CN111440812A - 一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用 - Google Patents

一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用，属于种植体技术领域。本发明所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基于本发明所述融合基因制备得到的外泌体负载于种植体上后，能够提高种植体的生物相容性，以及促进种植体周围血管生成和成骨。

Description

一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因、外泌体、生 物涂料以及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及种植体技术领域，具体涉及一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用。
背景技术
种植体治疗是目前临床上骨缺损和牙缺失治疗的常见手段。然而，老年人或糖尿病患者等，种植体周围血管生成和骨形成能力降低，严重影响种植体的治疗效果。如何促进种植体周围的骨再生和血管再生，对提供治疗效果至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用。基于本发明所述融合基因制备得到的外泌体负载于种植体上后，能够提高种植体的生物相容性，以及促进种植体周围血管生成和成骨。
本发明提供了一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了基于上述技术方案所述融合基因的表达载体，所述表达载体含上述技术方案所述融合基因。
优选的是，所述表达载体的构建用骨架质粒包括pUC57载体或pWPI载体。
本发明还提供了一种促进种植体周围血管生成和成骨的外泌体，所述外泌体能够表达上述技术方案所述融合基因。
本发明还提供了上述技术方案所述外泌体的构建方法，包括以下步骤：
a)将上述技术方案所述融合基因克隆至pUC57载体，得到pUC57-BMP2-P2A-VEGFA；
b)将步骤a)所述pUC57-BMP2-P2A-VEGFA和pWPI载体酶切，连接，得到pWPI-BMP2-P2A-VEGFA；
c)将步骤b)得到的pWPI-BMP2-P2A-VEGFA转化入Stbl3大肠杆菌，提取pWPI-BMP2-P2A-VEGFA；
d)将步骤c)得到的pWPI-BMP2-P2A-VEGFA和psPAX2、pMD2G转染包装细胞HEK293细胞，得到过表达VEGFA-BMP2的病毒载体；
e)将步骤d)得到的过表达VEGFA-BMP2的病毒载体感染MSC细胞，培养、分离得到促进种植体周围血管生成和成骨的外泌体。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述外泌体的促进种植体周围血管生成和成骨的生物涂料，所述生物涂料包括PEI溶液、明胶溶液和外泌体溶液。
优选的是，所述PEI溶液中PEI的质量浓度为5mg/ml，所述PEI溶液的溶剂为0.15M的氯化钠水溶液；所述明胶溶液中明胶的质量浓度为5mg/ml，所述明胶溶液的溶剂为含有0.15M氯化钠的PBS水溶液；以蛋白质量浓度计，所述外泌体溶液中外泌体的质量浓度为100μg/ml，所述外泌体溶液的溶剂为壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为5mg/ml，所述壳聚糖溶液的溶剂为含0.15M氯化钠的体积百分含量为1％的醋酸水溶液。
本发明还提供了基于上述技术方案所述生物涂料的种植体的改造方法，包括以下步骤：
1)将种植体进行酸蚀，得到酸蚀后的种植体；
2)将步骤1)酸蚀后的种植体在PEI溶液中浸泡20～30min，清洗，得到吸附PEI分子的种植体；
3)将步骤2)得到的吸附PEI分子的种植体在明胶溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载明胶的种植体；
4)将步骤3)得到的负载明胶的种植体在外泌体溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载外泌体的种植体；
5)重复步骤3)和步骤4)4～5次，得到改造后的种植体。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述改造方法制备得到的促进周围血管生成和成骨的改造后的种植体。
本发明还提供了上述技术方案所述融合基因或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述外泌体或上述技术方案所述构建方法得到的外泌体或上述技术方案所述生物涂料在制备促进种植体周围血管生成和成骨的试剂中的应用。
本发明提供了一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因。基于本发明所述融合基因制备得到的外泌体负载于种植体上后，能够提高种植体的生物相容性，以及促进种植体周围血管生成和成骨。具体的，本发明通过明胶将外泌体负载于种植体表面，形成一层生物涂层，增加了生物相容性；通过外泌体改构，使外泌体中携带VEGFA-BMP2融合表达的mRNA，当外泌体从涂层释放进入受体细胞，分别被翻译成VEGFA和BMP2，具有显著的促进血管生成和骨再生的功能。
附图说明
图1为本发明提供的BMP2-P2A-VEGFA装载进入外泌体结果图；
图2为本发明提供的装载BMP2-P2A-VEGFA改构外泌体显著促进成骨和血管生成结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：Ttaattaa(Pac1位点)accatggtggccgggacccgctgtcttctagcgttgctgcttccccaggtcctcctgggcggcgcggctggcctcgttccggagctgggccgcaggaagttcgcggcggcgtcgtcgggccgcccctcatcccagccctctgacgaggtcctgagcgagttcgagttgcggctgctcagcatgttcggcctgaaacagagacccacccccagcagggacgccgtggtgcccccctacatgctagacctgtatcgcaggcactcaggtcagccgggctcacccgccccagaccaccggttggagagggcagccagccgagccaacactgtgcgcagcttccaccatgaagaatctttggaagaactaccagaaacgagtgggaaaacaacccggagattcttctttaatttaagttctatccccacggaggagtttatcacctcagcagagcttcaggttttccgagaacagatgcaagatgctttaggaaacaatagcagtttccatcaccgaattaatatttatgaaatcataaaacctgcaacagccaactcgaaattccccgtgaccagacttttggacaccaggttggtgaatcagaatgcaagcaggtgggaaagttttgatgtcacccccgctgtgatgcggtggactgcacagggacacgccaaccatggattcgtggtggaagtggcccacttggaggagaaacaaggtgtctccaagagacatgttaggataagcaggtctttgcaccaagatgaacacagctggtcacagataaggccattgctagtaacttttggccatgatggaaaagggcatcctctccacaaaagagaaaaacgtcaagccaaacacaaacagcggaaacgccttaagtccagctgtaagagacaccctttgtacgtggacttcagtgacgtggggtggaatgactggattgtggctcccccggggtatcacgccttttactgccacggagaatgcccttttcctctggctgatcatctgaactccactaatcatgccattgttcagacgttggtcaactctgttaactctaagattcctaaggcatgctgtgtcccgacagaactcagtgctatctcgatgctgtaccttgacgagaatgaaaaggttgtattaaagaactatcaggacatggttgtggagggttgtgggtgtcgc(BMP2)aagcttggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctcccgggcca(P2A)atgacggacagacagacagacaccgcccccagccccagctaccacctcctccccggccggcggcggacagtggacgcggcggcgagccgcgggcaggggccggagcccgcgcccggaggcggggtggagggggtcggggctcgcggcgtcgcactgaaacttttcgtccaacttctgggctgttctcgcttcggaggagccgtggtccgcgcgggggaagccgagccgagcggagccgcgagaagtgctagctcgggccgggaggagccgcagccggaggagggggaggaggaagaagagaaggaagaggagagggggccgcagtggcgactcggcgctcggaagccgggctcatggacgggtgaggcggcggtgtgcgcagacagtgctccagccgcgcgcgctccccaggccctggcccgggcctcgggccggggaggaagagtagctcgccgaggcgccgaggagagcgggccgccccacagcccgagccggagagggagcgcgagccgcgccggccccggtcgggcctccgaaaccatgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctctacctccaccatgccaagtggtcccaggctgcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaagtggtgaagttcatggatgtctatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtggacatcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgcccctgatgcgatgcgggggctgctgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagtccaacatcaccatgcagattatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatgagcttcctacagcacaacaaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaagaaaaaaaatcagttcgaggaaagggaaaggggcaaaaacgaaagcgcaagaaatcccggtataagtcctggagcgtgtacgttggtgcccgctgctgtctaatgccctggagcctccctggcccccatccctgtgggccttgctcagagcggagaaagcatttgtttgtacaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggcgaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgtgacaagccgaggcggtga(VEGFA)gacccctggaccaccagccccagcaagagcacaagaggaagagagagaccctcactgctggggagtccctgccacactcagtcccccaccacactgaatctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggcctagggagccgcaccttgtcatgtaccatcaataaagtaccctgtgctcaacca(GAPDH UTR)ttaattaa。本发明所述融合基因能够实现VEGFA和BMP2的表达，显著促进血管生成和骨再生。
本发明还提供了基于上述技术方案所述融合基因的表达载体，所述表达载体含上述技术方案所述融合基因。在本发明中，所述表达载体的构建用骨架质粒包括pUC57载体或pWPI载体。
本发明还提供了一种促进种植体周围血管生成和成骨的外泌体，所述外泌体能够表达上述技术方案所述融合基因。本发明所述外泌体作为递药载体，能够实现种植体周围的局部递药，促进种植体周围血管和骨再生。
本发明还提供了上述技术方案所述外泌体的构建方法，包括以下步骤：
a)将上述技术方案所述融合基因克隆至pUC57载体，得到pUC57-BMP2-P2A-VEGFA；
b)将步骤a)所述pUC57-BMP2-P2A-VEGFA和pWPI载体酶切，连接，得到pWPI-BMP2-P2A-VEGFA；
c)将步骤b)得到的pWPI-BMP2-P2A-VEGFA转化入Stbl3大肠杆菌，提取pWPI-BMP2-P2A-VEGFA；
d)将步骤c)得到的pWPI-BMP2-P2A-VEGFA和psPAX2、pMD2G转染包装细胞HEK293细胞，得到过表达VEGFA-BMP2的病毒载体；
e)将步骤d)得到的过表达VEGFA-BMP2的病毒载体感染MSC细胞，培养、分离得到促进种植体周围血管生成和成骨的外泌体。
本发明将上述技术方案所述融合基因克隆至pUC57载体，得到pUC57-BMP2-P2A-VEGFA。本发明对所述克隆的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规克隆方法即可。
得到pUC57-BMP2-P2A-VEGFA后，本发明将pUC57-BMP2-P2A-VEGFA和pWPI载体酶切，连接，得到pWPI-BMP2-P2A-VEGFA。本发明所述酶切优选使用Pac1酶切。本发明对所述酶切、连接的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规酶切、连接方法即可。
得到pWPI-BMP2-P2A-VEGFA后，本发明将pWPI-BMP2-P2A-VEGFA转化入Stbl3大肠杆菌，提取高纯度的pWPI-BMP2-P2A-VEGFA。本发明对所述转化的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规转化方法即可。转化后，本发明优选还包括将转化后的细菌进行涂板，本发明所述涂板优选涂在带有Amp抗性的LB细菌培养板上，挑选克隆并鉴定正确后，本发明优选留存菌种。需要时，复苏菌种，抽提质粒，供病毒包装使用。
得到高纯度的pWPI-BMP2-P2A-VEGFA后，本发明将高纯度的pWPI-BMP2-P2A-VEGFA和psPAX2、pMD2G转染包装细胞HEK293细胞，得到过表达VEGFA-BMP2的病毒载体。在本发明中，所述转染时，pWPI-BMP2-P2A-VEGFA、psPAX2和pMD2G的质量比优选为10:5:1。本发明优选在转染12h后撤换培养基，继续培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0.45μm滤器过滤培养基，收集滤液，得到含有病毒的培养液。本发明优选通过CsCl法纯化病毒。本发明对所述培养基的种类没有特殊限定，采用常规细胞培养基即可，如DMEM。本发明所述过滤能够去除大的杂质和细胞碎片。
得到过表达VEGFA-BMP2的病毒载体后，本发明将过表达VEGFA-BMP2的病毒载体感染MSC细胞，培养、分离得到促进种植体周围血管生成和成骨的外泌体。本发明对MSC细胞的制备方法没有特殊限定，采用MSC常规制备方法即可。本发明优选将过表达VEGFA-BMP2的病毒载体复温至室温(20～28℃)后，将过表达VEGFA-BMP2的病毒载体、Polybrene和细胞培养基混合，加入细胞中，孵育。本发明所述细胞培养基采用常规细胞培养基即可，如DMEM。在本发明中，每8mL细胞培养基优选与100μl含病毒载体的液体(MOI＝30)混合(本发明优选107细胞加入病毒108TU)，本发明所述Polybrene的在混合后的终浓度优选为8μg/ml。在本发明中，所述孵育的条件优选为37℃、5％CO2和95％相对湿度，在本发明优选在孵育16h后更换新鲜培养基。
本发明通过对外泌体的构建，使外泌体中携带VEGFA-BMP2融合表达的mRNA，当外泌体从生物涂层中释放进入受体细胞后，能够在受体细胞中表达VEGFA和BMP2，具有显著的促进血管生成和骨再生的功能。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述外泌体的促进种植体周围血管生成和成骨的生物涂料，所述生物涂料包括PEI溶液、明胶溶液和外泌体溶液。本发明所述生物涂料能够利用层层自组装和水溶胶等技术将外泌体负载于种植体表面，明胶和外泌体都能够增加种植体的生物相容性，同时外泌体携带的基因药物能够协同促进骨再生和血管再生。本发明所述生物涂料能够有效增加种植体治疗效果。
在本发明中，所述PEI溶液中PEI的质量浓度为5mg/ml，所述PEI溶液的溶剂为0.15M的氯化钠水溶液；所述明胶溶液中明胶的质量浓度为5mg/ml，所述明胶溶液的溶剂为含有0.15M氯化钠的PBS水溶液；以蛋白质量浓度计，所述外泌体溶液中外泌体的质量浓度为100μg/ml，所述外泌体溶液的溶剂为壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为5mg/ml，所述壳聚糖溶液的溶剂为含0.15M氯化钠的体积百分含量为1％的醋酸水溶液。在本发明中，所述水优选使用去离子水。
本发明还提供了基于上述技术方案所述生物涂料的种植体的改造方法，包括以下步骤：
1)将种植体进行酸蚀，得到酸蚀后的种植体；
2)将步骤1)酸蚀后的种植体在PEI溶液中浸泡20～30min，清洗，得到吸附PEI分子的种植体；
3)将步骤2)得到的吸附PEI分子的种植体在明胶溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载明胶的种植体；
4)将步骤3)得到的负载明胶的种植体在外泌体溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载外泌体的种植体；
5)重复步骤3)和步骤4)4～5次，得到改造后的种植体。
本发明将种植体进行酸蚀，得到酸蚀后的种植体。具体的，本发明优选将种植体在60～80℃的1M的氢氧化钠水溶液中浸泡5min，除油，清洗，在氢氟酸和硝酸的混合酸中浸泡10～15s，清洗，得到酸蚀后的种植体。本发明对所述除油的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规除油方法即可。在本发明中，所述清洗优选采用去离子水进行。本发明所述清洗的方式优选为润洗。在本发明中，所述混合酸优选为1M氢氟酸和6M硝酸等体积混合制备得到。在本发明中，所述酸蚀能够去除表面陈旧氧化层。本发明在清洗后，优选进行干燥。本发明对所述干燥的方法没有特殊限定，优选放置在室温下进行干燥即可。在本发明中，所述种植体的材质优选为纯钛。
得到酸蚀后的种植体后，本发明将酸蚀后的种植体在PEI溶液中浸泡20min，清洗，得到吸附PEI分子的种植体。本发明在PEI溶液中浸泡后，种植体表面能够吸附带有稳定正电荷的PEI分子，将其作为引发层启动层层自组装过程。本发明所述清洗的次数优选为2次，每次优选清洗1min。本发明所述清洗的方式优选为润洗。
得到吸附PEI分子的种植体后，本发明将吸附PEI分子的种植体在明胶溶液中浸泡10min，清洗，得到负载明胶的种植体。在本发明中，所述清洗的次数优选为2次，每次清洗的时间优选为1min。本发明所述清洗的方式优选为润洗。
得到负载明胶的种植体后，本发明将负载明胶的种植体在外泌体溶液中浸泡10min，清洗，得到负载外泌体的种植体。在本发明中，所述清洗的次数优选为2次，每次清洗的时间优选为1min。本发明所述清洗的方式优选为润洗。
得到负载外泌体的种植体后，本发明优选重复步骤3)在明胶溶液中浸泡和步骤4)在外泌体溶液中浸泡的操作4～5次，得到改造后的种植体，即涂覆了含外泌体的生物涂层的种植体。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述改造方法制备得到的促进周围血管生成和成骨的改造后的种植体。本发明通过明胶将外泌体负载于种植体表面，形成一层生物涂层，增加了种植体的生物相容性。且本发明所述改造后的种植体与未改造的种植体比较，种植体周围血管密度增加，新生骨增加，骨结合能力增加。
本发明还提供了上述技术方案所述融合基因或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述外泌体或上述技术方案所述构建方法得到的外泌体或上述技术方案所述生物涂料在制备促进种植体周围血管生成和成骨的试剂中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1)外泌体加载BMP2-VEGFA的mRNA
构建BMP2-VEGFA融合表达的病毒载体
1.设计表达独立VEGFA、BMP2的病毒系统
(1)通过公司合成序列，包括VEGFA、P2A、BMP2，具体序列如SEQ ID NO.1所示：Ttaattaa(Pac1位点)accatggtggccgggacccgctgtcttctagcgttgctgcttccccaggtcctcctgggcggcgcggctggcctcgttccggagctgggccgcaggaagttcgcggcggcgtcgtcgggccgcccctcatcccagccctctgacgaggtcctgagcgagttcgagttgcggctgctcagcatgttcggcctgaaacagagacccacccccagcagggacgccgtggtgcccccctacatgctagacctgtatcgcaggcactcaggtcagccgggctcacccgccccagaccaccggttggagagggcagccagccgagccaacactgtgcgcagcttccaccatgaagaatctttggaagaactaccagaaacgagtgggaaaacaacccggagattcttctttaatttaagttctatccccacggaggagtttatcacctcagcagagcttcaggttttccgagaacagatgcaagatgctttaggaaacaatagcagtttccatcaccgaattaatatttatgaaatcataaaacctgcaacagccaactcgaaattccccgtgaccagacttttggacaccaggttggtgaatcagaatgcaagcaggtgggaaagttttgatgtcacccccgctgtgatgcggtggactgcacagggacacgccaaccatggattcgtggtggaagtggcccacttggaggagaaacaaggtgtctccaagagacatgttaggataagcaggtctttgcaccaagatgaacacagctggtcacagataaggccattgctagtaacttttggccatgatggaaaagggcatcctctccacaaaagagaaaaacgtcaagccaaacacaaacagcggaaacgccttaagtccagctgtaagagacaccctttgtacgtggacttcagtgacgtggggtggaatgactggattgtggctcccccggggtatcacgccttttactgccacggagaatgcccttttcctctggctgatcatctgaactccactaatcatgccattgttcagacgttggtcaactctgttaactctaagattcctaaggcatgctgtgtcccgacagaactcagtgctatctcgatgctgtaccttgacgagaatgaaaaggttgtattaaagaactatcaggacatggttgtggagggttgtgggtgtcgc(BMP2)aagcttggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctcccgggcca(P2A)atgacggacagacagacagacaccgcccccagccccagctaccacctcctccccggccggcggcggacagtggacgcggcggcgagccgcgggcaggggccggagcccgcgcccggaggcggggtggagggggtcggggctcgcggcgtcgcactgaaacttttcgtccaacttctgggctgttctcgcttcggaggagccgtggtccgcgcgggggaagccgagccgagcggagccgcgagaagtgctagctcgggccgggaggagccgcagccggaggagggggaggaggaagaagagaaggaagaggagagggggccgcagtggcgactcggcgctcggaagccgggctcatggacgggtgaggcggcggtgtgcgcagacagtgctccagccgcgcgcgctccccaggccctggcccgggcctcgggccggggaggaagagtagctcgccgaggcgccgaggagagcgggccgccccacagcccgagccggagagggagcgcgagccgcgccggccccggtcgggcctccgaaaccatgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctctacctccaccatgccaagtggtcccaggctgcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaagtggtgaagttcatggatgtctatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtggacatcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgcccctgatgcgatgcgggggctgctgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagtccaacatcaccatgcagattatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatgagcttcctacagcacaacaaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaagaaaaaaaatcagttcgaggaaagggaaaggggcaaaaacgaaagcgcaagaaatcccggtataagtcctggagcgtgtacgttggtgcccgctgctgtctaatgccctggagcctccctggcccccatccctgtgggccttgctcagagcggagaaagcatttgtttgtacaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggcgaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgtgacaagccgaggcggtga(VEGFA)gacccctggaccaccagccccagcaagagcacaagaggaagagagagaccctcactgctggggagtccctgccacactcagtcccccaccacactgaatctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggcctagggagccgcaccttgtcatgtaccatcaataaagtaccctgtgctcaacca(GAPDH UTR)ttaattaa
然后将上述序列克隆至pUC57载体，命名为pUC57-BMP2-P2A-VEGFA。
(2)通过Pac1酶切pUC57-BMP2-P2A-VEGFA和pWPI载体，然后将上述含有BMP2-P2A-VEGFA的序列克隆至pWPI载体，称为pWPI-BMP2-P2A-VEGFA。
(3)连接产物转化入高效率的Stbl3 E.Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，留存菌种。需要时，复苏菌种，重新抽提质粒，供病毒包装使用。
(4)将提取好的高纯度pWPI-BMP2-P2A-VEGFA、psPAX2、pMD2G按照10：5：1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0.45μm滤器过滤培养基，获得含有病毒的培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。
将过表达VEGFA-BMP2融合表达的病毒载体感染MSC细胞
(1)取新鲜抗凝骨髓穿刺液(稀释前骨髓液)约10ml，(EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可)。用等体积PBS或生理盐水稀释全血。
(2)稀释骨髓液，具体过程如下：将Ficoll分离液(达科为生物公司，中国深圳)、稀释前骨髓液、PBS(或生理盐水)按体积比为1:1:1混合，将稀释后的骨髓液缓慢平铺到Ficoll分离液上方，保持液面界面清晰。
(3)室温，水平转子700-800g，离心20-30min。
(4)离心结束后，管底主要为红细胞，中间层为分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆/组织匀浆层与分离液层之间是一层薄且致密的白膜，即：单个核细胞(mononuclear cell,MNC)层。小心吸取白膜层到另一离心管中。
(5)用适量PBS稀释洗涤细胞，颠倒混匀。室温，水平转子250g，离心10min，弃上清。重复洗涤1-2次。
(6)用含有5％人血小板裂解产物(HELIOS，美国)，1％谷氨酰胺(Gibco，美国)，1％青/链霉素(Gibco，美国)的α-MEM培养基(Gibco,美国)，重悬细胞。按照106MNC/cm2密度接种细胞。3天后移除未贴壁细胞，PBS清洗。继续培养至80-90％融合度后按照1:3传代。P3-P5代细胞(MSC)用于后续实验。
(7)将上述P3-P5代细胞(MSC)培养于10cm培养板中，至细胞密度达到80％时，同时感染前述病毒。感染方法为：使病毒液复温至室温，取8ml细胞培养基、100μl病毒液(MOI＝30)和终浓度为8μg/ml的Polybrene混合后，加入细胞中。在37℃、5％CO2和95％相对湿度的孵箱培养16h，更换新鲜培养基，最终得到病毒感染的细胞。
2)提取外泌体
(1)上述病毒感染的细胞换成含无外泌体血清的培养基，进行培养。
(2)培养48h后，用吸管收集细胞培养上清于无菌50ml离心管中；将细胞培养液离心，设置转速为：300g/min，温度为：4℃，时间为：10min；离心完成后，取上清至另一无菌离心管中，弃沉淀。
(3)将步骤(2)中得到的细胞培养上清离心，设置转速为：2000g/分，温度为：4℃，时间为：10min；离心完成后，取上清至另一无菌离心管中，弃沉淀。
(4)将步骤(3)中得到的细胞培养上清离心，设置转速为：10000g/分，温度为：4℃，时间为：30min；离心完成后，取上清至无菌超速离心管中，弃沉淀。
(5)使用超速离心机，将步骤(4)中得到的细胞培养上清进行超速离心，设置转速为：100000g/分，温度为：4℃，时间为：70min；超速离心后弃上清，收集沉淀(此时沉淀为外泌体和蛋白质)。
(6)在步骤(5)中得到的沉淀中加入适量无菌PBS洗涤，进行超速离心，设置转速为：100000g/分，温度为：4℃，时间为：70min；超速离心后弃上清，此时收集的沉淀即为外泌体。用适量PBS重悬外泌体，立即使用或冻存于-80℃冰箱中用于后续实验。
3)外泌体溶液、PEI溶液与明胶水溶液的配置
溶液的配置：PEI溶于含有0.15M NaCl的去离子水中，明胶溶于含有0.15MNaClPBS溶液中，浓度为5mg/ml。壳聚糖溶于含有0.15M NaCl的1％(v/v)HAc溶液中，浓度为5mg/ml。外泌体以100μg/ml蛋白浓度混入配置好的壳聚糖溶液中。
4)将钛材种植体浸泡在60-80℃1M氢氧化钠溶液中，5min后进行除油处理，用去离子水清洗样本，然后浸在氢氟酸和硝酸的混合酸中10-15s，以去除表面陈旧氧化层，再用去离子水清洗，置于室温下干燥，得到酸蚀后的钛材种植体。
将酸蚀后的钛材种植体沉浸于PEI溶液中20min，在钛材种植体表面吸附带有稳定正电荷的PEI分子，将其作为引发层启动层层自组装过程。用去离子水润洗两次，每次1min。
将钛材种植体置于明胶溶液中浸泡10min，用去离子水润洗两次，每次1min。
将钛材种植体置于外泌体溶液中浸泡10min，用水润洗两次，每次1min。
重复在明胶溶液中浸泡和在外泌体溶液中浸泡的操作3～5次，得到涂覆生物涂层的种植体。
图1为BMP2-P2A-VEGFA装载进入外泌体结果图，设置空载体病毒为对照。结果表明，BMP2-P2A-VEGFA病毒感染MSC后，其转录的mRNA高效装入外泌体(qPCR检测)。
图2为装载BMP2-P2A-VEGFA改构外泌体显著促进成骨和血管生成结果图，结果表明，种植体经外泌体改造后，移植小鼠2天后，取种植体周围组织，qPCR检测组织CD31(血管密度)和Runx2(成骨基因)表达。发现携带BMP2-P2A-VEGFA的外泌体处理，最能有效增强种植体周围血管生成和成骨效果。
与未改造的种植体或单纯加未感染BMP2-P2A-VEGFA的对照外泌体比较，种植体周围血管密度增加，新生骨增加，骨结合能力增加。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京口腔医院
<120> 一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2728
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaattaaac catggtggcc gggacccgct gtcttctagc gttgctgctt ccccaggtcc 60
tcctgggcgg cgcggctggc ctcgttccgg agctgggccg caggaagttc gcggcggcgt 120
cgtcgggccg cccctcatcc cagccctctg acgaggtcct gagcgagttc gagttgcggc 180
tgctcagcat gttcggcctg aaacagagac ccacccccag cagggacgcc gtggtgcccc 240
cctacatgct agacctgtat cgcaggcact caggtcagcc gggctcaccc gccccagacc 300
accggttgga gagggcagcc agccgagcca acactgtgcg cagcttccac catgaagaat 360
ctttggaaga actaccagaa acgagtggga aaacaacccg gagattcttc tttaatttaa 420
gttctatccc cacggaggag tttatcacct cagcagagct tcaggttttc cgagaacaga 480
tgcaagatgc tttaggaaac aatagcagtt tccatcaccg aattaatatt tatgaaatca 540
taaaacctgc aacagccaac tcgaaattcc ccgtgaccag acttttggac accaggttgg 600
tgaatcagaa tgcaagcagg tgggaaagtt ttgatgtcac ccccgctgtg atgcggtgga 660
ctgcacaggg acacgccaac catggattcg tggtggaagt ggcccacttg gaggagaaac 720
aaggtgtctc caagagacat gttaggataa gcaggtcttt gcaccaagat gaacacagct 780
ggtcacagat aaggccattg ctagtaactt ttggccatga tggaaaaggg catcctctcc 840
acaaaagaga aaaacgtcaa gccaaacaca aacagcggaa acgccttaag tccagctgta 900
agagacaccc tttgtacgtg gacttcagtg acgtggggtg gaatgactgg attgtggctc 960
ccccggggta tcacgccttt tactgccacg gagaatgccc ttttcctctg gctgatcatc 1020
tgaactccac taatcatgcc attgttcaga cgttggtcaa ctctgttaac tctaagattc 1080
ctaaggcatg ctgtgtcccg acagaactca gtgctatctc gatgctgtac cttgacgaga 1140
atgaaaaggt tgtattaaag aactatcagg acatggttgt ggagggttgt gggtgtcgca 1200
agcttggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga 1260
accctggacc tcccgggcca atgacggaca gacagacaga caccgccccc agccccagct 1320
accacctcct ccccggccgg cggcggacag tggacgcggc ggcgagccgc gggcaggggc 1380
cggagcccgc gcccggaggc ggggtggagg gggtcggggc tcgcggcgtc gcactgaaac 1440
ttttcgtcca acttctgggc tgttctcgct tcggaggagc cgtggtccgc gcgggggaag 1500
ccgagccgag cggagccgcg agaagtgcta gctcgggccg ggaggagccg cagccggagg 1560
agggggagga ggaagaagag aaggaagagg agagggggcc gcagtggcga ctcggcgctc 1620
ggaagccggg ctcatggacg ggtgaggcgg cggtgtgcgc agacagtgct ccagccgcgc 1680
gcgctcccca ggccctggcc cgggcctcgg gccggggagg aagagtagct cgccgaggcg 1740
ccgaggagag cgggccgccc cacagcccga gccggagagg gagcgcgagc cgcgccggcc 1800
ccggtcgggc ctccgaaacc atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct 1860
tgctgctcta cctccaccat gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag 1920
ggcagaatca tcacgaagtg gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc 1980
caatcgagac cctggtggac atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca 2040
agccatcctg tgtgcccctg atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt 2100
gtgtgcccac tgaggagtcc aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag 2160
gccagcacat aggagagatg agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga 2220
aagatagagc aagacaagaa aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa 2280
agcgcaagaa atcccggtat aagtcctgga gcgtgtacgt tggtgcccgc tgctgtctaa 2340
tgccctggag cctccctggc ccccatccct gtgggccttg ctcagagcgg agaaagcatt 2400
tgtttgtaca agatccgcag acgtgtaaat gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca 2460
aggcgaggca gcttgagtta aacgaacgta cttgcagatg tgacaagccg aggcggtgag 2520
acccctggac caccagcccc agcaagagca caagaggaag agagagaccc tcactgctgg 2580
ggagtccctg ccacactcag tcccccacca cactgaatct cccctcctca cagttgccat 2640
gtagacccct tgaagagggg aggggcctag ggagccgcac cttgtcatgt accatcaata 2700
aagtaccctg tgctcaacca ttaattaa 2728

Claims (10)

1.一种促进种植体周围血管生成和成骨的融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.基于权利要求1所述融合基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体含权利要求1所述融合基因。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建用骨架质粒包括pUC57载体或pWPI载体。
4.一种促进种植体周围血管生成和成骨的外泌体，其特征在于，所述外泌体能够表达权利要求1所述融合基因。
5.权利要求4所述外泌体的构建方法，包括以下步骤：
a)将权利要求1所述融合基因克隆至pUC57载体，得到pUC57-BMP2-P2A-VEGFA；
b)将步骤a)所述pUC57-BMP2-P2A-VEGFA和pWPI载体酶切，连接，得到pWPI-BMP2-P2A-VEGFA；
c)将步骤b)得到的pWPI-BMP2-P2A-VEGFA转化入Stbl3大肠杆菌，提取pWPI-BMP2-P2A-VEGFA；
d)将步骤c)得到的pWPI-BMP2-P2A-VEGFA和psPAX2、pMD2G转染包装细胞HEK293细胞，得到过表达VEGFA-BMP2的病毒载体；
e)将步骤d)得到的过表达VEGFA-BMP2的病毒载体感染MSC细胞，培养、分离得到促进种植体周围血管生成和成骨的外泌体。
6.一种基于权利要求4所述外泌体的促进种植体周围血管生成和成骨的生物涂料，其特征在于，所述生物涂料包括PEI溶液、明胶溶液和外泌体溶液。
7.根据权利要求6所述的生物涂料，其特征在于，所述PEI溶液中PEI的质量浓度为5mg/ml，所述PEI溶液的溶剂为0.15M的氯化钠水溶液；所述明胶溶液中明胶的质量浓度为5mg/ml，所述明胶溶液的溶剂为含有0.15M氯化钠的PBS水溶液；以蛋白质量浓度计，所述外泌体溶液中外泌体的质量浓度为100μg/ml，所述外泌体溶液的溶剂为壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为5mg/ml，所述壳聚糖溶液的溶剂为含0.15M氯化钠的体积百分含量为1％的醋酸水溶液。
8.基于权利要求6或7所述生物涂料的种植体的改造方法，包括以下步骤：
1)将种植体进行酸蚀，得到酸蚀后的种植体；
2)将步骤1)酸蚀后的种植体在PEI溶液中浸泡20～30min，清洗，得到吸附PEI分子的种植体；
3)将步骤2)得到的吸附PEI分子的种植体在明胶溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载明胶的种植体；
4)将步骤3)得到的负载明胶的种植体在外泌体溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载外泌体的种植体；
5)重复步骤3)和步骤4)4～5次，得到改造后的种植体。
9.一种基于权利要求8所述改造方法制备得到的促进周围血管生成和成骨的改造后的种植体。
10.权利要求1所述融合基因或权利要求2或3所述表达载体或权利要求4所述外泌体或权利要求5所述构建方法得到的外泌体或权利要求6或7所述生物涂料在制备促进种植体周围血管生成和成骨的试剂中的应用。
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