CN107737375A - 一种生物纤维素皮肤修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物纤维素皮肤修复材料及其制备方法，制备方法为：将菌液加入到培养乳液中均匀分散后静置培养得到生物纤维素皮肤修复材料，菌液为菌株在水中分散的体系，培养乳液为水包油型乳液，其中水相为菌株培养液，菌株是指能够生物合成纤维素纳米纤维的微生物。本发明的生物纤维素皮肤修复材料及其制备方法，制备方法简单易行、操作方便且成本低，制备过程中材料自身结构容易调控，最终制得的生物纤维素皮肤修复材料具有生物相容性好、力学性能优良和吸水性与持水性佳的优点，可减少水分挥发，保持湿性状态，有效阻隔外界细菌，促进细胞的粘附和增殖速度，导向细胞进入材料内部，加快周围组织的血管化，从而显著加快皮肤创伤的修复。

Description

一种生物纤维素皮肤修复材料及其制备方法
技术领域
本发明属于医用材料领域，具体涉及一种生物纤维素皮肤修复材料及其制备方法。
背景技术
皮肤的损伤是临床医疗工作者面临的最古老和最常见的疾病之一。目前临床上应用最多的人工皮肤替代物是自体表皮替代物，但自体来源有限，并且容易造成二次损伤。因此，能够模拟天然皮肤组织结构的皮肤修复材料是目前皮肤组织修复研究的热点。
生物纤维素(又称细菌纤维素，Baterial Cellulose BC)是由微生物在温和条件下通过代谢糖源，并分泌于体外的一种胞外多糖，是自然界纤维素存在的一种形式。生物纤维素具有良好的生物相容性、高抗张强度和弹性模量以及良好的透气、吸水和持水性能，同时生物纤维素所具有的极低的免疫源性和优良的组织相容性，使其能够作为多种组织器官修复重建的支架材料。然而BC本身并没有微米级多孔结构，其纳米纤维形成的网络结构孔径只有0.05～5μm。为了解决这个限制问题，提高BC支架材料的细胞渗透性，促进细胞长入与血管化，研究人员进行了大量的研究。
目前BC多孔结构材料的制备方法主要有：发泡法，冷冻干燥法以及致孔剂法。例如专利CN102276876A采用发泡法对BC进行后处理，能够在BC薄膜内部形成均匀、连续的互通多孔结构，平均孔径在20μm。这种发泡法制备工艺简单，但孔径较小并且孔径分布难以控制，且发泡过程中试剂有一定的细胞毒性；文献Engineering microporosity inbacterial cellulose scaffolds公开了一种使用淀粉、石蜡和琼脂球作为致孔剂制备三维BC组织工程支架材料的制备方法，其中多孔结构可以通过改变致孔剂的尺寸和发酵条件来控制，这种方法可以更好的控制孔径大小及孔径分布，保持原有的BC纳米网络结构，但致孔剂去除过程较为繁琐，支架的连通性较低；根据文章Preparation andcharacterization of bacterial cellulose sponge with hierarchical porestructure as tissue engineering scaffold的报道，冷冻干燥法能够通过控制体系浓度、冷冻温度和模具，获得理想的支架孔径，孔隙率，连通性以及宏观形貌，但这种方法破坏了BC原有的能够模拟ECM的三维纳米网络结构，同时原有的纳米纤维之间的氢键作用被可溶性多糖的粘合作用所替代，降低了材料的力学性能、微孔孔壁的纳米粗糙度和比表面积，进一步降低了细胞与纳米纤维之间的相互作用。
专利CN 103861154B公开了一种由外层细菌纤维素膜和内层静电纺丝多孔支架构成的双层复合骨组织工程支架及制备方法。该方法是把冷冻干燥后的细菌纤维素膜作为静电纺丝的接受器，在其上沉积PLGA/MWNTs复合纳米纤维。但是由于静电纺丝方法的局限性，双层材料中多孔疏松部分的孔径大小及材料厚度调控有限。专利CN102973985B公开了一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料及其制备方法，通过控制细菌纤维素的培养条件并在培养过程中加入缓释微球制备出一种具有类似人体皮肤“上密下疏”结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。该方法首次提出了细菌纤维素双层疏密结构的原位发酵制备，但该方法中氧气分压的控制与缓释微球的制备，均较为复杂，且材料结构的控制参数复杂多变。
因此，研究一种制备简便且材料自身结构易调控的生物纤维素皮肤修复材料及其制备方法具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的生物纤维素皮肤修复材料制备过程复杂和材料自身结构难以调控的问题，提供一种制备简便且材料自身结构易调控的生物纤维素皮肤修复材料及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，将菌液加入到培养乳液中均匀分散后静置培养得到生物纤维素皮肤修复材料；所述菌液为菌株在水中分散的体系，所述培养乳液为水包油型乳液，其中水相为菌株培养液，所述菌株是指能够生物合成纤维素纳米纤维的微生物。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，所述菌株培养液中各组分及其含量为：葡萄糖2～5wt％，蛋白胨0.05～0.5wt％，酵母膏0.05～0.5wt％，柠檬酸0.01～0.1wt％，磷酸氢二钠0.02～0.2wt％，磷酸二氢钾0.01～0.1wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将不同组分均质乳化后通入少量气体得到pH值为5～7的培养乳液，按重量份数计，所述培养乳液中各组分及其含量为：菌株培养液50～80份，油5～30份，乳化剂3～15份，增稠稳定剂5～22份；
将冷藏的菌株在室温解冻，并置于菌株培养液中，在28～32℃条件下摇床培养6～24h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在28～32℃条件下静置培养3～5天得到菌液，所述摇床培养时摇床的转速为50～150r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的10～100倍；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在28～32℃条件下静置培养3～9天得到生物纤维素膜，所述菌液与培养乳液的体积比为1:10～1000；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为0.5～3wt％的氢氧化钠溶液或浓度为0.1～3wt％的Triton X-100溶液中，静置0.5～12小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL时灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
如上所述的一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，步骤(2)中，所述油为花生油、椰子油、大豆油或矿油中的一种以上；
所述乳化剂为聚山梨酯、蔗糖脂肪酸酯、氢化卵磷脂或聚氧乙烯氢化蓖麻油中的一种以上；
所述增稠稳定剂为明胶、海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸钠或羧甲基纤维素钠中的一种以上；
所述通入少量气体是指将医用氧气或空气以0.1～1L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟。本发明能够生物合成纤维素纳米纤维的微生物主要为耗氧菌，少量氧气或空气的加入可以提高菌株的转化效率，提高产率。同时，少量气体在黏度较高的培养乳液中能够起到一定的致孔剂作用，有助于提高最终产物的孔隙率。
如上所述的一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，步骤(2)中，所述菌株为葡糖醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种以上；本发明中菌株的种类包括但不限于此，能够生物合成纤维素纳米纤维的微生物都可以作为本发明的菌株。
所述菌液中单位体积内菌株细胞的数目为1×103～1×1011个/mL。
如上所述的一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，步骤(4)中，所述灭菌指采用高能射线辐照灭菌、压力蒸汽灭菌或电子束灭菌。
本发明还提供了一种如上所述的制备方法制得的生物纤维素皮肤修复材料，生物纤维素皮肤修复材料具有双层结构，由上层致密部分和下层多孔疏松部分组成；
所述上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，上层致密部分的密度为20～50kg/m3；
所述下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，下层多孔疏松部分的密度为5～15kg/m3；相互连通的多孔网络可以保证生物信号、氧气和营养物质进入材料内部，提高细胞增殖和迁移速度，促进组织血管化和新生组织的形成；而具有高孔隙率和比表面积的纳米纤维材料能够影响细胞-材料的相互作用，促进物质传输，提高细胞黏附、增殖、分化以及基质表达等细胞行为的速度。本发明中皮肤修复材料的下层多孔疏松部分是相互交错的生物纤维素纳米纤维构成的兼具微米多孔与纳米纤维的多孔疏松结构，具有上述多孔网络与纳米纤维材料共同的优势，能够促进细胞粘附和增殖，导向细胞进入材料内部，加快周围组织的血管化，从而显著加快皮肤创伤的修复。
所述上层致密部分与下层多孔疏松部分通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合，无明显的外力分层现象。
作为优选的技术方案：
如上所述的生物纤维素皮肤修复材料，所述生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为80％以上，所述生物纤维素皮肤修复材料的厚度为1～10mm，其中上层致密部分的厚度为0.02～4mm。正常的人体皮肤厚度为0.5～4mm，而不同生理部位皮肤厚度差异性较大。因此，控制皮肤修复材料的厚度有一定的必要性。本发明的生物纤维素皮肤修复材料可以通过调节培养时间、菌株数目与培养乳液用量等精确调控材料的厚度，同时改变培养体系黏度能够进一步调节双层结构的比例结构。上层致密部分厚度对于皮肤修复材料的细胞阻隔作用、水蒸气透过率和力学性能等有显著影响；而下层多孔疏松部分结构能够影响材料的吸水性能、细胞增殖率和血管化等指标。因此，在材料设计时，应根据实际的用途综合考虑生物纤维素皮肤修复材料的厚度以及上、下层比例。
如上所述的生物纤维素皮肤修复材料，所述纤维素纳米纤维的平均直径为20～100nm。
如上所述的生物纤维素皮肤修复材料，所述上层致密部分的平均孔径为3～10μm，所述下层多孔疏松部分的平均孔径为80～200μm。
发明机理：
本发明的目的是制备一种具有类似人体皮肤组织脱细胞基质的“上层致密和下层疏松多孔”双层结构的生物纤维素皮肤修复材料。生物纤维素膜的传统培养方法是将菌株均匀分散在水相的菌株培养液中，静态发酵，得到由生物纤维素纳米纤维互相交织形成的较为致密的三维网络结构，本发明采用水包油型乳液作为发酵体系，油相以微小液滴的形式被乳化剂包裹均匀分散在水相(菌株培养液)中，同时增稠剂的引入使得水相具有较高的黏度，在静置培养阶段，将菌液加入到培养乳液中，由于菌液与培养乳液中的水相(菌株培养液)均为水性液体，菌株将均匀分散在培养乳液的水相中，同时，由于乳化剂的保护以及水相黏度的影响，菌株很难进入到油相颗粒中去。在生物纤维素生化合成过程中，菌株细胞作为生物合成反应器，将营养物质在酶催化作用下生成纤维素微纤丝，菌株细胞携带着微纤丝束在培养乳液的水相中无规运动，由于油相液滴的空间位阻作用，菌种只能在水相中生物合成纤维素纤维，从而形成了生物纤维素下层多孔的结构，而在培养体系的上表面，由于表面张力以及油相液滴自身重力作用，水相在乳液液面上形成了薄层水相液面，在这一较小的区域内，菌株的培养与传统方式相似，因此，在培养体系的上表面形成了上层致密的生物纤维素薄膜。采用本发明的制备方法，由于菌株细胞是均匀分散在培养体系的水相中的，因此形成的生物纤维素皮肤修复材料为整体结构，上层致密部分与下层多孔疏松部分是由连续的、互相交织的纤维素纳米纤维通过分子内与分子间氢键结合而形成的，无明显的外力分层现象，同时培养乳液中的增稠剂能够调节培养系统粘度，控制油相液滴的分布与体系中的溶氧指数，从而进一步调节生物纤维素聚集体中上层致密部分与下层多孔疏松部分的结构。
有益效果：
(1)本发明的一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，制备方法简单易行、操作方便且成本低，制备过程中材料自身的厚度和多孔结构容易调控，最终制得的生物纤维素皮肤修复材料具有生物相容性好、力学性能优良和吸水性与持水性佳的优点；
(2)本发明的一种生物纤维素皮肤修复材料，具有类似人体皮肤组织脱细胞基质的“上层致密和下层疏松多孔”的双层结构，上层致密部分可减少水分挥发，保持湿性状态，同时致密的纳米纤维网络具有阻隔外界细菌的功能；下层疏松多孔且孔壁表面存在纤维素纳米纤维网络，能够促进细胞的粘附和增殖速度，导向细胞进入材料内部，加快周围组织的血管化，从而显著加快皮肤创伤的修复；
(3)本发明的一种生物纤维素皮肤修复材料，可制备湿性敷料，用于治疗各类慢性皮肤创伤、烧伤、烫伤和手术切口等多种皮肤类创伤，也可以作为细胞的承载支架，用于各类皮肤缺损和色素脱失等皮肤疾病的治疗，应用范围广泛。
附图说明
图1是本发明的生物纤维素皮肤修复材料的截面示意图；
图2是本发明的生物纤维素皮肤修复材料的的截面扫描电镜图；
图3是图2中上层致密部分的截面扫描电镜图；
图4是图2中下层多孔疏松部分的截面扫描电镜图；
其中，1-上层致密部分，2-下层多孔疏松部分。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为2wt％，蛋白胨的含量为0.3wt％，酵母膏的含量为0.5wt％，柠檬酸的含量为0.05wt％，磷酸氢二钠的含量为0.02wt％，磷酸二氢钾的含量为0.1wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为50份的菌株培养液、6份的花生油、15份的聚山梨酯以及5份的明胶进行均质乳化后将医用氧气以0.1L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为5的培养乳液；
将冷藏的葡糖醋杆菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在28℃条件下摇床培养24h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在28℃条件下静置培养3天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为100r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的100倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为1×103个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在28℃条件下静置培养3天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:30；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为0.5wt％的氢氧化钠溶液中，静置0.5小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用高能射线辐照灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
如图1～2所示，采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料具有由上层致密部分1和下层多孔疏松部分2所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。如图3所示，上层致密部分1是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，测得的密度为20kg/m3，平均孔径为4μm；如图4所示，下层多孔疏松部分2是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，测得的密度为15kg/m3，平均孔径为150μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为20nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为85％，厚度为10mm，其中上层致密部分的厚度为3.09mm。
实施例2
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为3wt％，蛋白胨的含量为0.10wt％，酵母膏的含量为0.05wt％，柠檬酸的含量为0.09wt％，磷酸氢二钠的含量为0.05wt％，磷酸二氢钾的含量为0.01wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为52份的菌株培养液、5份的椰子油、3份的蔗糖脂肪酸酯以及22份的海藻酸钠进行均质乳化后将医用空气以1L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为7的培养乳液；
将冷藏的产醋杆菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在28℃条件下摇床培养7h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在28℃条件下静置培养3天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为60r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的90倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为5×103个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在32℃条件下静置培养3天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:10；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为1wt％的Triton X-100溶液中，静置2小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用压力蒸汽灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为23kg/m3，平均孔径为10μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为14kg/m3，平均孔径为200μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为100nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为81％，厚度为4mm，其中上层致密部分的厚度为1.73mm。
实施例3
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为4wt％，蛋白胨的含量为0.4wt％，酵母膏的含量为0.15wt％，柠檬酸的含量为0.1wt％，磷酸氢二钠的含量为0.02wt％，磷酸二氢钾的含量为0.08wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为56份的菌株培养液、9份的大豆油、5份的氢化卵磷脂以及21份的壳聚糖进行均质乳化后将医用氧气以0.2L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为5的培养乳液；
将冷藏的醋化杆菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在29℃条件下摇床培养10h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在29℃条件下静置培养3天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为50r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的30倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为1×104个/mL。
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在28℃条件下静置培养8天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:70；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为1.5wt％的Triton X-100溶液中，静置6小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用电子束灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为31kg/m3，平均孔径为3μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为5kg/m3，平均孔径为80μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为30nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为82％，厚度为1mm，其中上层致密部分的厚度为0.18mm。
实施例4
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为5wt％，蛋白胨的含量为0.05wt％，酵母膏的含量为0.1wt％，柠檬酸的含量为0.08wt％，磷酸氢二钠的含量为0.04wt％，磷酸二氢钾的含量为0.07wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为65份的菌株培养液、12份的矿油、7份的聚氧乙烯氢化蓖麻油以及17份的透明质酸钠进行均质乳化后将医用氧气以0.3L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为7的培养乳液；
将冷藏的巴氏醋杆菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在30℃条件下摇床培养6h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在29℃条件下静置培养4天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为90r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的40倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为6×105个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在30℃条件下静置培养8天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:90；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为2.5wt％的氢氧化钠溶液中，静置5小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用压力蒸汽灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为35kg/m3，平均孔径为8μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为13kg/m3，平均孔径为100μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为50nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为84％，厚度为5mm，其中上层致密部分的厚度为2.2mm。
实施例5
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为2.5wt％，蛋白胨的含量为0.25wt％，酵母膏的含量为0.2wt％，柠檬酸的含量为0.07wt％，磷酸氢二钠的含量为0.08wt％，磷酸二氢钾的含量为0.06wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为68份的菌株培养液、17份的花生油和大豆油的混合物(质量比为1:1)、8份的聚山梨酯和蔗糖脂肪酸酯的混合物(质量比为2:1)以及22份的羧甲基纤维素钠进行均质乳化后将医用空气以0.4L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为6的培养乳液；
将冷藏的葡萄糖杆菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在29℃条件下摇床培养8h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在30℃条件下静置培养4天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为90r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的50倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为3×106个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在31℃条件下静置培养7天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:700；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为3wt％的氢氧化钠溶液中，静置6小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用高能射线辐照灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为25kg/m3，平均孔径为9μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为5kg/m3，平均孔径为110μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为40nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为80％，厚度为1mm，其中上层致密部分的厚度为0.05mm。
实施例6
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为3.5wt％，蛋白胨的含量为0.5wt％，酵母膏的含量为0.25wt％，柠檬酸的含量为0.06wt％，磷酸氢二钠的含量为0.09wt％，磷酸二氢钾的含量为0.04wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为50份的菌株培养液、20份的椰子油和矿油的混合物(质量比为2:1)、12份的氢化卵磷脂和聚氧乙烯氢化蓖麻油的混合物(质量比为1:1)以及13份的明胶和海藻酸钠的混合物(质量比为2:1)进行均质乳化后将医用空气以0.5L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为6的培养乳液；
将冷藏的农杆菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在31℃条件下摇床培养11h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在30条件下静置培养3天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为110r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的60倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为1×107个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在29℃条件下静置培养5天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:100；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为2wt％的Triton X-100溶液中，静置7.5小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用电子束灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为35kg/m3，平均孔径为7μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为10kg/m3，平均孔径为120μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为60nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为89％，厚度为8mm，其中上层致密部分的厚度为3mm。
实施例7
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为4.5wt％，蛋白胨的含量为0.35wt％，酵母膏的含量为0.35wt％，柠檬酸的含量为0.05wt％，磷酸氢二钠的含量为0.11wt％，磷酸二氢钾的含量为0.05wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为60份的菌株培养液、23份的花生油、椰子油和矿油的混合物(质量比为1:2:1)、15份的聚山梨酯和聚氧乙烯氢化蓖麻油的混合物(质量比为1:1)以及12份的壳聚糖和透明质酸钠的混合物(质量比为1:1)进行均质乳化后将医用氧气以0.6L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为7的培养乳液；
将冷藏的根瘤菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在32℃条件下摇床培养13h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在32℃条件下静置培养5天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为120r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的80倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为8×107个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在31℃条件下静置培养4天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:200；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为1.5wt％的氢氧化钠溶液中，静置6小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用压力蒸汽灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为50kg/m3，平均孔径为6μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为9kg/m3，平均孔径为150μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为70nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为80％，厚度为3mm，其中上层致密部分的厚度为0.1mm。
实施例8
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为5wt％，蛋白胨的含量为0.15wt％，酵母膏的含量为0.3wt％，柠檬酸的含量为0.03wt％，磷酸氢二钠的含量为0.12wt％，磷酸二氢钾的含量为0.1wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为74份的菌株培养液、26份的椰子油、大豆油和矿油的混合物(质量比为2：1：1)、4份的聚山梨酯、蔗糖脂肪酸酯和氢化卵磷脂的混合物(质量比为2:1:2)以及10份的海藻酸钠、壳聚糖和透明质酸钠的混合物(质量比为1:1:2)进行均质乳化后将医用空气以0.7L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为5的培养乳液；
将冷藏的八叠球菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在32℃条件下摇床培养6h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在28℃条件下静置培养3天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为50r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的10倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为3×108个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在32℃条件下静置培养9天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:300；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为2wt％的氢氧化钠溶液中，静置2小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用电子束灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为42kg/m3，平均孔径为5μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为8kg/m3，平均孔径为200μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为90nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为90％，厚度为10mm，其中上层致密部分的厚度为3.8mm。
实施例9
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为2wt％，蛋白胨的含量为0.2wt％，酵母膏的含量为0.4wt％，柠檬酸的含量为0.02wt％，磷酸氢二钠的含量为0.14wt％，磷酸二氢钾的含量为0.03wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为72份的菌株培养液、30份的花生油、椰子油、大豆油和矿油的混合物(质量比为1:2:2:1)、8份的蔗糖脂肪酸酯、氢化卵磷脂和聚氧乙烯氢化蓖麻油的混合物(质量比为1:1:2)以及8份的明胶、海藻酸钠、透明质酸钠和羧甲基纤维素钠的混合物(质量比为1:2:2:1)进行均质乳化后将医用空气以0.7L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为6的培养乳液；
将冷藏的洋葱假单胞菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在29℃条件下摇床培养15h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在31℃条件下静置培养4天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为130r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的30倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为1×103个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在28℃条件下静置培养3天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:600；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为3wt％的Triton X-100溶液中，静置0.5小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用高能射线辐照灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为37kg/m3，平均孔径为4μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为5kg/m3，平均孔径为80μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为60nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为87％，厚度为7mm，其中上层致密部分的厚度为4mm。
实施例10
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为5wt％，蛋白胨的含量为0.10wt％，酵母膏的含量为0.45wt％，柠檬酸的含量为0.01wt％，磷酸氢二钠的含量为0.15wt％，磷酸二氢钾的含量为0.02wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为80份的菌株培养液、5份的花生油和矿油的混合物(质量比为1:1)、3份的聚山梨酯、氢化卵磷脂和聚氧乙烯氢化蓖麻油的混合物(质量比为1:2:2)以及6份的海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸钠和羧甲基纤维素钠的混合物(质量比为1:1:2:1)进行均质乳化后将医用氧气以0.8L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为7的培养乳液；
将冷藏的椰毒假单胞菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在30℃条件下摇床培养22h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在28℃条件下静置培养5天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为140r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的20倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为4×1010个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在29℃条件下静置培养5天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:800；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为0.5wt％的氢氧化钠溶液中，静置12小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用电子束灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为20kg/m3，平均孔径为10μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为7kg/m3，平均孔径为160μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为20nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为80％，厚度为2mm，其中上层致密部分的厚度为0.32mm。
实施例11
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，其中菌株培养液中葡萄糖的含量为5wt％，蛋白胨的含量为0.05wt％，酵母膏的含量为0.25wt％，柠檬酸的含量为0.01wt％的，磷酸氢二钠的含量为0.2wt％的，磷酸二氢钾的含量为0.01wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将重量份数为56份的菌株培养液、15份的花生油、椰子油和矿油的混合物(质量比为1:1:2)、10份的聚山梨酯、蔗糖脂肪酸酯、氢化卵磷脂和聚氧乙烯氢化蓖麻油的混合物(质量比为1:1:2:1)以及5份的明胶、海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸钠和羧甲基纤维素钠的混合物(质量比为1:1:2:2:1)进行均质乳化后将医用氧气以1L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟，得到pH值为5的培养乳液；
将冷藏的空肠弯曲菌在室温下解冻，并置于菌株培养液中，在32℃条件下摇床培养24h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在32℃条件下静置培养5天得到菌液，其中摇床培养时摇床的转速为150r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的10倍，得到的菌液中单位体积内菌株细胞的数目为1×1011个/mL；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在28℃条件下静置培养4天得到生物纤维素膜，其中菌液与培养乳液的体积比为1:1000；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为0.1wt％的Triton X-100溶液中，静置12小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL，采用压力蒸汽灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
采用上述步骤制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，其密度为20kg/m3，平均孔径为3μm；下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，其密度为6kg/m3，平均孔径为80μm，其中纤维素纳米纤维的平均直径为40nm。
所得到的生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为83％，厚度为1mm，其中上层致密部分的厚度为0.02mm。
实施例12～30
一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，具体步骤与实施例1一致，不同的是步骤(2)中冷藏的菌株种类和数目不同，如下表所示：
最终制得的生物纤维素皮肤修复材料，由上层致密部分和下层多孔疏松部分所组成的双层结构，两者通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络。
测得的生物纤维素皮肤修复材料的性能如下表所示：

Claims (9)

1.一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征是：将菌液加入到培养乳液中均匀分散后静置培养得到生物纤维素皮肤修复材料；所述菌液为菌株在水中分散的体系，所述培养乳液为水包油型乳液，其中水相为菌株培养液，所述菌株是指能够生物合成纤维素纳米纤维的微生物。
2.根据权利要求1所述的一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)配制菌株培养液；
将不同组分混合均匀后得到菌株培养液，所述菌株培养液中各组分及其含量为：葡萄糖2～5wt％，蛋白胨0.05～0.5wt％，酵母膏0.05～0.5wt％，柠檬酸0.01～0.1wt％，磷酸氢二钠0.02～0.2wt％，磷酸二氢钾0.01～0.1wt％，余量为水；
(2)配制培养乳液和菌液；
将不同组分均质乳化后通入少量气体得到pH值为5～7的培养乳液，按重量份数计，所述培养乳液中各组分及其含量为：菌株培养液50～80份，油5～30份，乳化剂3～15份，增稠稳定剂5～22份；
将冷藏的菌株在室温解冻，并置于菌株培养液中，在28～32℃条件下摇床培养6～24h，补充加入菌株培养液并混合均匀，在28～32℃条件下静置培养3～5天得到菌液，所述摇床培养时摇床的转速为50～150r/min，补充加入的菌株培养液为原菌株培养液体积的10～100倍；
(3)静置培养；
将菌液加入到培养乳液中均匀分散后在28～32℃条件下静置培养3～9天得到生物纤维素膜，所述菌液与培养乳液的体积比为1:10～1000；
(4)后处理；
将生物纤维素膜浸泡至浓度为0.5～3wt％的氢氧化钠溶液或浓度为0.1～3wt％的Triton X-100溶液中，静置0.5～12小时，用纯净水清洗至pH值为7.0且材料内毒素<0.5EU/mL时灭菌后包装低温封存得到生物纤维素皮肤修复材料。
3.根据权利要求2所述的一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述油为花生油、椰子油、大豆油或矿油中的一种以上；
所述乳化剂为聚山梨酯、蔗糖脂肪酸酯、氢化卵磷脂或聚氧乙烯氢化蓖麻油中的一种以上；
所述增稠稳定剂为明胶、海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸钠或羧甲基纤维素钠中的一种以上；
所述通入少量气体是指将医用氧气或空气以0.1～1L/min的速度通入乳液中，并维持30分钟。
4.根据权利要求2所述的一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述菌株为葡糖醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种以上；
所述菌液中单位体积内菌株细胞的数目为1×103～1×1011个/mL。
5.根据权利要求2所述的一种生物纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述灭菌指采用高能射线辐照灭菌、压力蒸汽灭菌或电子束灭菌。
6.采用如权利要求1～5任一项所述的制备方法制得的生物纤维素皮肤修复材料，其特征是：生物纤维素皮肤修复材料具有双层结构，由上层致密部分和下层多孔疏松部分组成；
所述上层致密部分是由纤维素纳米纤维层状重叠形成的相互交织的纳米纤维网络，上层致密部分的密度为20～50kg/m3；
所述下层多孔疏松部分是由纤维素纳米纤维组成的相互连通的多孔结构，同时其孔壁表面存在着纤维素纳米纤维网络，下层多孔疏松部分的密度为5～15kg/m3；
所述上层致密部分与下层多孔疏松部分通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键紧密结合。
7.根据权利要求6所述的生物纤维素皮肤修复材料，其特征在于，所述生物纤维素皮肤修复材料的孔隙率为80％以上，所述生物纤维素皮肤修复材料的厚度为1～10mm，其中上层致密部分的厚度为0.02～4mm。
8.根据权利要求6所述的生物纤维素皮肤修复材料，其特征在于，所述纤维素纳米纤维的平均直径为20～100nm。
9.根据权利要求6所述的生物纤维素皮肤修复材料，其特征在于，所述上层致密部分的平均孔径为3～10μm，所述下层多孔疏松部分的平均孔径为80～200μm。
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