CN107115568A - 具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法 - Google Patents

具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法，属于生物医用材料制备技术领域。所述的制备方法包括自组装多层膜基材的准备、植物多酚溶液的配制、溶菌酶溶液的配置以及自组装多层膜的制备等四个步骤。本发明采用植物多酚和溶菌酶的分子间强氢键作用作为沉积过程的推动力，该自组装膜的主体部分没有使用聚阳离子，可以有效减少传统自组装膜中多层聚阳离子对细胞所产生的伤害。将该自组装多层膜装饰在人体植入材料表面，能显著提高植入材料的生物相容性和抗菌性，应用前景十分广阔。

Description

具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体是指一种自组装溶菌酶多层膜制备方法。
背景技术
层层自组装技术是一种有效制备薄膜的方法，可适用于多种材料的组装，操作简单，易于控制。其中聚电解质层层自组装技术是通过将基底在阴阳离子聚电解质溶液中交替浸泡，从而在基底表面制备聚电解质薄膜。自组装过程的结合力主要包括共价键，配位键，电荷转移，氢键和静电引力等形式的作用力。层层自组装技术可以实现在玻璃，钛合金，陶瓷,石英，单晶硅片，云母，金，银，氧化铝以及聚合物等底上的组装，并且基底形状不受限制。目前，层层自组装技术得到了很大发展，制备自组装膜的聚合物也从聚电解质扩展到蛋白质，DNA，染料分子，纳米颗粒，胶束等等。
随着组织工程的发展 ,组装工程材料表面的生物相容性的改善已成为生物医用材料研究的一个关键问题 。层层自组装由于具有温和的组装条件,对生物分子和基材的广泛适应性及其能在纳米和亚微米尺度设计的可调性等优点 ,已经越来越多地被应用于组织工程材料的表面改性中。然而，植入体表面若促进细胞粘附生长，往往也有利于细菌，因为细菌与细胞有较多相同的粘合机制。临床上，植入体感染是最常见的并发症。细菌粘附在植入体表面，逐渐形成细菌生物被膜，引发严重的医源性感染。因此，组装工程材料面临的挑战是提高细胞相容性的同时还具有抗菌能力。
溶菌酶是一种糖苷水解酶（又称胞壁质酶），主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性粘多糖分解，导致细菌细胞壁破裂。溶菌酶化学性质稳定，具有有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织功能恢复等作用，在医药领域具有广泛应用。目前，邓红兵等利用静电纺丝技术以及静电层层组装技术制备出溶菌酶和丝蛋白修饰的纤维素纳米纤维膜（申请号为CN201310456538.9）。马余强等通过溶液浇铸法制备得到氧化石墨烯/溶菌酶抗菌纳米复合薄膜材料（申请号为CN201010610000.5）。与上述发明相比，本发明采用植物多酚和溶菌酶分子间强氢键作用进行自组装结合，制备过程更加简单温和，可适用于多种基底的表面改性。
综上，目前还没有现有技术文献公开将溶菌酶与植物多酚利用分子间强氢键作用进行自组装获得有抗菌性和生物相容性的生物多层膜的技术方案，因此有必要对此进行改进和创新。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法，该制备方法，利用植物多酚和溶菌酶分子间的氢键作用，采用层层自组装的方法，制备出具有生物活性和抗菌性的溶菌酶多层膜。
为实现上述目的，本发明的技术方案是包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将基材进行表面处理后，浸入到浓度为0.01～10mg/mL的阳离子聚电解质溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
在缓冲溶液中，调节pH 4-11，依次加入氯化钠、抗坏血酸和植物多酚，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01～50mg/mL的植物多酚水溶液；
（3）溶菌酶水溶液的配制
在缓冲溶液中，调节pH 4-11，依次加入氯化钠、抗坏血酸和溶菌酶，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01～50mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的植物多酚水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的溶菌酶，植物多酚与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装；
（5）多次循环操作步骤（4），得到自组装溶菌酶多层膜。
进一步设置是阳离子聚电解质为聚乙烯亚胺(PEI)或聚烯丙胺盐酸盐(PAH)。
进一步设置是所述缓冲溶液为1~50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或1~50mM醋酸-醋酸钠缓冲液或1~50mMHEPES缓冲溶液的一种。
进一步设置是基材为陶瓷、镍合金、镁合金、钛合金、不锈钢、石英片、玻璃片、金、银、氧化铝中的任一种。
进一步设置是植物多酚为单宁酸、咖啡酸、鸡纳酸、茶多酚、儿茶素，葡萄籽多酚、仙鹤素、地榆素、玫瑰素、老鹳草素、云实素、柯子酸，月见草素、虾子花素、石榴素或山茱萸素中的任一种。
进一步设置是所述的抗坏血酸，浓度为1~50mM。
进一步设置是所述的氯化钠浓度为0.01~0.5mol/L。
本发明通过层层自组装技术把溶菌酶直接固定在材料表面,使材料的细胞相容性和抗菌性显著提高，是一种高效方法,可以有效克服传统抗菌素的耐药性问题。
本发明采用植物多酚和溶菌酶的分子间强氢键作用作为沉积过程的推动力。该自组装膜的主体部分没有使用聚阳离子，可以有效减少传统自组装膜中多层聚阳离子对细胞所产生的伤害。该多层膜主要由植物多酚和溶菌酶成，生物相容性好，可以显著促进人体细胞的黏附、生长与增殖。其中溶菌酶具有抗菌作用，且不会产生耐药性。将该自组装多层膜装饰在人体植入材料表面，能显著提高植入材料的生物相容性和抗菌性，应用前景十分广阔。
本发明的创新机理是：
植物多酚分子中具有大量酚羟基和溶菌酶分子中的酰胺键 可以形成稳定的氢键作用。自组装多层膜中溶菌酶提供细胞识别位点，可以显著地促进细胞的粘附和生长。单宁酸和溶菌酶都具有抗菌性，能够长时间抗菌而不会产生耐药性。在生理环境条件下 ,该层层组装的溶菌酶多层膜具有良好的稳定性，同时具有生物相容性和抗菌性，方法简单易行，条件温和，符合环保要求。本发明的多层膜可用于植入材料和器件的生物界面构建，提高医用植入体的生物活性和抗菌性。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1 本发明实施例1（单宁酸和溶菌酶）的QCM测试图，从QCM测试图看出，单宁酸和溶菌酶可以进行连续组装。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为0.01mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置10mM的HEPES缓冲液10ml，pH=4，依次加入抗坏血酸至5mM和单宁酸（TA）至0.01mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度0.01mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）蛋白质水溶液的配制
配置10mM的HEPES缓冲液10ml，调节pH至4，，依次加入5mM至抗坏血酸和溶菌酶至0.01mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的蛋白质水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的蛋白质，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环10次，得到自组装蛋白质多层膜。
如图1可知，单宁酸和溶菌酶可以进行连续组装，形成蛋白质多层膜。
实施例2
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为1mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置50mM的HEPES缓冲液，pH=6，依次加入氯化钠至0.15mol/l，抗坏血酸至10mM和单宁酸（TA）至1mg/mL，搅拌至完全溶解，配置成浓度1mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）蛋白质水溶液的配制
配置50mM的HEPES缓冲液，pH=6，依次加入氯化钠至0.15mol/l，抗坏血酸至10mM和溶菌酶至1mg/mL，搅拌至完全溶解，配置成浓度为1mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的单宁酸，再浸入到经过步骤（3）制备的蛋白质水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的蛋白质，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环4次，得到自组装蛋白质多层膜。
实施例3
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为10mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）单宁酸水溶液的配制
配置50mM的HEPES缓冲液，pH=8，依次加入氯化钠至0.5mol/l，抗坏血酸至50mM和单宁酸（TA）至10mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度10mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）溶菌酶水溶液的配制
配置50mM的HEPES缓冲液，pH=8，依次加入氯化钠至0.5mol/l，抗坏血酸至50mM和溶菌酶至10mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度为10mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的溶菌酶，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环20次，得到自组装蛋白质多层膜。
实施例4
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为0.01mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置10mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=9，依次加入抗坏血酸至1mM和单宁酸（TA）至0.01mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度0.01mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）蛋白质水溶液的配制
配置10mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液， pH=9，，依次加入抗坏血酸至1mM和溶菌酶至0.01mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的蛋白质水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的蛋白质，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环30次，得到自组装蛋白质多层膜。
如图1可知，单宁酸和溶菌酶可以进行连续组装，形成蛋白质多层膜。
实施例5
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为10mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=11，依次加入氯化钠至0.15mol/l，抗坏血酸至50mM和单宁酸（TA）至50mg/mL，搅拌至完全溶解，配置成浓度50mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）蛋白质水溶液的配制
配置50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=11，依次加入氯化钠至0.15mol/l，抗坏血酸至50mM和溶菌酶至50mg/mL，搅拌至完全溶解，配置成浓度为50mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的单宁酸，再浸入到经过步骤（3）制备的蛋白质水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的蛋白质，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环50次，得到自组装蛋白质多层膜。
实施例6
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为5mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）单宁酸水溶液的配制
配置50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=14，依次加入氯化钠至0.05mol/l，抗坏血酸至50mM和单宁酸（TA）至50mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度50mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）溶菌酶水溶液的配制
配置50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=14，依次加入氯化钠至0.05mol/l，抗坏血酸至50mM和溶菌酶至50mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度为50mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的溶菌酶，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环100次，得到自组装蛋白质多层膜。

Claims (7)

1.一种具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将基材进行表面处理后，浸入到浓度为0.01～10mg/mL的阳离子聚电解质溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
在缓冲溶液中，调节pH 4-11，依次加入氯化钠、抗坏血酸和植物多酚，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01～50mg/mL的植物多酚水溶液；
（3）溶菌酶水溶液的配制
在缓冲溶液中，调节pH 4-11，依次加入氯化钠、抗坏血酸和溶菌酶，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01～50mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的植物多酚水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的溶菌酶，植物多酚与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装；
（5）多次循环操作步骤（4），得到自组装溶菌酶多层膜。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法，其特征在于，阳离子聚电解质为聚乙烯亚胺或聚烯丙胺盐酸盐。
3.根据权利要求1所述的具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为1~50Mm Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液、1~50Mm醋酸-醋酸钠缓冲液或1~50MmHEPES缓冲溶液的一种。
4.根据权利要求1所述的一种具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法，其特征在于：基材为陶瓷、镍合金、镁合金、钛合金、不锈钢、石英片、玻璃片、金、银、氧化铝中的任一种。
5.根据权利要求1所述的一种自组装蛋白质多层膜制备方法，其特征在于：植物多酚为单宁酸、咖啡酸、鸡纳酸、茶多酚、儿茶素、表儿茶素、肉桂酸、绿原酸、原花青素、葡萄籽多酚、仙鹤素、地榆素、玫瑰素、老鹳草素、云实素、柯子酸、月见草素、虾子花素、石榴素或山茱萸素中的任一种。
6.根据权利要求1所述的一种具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法，其特征在于：所述的抗坏血酸浓度为1~50mM。
7.根据权利要求1所述的一种具有抗菌性和生物相容性的自组装溶菌酶多层膜制备方法，其特征在于：所述的氯化钠浓度为0.01~0.5mol/L。
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