CN103536958B

CN103536958B - 一种基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜及其制备与应用

Info

Publication number: CN103536958B
Application number: CN201310456538.9A
Authority: CN
Inventors: 邓红兵; 王先恺; 詹颖菲; 忻尚璟; 杜予民; 施晓文
Original assignee: HUBEI SAILUO BIOLOGICAL MATERIAL Co Ltd
Current assignee: Hubei Sailuo Biomaterials Co., Ltd.
Priority date: 2013-09-29
Filing date: 2013-09-29
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2033-09-29
Also published as: CN103536958A

Abstract

本发明公开了一种基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜及其制备与应用，属于高分子材料和生物医用材料技术领域。利用静电纺丝技术制备醋酸纤维素纳米纤维膜，采用层层组装技术将具有相反电荷的溶菌酶和丝蛋白交替组装到纤维素纳米纤维膜表面得到本发明的改性纳米纤维素纤维膜。本发明制备设备简单，原料成本低，无毒，可生物降解，整个工艺过程操作简单，溶菌酶/丝蛋白层层数可控。通过抗菌试验、细胞生存试验、细胞荧光染色、细胞粘附试验以及体外伤口愈合试验，表明本发明的改性纳米纤维素纤维膜具有良好的抗菌性能和细胞粘着性，可以提高伤口愈合的效率并防止伤口感染，是一种很好的创面修复材料，可用于创面修复领域。

Description

一种基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜及其制备与应用

技术领域

本发明属于高分子材料和生物医用材料技术领域，涉及一种基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜及其制备与应用。

背景技术

由于丝蛋白具有极好的生物适应性，它在组织工程领域被广泛研究。与此同时，它和人体真皮具有极好的适配性并且可以在伤口修复方面发挥重要作用。溶菌酶是一种具有杀菌作用的天然抗感染物质，有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织功能恢复等作用，但是溶菌酶工业化生产常会遇到稳定性差，易受外界环境影响，易失活，难以回收利用等问题，限制了它在生物医用材料、药物控释和日用化工和食品领域的应用，而溶菌酶的固定化可有效改善这些问题。纤维素是地球上最丰富的可再生资源，在植物中起到结构支撑作用，具有良好的力学性能。运用纤维素作为层层自组装底板不仅保留了组装成分良好的性质，还增加了其稳定性并且具有可重复利用性，而且固定化过程中蛋白质无损失，为天然可降解的生物安全性材料开发提供了一个新的有效途径。

目前鲜有通过纯天然高分子来制备纳米纤维膜并用于创面修复的相关文献，控制自组装开始时的电解质溶液（如多糖溶液、蛋白质溶液）的电负性也非常具有创新性。申请号为“CN201010190222.6”的专利报道了纳米纤维固定化β-D-半乳糖苷酶的制备方法，但并没有进行生物运用的研究。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜。

本发明的再一目的在于提供上述基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的制备方法，包含如下步骤：利用静电纺丝技术制备醋酸纤维素纳米纤维膜，采用层层组装技术将具有相反电荷的溶菌酶和丝蛋白交替组装到纤维素纳米纤维膜表面。

优选的，基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的制备方法，包含如下步骤：

（1）将醋酸纤维素溶液进行静电纺丝，再在碱液中水解得到醋酸纤维素纳米纤维膜。

（2）将醋酸纤维素纳米纤维膜在溶菌酶溶液中浸泡5～30分钟，再用NaCl溶液洗涤，接着在丝蛋白溶液中浸泡5～30分钟再用NaCl溶液洗涤；用同样的方法组装（溶菌酶/丝蛋白）_n双分子层，n为0.5的倍数（如n为0.5表示只组装了溶菌酶）。

步骤（1）中所述的醋酸纤维素溶液的质量浓度优选为5～25%；所述的醋酸纤维素溶液优选为将醋酸纤维素溶于丙酮与二甲基乙酰胺混合溶剂中得到，其中丙酮与二甲基乙酰胺的质量配比为2:1。

步骤（1）中所述的静电纺丝的条件优选为：静电纺丝的电压为1～35kV，流速为0.5～2mL/h，温度为5～35℃，相对湿度为20～80%，持续时间为1～96h。

步骤（1）中所述的水解的条件优选为在0.01～0.5M的NaOH溶液中水解6～8天。

步骤（2）中所述的溶菌酶溶液、NaCl溶液和丝蛋白溶液的浓度均优选为0.1～5mg/L，溶菌酶溶液和丝蛋白溶液pH值分别为4.5和5.3，电位分别为+27.4和-12.7mv。

步骤（2）中所述的（溶菌酶/丝蛋白）_n双分子层的层数n优选为0.5～55。

一种基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜，通过上述制备方法制备得到。

上述基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜在创面修复中的应用。利用本发明的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜进行抗菌试验、细胞生存试验、细胞荧光染色、细胞粘附试验以及体外伤口愈合试验，结果表明其具有良好的抗菌性能，以及较好的细胞粘着性，可以提高伤口愈合的效率并防止伤口感染。表明基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜是一种很好的创面修复材料。

一种创面修复材料，包含上述基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

（1）往纤维素纳米纤维膜表面加入丝蛋白能提供良好的生物相容性，不仅较好的完成了溶菌酶的固定化，同时也提供了与人体真皮细胞生长所需的三维立体结构，有利于细胞的粘附；加入溶菌酶后，纤维素纳米纤维膜具有更好的抑菌性能。

（2）本发明制备设备简单，原料成本低，无毒，可生物降解，对人体以及环境不会造成有害影响，整个工艺过程操作简单，溶菌酶/丝蛋白层层数可控，得到的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜具有极好的抑菌性能、细胞粘着性，可以提高伤口愈合的效率并防止伤口感染，在创面修复领域有较好的应用。

附图说明

图1是实施例3制备的改性纤维素纳米纤维膜的形貌图。

图2是制备的改性纤维素纳米纤维膜的细胞荧光试验结果图，左图：试验初始情况，右图：七天后结果，左图中不含有死细胞，右图中亮点代表活细胞，暗点代表死细胞；A：实施例1，B：实施例2，C：实施例3，D：实施例4。

图3是制备的改性纤维素纳米纤维膜的细胞粘附试验的结果图，A：实施例1，B：实施例2，C：实施例3，D：实施例4。

图4是制备的改性纤维素纳米纤维膜的进行体外伤口愈合试验的结果图；其中，A：开始时的伤口情况，B：经过七天愈合之后的伤口情况；a：实施例1，b：实施例2，c：实施例3，d：实施例4。

具体实施方式

下面通过具体实施例及附图对本发明的技术方案做进一步说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

（1）利用静电纺丝技术制备醋酸纤维素纳米纤维膜，即将醋酸纤维素溶解于丙酮/二甲基乙酰胺（质量配比为2:1）中配制25%（w/w）醋酸纤维素溶液，静电纺丝的电压为35kV，流速为0.5mL/h，温度为5℃，相对湿度为20%，持续时间为96h；再在0.5M NaOH溶液中水解所得纤维素纳米纤维膜7天。

（2）室温下，将所制得的纤维素纳米纤维膜在0.2mg/L溶菌酶溶液中浸泡5分钟，再用0.2mg/L NaCl溶液洗涤三次，接着在0.2mg/L丝蛋白溶液中浸泡5分钟，再用0.2mg/L NaCl溶液洗涤三次，用同样的方法组装（溶菌酶/丝蛋白）_n（n=30）双分子层，得到基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜。

实施例2

（1）利用静电纺丝技术制备醋酸纤维素纳米纤维膜，即将醋酸纤维素溶解于丙酮/二甲基乙酰胺（质量配比为2:1）中配制20%（w/w）醋酸纤维素溶液，静电纺丝的电压为20kV，流速为1mL/h，温度为35℃，相对湿度为80%，持续时间为36h；再在0.2M NaOH溶液中水解所得纤维素纳米纤维膜6天。

（2）室温下，将所制得的纤维素纳米纤维膜在0.1mg/L溶菌酶溶液中浸泡25分钟，再用0.1mg/L NaCl溶液洗涤三次，接着在0.1mg/L丝蛋白溶液中浸泡25分钟，再用0.1mg/L NaCl溶液洗涤三次，用同样的方法组装（溶菌酶/丝蛋白）_n（n=50.5）双分子层，得到基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜。

实施例3

（1）利用静电纺丝技术制备醋酸纤维素纳米纤维膜，即将醋酸纤维素溶解于丙酮/二甲基乙酰胺（质量配比为2:1）中配制16%（w/w）醋酸纤维素溶液，静电纺丝的电压为15kV，流速为1mL/h，温度为25℃，相对湿度为45%，持续时间为24h；再在0.1M NaOH溶液中水解所得纤维素纳米纤维膜7天。

（2）室温下，将所制得的纤维素纳米纤维膜在0.1mg/L的溶菌酶溶液中浸泡20分钟，再用0.1mg/L NaCl溶液洗涤三次，接着在0.1mg/L丝蛋白溶液中浸泡20分钟，再用0.1mg/LNaCl溶液洗涤三次，用同样的方法组装（溶菌酶/丝蛋白）_n（n=5）双分子层，得到基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜。该改性纤维素纳米纤维膜的形貌图如图1所示，其具有较好的三维结构，纤维表面具有一些孔洞，而且纤维间也具有较合适的距离，便于细胞的生长以及粘附。

实施例4

（1）利用静电纺丝技术制备醋酸纤维素纳米纤维膜，即将醋酸纤维素溶解于丙酮/二甲基乙酰胺（质量配比为2:1）中配制5%（w/w）醋酸纤维素溶液，静电纺丝的电压为1kV，流速为2ml/h，温度为35℃，相对湿度为50%，持续时间为2h；再在0.01M NaOH溶液中水解所得纤维素纳米纤维膜8天。

（2）室温下，将所制得的纤维素纳米纤维膜在0.01mg/L溶菌酶溶液中浸泡30分钟，再用0.01mg/L NaCl溶液洗涤三次，接着在丝蛋白溶液中浸泡30分钟，再用0.01mg/L NaCl溶液洗涤三次，用同样的方法组装（溶菌酶/丝蛋白）_n（n=5.5）双分子层，得到基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜。

实施例5

将实施例1～4制备的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜分别用于抗菌试验、细胞生存试验、细胞荧光染色、细胞粘附试验以及体外伤口愈合试验，各试验方法及结果如下：

抗菌试验

把改性纤维素纳米纤维膜剪成直径为6毫米的小圆盘，紫外消毒2h后，将50μL的细菌（大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌）悬浊液加入牛肉膏-蛋白胨培养基中，然后将小圆盘平铺在细菌悬浊液中，在37℃环境中培养12h，用精确度为1mm的尺子测量抑菌圈的直径。结果如表1所示：

表1.抗菌试验结果

改性纤维素纳米纤维膜	空白	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
						金黄色葡萄球菌抑菌圈大小（cm）	8	11.5	17.4	8.5	16.3
大肠杆菌抑菌圈大小（cm）	7.9	12.1	20.2	11.6	17.4

注：空白为实施例3步骤（1）获得的未改性的纤维素纳米纤维膜。

细胞生存试验

将改性纤维素纳米纤维膜剪成96孔培养板的大小并用紫外消毒2h，把总量为10⁴的人表皮细胞播撒于杜尔伯科改良伊格尔培养基上。向杜尔伯科改良伊格尔培养基中添加10%的胎牛血清以及1%的青霉素/链霉素。将植有细胞的膜置于37℃饱和湿度下培养，使细胞分散开并粘附与纤维膜上。培养24h后用磷酸缓冲溶液轻轻洗涤纤维膜。25μL浓度为5mg/mL噻唑蓝（MTT）溶液加入培养孔中在37℃下培养4h，然后加入150μL二甲基亚砜溶液洗去紫水晶甲。最后用酶联免疫化验仪在490nm波长处测量溶液的吸光度。细胞生存试验结果如表2所示：

表2.细胞生存试验结果

改性纤维素纳米纤维膜	空白	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
						细胞存活率（%）	65.5	78	78	96	80

细胞荧光染色

将人表皮细胞放在置于96孔培养板中的改性纤维素纳米纤维膜上进行培养。培养24小时后用磷酸缓冲溶液清洗纤维膜两次，每次持续10分钟，去除残余的培养基。将包含聚阴离子染料钙黄绿素和乙锭同型二聚体-1的荧光染色染料添加到膜上，将着色后的膜置于一个载玻片上，用激光扫描共聚焦显微镜进行观察，结果如图2所示。

细胞粘附试验

经过7天的培养，用磷酸缓冲溶液洗涤植有人表皮细胞的改性纤维素纳米纤维膜两次，然后用4%的戊二醛在4℃下固定2h，用扫描电子显微镜（JSM-6700F,JEOL,Japan）观察细胞在改性纤维素纳米纤维膜表面的粘附和铺展的形态结构，结果如图3所示。

体外伤口愈合试验

将大鼠麻醉，在它的背面制造一个直径为1cm的全层伤口，然后将改性纤维素纳米纤维膜剪成伤口大小，植入人表皮细胞并培养七天，最后将含有人表皮细胞的改性纤维素纳米纤维膜敷在伤口上，用直尺测试七天后恢复的情况。结果如图4和表3所示：

表3.体外伤口愈合试验结果

改性纤维素纳米纤维膜	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					伤口的恢复速率	55.33%	48.68%	78.24%	60.25%

上述结果表明，本发明制备的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜有很好的抗菌效果，较低的细胞毒性，细胞生存以及粘附情况较好，较快的伤口恢复速率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤：利用静电纺丝技术制备醋酸纤维素纳米纤维膜，采用层层组装技术将具有相反电荷的溶菌酶和丝蛋白交替组装到纳米纤维膜表面；具体包括如下步骤：

(1)将醋酸纤维素溶液进行静电纺丝，再在碱液中水解得到醋酸纤维素纳米纤维膜；

(2)将醋酸纤维素纳米纤维膜在溶菌酶溶液中浸泡5～30分钟，再用NaCl溶液洗涤，接着在丝蛋白溶液中浸泡5～30分钟再用NaCl溶液洗涤；用同样的方法组装(溶菌酶/丝蛋白)_n双分子层，n为0.5的倍数；所述的溶菌酶溶液和丝蛋白溶液的pH值分别为4.5和5.3。

2.根据权利要求1所述的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的醋酸纤维素溶液的质量浓度为5～25％。

3.根据权利要求1所述的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的静电纺丝的条件为：静电纺丝的电压为1～35kV，流速为0.5～2mL/h，温度为5～35℃，相对湿度为20～80％，持续时间为1～96h。

4.根据权利要求1所述的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的水解的条件为在0.01～0.5M的NaOH溶液中水解6～8天。

5.根据权利要求1所述的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的溶菌酶溶液、NaCl溶液和丝蛋白溶液的浓度均为0.1～5mg/L。

6.根据权利要求1所述的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的(溶菌酶/丝蛋白)_n双分子层的层数n＝0.5～55。

7.一种基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到。

8.权利要求7所述的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜在制备创面修复材料中的应用。

9.一种创面修复材料，其特征在于：包含权利要求7所述的基于溶菌酶和丝蛋白的层层自组装改性纤维素纳米纤维膜。