CN113304316A - 一种氧化锆种植体表面促成骨活化处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氧化锆种植体表面促成骨活化处理方法，该氧化锆种植体包括基体、涂层和活性分子，所述基体为氧化锆陶瓷，所述涂层为附着于所述基体表面的聚乙烯亚胺/壳聚糖涂层，所述活性分子为接枝于所述涂层上的绿原酸。经过本发明的方法在氧化锆种植体表面接枝活性分子后，能够有效促进细胞黏附和成骨分化，即具有较好的促进成骨活性能力，有很好的临床应用前景。

Description

一种氧化锆种植体表面促成骨活化处理方法
技术领域
本发明涉及医用材料领域，特别是涉及一种氧化锆种植体表面促成骨活化处理方法。
背景技术
传统的钛金属种植体因金属的深灰色限制了其前牙区和一些种植体周围黏膜厚度不足的患者中的应用。随着“无金属种植”这一概念的深入，氧化锆因其具有良好的生物相容性、美学效果以及力学性能如高断裂韧性和高抗弯强度，被认为是理想的钛金属替代品。大量的体内、体外实验被执行去评价氧化锆作为种植体材料的可行性，但是发现氧化锆材料的成骨诱导性能与纯钛种植体相比欠佳。氧化锆具有生物惰性，表面有机官能团较少，不利于血液中蛋白成分及成骨细胞的吸附，这成为限制氧化锆种植体广泛应用的主要问题。
种植体表面的组织反应及骨结合是种植成功的关键，针对氧化锆种植体如何有效地提高表面生物活性，促进骨结合的研究一直在进行。物理法(喷砂、激光处理及紫外线处理等)、化学法(酸蚀)、物理化学法(喷砂酸蚀及选择性渗透酸蚀等)以及表面涂层或化学改性是当前较常见的改善氧化锆早期骨结合的手段。其中，表面涂层或化学改性不损伤植体实质，提高生物活性效果显著，应用前景较好。
氧化锆种植体的涂层技术主要是通过表面涂覆、粉浆涂层等技术在其表面形成具有生物活性的涂层材料，如磷酸钙及羟基磷灰石等。具有与人体骨及牙体组织相似的化学组成的磷酸钙类材料，可提高种植体表面的生物相容性，促进骨细胞的早期黏附，加速骨整合。同时，纳米级颗粒涂层相较光滑表面和酸蚀粗糙表面更利于细胞的迁移和增殖，实现更好的骨整合效果。还有研究通过对氧化锆种植体表面进行氧化锆多孔涂层处理，结果表明该涂层对其骨整合存在促进作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种氧化锆种植体表面促成骨活化处理方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过采用共轭吸附法在氧化锆表面浸渍聚乙烯亚胺/壳聚糖涂层，并接枝活性分子绿原酸，以达到促进早期成骨分化，实现良好的骨结合的目的。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种氧化锆种植体，包括基体、涂层和活性分子，所述基体为氧化锆陶瓷，所述涂层为附着于所述基体表面的聚乙烯亚胺/壳聚糖涂层，所述活性分子为接枝于所述涂层上的绿原酸。
进一步地，所述聚乙烯亚胺/壳聚糖涂层包括附着于所述基体表面的聚乙烯亚胺薄膜和接枝于所述聚乙烯亚胺薄膜上的壳聚糖。
本发明还提供一种上述的氧化锆种植体的制备方法，包括：
对所述氧化锆陶瓷进行清洗干燥，先浸渍于聚乙烯亚胺溶液中，形成聚乙烯亚胺薄膜，再浸渍于壳聚糖溶液中，形成聚乙烯亚胺/壳聚糖涂层，最后浸渍于绿原酸溶液，得到所述氧化锆种植体。
进一步地，所述聚乙烯亚胺溶液的浓度为5mg/mL，pH 9.0。
进一步地，所述壳聚糖溶液的浓度为1g/mL，黏度为100-200P。
进一步地，所述绿原酸溶液浓度为0.025-0.1mg/mL。
进一步地，所述绿原酸溶液是通过稀释绿原酸预溶液得到的；所述绿原酸预溶液为100mg/mL的绿原酸二甲基亚砜溶液,预溶液溶于壳聚糖溶液中，终浓度为0.1mg/mL。
进一步地，所述氧化锆陶瓷在所述聚乙烯亚胺溶液中的浸渍时间为4h。
进一步地，所述氧化锆陶瓷在所述壳聚糖-绿原酸溶液中的浸渍时间为24h。
本发明公开了以下技术效果：
在本发明中，首先将氧化锆陶瓷置于聚乙烯亚胺溶液中进行处理。阳离子聚合物聚乙烯亚胺中，因具有极性基团(氨基)和疏水基团(乙烯基)的结构，聚乙烯亚胺能促进细胞以及其他分子的吸附。仲胺叔胺基团能在中性环境中质子化，使氧化锆种植体表面带上高正电荷密度。
壳聚糖具有低毒性、生物降解性和生物相容性等优点，通过将壳聚糖接枝聚乙烯亚胺薄膜表面，在降低聚乙烯亚胺低毒性的同时，为材料表面增加了更多的正电荷。
绿原酸是天然存在于咖啡提取物和绿茶中的酚酸化合物中最有效的酸之一，可以促进成骨细胞的增殖及粘附，在氧化锆种植体表面接枝结合稳定有效。
经过本发明的方法在氧化锆种植体表面接枝活性分子后，能够有效促进细胞黏附和成骨分化，即具有较好的促进成骨活性能力，有很好的临床应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明氧化锆种植体的表面处理流程图；
图2为本发明效果验证1经过单接PEI和不同浓度的绿原酸处理后的氧化锆种植体表面谱图；其中，图2A、图2B为未处理氧化锆的XPS碳谱和氧谱；图2C、图2D为单接PEI的氧化锆的XPS碳谱和氧谱；图2E、图2F为0.025mg/ml的绿原酸接枝氧化锆的XPS碳谱和氧谱；图2G、图2H为0.05mg/ml的绿原酸接枝氧化锆的XPS碳谱和氧谱；图2I、图2J为0.1mg/ml的绿原酸接枝氧化锆XPS碳谱和氧谱；
图3为本发明效果验证1中氧化锆种植体接触角测试图，其中，图3A为空白组，图3B为PEI组，图3C为0.025mg/ml的绿原酸接枝氧化锆组，图3D为0.1mg/ml的绿原酸接枝氧化锆组，图3E为0.025mg/ml的绿原酸接枝氧化锆组；
图4为本发明效果验证2中激光共聚焦显微镜下观察到的MC3T3-E1细胞在经过单接PET/CS和不同浓度的绿原酸的氧化锆表面培养6h的细胞形态图；图4A-图4C为未处理氧化锆；图4D-图4F为单接PEI/CS氧化锆；图4G-图4I为0.025mg/ml的绿原酸接枝氧化锆；图4J-图4L为0.05mg/ml的绿原酸接枝氧化锆；图4M-图4O为0.1mg/ml的绿原酸接枝氧化锆(绿色：肌动蛋白；蓝色：细胞核)；
图5为本发明效果验证2中蛋白质印迹法检测在未处理或接枝不同浓度绿原酸的氧化锆种植体表面MC3T3-E1细胞在第7天COL-1,RUNX2,OCN蛋白的表达量图；
图6为本发明效果验证2中不同涂层和不同活性因子对成骨细胞增殖作用的影响；
图7为本发明效果验证2中未处理或接枝不同浓度绿原酸的氧化锆种植体的细胞的相对生长率图，其中，图7A为第1天，图7B为第4天。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
一种氧化锆种植体的制备方法，流程如图1所示，包括以下步骤：
取三个直径为5mm，厚度1mm的氧化锆陶瓷瓷片(5％Y2O3，95％ZrO2，珠海粤博佳新材料有限公司，中国)分别经乙醇、纯水超声清洗3次后干燥。
将清洗干燥后的瓷片分别浸渍在聚乙烯亚胺溶液(用去离子水配置成5mg/ml，pH9.0)中4h，孵育后，在室温通风环境中风干4小时。
利用磁力搅拌器将1g壳聚糖溶于100mL 1％(v/v)的冰醋酸溶液中，制备得到1mg/mL的壳聚糖溶液。将上述风干的瓷片分别在壳聚糖溶液中浸渍4h后，风干储备在4℃无菌情况下备用。
配制100mg/mL的绿原酸二甲基亚砜溶液，用去离子水按照0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml的浓度稀释绿原酸二甲基亚砜溶液，分别将上述瓷片浸渍在溶液中24小时，纯水冲洗干燥后，储备在37℃无菌情况下备用。
效果验证1
以实施例1制备得到的三个氧化锆种植体为实验组，以单独接枝聚乙烯亚胺的氧化锆种植体、未经过接枝处理的氧化锆种植体为对照。
(1)XPS
通过XPS(Escalab 250xi，Thermo Fisher Scientific，英国)检测不同氧化锆种植体末端基团硅烷与氧化锆的结合情况。具体为：在225W下用单色AlKa辐照(1486.7eV)进行测量，入射角为90°。通过CasaXPS软件对XPS碳谱及氧谱分析，用C1(285.0eV)校准每个光谱的结合能。结果见图2。
(2)接触角
测试各组氧化锆种植体表面亲水性。使用接触角计(SL200,Kino Industry,Boston,MA，美国)，通过1μL水滴的接触角来检测氧化锆种植体的亲水性。从每组中挑选1个氧化锆种植体，测三处的接触角求均值，评价每组湿润性，结果见图3。由图3可知，与纯氧化锆瓷片相比，氧化锆表面涂覆PEI后显著降低了水接触角，由79.39°降至45.86°，增加了亲水性。这种接触角减小和亲水性的增加可以归因于CS分子中含有正电荷的氨基官能团的存在。接枝绿原酸后，接触角进一步下降至36.18°，是因为绿原酸的酚羟基及羧基增加了其亲水效果。
效果验证2
(1)免疫荧光
MC3T3-E1细胞(中国科学院上海细胞库)在经过实施例1制备的氧化锆种植体上培养6小时，用1×PBS冲洗三次去除培养基及漂浮的细胞，4％多聚甲醛固定30min后用0.1％Triton X-100通透细胞。用DAPI(ApexBio，美国)和鬼笔环肽(ApexBio)分别染色细胞核和细胞骨架，使用激光共聚焦扫描显微镜(ZEISS LSM710，CarlZeiss，德国)观察样本，结果见图4；由图4可以看出，绿原酸接枝的氧化锆表面培养的细胞呈现出扁平的多边形形态和明显的肌动蛋白应力纤维，且随着浓度的增高，多边形形态及纤维越明显，表明细胞在界面处有很强的粘附力。
(2)蛋白质印迹法
用RIPA裂解缓冲液(碧云天，中国)提取培养第7天的蛋白，在10％SDS-PAGE凝胶(BioFroxx，德国)上分离蛋白质后，将样品转移到PVDF膜(密理博，德国)上。用快速封闭液封闭后，一抗4℃下孵育过夜，TBST清洗PVDF膜三遍后，二抗标记1小时，所有抗体在1:1000稀释度下使用，GAPDH设为内参。观察蛋白质印迹法检测在绿原酸接枝前后氧化锆表面MC3T3-E1细胞在第7天COL-1,RUNX2,OCN蛋白的表达量，结果见图5；由图5可以得出，绿原酸接枝的氧化锆表面MC3T3-E1细胞的COL-1,RUNX2,OCN蛋白表达量有所提高。
(3)细胞增殖
用细胞计数试剂盒-8(Dojindo Molecular T echnologies,Kumamoto,Japan)估计第1、4天的细胞数。用0.9mL培养基和0.1mL CCK-8代替培养基培养2h。然后，将上述培养基100ul转移到96孔板上进行检测。以有CCK-8溶液但无细胞的培养基为对照组。使用微型平板阅读器(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)测量介质在450nm处的吸收。从样本值中减去无细胞培养基(空白组)的吸光度。每组5孔，用吸光度的平均值表示光密度值(OD)。根据细胞的相对生长率(RGR)评价细胞增殖效果，用以下公式计算细胞相对生长率：实验组RGR＝(OD-空白组OD/对照组OD-空白组OD)×100％。由图6可知，在聚乙烯亚胺/壳聚糖、多巴胺、MPTS表面涂层处理中，绿原酸在聚乙烯亚胺/壳聚糖的处理中对成骨细胞都有较好的增殖作用。由图7可知，随着药物浓度的增加，第一天和第四天细胞相对生长率与空白组相比呈增加趋势，说明绿原酸早期对成骨细胞增长起促进作用。其中第一天单接PEI组细胞相对生长率下降，是因为PEI具有一定的细胞毒性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种氧化锆种植体，其特征在于，包括基体、涂层和活性分子，所述基体为氧化锆陶瓷，所述涂层为附着于所述基体表面的聚乙烯亚胺/壳聚糖涂层，所述活性分子为接枝于所述涂层上的绿原酸。
2.根据权利要求1所述的氧化锆种植体，其特征在于，所述聚乙烯亚胺/壳聚糖涂层包括附着于所述基体表面的聚乙烯亚胺薄膜和接枝于所述聚乙烯亚胺薄膜上的壳聚糖。
3.一种权利要求1或2任一项所述的氧化锆种植体的制备方法，其特征在于，包括：
对所述氧化锆陶瓷进行清洗干燥，先浸渍于聚乙烯亚胺溶液中，形成聚乙烯亚胺薄膜，再浸渍于壳聚糖溶液中，形成聚乙烯亚胺/壳聚糖涂层，最后浸渍于绿原酸溶液，得到所述氧化锆种植体。
4.根据权利要求3所述的氧化锆种植体的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺溶液的浓度为5mg/mL，pH 9.0。
5.根据权利要求3所述的氧化锆种植体的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的浓度为1g/mL，黏度为100-200P。
6.根据权利要求3所述的氧化锆种植体的制备方法，其特征在于，所述绿原酸溶液浓度为0.025-0.1mg/mL。
7.根据权利要求6所述的氧化锆种植体的制备方法，其特征在于，所述绿原酸溶液是通过稀释绿原酸预溶液得到的；所述绿原酸预溶液为100mg/mL的绿原酸二甲基亚砜溶液。
8.根据权利要求3所述的氧化锆种植体的制备方法，其特征在于，所述氧化锆陶瓷在所述聚乙烯亚胺溶液中的浸渍时间为4h。
9.根据权利要求3所述的氧化锆种植体的制备方法，其特征在于，所述绿原酸溶液溶于壳聚糖溶液中，终浓度为0.1mg/mL。
10.根据权利要求3所述的氧化锆种植体的制备方法，其特征在于，所述氧化锆陶瓷在所述壳聚糖-绿原酸溶液中的浸渍时间为24h。
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