CN114058591B - 一种重组间充质干细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组间充质干细胞及其应用，属于生物医药技术领域；包括原始细胞和重组病毒，其特征在于，所述重组病毒包含重组腺病毒和/或重组慢病毒；所述重组腺病毒或重组慢病毒携带胆汁酸受体编码基因。本发明通过过表达间充质干细胞中胆汁酸受体FXR，使其响应心肌缺血微环境中生理性的胆汁酸，从而激活下游保护因子表达及释放，最终增强间充质干细胞的心肌保护能力。并且，由于体内心肌缺血微环境存在胆汁酸，所以在体外只需对重组间充质干细胞中的胆汁酸受体进行干预，操作简单，干预环节少，便于临床转化和应用。

Description

一种重组间充质干细胞及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种重组间充质干细胞及其应用。
背景技术
心力衰竭(heart failure)简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和/或舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心力衰竭是几乎所有心脏疾病的最终结局，随着β-肾上腺素受体阻断剂(β-blocker)和血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)等药物的应用，心衰患者的院内病死率已经显著下降，但是患者出院后的长期预后依然很差，5年生存率不足50％。如何防止心衰的发展，仍是亟待解决的关键问题和临床需求。
目前，干细胞移植是治疗心衰最有前景的手段之一。心肌细胞的丢失和心脏重构是造成心衰发生的关键环节。移植的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)通过旁分泌、免疫调节、分化替代及释放外泌体等多种机制，减少心肌细胞丢失并减轻心脏重构，从而改善心功能障碍的方法称为MSC移植治疗心脏病。目前认为，应用基因修饰、药物预处理或新型生物材料，提高MSC移植后的“质”和“量”，是增强MSC防治心衰的重要策略。
然而，近年来多项采用移植MSC治疗心衰的临床试验终点的改善却远未达到预期，其主要原因是MSC移植后的在心脏内的滞留量不足及旁分泌功能较弱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组间充质干细胞及其应用，本发明的重组间充质干细胞在心脏中的滞留率高，旁分泌功能较强，从而能够提高移植重组间充质干细胞治疗心脏病的疗效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种重组间充质干细胞，包括原始细胞和重组病毒，其特征在于，所述重组病毒包含重组腺病毒和/或重组慢病毒；所述重组腺病毒或重组慢病毒携带胆汁酸受体编码基因。
优选的，所述原始细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脐带血间充质干细胞。
优选的，所述胆汁酸受体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了上述方案所述重组间充质干细胞在制备治疗心脏病药物中的应用。
优选的，所述心脏病包括缺血性心脏病。
优选的，所述缺血性心脏病包括急性心肌梗死。
优选的，所述药物的剂型包括注射剂。
本发明还提供了一种治疗心脏病的药物，包括上述方案所述的重组间充质干细胞和药学上可接受的辅料。
本发明提供了一种重组间充质干细胞，包含重组腺病毒和/或重组慢病毒；所述重组腺病毒或重组慢病毒携带胆汁酸受体编码基因。在心肌缺血微环境中，有生理性的胆汁酸存在，在体外对MSC中过表达胆汁酸受体后，可以响应体内的胆汁酸信号，从而激活干细胞的胆汁酸—胆汁酸受体信号，增加MSC在患者心脏中的滞留率，提高MSC治疗心脏病的效果。激活胆汁酸-FXR信号的MSC具有存活数量多、存活时间长、心肌修复功能强等优势。本发明通过过表达重组间充质干细胞中胆汁酸受体FXR，使其响应心肌缺血微环境中生理性的胆汁酸，从而激活下游保护因子Angptl4的表达及释放，最终增强MSC的心肌保护能力。并且，由于体内心肌缺血微环境存在胆汁酸，所以在体外只需对重组间充质干细胞中的胆汁酸受体进行干预，操作简单，干预环节少，便于临床转化和应用。此外，激活胆汁酸—胆汁酸受体信号后，既增强了重组间充质干细胞本身应对氧化损伤的能力，又大大提高了其旁分泌心肌保护效果，从“质”和“量”两个方面提高了重组间充质干细胞心肌修复作用。
附图说明
图1为FXR腺病毒质粒构建示意图；
图2为FXR信号是否可以增强ADSC的心肌保护作用的验证结果，其中：A.不同处理组小鼠超声心动图的代表性图片；B～D.小鼠心脏功能指标(射血分数EF、左室收缩末期内径LVIDs、左室舒张末期内径LVIDd)(n＝20)；E.不同处理组小鼠生存率曲线(n＝20)；
图3为激动FXR信号是否影响ADSC的滞留/生存能力的验证结果，其中：A.心肌梗死后点注射3天后，CM-DiI标记的ADSC心肌切片的代表性图像。心脏组织免疫荧光染色为CM-DiI(红色)、肌钙蛋白T(绿色)和DAPI(蓝色)；B.通过计算梗死区(Trop T阴性区)中红色区域的百分比来比较梗死区周围ADSC的滞留量(n＝8)；C.心肌梗死后点注射7天后，CM-DiI标记的ADSC心肌切片的代表性图像，心脏组织免疫荧光染色为CM-DiI(红色)、肌钙蛋白T(绿色)和DAPI(蓝色)；D.通过计算梗死区(Trop T阴性区)中红色区域的百分比来比较梗死区周围ADSC的滞留量(n＝6-8)；E.流式细胞术检测不同处理组ADSC的凋亡情况；F.不同处理组ADSC的凋亡细胞比例(n＝4)；
图4为激动FXR信号是否影响ADSC旁分泌促血管新生的能力的验证结果，其中，A.CD31染色检测不同处理组小鼠心脏梗死周边区血管新生情况；B.不同处理组小鼠心脏梗死周边区新生血管密度比较(n＝6)；C.内皮成管实验检测不同处理组细胞的条件培养基促血管新生能力；D.不同条件培养基处理下，内皮细胞成管的数量比较(n＝4)；
图5为在心肌梗死发生后，心肌缺血微环境中是否存在胆汁酸池的验证结果，其中：A.大鼠心肌缺血微环境中胆汁酸靶向代谢组学热点图(n＝10)；B～D.MI后大鼠心肌梗死周边区各种胆汁酸表达水平(n＝10)；
图6为激动FXR信号后，ADSC发挥旁分泌促血管新生作用的具体机制的验证结果，其中A～D表示Angptl4的蛋白表达水平；E和F表示ADSC中Angptl4的表达敲低后旁分泌促血管新生能力；
图7为激动胆汁酸—FXR信号增强ADSC生存能力的具体机制的验证结果，其中，A～B表示Nqo-1的表达水平；C～F表示激动胆汁酸—FXR信号后ADSC增强的生存能力。
具体实施方式
本发明提供了一种重组间充质干细胞，包括原始细胞和重组病毒，其特征在于，所述重组病毒包含重组腺病毒和/或重组慢病毒；所述重组腺病毒或重组慢病毒携带胆汁酸受体编码基因。
在本发明中，所述重组间充质干细胞中重组腺病毒和/或重组慢病毒的滴度优选为10～200，更优选为50～100。
在本发明中，所述胆汁酸受体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在本发明中，所述原始细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脐带血间充质干细胞。
本发明对所述待改造间充质干细胞的原始细胞的来源没有特殊限制，采用商品化间充质干细胞或者采用本领域常规方法获得的间充质干细胞即可。
本发明的重组间充质干细胞能够过表达细胞中胆汁酸受体FXR，激活干细胞内胆汁酸-胆汁酸受体(FXR)信号，激活胆汁酸-FXR信号的MSC具有存活数量多、存活时间长、心肌修复功能强等优势。本发明通过过表达重组间充质干细胞中胆汁酸受体FXR，使其响应心肌缺血微环境中生理性的胆汁酸，从而激活下游保护因子表达及释放，最终增强MSC的心肌保护能力。并且，由于体内心肌缺血微环境存在胆汁酸，所以在体外只需对重组间充质干细胞中的胆汁酸受体进行干预，操作简单，干预环节少，便于临床转化和应用。才外，激活胆汁酸—胆汁酸受体信号后，即增强了重组间充质干细胞本身应对氧化损伤的能力，又大大提高了其旁分泌心肌保护效果，从“质”和“量”两个方面提高了重组间充质干细胞心肌修复作用。
本发明还提供了上述方案所述重组间充质干细胞在制备治疗心脏病药物中的应用。
在本发明中，重组间充质干细胞单独过表达FXR，可以在一定程度激活胆汁酸-胆汁酸信号，旁分泌功能增强；重组间充质干细胞过表达FXR联合体内的FXR配体(内源性胆汁酸、奥贝胆酸或GW4064)，胆汁酸-胆汁酸信号被显著激活，MSC的旁分泌功能进一步增强，同时细胞本身生存能力也显著提高，能显著提高氧化应激条件下MSC的生存率，进一步增强MSC的旁分泌促血管新生能力。
在本发明中，所述心脏病优选的包括缺血性心脏病；所述缺血性心脏病优选的包括急性心肌梗死。
在本发明中，所述药物优选的通过改善心脏重构来治疗心脏病。
在本发明中，所述药物中重组间充质干细胞的浓度优选为1×104个/mL～1×106个/mL，更优选为1×105个/mL。
在本发明中，所述药物的剂型优选的包括注射剂。在本发明中，所述重组间充质干细胞的注射方式优选为心肌点注射；所述重组间充质干细胞的注射部位优选为左心室前壁、后壁、下壁和侧壁；所述药物的注射剂量优选为10～30μL，更优选为20μL。
本发明还提供了一种治疗心脏病的药物，包括上述方案所述的重组间充质干细胞和药学上可接受的辅料；所述辅料优选的包括生理盐水或无血清培养基。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、分离培养小鼠MSC至P3代
本研究所使用MSC均从6～8周雄性C57小鼠附睾脂肪获取。具体操作方法：使用异氟烷对小鼠进行吸入麻醉(氧气流量为300～500ml/min，异氟烷诱导浓度为3％～4％，维持浓度为1.5％)，将已麻醉的小鼠于超净台内固定，使用消毒酒精对小鼠双侧腹股沟、腹中线及周围区域进行消毒，随后沿腹中线和双侧腹股沟作一倒“Y”型切口，充分暴露腹腔脏器，寻找并轻柔提出附睾脂肪组织，剪取脂肪组织时避免误取周围血管及附睾，并迅速将脂肪组织置入预冷的干净磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将附睾脂肪多次洗涤后，使用无菌剪刀将其剪成0.5cm左右的组织块，随后将组织块收集并置入Ⅰ型胶原酶溶液(1mg/ml)中于37℃水浴消化1h，中间可使用滴管吹打组织一次。1h后，无肉眼可见组织块，此时将胶原酶溶液通过70μm细胞滤器，并向过滤后的溶液中加入等体积完全培养基(含10％胎牛血清和1％青-链霉素的DMEM/F12(1:1)培养基)及时终止消化，再将中和后的溶液离心5min(800g)。离心后可见溶液分为清晰的3层，从上至下依次是脂肪层、消化液层、细胞层，弃去上中层后，于细胞层加入适量红细胞裂解液(154mM NH4cl、14mM NaHCO3和0.1mM EDTA；ph＝7.3)，最后再加入8～10ml全培养基，混匀后接种至100mm培养皿中，次日换液。待细胞长至90％左右时进行传代，P2～P3代用于实验。
2、FXR腺病毒构建
pDC315-mNr1h4-3flag质粒构建，如图1所示。
构建信息：
基因名称：小鼠Nr1h4(NM_009108.2)
克隆载体：Pdc315
克隆策略：BamHI+SalI
mNr1h4 synthesis sequence(SEQ ID NO：1)：1539bp BamHI---SalI inpUC57Vector
ggatccgccaccatggtgatgcagtttcagggtttagaaaatccaattcagattagtcttcaccacagccaccggctgtcaggatttgtgccggaagggatgagtgtgaagccagctaaaggtatgctaacagaacacgcggcaggccctctggggcagaatctggatttggaatcgtactccccatacaacaatgtcccgtttcctcaagttcagccacagatttcctcctcgtcttactattccaacctgggcttctacccccaacaaccggaagactggtattctcctggcatctatgaactcaggcgaatgcccgctgagactgggtaccagggagagactgaggtatcagagatgcctgtgacaaagaagccgcgaatggccgcggcatcggcaggcagaataaaaggggatgagctgtgtgttgtctgtggagacagggcctctgggtaccactacaacgcgctcacctgtgagggctgcaaaggtttcttccgaagaagcattaccaagaacgccgtgtacaagtgtaagaacgggggcaactgcgtgatggacatgtacatgcgcaggaagtgccaggagtgccggctaaggaagtgcaaagagatggggatgttggctgaatgtttgttaactgaaatccagtgtaaatctaaacggctaaggaaaaatgtgaagcagcacgctgatcagacagctaatgaggacgacagcgaagggcgtgacttgcgacaagtgacctccacaaccaagttttgcagggagaaaacggaactcacggcagaccaacagaccctcctggattatattatggattcgtacaacaaacagagaatgcctcaggaaatcacaaataaaatcttaaaagaagaatttagtgcagaagaaaattttctcatattaacagaaatggcaaccagtcatgtacagattctcgtagaattcacaaaaaagcttccagggtttcagacactggatcacgaagatcagattgctttgctcaaagggtccgcagtggaggccatgtttcttcgttcggcggagattttcaataagaaacttcctgccggtcatgcagacctgttggaagaaagaattcgaaagagtggtatctctgatgagtatataaccccgatgttcagtttctataaaagtgttggagaactcaaaatgactcaggaggagtacgctctgctcacagcgatcgtcatcctctctccagacagacaatacatcaaggacagagaggcggtggagaagctgcaggagcccctgcttgatgtgctacaaaagctgtgcaagatgtaccagcctgagaacccgcagcatttcgcctgcctcctgggtcgcctgacggaactccggacattcaaccatcaccacgctgagatgctgatgtcttggagagtgaatgatcacaagttcaccccgctcctctgtgagatctgggatgtgcaggactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaagtgagtcgac。
实验方法：
a.质粒载体pDC315的BamHI和SalI双酶切
酶切反应在37℃水浴反应3h，酶切体系如下：
Figure BDA0003359240580000071
1％琼脂糖凝胶电泳回收质粒pDC315 BamHI+SalI酶切大片段。
b.目的基因质粒pUC57-mNr1h4的BamHI和SalI双酶切
酶切反应在37℃水浴反应3h，酶切体系如下：
Figure BDA0003359240580000072
Figure BDA0003359240580000081
1％琼脂糖凝胶电泳回收质粒pUC57-mNr1h4 BamHI+SalI酶切小片段。
c.质粒pDC315 BamHI+SalI回收大片段与mNr1h4回收片段的连接，连接反应在22℃反应2h，连接反应体系如下：
Figure BDA0003359240580000082
d.连接产物转化：取10ul连接产物与100ul JM109感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激45s，立即置冰上放置2min，加入预热至室温的400ul LB培养基，37℃恒温摇床培养1h，4000rpm离心1min，弃去400ul培养上清，剩余100ul用移液器混匀后均匀涂布于含100μg/mlAmpicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。
e.挑取3个单菌落接种于含5ml，100μg/mlAmpicillin抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，用BamHI+SalI进行酶切鉴定，然后送菌液进行测序验证，测序引物：mCMV-F，引物序列为：5‘-cgagccaatacacgtcaatg-3’(SEQ ID NO：2)。
3、病毒转染MSC
待MSC长至约70％时，可进行Ad-FXR腺病毒转染。病毒储存液滴度为1×107ifu/ml～1×1011ifu/ml，取10μl加入10ml含10％FBS的DMEM/F12培养基中，再将其加入100mm培养皿中。次日予以换液，并进行后续实验。
4、CM-DiI染色
为了便于对MSC进行体内示踪，我们使用CM-DiI对MSC进行染色。CM-Dil为DiI的一种衍生物(DiI即1,1'-双十八烷-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐，1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)，通过与膜结构的脂质分子结合而标记细胞，适合监测细胞运动以及细胞定位分析。在549nm的激发光下，CM-DiI可发出红色荧光，因具有良好的染料维持性，可用以追踪多次传代细胞的运动特性。具体的操作为将50μg CM-DiI溶解于47.5μl的二甲基亚砜(DMSO)中，待MSC消化离心后，用2ml全培养基重悬细胞，并加入上述染色液10μl对细胞进行染色，时间为20min。
5、制备小鼠心肌梗死模型
使用异氟烷对小鼠进行吸入麻醉(氧气流量为300～500ml/min，异氟烷诱导浓度为3％～4％，维持浓度为1.5％)；用75％乙醇对小鼠胸部手术区域进行消毒，并在胸骨左侧做一斜行切口，切口长度约为1.5cm；使用4-0手术缝线在切口处做荷包缝合，此时不收紧缝线；沿着肌纤维方向顿性分离小鼠的胸大肌和胸小肌，暴露出第四肋间。随后，用蚊式止血钳轻微扩大四五肋间隙，并用手指轻轻将心脏从心腔挤出；使用6-0的手术缝线在小鼠心脏冠状动脉左前降支根部以下2～3mm处打结，减去线头后迅速小心地将心脏塞回胸腔。此时，注意要用手指挤压切口两侧的胸廓，目的是将胸腔内残留的气体挤出从而防止发生气胸。并迅速收紧缝线。
6、制备MSC悬液
将CM-DiI染色完毕的细胞进行离心(800g，5min)，弃上清后用EDTA-PBS重悬细胞，每1×106个细胞加入200μl EDTA-PBS。
7、心肌点注射MSC
使用异氟烷对小鼠进行吸入麻醉(氧气流量为300-500ml/min，异氟烷诱导浓度为3％～4％，维持浓度为1.5％)；使用75％的乙醇对小鼠的胸部手术区域进行消毒，在小鼠胸骨的左侧做一斜行切口，切口的长度为1.5cm作用；使用4-0手术缝线在切口处做荷包缝合，此时不收紧缝线；使用蚊式止血钳沿着肌纤维方向对小鼠的胸大肌和胸小肌进行顿性分离，暴露出第四肋间。随后，用蚊式止血钳轻微扩大四五肋间隙，并用手指轻轻将心脏从心腔挤出；使用Hamilton微量注射器在小鼠左心室游离壁结扎线以下的两个点进行注射，每个点注射10μLMSC悬液，每个心脏注射的细胞量为1×104～1×106个；所选取的两处注射点分别为：a.心尖处；b.心前区；在完成注射后，将心脏送回胸腔，用手指挤压切口两侧的胸廓，将胸腔内残留气体挤出，并迅速收紧缝线。
8、MSC滞留率检测
在小鼠行MI术及点注射MSC后3、7天时处死小鼠，将心腔内血液冲洗干净并摘下心脏，浸泡至4％多聚甲醛溶液中，固定24h后将心脏取出，沿结扎线下缘将心脏切开，将心尖部分进行石蜡包埋并连续切片，切片厚度为5μm。选择切片进行免疫荧光染色，首先将切片脱蜡至水，再使用柠檬酸缓冲液对切片进行抗原修复，使用Triton-100透膜后进行血清封闭30分钟，后于4℃孵育TNNT2抗体过夜。次日室温孵育荧光二抗1h，并用4’，6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)进行核染。使用荧光显微镜观察切片并获取图片，CM-DiI红色荧光阳性面积与组织总面积的比值即为MSC的滞留率。
9、条件培养基收集
首先给分离培养的P2-P3代MSC转染Ad-FXR腺病毒，在细胞转染Ad-FXR 24h后，换液并给与细胞奥贝胆酸(10μM)孵育24h，24h后使用PBS充分洗涤细胞，然后再加入无血清的DMEM/F12培养细胞，再等待12～24h后，收集各组细胞的DMEM/F12培养液，离心去除细胞碎片及残渣后(3000r，5min)，得到的即为条件培养基。
10、内皮细胞成管检测
首先将Matrigel基质胶和DMEM/F12以1：1比例混合，后加入48孔板的各个孔中，每孔100μl液体，注意在滴加的过程中不要产生气泡，且保证液体将底面完全覆盖，将48孔板置于37℃细胞孵箱中，等待2h，使基质胶完全凝固。将大鼠冠状动脉内皮细胞消化离心后，用不同处理组的条件培养基(100μl)进行重悬并分别滴加至基质胶上(每孔细胞数量约为1×105个)，再将盛有基质胶和细胞的48孔板置入孵箱中培养24～48h，中途可使用显微镜观察细胞成管状态并获取图片。
11、氧化应激处理MSC及MSC存活率检测
将MSC种至6孔板中，待细胞长至80％左右时给与各组条件培养基预处理(同时加入1/4体积的全培养基)，24h后给与H2O2(300μM)诱导损伤，再过24h后检测各组细胞生存率。使用Beyotime细胞凋亡检测试剂盒检测各组细胞生存率，具体如下：首先将各组细胞的培养液吸出至对应的15ml离心管中，用PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞，室温3～5min后分别加入等量的全培养基终止消化。用移液枪轻吹细胞，将细胞吹打下来并全部液体转移至对应15ml离心管中。1000g离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。每组取5～10万重悬的细胞，1000g离心5min，弃上清，加入195μlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。分别加入5μlAnnexinV-FITC和10μl碘化丙啶染色液并轻轻混匀。室温避光孵育10～20min后即可上流式细胞仪检测。
实验数据：
1、验证本发明中所述激动干细胞FXR信号显著增强移植MSC的在体心肌保护作用
为了验证激动FXR信号是否可以增强MSC的心肌保护作用，我们从成年C57小鼠体内提取附睾脂肪来源间充质干细胞(ADSC)进行体外培养，并将ADSC分为两组，分别为control组(ADSC-con)和FXR腺病毒过表达组(ADSC-FXR)。并利用成年C57小鼠制备MI模型，在建模的同时进行心肌点注射，每只小鼠心脏注射2-3个点，共注射约5×105个细胞。在心梗四周后，与Sham组相比，MI组小鼠心脏射血分数显著下降，并伴随左心室收缩末期内径和舒张末期内径的增大；与MI组相比，ADSC-con可一定程度改善小鼠心脏功能，但不具有统计学差异；而给予ADSC-FXR治疗后，MI小鼠心脏功能得到显著改善(图2中的A～D)，MI 4周时小鼠的死亡率也显著降低(图2中的E)，具体参见图2。
2、验证本发明所述激动干细胞FXR信号，显著增加移植ADSC在心脏中的滞留率；且在配体存在的前提下，激活FXR信号显著提高体外培养ADSC的生存能力。
为了验证激动FXR信号是否影响ADSC的滞留/生存能力，我们将接受ADSC-con或ADSC-FXR点注射的MI小鼠心脏分别制备成石蜡切片，并将切片进行Troponin T染色后，使用荧光显微镜观察ADSC(已用红色荧光染料CM-DiI标记)。如图3中的A～D所示，与对照组相比，FXR过表达显著增加ADSC在MI小鼠心脏中的滞留率。进一步细胞实验证实，给与300μMH2O2处理，可引起显著的ADSC凋亡，单纯FXR过表达无法提高ADSC抗氧化损伤的能力；FXR过表达联合配体胆汁酸激动，能显著提高氧化应激条件下ADSC的生存率(图3中的E～F)。
3、验证本发明所述激动移植ADSC的FXR信号，显著增加心肌梗死周边区新生微血管数目；且在配体存在的前提下，激活FXR信号显著提高体外培养ADSC的旁分泌促血管新生能力。
为了验证激动FXR信号是否影响ADSC旁分泌促血管新生的能力，我们将接受ADSC-con和ADSC-FXR点注射治疗的MI小鼠心脏分别制备成石蜡切片，并将切片进行CD31染色后，使用荧光显微镜观察心肌梗死周边区血管新生情况。如图4中的A～B所示，与MI心脏相比，接受ADSC-con治疗的小鼠心脏梗死周边区微血管数目轻度增加，但无统计学差异；而接受ADSC-FXR治疗的小鼠心脏梗死周边区微血管数目显著增加。进一步细胞实验证实，与来源于ADSC-con的条件培养基(ADSC-con-CM)相比，来源于ADSC-FXR的条件培养基(ADSC-FXR-CM)表现出更强的促血管新生能力；更重要的是，FXR过表达联合配体激动，进一步增强了ADSC的旁分泌促血管新生能力(图4中的C～D)。
4、验证本发明所述在心肌缺血微环境中存在胆汁酸池；ADSC-FXR通过响应内源性的胆汁酸信号从而发挥心肌保护作用。
为验证在心肌梗死发生后，心肌缺血微环境中是否存在胆汁酸池，我们通过结扎大鼠冠状动脉的左前降支构建MI模型，并将正常大鼠心肌组织和MI大鼠梗死周边区心肌组织分别行靶向代谢组学检测41种胆汁酸水平。结果示在大鼠MI后心肌缺血微环境中共检测出17种胆汁酸，其中大部分在MI后呈现下降趋势(图5中的A～D)。
5、验证本发明所述激活FXR信号后，ADSC通过促进Angptl4的表达和释放发挥旁分泌促血管新生作用。
为验证激动FXR信号后，ADSC发挥旁分泌促血管新生作用的具体机制，我们分别给与ADSC转染腺病毒Ad-FXR、FXR激动剂GW4064或对照处理。结果示：与对照组相比，GW4064处理的ADSC中有1371种基因发生显著变化；与对照组相比，转染Ad-FXR病毒的ADSC中有51种基因发生显著变化。通过将两种干预方式下发生变化的基因取交集，并逐个分析验证，发现Angptl4的蛋白表达水平随着FXR病毒滴度的增加而增加(图6中的A-D)。进一步机制研究证实，Angptl4具有显著的促进内皮细胞成管的能力，而将ADSC中Angptl4的表达敲低后，其旁分泌促血管新生能力则明显下降(图6中的E-F)。说明激活FXR信号后，ADSC通过促进Angptl4的表达和释放发挥旁分泌促血管新生作用。
6、验证本发明所述激活胆汁酸—FXR信号可通过上调ADSC中Nqo-1的表达从而增强其生存能力。
为验证激动胆汁酸—FXR信号增强ADSC生存能力的具体机制，我们检测了细胞中几种经典的抗氧化损伤蛋白的表达，结果发现Nqo-1的表达水平在激动胆汁酸—FXR信号后显著增加(图7中的A～B)。进一步机制研究证实，激动胆汁酸—FXR信号后ADSC增强的生存能力在Nqo-1敲低后显著下降(图7中的C～F)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军空军军医大学
<120> 一种重组间充质干细胞及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccgcca ccatggtgat gcagtttcag ggtttagaaa atccaattca gattagtctt 60
caccacagcc accggctgtc aggatttgtg ccggaaggga tgagtgtgaa gccagctaaa 120
ggtatgctaa cagaacacgc ggcaggccct ctggggcaga atctggattt ggaatcgtac 180
tccccataca acaatgtccc gtttcctcaa gttcagccac agatttcctc ctcgtcttac 240
tattccaacc tgggcttcta cccccaacaa ccggaagact ggtattctcc tggcatctat 300
gaactcaggc gaatgcccgc tgagactggg taccagggag agactgaggt atcagagatg 360
cctgtgacaa agaagccgcg aatggccgcg gcatcggcag gcagaataaa aggggatgag 420
ctgtgtgttg tctgtggaga cagggcctct gggtaccact acaacgcgct cacctgtgag 480
ggctgcaaag gtttcttccg aagaagcatt accaagaacg ccgtgtacaa gtgtaagaac 540
gggggcaact gcgtgatgga catgtacatg cgcaggaagt gccaggagtg ccggctaagg 600
aagtgcaaag agatggggat gttggctgaa tgtttgttaa ctgaaatcca gtgtaaatct 660
aaacggctaa ggaaaaatgt gaagcagcac gctgatcaga cagctaatga ggacgacagc 720
gaagggcgtg acttgcgaca agtgacctcc acaaccaagt tttgcaggga gaaaacggaa 780
ctcacggcag accaacagac cctcctggat tatattatgg attcgtacaa caaacagaga 840
atgcctcagg aaatcacaaa taaaatctta aaagaagaat ttagtgcaga agaaaatttt 900
ctcatattaa cagaaatggc aaccagtcat gtacagattc tcgtagaatt cacaaaaaag 960
cttccagggt ttcagacact ggatcacgaa gatcagattg ctttgctcaa agggtccgca 1020
gtggaggcca tgtttcttcg ttcggcggag attttcaata agaaacttcc tgccggtcat 1080
gcagacctgt tggaagaaag aattcgaaag agtggtatct ctgatgagta tataaccccg 1140
atgttcagtt tctataaaag tgttggagaa ctcaaaatga ctcaggagga gtacgctctg 1200
ctcacagcga tcgtcatcct ctctccagac agacaataca tcaaggacag agaggcggtg 1260
gagaagctgc aggagcccct gcttgatgtg ctacaaaagc tgtgcaagat gtaccagcct 1320
gagaacccgc agcatttcgc ctgcctcctg ggtcgcctga cggaactccg gacattcaac 1380
catcaccacg ctgagatgct gatgtcttgg agagtgaatg atcacaagtt caccccgctc 1440
ctctgtgaga tctgggatgt gcaggactac aaagaccatg acggtgatta taaagatcat 1500
gacatcgatt acaaggatga cgatgacaag tgagtcgac 1539
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgagccaata cacgtcaatg 20

Claims (4)

1.一种重组间充质干细胞在制备治疗心脏病药物中的应用，所述重组间充质干细胞包括原始细胞和重组病毒，所述重组病毒包含重组腺病毒和/或重组慢病毒；所述重组腺病毒或重组慢病毒携带胆汁酸受体编码基因；
所述胆汁酸受体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述心脏病为缺血性心脏病。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述原始细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脐带血间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缺血性心脏病包括急性心肌梗死。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂。
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