酸三钙，磷酸钙骨水泥，聚合磷酸钙，天然珊瑚，生物玻璃或微晶玻璃等或其复合物)、高分子材料(包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚β-羟基丁酸酯，聚原酸酯、聚碳酸酯等或其复合物)、天然生物材料(包括胶原、明胶等天然蛋白，壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、糖胺聚糖等天然多糖等)或相互间的复合物。

Images