CN101947335A - 细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料及其制备方法。它是以细菌纤维素凝胶膜、明胶、原花青素、CaCl2和模拟体液为原料，细菌纤维素凝胶膜、明胶、原花青素、CaCl2的质量比：100-200∶1-5∶4-6∶6-10。首次以原花青素作为交联剂对明胶进行交联，使明胶包裹在细菌纤维素的纤维表面，制得细菌纤维素/明胶复合材料，进而采用仿生矿化方法制备细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料。本发明提供的复合材料具有良好的力学性能和独特的三维纳米网络结构，在结构和成分上更加接近仿生，满足人体软骨组织工程材料的要求。本发明所用试剂安全无毒性，成本低，制备工艺简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料及其制备方法。
背景技术
随着生物医学工程研究的发展，组织工程已经成为当今科研与临床应用的一大热点。组织工程支架材料的研究也备受研究人员的关注。目前，人们已经利用静电纺丝、相分离等方法制备出胶原、藻酸盐、壳聚糖、PLGA等众多的高分子组织工程支架。与上述生物高分子相比，细菌纤维素具有特殊的结构和物理化学性能。细菌纤维素三维的纳米网络结构、良好的力学性能、透气性能、生物相容性等使其在生物医用领域中具有十分广泛的应用潜力，已被广泛应用于人工皮肤、伤口敷料、人工血管和人工角膜等方面。
最近细菌纤维素作为软骨组织工程支架的研究也有了进展。细菌纤维素与关节软骨组织相似的杨氏模量和良好的细胞黏附性能，使其作为骨修复替代材料具有可行性。软骨细胞在细菌纤维素基体上的繁殖速度虽然仅为胶原II上的50％，但在相同的体外免疫反应程度下，软骨细胞在细菌纤维素基体上的生长速度要高于在藻酸盐基体上的生长速度。在这种由细菌纤维素构成的支架上，软骨细胞保持了分化型。
由于人体骨骼是由羟基磷灰石和胶原复合而成，明胶作为胶原的降解产物，其氨基酸组成和胶原相似，且具有水溶性。鉴于这一特点，许多学者对羟基磷灰石/明胶复合材料进行了研究。发现这种复合材料不仅具有与人体骨骼相似的结构，而且具有多孔和可降解性等优点，但普遍存在力学性能较差的问题，限制了这类支架材料在骨组织工程中的应用。另外，Kim等合成羟基磷灰石/明胶纳米复合材料作为骨组织工程支架，并与非纳米结构的羟基磷灰石/明胶复合材料进行对比，发现前者支架表面造骨细胞的数量和增殖量明显增多，说明纳米结构更有利于造骨细胞的生长和繁殖。细菌纤维素的杨氏模量与关节软骨组织相似，同时具有纳米结构，若在羟基磷灰石/明胶复合材料中引入细菌纤维素，在保持原有材料仿生、多孔和可降解性的前提下，可突破力学性能较低这一难题，同时使材料具有纳米结构。
鉴于此，本发明首次制备了细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料。相比于传统的羟基磷灰石/明胶复合材料，该材料不仅具有仿生的特点，而且具有独特的纳米结构和良好的力学性能，解决了传统羟基磷灰石/明胶复合材料力学性能较低的难题。这种在化学组成、聚集态结构和性能上均与自然骨接近的支架材料将在骨修复领域具有很高的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料及其制备方法。本发明将细菌纤维素与明胶复合，首次以原花青素作为交联剂对明胶进行交联，使明胶包裹在细菌纤维素的纤维表面，制得细菌纤维素/明胶复合材料，进而采用仿生矿化方法制备细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料。细菌纤维素的引入解决了传统羟基磷灰石/明胶支架力学性能较低的难题，并具有独特的纳米结构，有利于细胞的生长和繁殖，满足骨组织工程支架的要求。本发明制备工艺简单，未使用任何有毒药品，安全无毒性。
本发明提供的细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料是以细菌纤维素凝胶膜、明胶、原花青素、CaCl2和模拟体液为原料制成，细菌纤维素凝胶膜、明胶、原花青素、CaCl2的的质量比：100-200∶1-5∶4-6∶6-10，模拟体液是模拟人体血浆中各类无机盐成分，离子浓度为142.0mmol/L Na+、5.0mmol/L K+、3.75mmol/L Ca2+、1.5mmol/L Mg2+、148.8mmol/LCl-、4.2mmol/L HCO3 -、1.5mmol/L HPO4 2-、0.5mmol/L SO4 2-。每100-200克细菌纤维素凝胶膜使用模拟体液600-800毫升。
所述的细菌纤维素凝胶膜是由根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、木醋杆菌中的一种或几种微生物发酵制得，用碱液多次煮沸清洗至乳白色再用去离子水洗至中性。
本发明提供的一种细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料的制备方法经过如下步骤：
1)将细菌纤维素凝胶膜放入1-5克/升的明胶水溶液37摄氏度恒温浸泡0.5-2天；
2)将1)中的凝胶膜取出放入4-6克/升的原花青素溶液，37摄氏度恒温搅拌1-3小时，即得细菌纤维素/明胶复合材料；
3)将2)中的凝胶膜取出放入0.05-0.2摩尔/升的CaCl2溶液，37摄氏度恒温浸泡1-5天；
4)将3)中的凝胶膜取出放入预先配好的模拟体液中，37摄氏度恒温浸泡3-14天，每24小时更新一次模拟体液，即得细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料。
本发明将细菌纤维素与明胶复合，首次以原花青素作为交联剂对明胶进行交联，使明胶包裹在细菌纤维素的纤维表面，制得细菌纤维素/明胶复合材料，进而采用仿生矿化方法制备细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料。细菌纤维素的引入解决了传统羟基磷灰石/明胶支架力学性能较低的难题，并具有独特的纳米结构，有利于细胞的生长和繁殖，满足骨组织工程支架的要求。
本发明使用原花青素作为细菌纤维素和明胶的交联剂，原花青素作为可食用的滋补品，安全无毒性。本发明使用的原料廉价易得，成本低。本发明在常压下即可完成材料制备，工艺简单，未使用任何有毒药品，安全无毒性。
附图说明
图1实施例1所得样品的X射线衍射图谱。
图2实施例1所得样品的扫描电镜照片(a)细菌纤维素/明胶复合材料的扫描电镜照片，(b)细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料的扫描电镜照片。
具体实施方式
实施例1：
将葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二钠按质量分数分别为2.5％、1％、0.75％、1％依次加入烧杯中，用醋酸调节pH值至4.5，115摄氏度高温灭菌半小时后取出，作为木醋杆菌生长的培养基。
木醋杆菌菌种至于琼脂固体培养基中，在4摄氏度下冷藏保存。用铁丝在固态培养基中轻轻划一下，立即浸入100毫升液体培养基中，30摄氏度振荡培养30小时，摇床转速为160转/分钟，作为种子溶液。以种子溶液的体积分数不少于6％的接种量接种到液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，30摄氏度恒温静置培养5天，得到细菌纤维素凝胶膜。用质量分数1％的氢氧化钠溶液清洗至乳白色，再用去离子水洗至中性。
配制100毫升2.5克/升的明胶(比利时Acros Organics公司生产)水溶液。取20克细菌纤维素凝胶膜放入明胶水溶液中，37摄氏度恒温充分搅拌1天。将凝胶膜取出，放入100毫升5克/升原花青素水溶液中，37摄氏度恒温搅拌2小时。反应结束后，将凝胶膜放入80毫升浓度为0.1摩尔/升的CaCl2溶液中，37摄氏度恒温浸泡3天。将凝胶膜取出，置于80毫升预先配好的模拟体液中，在37摄氏度恒温浸泡7天，即得细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料。
配制模拟体液：向去离子水中依次加入NaCl、NaHCO3、KCl、Na2HPO4·7H2O、MgCl、HCl、CaCl2、Na2SO4，配得模拟体液的离子浓度为142.0mmol/L Na+、5.0mmol/L K+、3.75mmol/L Ca2+、1.5mmol/L Mg2+、148.8mmol/L Cl-、4.2mmol/L HCO3 -、1.5mmol/L HPO4 2-、0.5mmol/L SO4 2-，最后用tris((CH2-OH)3CNH2)将pH值调至7.4。
本发明首次成功制备了细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料。由图1所示的X射线衍射可知，材料中分别出现了细菌纤维素、明胶和羟基磷灰石的衍射峰，且无其他杂质峰，证明制得了成分纯净的细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料。
本发明制得的细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料首先以原花青素作为交联剂，制得细菌纤维素/明胶复合材料，在细菌纤维素的纳米纤维上均匀包裹上一层球状蛋白类物质，见图2(a)。再对细菌纤维素/明胶复合材料进行仿生矿化，在已包裹明胶的纳米纤维上沉积羟基磷灰石。由图2(b)可知，片状羟基磷灰石均匀包裹在含有明胶的纤维表面，复合材料仍然保留了细菌纤维素清晰的三维纳米网络结构。
实施例2：
配制100毫升1克/升的明胶水溶液，将凝胶膜置于预先配好的模拟体液中恒温浸泡3天，其他实验条件同实施例1。
Claims (7)
1.一种细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料，其特征在于它是以细菌纤维素凝胶膜、明胶、原花青素、CaCl2和模拟体液为原料制成，细菌纤维素凝胶膜、明胶、原花青素、CaCl2的的质量比：100-200∶1-5∶4-6∶6-10。
2.根据权利要求1中所述的复合材料，其特征在于所述的模拟体液各类无机盐成分离子浓度为：142.0mmol/L Na+、5.0mmol/L K+、3.75mmol/L Ca2+、1.5mmol/L Mg2+、148.8mmol/L Cl-、4.2mmol/L HCO3 -、1.5mmol/L HPO4 2-和0.5mmol/L SO4 2-。
3.根据权利要求1中所述的复合材料，其特征在于所述的每100-200克细菌纤维素凝胶膜使用模拟体液600-800毫升。
4.根据权利要求1中所述的复合材料，其特征在于所述的细菌纤维素凝胶膜是由根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、木醋杆菌中的一种或几种微生物发酵制得，用碱液多次煮沸清洗至乳白色再用去离子水洗至中性。
5.一种权利要求1中所述的细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于经过如下步骤：
1)将细菌纤维素凝胶膜放入1-5克/升的明胶水溶液，37摄氏度恒温浸泡0.5-2天；
2)将1)中的凝胶膜取出放入4-6克/升的原花青素溶液，37摄氏度恒温搅拌1-3小时，即得细菌纤维素/明胶复合材料；
3)将2)中的凝胶膜取出放入0.05-0.2摩尔/升的CaCl2溶液，37摄氏度恒温浸泡1-5天；
4)将3)中的凝胶膜取出放入预先配好的模拟体液中，37摄氏度恒温浸泡3-14天，每24小时更新一次模拟体液，即得细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料。
6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于所述的模拟体液的离子浓度为142.0mmol/L Na+、5.0mmol/L K+、3.75mmol/L Ca2+、1.5mmol/L Mg2+、148.8mmol/L Cl-、4.2mmol/L HCO3 -、1.5mmol/L HPO4 2-和0.5mmol/L SO4 2-。
7.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于所述的细菌纤维素凝胶膜是由木醋杆菌在培养基中发酵制得，用碱液多次煮沸清洗至乳白色再用去离子水洗至中性。
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