CN103751848A - 一种抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其包括以下步骤：制备混合溶剂、溶解细菌纤维素和胶原蛋白，制备含有AgNO3或金、银纳米簇的细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液，采用静电纺丝技术对含有AgNO3或金、银纳米簇等荧光纳米材料的细菌纤维素和胶原蛋白混合溶液进行纺丝，采用紫外光光照还原含有AgNO3或金、银纳米簇等的复合纤维获得载有纳米银或金、银荧光纳米簇等的纳米纤维支架，将相关复合纳米纤维支架用于细胞培养制备出组织工程材料。本发明采用不同细菌纤维素与胶原蛋白间配比，制备出的复合纳米纤维支架材料，实现了力学强度、体内降解能力可调，可用于制备多用途的组织工程材料。
Description
技术领域
本发明属于细菌纤维素复合纳米纤维支架的制备领域，具体涉及一种抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法。
背景技术
组织工程是将细胞生物学和材料学相结合而形成的一门新生技术。其主要目的和方法是制备一种三维的具有良好生物相容性且能逐渐降解被人体所吸收的细胞外基质材料，在该外源性细胞外基质中种植细胞，在生物反应器中进行培养扩增，形成生物材料-细胞的复合物，然后再将这种复合体植入机体所需部位去代替缺损组织或器官。为此找到合适的外源性细胞外基质来模拟天然组织中的细胞外基质分子的功能对于组织工程具有重大意义，此外理想支架材料还应具有一定的机械强度，良好的血液相容性以及三维多孔结构以便细胞的粘附、生长和增殖。
采用静电纺丝原理制备的仿细胞外基质结构的多孔网状组织工程支架，具有多孔结构，比表面积大，适合于细胞的迁移和增殖。该方法具有制备条件温和，条件要求不高，制备过程聚合物不易降解，且支架能携带并释放药物、蛋白、核酸等多种生物化学物质，高的比表面积使细胞能更好地吸收上述物质且能更好地促进代谢产物的排出，从而更好的调控细胞生物学行为。研究提示，应用静电纺丝法制备纳米组织工程支架前景良好。
采用微生物发酵合成的细菌纤维素作为一种可降解的仿生材料，制成组织器官表膜的商品已经出现；也有研究表明细菌纤维素可制备为软骨工程支架以及骨组织工程支架，能有效的促进伤口的愈合。但目前由静电纺丝细菌纤维素作为基体材料，同时兼有作为组织工程支架又能促进组织修复，还能有效抑制手术感染等功能的商品还为之甚少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可生物降解的，多孔的，抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架的制备方法。
实现本发明目的的技术解决方案为：抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
1）制备混合溶剂：首先制备离子液体氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑（AMIMCL），将一定量的甲基咪唑和氯丙烯混合溶液（混合溶液中的甲基咪唑与氯丙烯体积比为1:1.1到1:1.9之间）加入到双口烧瓶中，在氮气中保护五分钟，之后在油浴中恒温加热回流一定时间；用无水乙醚对反应物进行数次萃取，再加入活性炭和去离子水后，在油浴中一定温度下对反应物再次进行数小时回流，过硅藻土得到淡黄色的液体，将其真空旋转蒸发，之后再真空干燥48小时制得AMIMCL；再将4-甲基吗啉-N-氧化物（NMMO）和所制得的( AMIMCL)按照不同的质量比进行混合，混合体系中NMMO的质量分数分别为9-90%；
2）制备细菌纤维素溶液：取一定量的细菌纤维素溶于上述已干燥的NMMO和AMIMCL混合溶剂中,在密闭容器中油浴加热,保持一定温度,并持续搅拌12-24个小时,可得到黄色液体,制备不同质量分数的0.5-20%的细菌纤维素溶液；
3）制备胶原蛋白溶液：将一定量的胶原蛋白溶于六氟异丙醇，50℃微热搅拌至完全溶解，得到不同质量分数的0.5-20%的胶原蛋白溶液；
4）制备细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将细菌纤维素和胶原蛋白溶液以各种比例混合，得到总质量分数为0.5%-20%的胶原蛋白和细菌纤维素的混合溶液；
5）制备含有AgNO3或金、银纳米簇等的细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将上述细菌纤维素和胶原蛋白混合溶液中加入一定质量的AgNO3或金、银纳米簇等溶液，充分混匀；
6）含AgNO3或金、银纳米簇等的上述混合溶液进行静电纺丝：将一定量的AgNO3或金、银纳米簇等溶液分散于聚合物溶液中，将含有AgNO3或金、银纳米簇等的胶原蛋白和细菌纤维素溶液进行有序结构静电纺丝，得到AgNO3或金、银纳米簇等/胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维；
7）制备载纳米银复合纳米纤维：将静电纺丝得到的AgNO3/胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维在紫外光照射下进行光还原，光还原后的复合纤维颜色逐渐变为浅黄，表明银纳米颗粒的形成；
8）制备的相关有序多孔结构复合纳米纤维支架用于细胞培养：将相应类型的细胞植入上述各类孔径大小的支架中，然后整体放置于细胞培养液中进行培养，培养一段时间后观察具体效果。
根据本发明的一个方面，在步骤1）中的NMMO和制备出的AMIMCL的质量比在1:10到10:1之间。
根据本发明的一个方面，在步骤2）中的细菌纤维素溶液制备中，反应温度为10℃到110℃。
根据本发明的一个方面，在步骤4）中的细菌纤维素溶液：胶原蛋白溶液的体积比是1：5到5:1之间。
根据本发明的一个方面，在步骤6）中已配好的范围在0.5%到20%之间的不同浓度的混和溶液转移到注射器中，在范围为10kv到30kv之间的不同外加电场强度以及在5cm到20cm之间的不同接收距离范围内进行静电纺丝。
根据本发明的一个方面，在步骤8）中采用的细胞培养液为50ml胎牛血清 (FBS）与440ml的DMEM培养基，培养仪器为六孔板，加入75%酒精，浸泡消毒5小时，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗6次，每次5ml，浸泡时间不少于12小时，然后用DMEM培养基浸泡材料半小时左右，放入CO2培养箱，过夜晾干，用于内皮细胞培养；然后用移液枪吸取2ml内皮细胞悬液，种植在六孔培养板的各个孔中，然后放入CO2培养箱培养4个小时，等内皮细胞基本粘附，再加入3ml预热到37℃的加有10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养过程中根据消耗情况更换培养基，总共培养3-5天。
根据本发明的一个方面，在步骤8）中首先在六孔板中加入75%酒精，浸泡消毒5小时，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗1-6次，每次5ml，浸泡时间不少于12小时，然后用DMEM培养基浸泡材料10-60分钟，放入CO2培养箱，过夜晾干，用于平滑肌细胞的培养；然后用移液枪吸取2ml平滑肌细胞悬液，种植在六孔培养板的各个孔中，然后放入CO2培养箱培养1-10小时，等平滑肌细胞基本粘附，再加入3ml预热到37℃的加有1%-10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养过程中根据消耗情况更换培养基，总共培养3-8天。
本发明与现有技术相比，其显著优点：
（1）通过调节胶原蛋白和细菌纤维素两者的比例来调节支架的降解速率，也可通过静电纺丝过程中的参数设置来调节支架的孔径大小来满足不同细胞的培养。这些都使得该胶原蛋白-细菌纤维素细胞培养支架在组织工程学中有着广阔的应用前景；
（2）采用胶原蛋白和细菌纤维素为基体材料，模拟细胞外基质中的多糖和胶原，由静电纺丝所制得的该纳米纤维支架，能有效促进细胞的粘附、生长与增殖；
（3）由于采用生物相容性好的胶原蛋白/细菌纤维素等作为基体材料，植入抗菌能力强的纳米银后，制备出的支架具有抗菌修复之功效可在组织工程中获得应用。
同时,将含有金、银荧光纳米簇等的相关有序多孔结构的胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维支架用于细胞培养制备出组织工程材料，兼有精确成像示踪、消炎、材料体内可控化降解的作用。
附图说明
图1是胶原蛋白和细菌纤维素的静电纺丝电镜图。
具体实施方式
以下的说明本质上仅仅是示例性的而并不是为了限制本公开、应用或用途。
下面结合附图和实例对本发明作进一步详细描述。
实施实例1：
（1） 制备混合溶剂：首先制备离子液体氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑（AMIMCL），将体积比为1:1.1的甲基咪唑和氯丙烯加入到的双口烧瓶中，在氮气保护五分钟，之后在油浴中恒温加热回流一定时间；用无水乙醚对反应物进行数次萃取，再加入活性炭和去离子水后，在油浴中一定温度下对反应物再次进行回流数小时，过硅藻土得到淡黄色的液体，将其真空旋转蒸发，之后真空干燥48小时制得AMIMCL；再将4-甲基吗啉-N-氧化物（NMMO）和所制得的( AMIMCL)按照1:10的质量比进行混合，混合体系中NMMO的质量分数分别为9%；
（2）制备细菌纤维素溶液：取0.05g的细菌纤维素溶于10ml的NMMO和AMIMCL混合溶剂中,在密闭容器中油浴加热,保持恒温10℃,并持续搅拌12个小时,可得到黄色液体,制备质量分数为0.5%的细菌纤维素溶液;
（3）制备胶原蛋白溶液：将0.05g胶原蛋白溶于10ml六氟异丙醇，50℃微热搅拌至完全溶解，得到质量分数为0.5%的胶原蛋白溶液；
（4）制备细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将细菌纤维素和胶原蛋白溶液以1:5体积比混合，得到总质量分数为0.5%的胶原蛋白和细菌纤维素的混合溶液；
（5）制备含有AgNO3或金、银纳米簇等的细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将上述细菌纤维素和胶原蛋白混合溶液中加入0.001gAgNO3或金、银纳米簇等的溶液，充分混匀；
（6）含AgNO3或金、银纳米簇等的上述混合溶液进行静电纺丝：将AgNO3或金、银纳米簇等溶液分散于聚合物溶液中，将含有AgNO3或金、银纳米簇等的胶原蛋白和细菌纤维素溶液进行静电纺丝，设置接收距离为5cm，外加电场强度为25kv，将浓度0.5%的混和溶液转移到注射器中进行纺丝，得到AgNO3或金、银纳米簇等/胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维；
（7）制备载纳米银复合纳米纤维：将静电纺丝得到的AgNO3/胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维在紫外光照射下进行光还原，光还原后的复合纤维颜色逐渐变为浅黄，表明银纳米颗粒的形成；
（8）制备的纳米纤维支架用于细胞培养：将内皮细胞等植入上述各类孔径大小的支架中，然后整体放置于细胞培养液中进行培养，培养3天后观察具体效果。
实施实例2：
（1）制备混合溶剂：首先制备离子液体氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑（AMIMCL），将体积比为1：1.2的甲基咪唑和氯丙烯加入到的双口烧瓶中，在氮气保护五分钟，之后在油浴中恒温加热回流一定时间；用无水乙醚对反应物进行数次萃取，再加入活性炭和去离子水后，在油浴中一定温度下对反应物再次进行回流数小时，过硅藻土得到淡黄色的液体，将其真空旋转蒸发，之后真空干燥48小时制得AMIMCL；再将4-甲基吗啉-N-氧化物（NMMO）和所制得的( AMIMCL)按照3:7质量比进行混合，混合体系中NMMO的质量分数分别为30%；
（2）制备细菌纤维素溶液：取1g的细菌纤维素溶于上述10ml的NMMO和AMIMCL混合溶剂中,在密闭容器中油浴加热,保持恒温110℃,并持续搅拌12个小时,可得到黄色液体,制备质量分数为10%的细菌纤维素溶液；
（3）制备胶原蛋白溶液：将0.05g胶原蛋白溶于10ml六氟异丙醇，50℃微热搅拌至完全溶解，得到质量分数为0.5%的胶原蛋白溶液；
（4）制备细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将细菌纤维素和胶原蛋白溶液以3:3比例混合，得到总质量分数为5%的胶原蛋白和细菌纤维素的混合溶液；
（5）制备含有AgNO3或金、银纳米簇等的细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将上述细菌纤维素和胶原蛋白混合溶液中加入0.001g的AgNO3或金、银纳米簇等溶液，充分混匀；
（6）含AgNO3或金、银纳米簇等的上述混合溶液进行静电纺丝：将上述AgNO3或金、银纳米簇等溶液分散于聚合物溶液中，将含有AgNO3或金、银纳米簇等的胶原蛋白和细菌纤维素溶液进行静电纺丝，浓度为20%的混和溶液转移到注射器中,接收距离为20cm，在外加电场强度25kv下进行纺丝，得到AgNO3或金、银纳米簇等/胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维；
（7）制备载纳米银复合纳米纤维：将静电纺丝得到的AgNO3/胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维在紫外光照射下进行光还原，光还原后的复合纤维颜色逐渐变为浅黄，表明银纳米颗粒的形成；
（8）制备的纳米纤维支架用于细胞培养：将平滑肌细胞等植入上述支架中，然后整体放置于细胞培养液中进行培养，培养3天后观察具体效果。
实施实例3：
（1）制备混合溶剂：首先制备离子液体氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑（AMIMCL），将体积比为1：1.6的甲基咪唑和氯丙烯加入到的双口烧瓶中，在氮气保护五分钟，之后在油浴中恒温加热回流一定时间；用无水乙醚对反应物进行数次萃取，再加入活性炭和去离子水后，在油浴中一定温度下对反应物再次进行回流数小时，过硅藻土得到淡黄色的液体，将其真空旋转蒸发，之后真空干燥48小时制得AMIMCL；再将4-甲基吗啉-N-氧化物（NMMO）和所制得的( AMIMCL)按照7:3质量比进行混合，混合体系中NMMO的质量分数分别为70%；
（2）制备细菌纤维素溶液：取1g细菌纤维素溶于10ml的上述NMMO和AMIMCL混合溶剂中,在密闭容器中油浴加热,保持恒温10℃,并持续搅拌24个小时,可得到黄色液体,制备质量分数为10%的细菌纤维素溶液；
（3）制备胶原蛋白溶液：将1g胶原蛋白溶于10ml六氟异丙醇，50℃微热搅拌至完全溶解，得到质量分数为10%的胶原蛋白溶液；
（4）制备细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将细菌纤维素和胶原蛋白溶液以4:2体积比混合，得到总质量分数为10%的胶原蛋白和细菌纤维素的混合溶液；
（5）制备含有AgNO3或金、银纳米簇等的细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将上述细菌纤维素和胶原蛋白混合溶液中加入0.001g的AgNO3或金、银纳米簇等溶液，充分混匀；
（6）含AgNO3或金、银纳米簇等的上述混合溶液进行静电纺丝：将上述AgNO3或金、银纳米簇等溶液分散于聚合物溶液中，将含有AgNO3或金、银纳米簇等的胶原蛋白和细菌纤维素溶液进行静电纺丝，将已配好20%浓度的混和溶液转移到注射器中,接收距离5cm，外加电场强度为10kv进行纺丝，得到AgNO3或金、银纳米簇等/胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维；
（7）制备载纳米银复合纳米纤维：将静电纺丝得到的AgNO3/胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维在紫外光照射下进行光还原，光还原后的复合纤维颜色逐渐变为浅黄，表明银纳米颗粒的形成；
（8）制备的纳米纤维支架用于细胞培养：将内皮细胞等植入上述支架中，然后整体放置于细胞培养液中进行培养，培养5天后观察具体效果。
实施实例4：
（1）制备混合溶剂：首先制备离子液体氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑（AMIMCL），将体积比为1：1.9的甲基咪唑和氯丙烯加入到的双口烧瓶中，在氮气保护五分钟，之后在油浴中恒温加热回流一定时间；用无水乙醚对反应物进行数次萃取，再加入活性炭和去离子水后，在油浴中一定温度下对反应物再次进行回流数小时，过硅藻土得到淡黄色的液体，将其真空旋转蒸发，之后真空干燥48小时制得AMIMCL；再将4-甲基吗啉-N-氧化物（NMMO）和所制得的( AMIMCL)按照10：1质量比进行混合，混合体系中NMMO的质量分数分别为90%；
（2）制备细菌纤维素溶液：取2g细菌纤维素溶于上述10ml的NMMO和AMIMCL混合溶剂中,在密闭容器中油浴加热,保持恒温110℃,并持续搅拌24个小时,可得到黄色液体,制备质量分数为20%的细菌纤维素溶液；
（3）制备胶原蛋白溶液：将1g胶原蛋白溶于10ml的六氟异丙醇中，50℃微热搅拌至完全溶解，得到质量分数为10%的胶原蛋白溶液；
（4）制备细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将细菌纤维素和胶原蛋白溶液以5:1的体积比混合，得到总质量分数为18%的胶原蛋白和细菌纤维素的混合溶液；
（5）制备含有AgNO3或金、银纳米簇等的细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将上述细菌纤维素和胶原蛋白混合溶液中加入质量0.001g的AgNO3或金、银纳米簇等溶液，充分混匀；
（6）含AgNO3或金、银纳米簇等的上述混合溶液进行静电纺丝：将上述AgNO3或金、银纳米簇等溶液分散于聚合物溶液中，将含有AgNO3或金、银纳米簇等的胶原蛋白和细菌纤维素溶液进行静电纺丝，0.5%的混和溶液转移到注射器中,接收距离为5cm，在外加电场强度30kv下进行静电纺丝，得到AgNO3或金、银纳米簇等/胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维；
（7）制备载纳米银复合纳米纤维：将静电纺丝得到的AgNO3/胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维在紫外光照射下进行光还原，光还原后的复合纤维颜色逐渐变为浅黄，表明银纳米颗粒的形成；
（8）制备的纳米纤维支架用于细胞培养：将平滑肌细胞等植入上述支架中，然后整体放置于细胞培养液中进行培养，培养8天后观察具体效果。
结合附图，由图1可以看出，在此条件下可制备出50nm左右的胶原蛋白和细菌纤维素的静电纺丝。本发明通过细菌纤维素溶液与胶原蛋白溶液以及硝酸银溶液混合制备静电纺丝液，通过改变静电纺丝过程的参数来制备不同孔径的纤维支架, 将静电纺丝得到的AgNO3/胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维支架在紫外光照射下进行光还原，还原后得到粒径小、分布均匀的纳米银后形成Ag-胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架。Ag-胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架再通过细胞培养制备不同细胞类型的支架,该支架具有抗菌修复之功效可在组织工程中获得应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）制备混合溶剂：首先制备离子液体氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑（AMIMCL），将一定量的甲基咪唑和氯丙烯混合溶液加入到的双口烧瓶中，其中混合溶液中的甲基咪唑与氯丙烯体积比为1:1.1到1:1.9之间，在氮气中保护五分钟，之后在油浴中恒温加热回流一定时间；用无水乙醚对反应物进行数次萃取，再加入活性炭和去离子水后，在油浴中一定温度下对反应物再次进行数小时回流，过硅藻土得到淡黄色的液体，将其真空旋转蒸发，之后再真空干燥48小时制得AMIMCL；再将4-甲基吗啉-N-氧化物（NMMO）和所制得的 AMIMCL按照不同的质量比进行混合，混合体系中NMMO的质量分数分别为9-90%；
2）制备细菌纤维素溶液：取一定量的细菌纤维素溶于上述NMMO和AMIMCL混合溶剂中,在密闭容器中油浴加热,保持在一定温度条件下反应,在持续搅拌12-24小时后,即可得到黄色液体,从而制备出不同质量分数的0.5-20%的细菌纤维素溶液；
3）制备胶原蛋白溶液：将一定量的胶原蛋白溶于六氟异丙醇，50℃微热搅拌至完全溶解，得到不同质量分数的0.5-20%的胶原蛋白溶液；
4）制备细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将细菌纤维素和胶原蛋白溶液以各种比例混合，得到总质量分数为0.5%-20%的胶原蛋白和细菌纤维素的混合溶液；
5）制备含有AgNO3或金、银纳米簇等的细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将上述细菌纤维素和胶原蛋白混合溶液中加入一定质量的AgNO3或金、银纳米簇等溶液，充分混匀；
6）含AgNO3或金、银纳米簇的上述混合溶液进行静电纺丝：将一定量的AgNO3或金、银纳米簇等溶液分散于聚合物溶液中，将含有AgNO3或金、银纳米簇等的胶原蛋白和细菌纤维素溶液进行有序结构静电纺丝，得到AgNO3或金、银纳米簇等/胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维；
7）制备载纳米银复合纳米纤维：将静电纺丝得到的AgNO3/胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维在紫外光照射下进行光还原，光还原后的复合纤维颜色逐渐变为浅黄，表明银纳米颗粒的形成；
8）制备的纳米纤维支架用于细胞培养：将相应类型的细胞植入上述各类孔径大小的支架中，然后整体放置于细胞培养液中进行培养，培养一段时间后观察具体效果。
2.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤1）中的NMMO和AMIMCL的质量比在1:10到10:1之间。
3.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤2）中的细菌纤维素溶液制备中，反应温度为10℃到110℃。
4.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤4）中的细菌纤维素溶液：胶原蛋白溶液的体积比是1：5到5:1之间。
5.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤6）中已配好的范围在0.5%到20%之间的不同浓度的混和溶液转移到注射器中，在范围为10kv到30kv之间的不同外加电场强度以及在5cm到20cm之间的不同接收距离范围内进行静电纺丝。
6.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤8）中采用的细胞培养液为50ml胎牛血清 (FBS）与440ml的DMEM培养基，培养仪器为六孔板，加入75%酒精，浸泡消毒5小时，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗6次，每次5ml，浸泡时间不少于12小时，然后用DMEM培养基浸泡材料半小时左右，放入CO2培养箱，过夜晾干，用于内皮细胞培养；然后用移液枪吸取2ml内皮细胞悬液，种植在六孔培养板的各个孔中，然后放入CO2培养箱培养4个小时，等内皮细胞基本粘附，再加入3ml预热到37℃的加有10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养过程中根据消耗情况更换培养基，总共培养3-5天。
7.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤8）中首先在六孔板中加入75%酒精，浸泡消毒5小时，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗1-6次，每次5ml，浸泡时间不少于12小时，然后用DMEM培养基浸泡材料10-60分钟，放入CO2培养箱，过夜晾干,用于平滑肌细胞的培养；然后用移液枪吸取2ml平滑肌细胞悬液，种植在六孔培养板的各个孔中，然后放入CO2培养箱培养1-10小时，等平滑肌细胞基本粘附，再加入3ml预热到37℃的加有1%-10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养过程中根据消耗情况更换培养基，总共培养3-8天。
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