CN100460020C - 一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：(1)将菌种活化，取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于25～33℃，在转速为400～450rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养20～25小时，再接入液体培养基中培养6～10天；(2)观察到表面形成一层薄膜时，用滴管将重新制备的培养液缓缓加入到薄膜上；(3)每隔5～6天重复操作步骤(2)，直到薄膜均匀深度为3～8mm为止；(4)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。本发明的有益效果是：制备的多层细菌纤维素膜将对细菌纤维素膜在医用敷料、人造皮肤、医用纱布等方面的应用有良好的推动作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌纤维素膜的制备方法，特别是涉及一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法。
背景技术
纤维素是天然植物纤维的主要成分，细菌纤维素是由微生物产生的一类纤维素，从纤维素的分子组成看，二者都是由β-D-葡萄糖通过β-1，4-葡萄糖苷键结合成的直链，直链间彼此平行，不呈螺旋构象，无分支结构，又称β-1，4-葡萄糖。细菌纤维素和植物纤维素在化学性质上是相同的，但细菌纤维素作为一种新型生物材料，有许多独特的性质。(1)高杨氏模量、高抗张强度和极佳的形状维持能力。(2)超细(纳米级)，细菌纤维丝带的形成过程如下：木醋杆菌细胞壁侧的小孔分泌出的纤维素微纤丝直径为1.78nm，相邻几根微纤维丝间由氢键相互联接形成的微纤束直径为3～4nm，而由微纤维束联接成的纤维丝带宽度为30～100nm厚度为3～8nm。(3)高纯纤维网状结构。(4)有较高的生物适应性和良好的生物可降解性。
细菌纤维素用于人造皮肤或其他医用材料有很好的发展前景，将多层细菌纤维素用于医学领域将会起到更好的效果。而目前的细菌纤维素膜都是单层的，应用的效果不是非常理想；因此，我们特此发明多层细菌纤维素膜。比如说多层细菌纤维素膜用于绷带，层与层之间可以形成药物浓度梯度起到药物缓释的效果。根据同样的缓释原理也可以用于其他的材料中，这就可以起到自动调节浓度的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法，以弥补现有技术的不足或缺陷，满足生产和生活的需要。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化过程为，用无菌吸管吸取0.2～0.6ml液体培养基，滴入盛菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在25～33℃培养1～3天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔1～3天转移一次，如此重复6～10次，完成菌种的活化过程；
(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于25～33℃，在转速为400～450rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养20～25小时，再接入液体培养基中培养6～10天；然后在观察到表面形成一层薄膜时，用滴管将重新制备的培养液缓缓加入到薄膜上；
(3)每隔5～6天重复操作步骤(2)，直到薄膜平均深度为3～8mm为止；
(4)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。
所述的菌种包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
作为优选的技术方案：所述的斜面培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO3 1～30g和琼脂1～30g。
所述的液体培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO31～30g、蛋白胨1～20g、柠檬酸1～10g、Na2HPO4 1～10g和KH2PO4 1～10g。
所述的种子培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～100g、蔗糖10～50g、酵母膏1～10g、蛋白胨1～20g、柠檬酸1～10g、Na2HPO4 1～10g、KH2PO4 1～10g和MgSO4 1～10g。
整个培养及接种过程是在无菌室中完成的。
本发明的原理是：从细菌纤维素生物合成的初步阶段着手，结合细菌合成纤维素的好氧规律，经过反复的实验探索摸索出一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法。
本发明的有益效果是：(1)总结细菌纤维素合成过程中的规律，从而有目的地指导今后细菌纤维素膜的合成。(2)在熟练细菌纤维素膜制备的基础上，探索多层细菌纤维素膜的制备方法。(3)多层细菌纤维素膜将对细菌纤维素膜在医用敷料、人造皮肤、医用纱布等方面的应用有良好的推动作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细阐述。
实施例1：
(1)用无菌吸管吸取0.2ml液体培养基，滴入盛木醋杆菌菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在33℃培养1天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔1天转移一次，如此重复6次，完成菌种的活化过程；将一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于25℃在转速为400rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养20h，再以4％接种量接入液体培养基中培养3天；(2)仔细观察液体培养基表面，在表面形成一层薄膜时，用滴管将重新制备的培养液缓缓加入到薄膜上，使其分布平均深度为3mm；(3)隔5天重复操作(2)；5天后取出纤维素膜可以发现制得的纤维素膜为粘连在一起的双层细菌纤维素膜。
其中，斜面培养基成分为：1L水中含葡萄糖10g、酵母膏1g、CaCO3 30g、琼脂30g。
液体培养基成分为：1L水中含葡萄糖10g、酵母膏1g、CaCO3 1g、蛋白胨20g、柠檬酸10g、Na2HPO4 10g、KH2PO4 10g。
种子培养基成分为：1L水中含葡萄糖10g、蔗糖10g、酵母膏1g、蛋白胨1g、柠檬酸10g、Na2HPO4 10g、KH2PO4 10g、MgSO4 10g。
实施例2：
(1)用无菌吸管吸取0.6ml液体培养基，滴入盛葡萄糖杆菌菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在25℃培养3天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔3天转移一次，如此重复10次，完成菌种的活化过程；将一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于30℃在转速为420rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养22h，再以6％接种量接入液体培养基中培养3天；(2)仔细观察液体培养基表面，在表面形成一层薄膜时，用滴管将重新制备的培养液缓缓加入到薄膜上，使其分布平均深度为4mm；(3)隔4天重复操作(2)，重复2次；10天后取出纤维素膜可以发现制得的纤维素膜为粘连在一起的三层细菌纤维素膜。
其中，斜面培养基成分为：1L水中含葡萄糖120g、酵母膏20g、CaCO3 1g、琼脂1g。
液体培养基成分为：1L水中含葡萄糖120g、酵母膏20g、CaCO3 30g、蛋白胨1g、柠檬酸1g、Na2HPO4 1g、KH2PO4 1g。
种子培养基成分为：1L水中含葡萄糖100g、蔗糖50g、酵母膏10g、蛋白胨20g、柠檬酸1g、Na2HPO4 1g、KH2PO4 1g、MgSO4 1g。
实施例3：
(1)用无菌吸管吸取0.4ml液体培养基，滴入盛产醋杆菌菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在30℃培养2天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔2天转移一次，如此重复8次，完成菌种的活化过程；将一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于28℃在转速为400rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养24h，再以8％接种量接入液体培养基中培养3天；(2)仔细观察液体培养基表面，在表面形成一层薄膜时，用滴管将重新制备的培养液缓缓加入到薄膜上，使其分布平均深度为5mm；(3)隔3天重复操作(2)，重复3次；10天后取出纤维素膜可以发现制得的纤维素膜为粘连在一起的四层细菌纤维素膜。
其中，斜面培养基成分为：1L水中含葡萄糖100g、酵母膏10g、CaCO3 10g、琼脂10g。
液体培养基成分为：1L水中含葡萄糖100g、酵母膏10g、CaCO3 20g、蛋白胨10g、柠檬酸5g、Na2HPO4 5g、KH2PO4 5g。
种子培养基成分为：1L水中含葡萄糖50g、蔗糖30g、酵母膏5g、蛋白胨10g、柠檬酸5g、Na2HPO4 5g、KH2PO4 5g、MgSO4 5g。
Claims (4)
1.一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化过程为，用无菌吸管吸取0.2～0.6ml液体培养基，滴入盛菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在25～33℃培养1～3天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔1～3天转移一次，如此重复6～10次，完成菌种的活化过程；
(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于25～33℃，在转速为400～450rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养20～25小时，再接入液体培养基中培养6～10天；然后在观察到表面形成一层薄膜时，用滴管将重新制备的培养液缓缓加入到薄膜上；
(3)每隔5～6天重复操作步骤(2)，直到薄膜平均深度为3～8mm为止；
(4)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存；
所述的菌种包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的斜面培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO3 1～30g和琼脂1～30g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的液体培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO3 1～30g、蛋白胨1～20g、柠檬酸1～10g、Na2HPO4 1～10g和KH2PO4 1～10g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的种子培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～100g、蔗糖10～50g、酵母膏1～10g、蛋白胨1～20g、柠檬酸1～10g、Na2HPO4 1～10g、KH2P04 1～10g和MgSO4 1～10g。
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