CN111840327B - 治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用 - Google Patents

治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，所述治疗糖尿病足的间质干细胞制剂包含：TSP4过表达的间质干细胞，所述TSP4过表达的间质干细胞的制备方法包括：以pCMV6‑TSP4质粒和FT106质粒载体设计引物，通过PCR扩增和DNA连接反应得到FT106‑TSP4‑GFP慢病毒表达质粒，然后采用慢病毒包装质粒psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞得到FT106‑TSP4‑GFP慢病毒，在用获得的FT106‑TSP4‑GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。本发明提供的制剂能促进血管生成和活化，从而提高制剂对糖尿病足的治疗效果。

Description

治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用。
背景技术
糖尿病足是指由于糖尿病血管病变、神经病变及其感染等综合因素，导致神经性病变使得下肢保护功能减退，大血管和微血管病变使动脉灌注不足致微循环障碍而引起足部疼痛、皮肤深溃疡甚至肢体坏疽的疾病状态。糖尿病足是糖尿病一种严重的并发症，是糖尿病患者致残，甚至致死的重要原因之一，不但给患者造成痛苦，而且给社会及家庭造成了沉重的医疗负担。
临床上用于治疗糖尿病足的方法有药物治疗、血管重建和介入手术，然而，糖尿病患者多年老体弱，常患有心脑血管等疾病，不能耐受手术搭桥等刺激，且血管病变多累及小动脉，部分患者缺乏远端动脉流出道，不具备行血管搭桥和介入治疗的条件。因此，目前糖尿病足的临床治疗仍然非常棘手，难以取得令人满意的疗效，常常导致截肢甚至危及病患生命。目前，在糖尿病足的治疗中，干细胞疗法已经成为最有发展前景的治疗策略，应用干细胞移植为糖尿病足缺血损伤组织修复和功能恢复提供了希望。间充质干细胞，是一种具有自我更新、高度增殖和多系分化能力的细胞群。间质干细胞已被证实是一类具有多向分化潜能的干细胞，可以在一定的诱导条件下分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌等，参与不同组织的修复，还能够促进血管生成，既可以分化成为血管内皮细胞和平滑肌细胞，直接形成新的血管，同时还可以通过旁分泌VEGF、Ang-I、Ang-II等多种血管生成因子来参与血管的新生过程。
但是，在实际应用中，由于间质干细胞在人体中的含量不高，例如：骨髓间质干细胞大约占据骨髓中单核细胞数量的0.001％至0.01％，在临床治疗中需要较大的采髓量，对患者年龄、身体条件、心理接受程度要求较高。且由于氧化应激、低氧等微环境改变使移植后间质干细胞的存活率非常低，新生血管形成速度慢等，极大地限制了间质干细胞在糖尿病足疾病中的治疗效果。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，旨在解决现有间质干细胞由于在人体中含量不高，存活率非常低，形成速度慢等缺陷，极大地限制了间质干细胞在糖尿病足疾病中的应用和治疗效果技术问题。
本发明实施例的另一目的在于提供一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，所述治疗糖尿病足的间质干细胞制剂包含：TSP4过表达的间质干细胞，所述TSP4过表达的间质干细胞的制备方法包括以下步骤：
获取pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体，根据所述pCMV6-TSP4质粒的基因编码区序列设计用于扩增TSP4的第一引物对，根据所述FT106质粒载体的基因编码区序列设计用于扩增FT106的第二引物对；
分别以所述pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒为模板，进行聚合酶链式反应扩增，分别扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链；
通过DNA连接反应将所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链连接到所述FT106寡核苷酸链中，得到连接产物FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒；
获取慢病毒载体psPAX2和pMD.2G，将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒；
获取间质干细胞，用所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。
优选地，所述第一引物对包括：
第一上游引物: 5’ TATATAAGCAGAGCTATGCCGGCCCCACGCGCG 3’
第一下游引物: 5’ATGGTCTTTGTAGTCATTATCCAAGCGGTCGAAACTCTGG 3’。
优选地，所述第二引物对包括：
第二上游引物: 5’GACTACAAAGACCATGACGG 3’
第二下游引物: 5’AGCTCTGCTTATATAAACCTCCC 3’。
优选地，所述DNA连接反应的步骤包括：
获取5*In-Fusion® HD 蛋白酶，按所述5*In-Fusion® HD 蛋白酶、所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链和所述FT106寡核苷酸链的质量比为1：（1.5~2.5）：（1.5~2.5），建立反应体系；
将所述反应体系依次在35℃~40℃温度下反应5~10分钟、45℃~55℃温度下反应10~20分钟，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒。
优选地，所述将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞的步骤包括：
获取2.5M的CaCl2溶液，制备第一混合液，以所述第一混合液的质量百分比为100%计，所述第一混合液包括：10%~15%的所述2.5M的CaCl2溶液，0.015%~0.02%的所述psPAX2，0.005%~0.01%的所述pMD.2G，0.02%~0.03%的所述FT106-TSP4慢病毒表达质粒，余量为ddH2O；
获取2*HBS缓冲溶液，将所述第一混合液添加到等体积的所述2*HBS 缓冲溶液中，室温静置20~30分钟，得到DNA静置液；
获取含有293T细胞的培养皿，将所述DNA静置液滴加入所述含有293T细胞的培养皿中培养，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒。
优选地，所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞的步骤包括：
将所述间质干细胞接种到含有第一培养基的细胞培养瓶中，在温度为35℃~40℃的细胞培养箱中，培养至所述间质干细胞的密度为75%~85%，得到第一培养产物，其中，所述第一培养基为含有FBS和双抗的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第一培养基总质量的10%，所述双抗的质量百分含量占所述第一培养基总质量的1%；
将所述第一培养产物的培养基更换为第二培养基，在35℃~40℃的条件下培养2~4小时，得到第二培养产物，其中，所述第二培养基为含有FBS的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第二培养基总质量的5%；
将所述第二培养产物的培养基更换为慢病毒培养基，在35℃~40℃的条件下培养5~8小时，得到第三培养产物；
将所述第三培养产物的培养基更换为第三培养基，培养48~72小时，得到TSP4过表达的间质干细胞，其中，所述第三培养基为包含有FBS和GM的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第三培养基总质量的5%，所述GM的质量百分含量占所述第三培养基总质量的1‰。
优选地，所述慢病毒的培养基为包含有FBS，聚凝胺和FT106-TSP4-GFP慢病毒的上清液的DMEM/F-12培养基，其中，所述FBS的质量百分含量占所述慢病毒培养基总质量的5%，所述聚凝胺的浓度为8ng/ml·培养基，所述FT106-TSP4-GFP慢病毒的上清液的浓度为（0.5~1）ml/ml·培养基。
优选地，所述间质干细胞选自：骨髓间质干细胞、脐带间质干细胞、胎盘间质干细胞或脂肪间质干细胞。
优选地，所述间质干细胞选自：第三代至第六代的间质干细胞。
一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂的应用，将上述的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂应用于治疗糖尿病足的药物中。
本发明提供的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，包含有TSP4过表达的间质干细胞，该TSP4过表达的间质干细胞以pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体设计扩增引物，分别进行PCR扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链，然后通过DNA连接反应得到FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒，再采用慢病毒载体（包装质粒）psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞得到FT106-TSP4-GFP慢病毒，最后用获得的FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。本发明治疗糖尿病足的间质干细胞制剂通过可调控的基因修饰手段，以pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体设计引物，经过PCR扩增、DNA连接和质粒包装转染等步骤，得到含有TSP4的FT106-TSP4-GFP慢病毒，其中，pCMV6-TSP4质粒中TSP4具有促进新生血管的生长，并且在内皮细胞中也发挥促血管生成的功能；FT106质粒与间质干细胞具有好的结合效果，通过包装成慢病毒后，更容易感染间质干细胞，提高感染效果；且FT106质粒含有GFP标记基因，有利于后续对目标产物的检测鉴定。用含有TSP4的FT106-TSP4-GFP慢病毒感染的间质干细胞，将TSP4基因片段带入间质干细胞基因组，使间质干细胞在表达分泌蛋白时，除了表达自身蛋白外，同时也表达了新增的TSP4目的基因片段，使TSP4在间质干细胞可以过表达，促进间质干细胞的旁分泌功能从而发挥协同作用，使间质干细胞内血管内皮生长因子和促血管生成素1/2等多种血管生成因子过表达，提高间质干细胞促血管生成和活化的效率，增加糖尿病足局部缺血区域血管密度，生成活化的血管可促进微循环和代谢的恢复，从而提高治疗糖尿病足的间质干细胞制剂对糖尿病足的治疗效果，以促进糖尿病足神经系统和运动功能的恢复。
本发明提供的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂的应用，将能够实现TSP4、血管内皮生长因子和促血管生成素1/2等多种血管生成因子过表达，且造血重建和血管生成效率高的FT106-TSP4-GFP慢病毒感染的间质干细胞制剂应用于治疗糖尿病足疾病的药物中，能有效诱导糖尿病足引起的缺血损伤边缘区域的血管生成，促进缺血区域的新陈代谢以及修复神经系统和运动功能，从而提高糖尿病足药物对糖尿病的治疗效率。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的FT106-TSP4-GFP慢病毒质粒酶切琼脂糖凝胶电泳图。
图2是本发明实施例2提供的骨髓间质干细胞的流式检测图。
图3是本发明实施例3提供的TSP4过表达的间质干细胞的荧光蛋白检测图。
图4是本发明实施例提供的慢病毒感染的骨髓间质干细胞对大鼠DF模型缺血型区域血管生成测试的血管内皮细胞标志物vWF的阳性表达率图。
图5是本发明实施例提供的慢病毒感染的骨髓间质干细胞对大鼠DF模型缺血型区域血管生成测试的血管内皮细胞标志物vWF的分布图。
图6是本发明实施例提供的慢病毒感染的骨髓间质干细胞对大鼠DF模型运动功能恢复测试评分图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的重量可以是µg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
本发明实施例提供了一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，所述治疗糖尿病足的间质干细胞制剂包含：TSP4过表达的间质干细胞，所述TSP4过表达的间质干细胞的制备方法包括以下步骤：
S10. 获取pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体，根据所述pCMV6-TSP4质粒的基因编码区序列设计用于扩增TSP4的第一引物对，根据所述FT106质粒载体的基因编码区序列设计用于扩增FT106的第二引物对；
S20. 分别以所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链为模板，进行聚合酶链式反应扩增，分别扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链；
S30. 通过DNA连接反应将所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链连接到所述FT106寡核苷酸链中，得到连接产物FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒；
S40. 获取慢病毒载体psPAX2和pMD.2G，将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒；
S50. 获取间质干细胞，用所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。
本发明实施例提供的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，包含有TSP4过表达的间质干细胞，该TSP4过表达的间质干细胞以pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体设计扩增引物，分别进行PCR扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链，然后通过DNA连接反应得到FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒，再采用慢病毒载体（包装质粒）psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞得到FT106-TSP4-GFP慢病毒，最后用获得的FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。本发明实施例治疗糖尿病足的间质干细胞制剂通过可调控的基因修饰手段，以pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体设计引物，经过PCR扩增、DNA连接和质粒包装转染等步骤，得到含有TSP4的FT106-TSP4-GFP慢病毒，其中，pCMV6-TSP4质粒中TSP4具有促进新生血管的生长，并且在内皮细胞中也发挥促血管生成的功能；FT106质粒与间质干细胞具有好的结合效果，通过包装成慢病毒后，更容易感染间质干细胞，提高感染效果；且FT106质粒含有GFP标记基因，有利于后续对目标产物的检测鉴定。用含有TSP4的FT106-TSP4-GFP慢病毒感染的间质干细胞，将TSP4基因片段带入间质干细胞基因组，使间质干细胞在表达分泌蛋白时，除了表达自身蛋白外，同时也表达了新增的TSP4目的基因片段，使TSP4在间质干细胞可以过表达，促进间质干细胞的旁分泌功能从而发挥协同作用，使间质干细胞内血管内皮生长因子和促血管生成素1/2等多种血管生成因子过表达，提高间质干细胞促血管生成和活化的效率，增加糖尿病足局部缺血区域血管密度，生成活化的血管可促进微循环和代谢的恢复，从而提高治疗糖尿病足的间质干细胞制剂对糖尿病足的治疗效果，以促进糖尿病足神经系统和运动功能的恢复。
具体地，上述步骤S10中，获取pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体，根据所述pCMV6-TSP4质粒的基因编码区序列设计用于扩增TSP4的第一引物对，根据所述FT106质粒载体的基因编码区序列设计用于扩增FT106的第二引物对。本发明实施例以pCMV6-TSP4质粒的基因编码区序列设计第一引物对，采用的pCMV6-TSP4质粒中含有TSP4基因序列，TSP4具有结合胶原、肝素及钙离子的特点，可与多种基质蛋白结合调控细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，参与调节血小板黏附和聚集、血栓形成、平滑肌增殖和迁移等生物学过程，能够促进新生血管的生长，活化血管内皮细胞，提高内皮细胞促血管生成的功能。另外，以FT106质粒载体的基因编码区序列设计第二引物对，FT106质粒与间质干细胞具有好的结合效果，通过包装成慢病毒后，更容易感染间质干细胞，提高感染效果；且FT106质粒含有GFP标记基因，有利于后续对目标产物的检测鉴定。本发明实施例通过以pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体设计序列，不但有利于后续慢病毒感染间质干细胞，使慢病毒更好的结合到间质干细胞内中，而且后续制得的含有TSP4基因序列的间质干细胞，使间质干细胞的中TSP4的过表达，同时促进间质干细胞中多种血管生成因子的旁分泌，从而提高治疗糖尿病足的间质干细胞制剂对糖尿病足的治疗效果。
作为优选实施例，所述第一引物对包括：
第一上游引物: 5’ TATATAAGCAGAGCTATGCCGGCCCCACGCGCG 3’
第一下游引物: 5’ATGGTCTTTGTAGTCATTATCCAAGCGGTCGAAACTCTGG 3’。
作为优选实施例，所述第二引物对包括：
第二上游引物: 5’GACTACAAAGACCATGACGG 3’
第二下游引物: 5’AGCTCTGCTTATATAAACCTCCC 3’。
具体地，上述步骤S20中分别以所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链为模板，进行聚合酶链式反应扩增，分别扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链。本发明实施例通过特异性强，灵敏度高，操作简便的聚合酶链式反应（PCR）扩增，分别扩增得到目的基因：pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链。
作为优选实施例，所述第一引物对的PCR扩增反应体系包括下表1：
表1
Figure 195823DEST_PATH_IMAGE001
作为更优选地实施例，所述第一引物对的PCR扩增反应体系包括：以质粒pCMV6-TSP4为模板构建PCR扩增体系，加入2*phanta酶50ul、第一上游引物2ul、第一下游引物2ul、质粒2ul、补ddH2O至100ul，混合均匀后在94℃预变性2min，在94℃变性10 s；然后在57℃退火30 s，在72℃延伸3min，30 个循环；最后在72℃延伸 5min，得到PCR扩增pCMV6-TSP4序列。
作为优选实施例，所述第二引物对的PCR扩增反应体系包括下表2：
表2
Figure 975560DEST_PATH_IMAGE002
作为更优选地实施例，所述第二引物对的PCR扩增反应体系包括：以质粒FT106为模板构建PCR扩增体系，加入2*phanta酶50ul、第二上游引物2ul、第二下游引物2ul、质粒2ul、补ddH2O至100ul，混合均匀后在94℃预变性2min，在94℃变性10 s；然后在57℃退火30s，在72℃延伸30s，30 个循环；最后在72℃延伸 5min，得到PCR扩增FT106序列。
具体地，上述步骤S30中通过DNA连接反应将所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链连接到所述FT106寡核苷酸链中，得到连接产物FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒。本发明实施例通过DNA连接反应将所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链连接到所述FT106寡核苷酸链中，得到同时含有pCMV6-TSP4序列和FT106序列的慢病毒表达质粒，该慢病毒质粒不但与间质干细胞有较好的感染结合能力，而且其中的TSP4基因序列能够使间质干细胞中的TSP4过表达，并促进血管内皮生长因子和促血管生成素1/2等多种血管生成因子过表达，提高间质干细胞促血管生成和活化的效率，生成活化的血管可促进微循环和代谢的恢复，从而提高治疗糖尿病足的间质干细胞制剂对糖尿病足的治疗效果。另外，连接产物FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒还含有便于检测的GFP标记。
作为优选实施例，所述DNA连接反应的步骤包括：获取5*In-Fusion® HD 蛋白酶，按所述5*In-Fusion® HD 蛋白酶、所述pCMV6-TSP4序列和所述FT106序列的质量比为1：（1.5~2.5）：（1.5~2.5），建立反应体系；将所述反应体系依次在35℃~40℃温度下反应5~10分钟、45℃~55℃温度下反应10~20分钟，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒。
在一些具体实施例中，所述DNA连接反应的步骤包括：建立In-Fusion反应体系：分别加入PCR扩增的FT106和pCMV6-TSP4寡核苷酸链各4ul、5*In-Fusion® HD Enzymepremix 2ul，充分混匀。将PCR管置入PCR仪中，设置运行程序为：37℃*15min、50℃*15min，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒，产物于-20℃储存备用。经连接产物转化，菌液PCR后提取质粒，对连接产物FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒进行酶切鉴定。
作为优选实施例，上述步骤S40中获取慢病毒载体psPAX2和pMD.2G，将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒。本发明实施例采用慢病毒包装质粒（载体）psPAX2和pMD.2G与FT106-TSP4-GFP慢病毒包装，将FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒包装转染成为有感染力的病毒颗粒，然后通过转染293T细胞，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒，实现慢病毒基因在细胞或活体组织中表达。
在一些实施例中，将经酶切鉴定正确后FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞（人肾上皮细胞系），得到FT106-TSP4-GFP慢病毒。在一些具体实施例中，采用SalI和EcoRI对所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒进行双酶切鉴定，酶切体系包括下表3：
表3
体系组分 体积/µL
FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒 1µL
cut smart 2.5µL
SalI 0.5µL
EcoRI 0.5µL
dH2O 补至25µL
总和 25L
作为优选实施例，所述将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒包装质粒psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞的步骤包括：
S41. 获取2.5M的CaCl2溶液，制备第一混合液，以所述第一混合液的质量百分比为100%计，所述第一混合液包括：10%~15%的所述2.5M的CaCl2溶液，0.015%~0.02%的所述psPAX2，0.005%~0.01%的所述pMD.2G，0.02%~0.03%的所述FT106-TSP4慢病毒表达质粒，余量为ddH2O；
S42. 获取2*HBS 缓冲溶液，将所述第一混合液添加到等体积的所述2*HBS 缓冲溶液中，室温静置20~30分钟，得到DNA静置液；
S43. 获取含有293T细胞的培养皿，将所述DNA静置液滴加入所述含有293T细胞的培养皿中培养，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒。
在一些具体实施例中，所述将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒包装质粒psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞的步骤包括：
S41. 获取2.5M的CaCl2溶液，制备第一混合液，所述第一混合液包括：50ul的所述2.5M的CaCl2溶液，7.5ug的所述psPAX2，2.5ug的所述pMD.2G，10ug的所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒，补ddH2O至500ul；
S42. 获取2*HBS 缓冲溶液，将所述第一混合液添加到补ddH2O至500ul的所述2*HBS 缓冲溶液中，室温静置20分钟，得到DNA静置液；
S43. 获取含有293T细胞的培养皿，将所述DNA静置液滴加入所述含有293T细胞的培养皿中培养，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒。
具体地，上述步骤S50中获取间质干细胞，用所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。本发明实施例将制得的FT106-TSP4-GFP慢病毒感染间质干细胞即可得到TSP4过表达的间质干细胞，经FT106-TSP4-GFP慢病毒感染后的间质干细胞能够实现TSP4的过表达，促进间质干细胞的旁分泌功能，使间质干细胞内血管内皮生长因子和促血管生成素1/2等生长因子过表达，从而提高间质干细胞促血管生成的效率，提高其在缺血性疾病治疗药物中的应用。
作为优选实施例，所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞的步骤包括：
S51. 将所述间质干细胞接种到含有第一培养基的细胞培养瓶中，在温度为35℃~40℃的细胞培养箱中，培养至所述间质干细胞的密度为75%~85%，得到第一培养产物，其中，所述第一培养基为含有FBS和双抗的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第一培养基总质量的10%，所述双抗的质量百分含量占所述第一培养基总质量的1%；
S52. 将所述第一培养产物的培养基更换为第二培养基，在35℃~40℃的条件下培养2~4小时，得到第二培养产物，其中，所述第二培养基为含有FBS的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第二培养基总质量的5%；
S53. 将所述第二培养产物的培养基更换为慢病毒培养基，在35℃~40℃的条件下培养5~8小时，得到第三培养产物；
S54. 将所述第三培养产物的培养基更换为第三培养基，培养48~72小时，得到TSP4过表达的间质干细胞，其中，所述第三培养基为包含有FBS和GM的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第三培养基总质量的5%，所述GM的质量百分含量占所述第三培养基总质量的1‰。
具体地，上述步骤S51中，将所述间质干细胞接种到第一培养基的细胞培养瓶中，35℃~40℃的细胞培养箱中，培养至所述间质干细胞的密度为75%~85%，得到第一培养产物。本发明实施例采用的第一培养基为含有FBS和双抗的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第一培养基总质量的10%，所述双抗的质量百分含量占所述第一培养基总质量的1%，在间质干细胞培养的同时，起到抑制细菌生长，避免细胞污染的作用。本发明实施例得到的第一培养产物中间质干细胞密度为75%~85%，该细胞密度不但使细胞保持最佳增殖状态，而且使细胞维持一定的数量以便更好地与病毒结合。
具体地，上述步骤S52中，将所述第一培养产物的培养基更换为第二培养基，在35℃~40℃的条件下培养2~4小时，得到第二培养产物。本发明实施例采用的第二培养基为含有FBS的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第二培养基总质量的5%，在该培养基下培养的主要目的是去除培养基中双抗对后续添加的FT106-TSP4-GFP慢病毒的杀伤作用，并降低血清含量，使间质干细胞处于饥饿状态，有利于后续慢病毒进入细胞内。
具体地，上述步骤S53中，将所述第二培养产物的培养基更换为慢病毒培养基，在35℃~40℃的条件下培养5~8小时，得到第三培养产物。本发明实施例采用慢病毒培养基对第二培养产物进行培养，使慢病毒进入间质干细胞内，感染间质干细胞。
作为优选实施例，所述慢病毒的培养基为包含有FBS，polybrene（聚凝胺）和FT106-TSP4-GFP慢病毒的上清液的DMEM/F-12培养基，其中，所述FBS的质量百分含量占所述慢病毒培养基总质量的5%，所述聚凝胺的浓度为8ng/ml·培养基，所述FT106-TSP4-GFP慢病毒的上清液的浓度为（0.5~1）ml/ml·培养基。
具体地，上述步骤S54中，将所述第三培养产物的培养基更换为第三培养基，培养48~72小时，得到TSP4过表达的间质干细胞，其中，所述第三培养基为包含有FBS和GM的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第三培养基总质量的5%，所述GM的质量百分含量占所述第三培养基总质量的1‰。本发明实施例将经慢病毒感染完后的间质干细胞，培养在包含有FBS和GM的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第三培养基总质量的5%，所述GM的质量百分含量占所述第三培养基总质量的1‰的第三培养基中培养，待用。
作为优选实施例，所述间质干细胞选自：骨髓间质干细胞、脐带间质干细胞、胎盘间质干细胞或脂肪间质干细胞。本发明实施例采用的骨髓间质干细胞、脐带间质干细胞、胎盘间质干细胞或脂肪间质干细胞包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)、血小板源生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、促血管生成素1/2(angiopoietin-1/2, Ang1/2)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等在内的多种生长因子，这些生长因子一起参加了调节细胞营养、迁移、支持、增殖、存活、凋亡、分化等多种细胞反应，还含有能够促进新生血管的生长，提高内皮细胞促血管生成的功能的血小板反应素TSP-4(thrombospondin-4)。本发明实施例采用的间质干细胞具有自我更新和多向分化和高度增殖等能力，能够加速造血重建，诱导缺血损伤边缘区域的血管生成，促进缺血区域的新陈代谢以及修复神经系统和运动功能，能够提高治疗糖尿病足的间质干细胞制剂对糖尿病足的治疗效果。
作为更优选实施例，所述间质干细胞选自：第三代至第六代的间质干细胞。本发明实施例采用第三代至第六代骨髓间质干细胞，以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，并形成毗邻细胞之间的网状连接，此时细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，此时干细胞生命力旺盛，细胞增殖和分化能力强，FT106-TSP4-GFP慢病毒感染率高。更优选地，所述间质干细胞选自：第三代至第六代的骨髓间质干细胞。
本发明实施例还提供了一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂的应用，包括：将上述任一的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂应用于治疗糖尿病足的药物中。
本发明实施例提供的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂的应用，将能够实现TSP4、血管内皮生长因子和促血管生成素1/2等多种血管生成因子过表达，且造血重建和血管生成效率高的FT106-TSP4-GFP慢病毒感染的间质干细胞制剂应用于治疗糖尿病足疾病的药物中，能有效诱导糖尿病足引起的缺血损伤边缘区域的血管生成，促进缺血区域的新陈代谢以及修复神经系统，从而提高糖尿病足药物对糖尿病的治疗效率。
作为优选实施例，将上述任一的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂应用于治疗糖尿病足的肌肉注射药物中，通过局部肌肉注射治疗糖尿病足，应用方便，直达患处，疗效快。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
实施例1
一种FT106-TSP4-GFP慢病毒的制备方法。
（1）应用snapgene软件，根据所述pCMV6-TSP4质粒的基因编码区序列设计第一引物对：
第一上游引物: 5’ TATATAAGCAGAGCTATGCCGGCCCCACGCGCG 3’
第一下游引物: 5’ATGGTCTTTGTAGTCATTATCCAAGCGGTCGAAACTCTGG 3
根据所述FT106质粒载体的基因编码区序列设计第二引物对：
第二上游引物: 5’GACTACAAAGACCATGACGG 3’
第二下游引物: 5’AGCTCTGCTTATATAAACCTCCC 3。
（2）分别以所述pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒为模板，进行聚合酶链式反应扩增，分别扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链。
其中，所述第一引物对的PCR扩增反应体系包括：以质粒pCMV6-TSP4为模板构建PCR扩增体系，加入2*phanta酶50ul、第一上游引物2ul、第一下游引物2ul、质粒2ul、补ddH2O至100ul，混合均匀后在94℃预变性2min，在94℃变性10 s；然后在57℃退火30 s，在72℃延伸3min，30 个循环；最后在72℃延伸 5min，得到PCR扩增pCMV6-TSP4寡核苷酸链。
所述第二引物对的PCR扩增反应体系包括：以质粒FT106为模板构建PCR扩增体系，加入2*phanta酶50ul、第二上游引物2ul、第二下游引物2ul、质粒2ul、补ddH2O至100ul，混合均匀后在94℃预变性2min，在94℃变性10 s；然后在57℃退火30 s，在72℃延伸30s，30个循环；最后在72℃延伸 5min，得到PCR扩增FT106寡核苷酸链。
PCR扩增完成后，对扩增产物pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链进行胶回收纯化，得到纯化的pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链DNA溶液。
（3）DNA连接所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒。①建立In-Fusion反应体系：取PCR管，分别加入PCR扩增的FT106和pCMV6-TSP4寡核苷酸链各4ul、5*In-Fusion® HD Enzyme premix 2ul，充分混匀。②将PCR管置入PCR仪中，设置运行程序为：37℃*15min、50℃*15min，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒，-20℃储存备用。
构建的FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒经过SalI和EcoRI双酶切后得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测。如附图1，FT106-TSP4-GFP质粒酶切电泳图所示，分别在大约6411bp,3110bp和908bp处有三条清晰条带，与预期片段数和片段大小一致。证明慢病毒表达质粒FT106-TSP4-GFP构建成功。
（4）FT106-TSP4-GFP慢病毒的制备。①将4-5*106 293T细胞种植到10cm细胞培养皿（H-DMEM + 10% FBS+1%P/S），标记，细胞培养箱培养过夜。②质粒转染前2h，更换培养基（H-DMEM + 5% FBS）。③取1.5mlEP管标记为A，加入2.5M Cacl2 50ul、psPAX2 7.5ug 、pMD.2G 2.5ug、 FT106-TSP4 10ug，补ddH2O至500ul。取另一1.5mlEP管标记为B，加入2*HBSBuffer 500ul。将A中的DNA Mixed混匀后加入到B中，室温静置20min。④将静置后的上述DNA混悬液逐滴加入10cm细胞培养皿，标记，放至细胞培养箱继续培养。⑤培养6h后，更换培养基（H-DMEM + 10% FBS），每日观察质粒转染情况。⑥每24h更换培养基（H-DMEM + 10%FBS），并将被更换的培养基收集，质粒转染约72h后视细胞状态可选择停止继续更换培养基。⑦将收集好的培养基，通过0.45um针头式过滤器过滤处理，收集滤液。⑧将收集的滤液加入到超滤离心管中，置入离心机，4℃ 2000rpm*15min慢升慢降，离心结束收集滤网中的FT106-TSP4-GFP慢病毒上清液。标记，-80℃储存备用。
实施例2
一种骨髓间质干细胞BMSC的培养方法。
（1）SD大鼠(50±10)g断颈处死，75%酒精浸泡10min。
（2）无菌条件下分离大鼠股骨，剪掉股骨干骺端，用5ml注射器吸取DMEM/F12完全培养基（DMEM/F12+20%FBS+1%双抗）冲出骨髓至10cm2细胞培养皿中，经移液枪吹打制成细胞悬液。
（3）将上述细胞悬液移至15ml离心管中，标记，800rpm*10min离心处理，弃上清。DMEM/F12完全培养基重悬细胞后，将细胞悬液移至25cm2培养瓶中，放入37℃ 95%CO2细胞培养箱培养，48h后换液。
（4）细胞密度至80%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，并传至75cm2细胞培养瓶继续培养。
（5）待75cm2细胞培养瓶中细胞密度至80%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，完全培养基终止消化后经离心处理，PBS重悬细胞，得到BMSC。
选用CD44和CD90 (BMSC表面特征性标志物)，CD34 (淋巴细胞标志物)和CD45 (造血干细胞标志物)（eBioscience，San Diego，CA，USA），流式细胞术分析细胞表型特征，骨髓间质干细胞的流式检测结果如附图2所示。
由附图2可见，其中，CD44和CD90 (骨髓间质干细胞表面特征性标志物)的阳性率分别高达98.34%和99.88%，说明骨髓间质干细胞纯化程度好。然而，CD45 (淋巴细胞标志物)的阳性率为1.81%，CD34 (造血干细胞标志物)的阳性率为4.81%，含量较低，说明培养获得的骨髓间质干细胞中杂质细胞很少，进一步说明骨髓间质干细胞被高度纯化。
实施例3
一种FT106-TSP4-GFP慢病毒感染骨髓间质干细胞（TSP4-BMSC）的方法。
（1）将所述骨髓间质干细胞接种到细胞培养瓶中，在DMEM/F12+10%FBS+1%双抗的培养基中，37℃的细胞培养箱中，培养至所述骨髓间质干细胞的密度为80%，得到第一培养产物；
（2）将所述第一培养产物的培养基更换为包含DMEM/F-12 和 5% FBS的培养基，在37℃的条件下培养2小时，得到第二培养产物；
（3）将所述第二培养产物的培养基更换为包括DMEM/F-12，5% FBS，8ng/ml 聚凝胺和1ml/ ml·培养基的FT106-TSP4-GFP慢病毒上清液的慢病毒培养基，在37℃的条件下培养6小时，得到第三培养产物；
（4）将所述第三培养产物的培养基更换为包含DMEM/F-12，5% FBS和1‰GM的培养基，培养72小时，得到慢病毒感染的骨髓间质干细胞（TSP4-BMSC）。
用重组FT106-TSP4-GFP慢病毒载体感染BMSCs 72小时后，检测GFP（绿色荧光蛋白）阳性细胞的感染效率，其百分比为65.49%±0.0145，说明感染成功。如附图3所示，未感染前骨髓间质干细胞没有GFP，经慢病毒感染后的骨髓间质干细胞可观察到明显且分布均匀的GFP，说明感染成功。
实施例4
一种FT106-TSP4-GFP慢病毒感染的骨髓间质干细胞（TSP4-BMSC）促进大鼠DF模型动物缺血区域血管生成作用的测定。
分别取三组大鼠（DF组，BMSC+DF组，TSP4-BMSC+DF组）肢体缺血区域进行石蜡包埋切片，然后进行vWF免疫荧光染色，以测定TSP4-BMSC能否促进DF大鼠缺血区域血管生成。
（1）分别选取不同实验分组的大鼠（n≧3），使用10％的水合氯醛腹腔注射（3.0ml/kg）麻醉，取大鼠手术侧肢体于缺血周边区域剪取大小约1*2cm的肌肉组织，并包埋在石蜡中，制备5um的连续冠状切片。
（2）将切片置于60℃烘箱中烘烤2h后取出切片，趁热将其放入二甲苯中脱蜡三次，每次10min，无水乙醇浸泡10min，90%乙醇浸泡5min，80%乙醇浸泡3min。
（3）将切片浸泡于PBS中，洗3次，每次3min。
（4）配制1X柠檬酸修复液，将切片置于架上浸泡在抗原修复液中240℃*3min。
（5）使抗原修复液自然冷却至温度低于50℃，将切片浸泡于PBS中，洗3次，每次2min。
（6）用免疫组化笔画圈，使组织置于圈内，向圈内滴加50ul 3%H2O2孵育5min，以除去内源性过氧化氢酶，后将切片浸泡于PBS中，洗3次，每次2min。
（7）配制一抗工作液（1：200），滴加60ul一抗工作液于组织之上，4℃孵育过夜。
（8）将切片浸泡于PBS中，洗3次，每次3min。配制相应抗性Alexa Fluor 488标记的二抗工作液，滴加60ul二抗工作液于组织之上，37℃孵育1小时。
（9）将切片浸泡于PBS中，洗3次，每次3min。配制DAPI工作液染核，观察颜色变化。
（10）80%乙醇浸泡3min，90%乙醇浸泡5min，无水乙醇浸泡10min。
（11）使用倒置相差显微镜（Axio Observer 3，Carl Zeiss AG）拍摄图像。
术后28天对大鼠肢体缺血区域组织切片后进行免疫荧光染色分析，如附图4所示，TSP4-BMSC+DF组的血管内皮细胞标志物vWF的阳性表达率显著高于DF组及BMSC + DF组（**p < 0.01）。如附图5所示，TSP4-BMSC+DF组的血管内皮细胞标志物vWF，数量显著增加，密度最大，表示血管数量多，血管生成效率高，说明TSP4-BMSC能够促进DF大鼠局部缺血区域的血管生成作用。
实施例5
一种FT106-TSP4-GFP慢病毒感染的骨髓间质干细胞（TSP4-BMSC）对大鼠DF模型促进运动功能恢复作用的测定。
将实验大鼠分为四组（DF组，BMSC+DF组，TSP4-BMSC+DF组及假手术组），分别于术后第一天挑取建模成功的大鼠，确定实验分组，BMSC+DF组及TSP4-BMSC+DF组于缺血区域周围肌肉组织均匀注射2*106个BMSCs和TSP4-BMSCs，DF组注射等量的0.9%生理盐水，假手术组只切开皮肤，不结扎血管。应用BBB评分量表分别在术后第1，3，7，14，28天进行运动功能评分。
如附图6所示，假手术组运动功能正常，运动功能评分最高，实验组柱状条越高说明运动功能越接近正常，促进运动功能恢复作用越明显。TSP4-BMSC+DF组的运动功能评分从第7天开始较DF组和BMSC+DF组均有所提高，并一直持续到第28天 (**p < 0.01，*p <0.05)。这些数据表明，TSP4-BMSC治疗能够明显地促进大鼠缺血侧肢体运动功能的恢复。
上述结果充分说明，本发明实施例提供的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂中的TSP4过表达的间质干细胞经局部肌肉注射移植治疗糖尿病足，可以明显地促进糖尿病足局部缺血区域的血管生成作用，提高局部缺血区域血管生成效率，从而促进糖尿病足的运动功能恢复。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市罗湖区人民医院
<120> 一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用
<130> 2018.4.10
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 第一上游引物
<400> 1
tatataagca gagctatgcc ggccccacgc gcg 33
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 第一下游引物
<400> 2
atggtctttg tagtcattat ccaagcggtc gaaactctgg 40
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 第二上游引物
<400> 3
gactacaaag accatgacgg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 第二下游引物
<400> 4
agctctgctt atataaacct ccc 23

Claims (3)

1.一种TSP4过表达的骨髓间质干细胞制作为制备治疗糖尿病足药物的应用，其特征在于，所述TSP4过表达的间质干细胞的制备方法包括以下步骤：
获取pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体，根据所述pCMV6-TSP4质粒的基因编码区序列设计用于扩增TSP4的第一引物对，根据所述FT106质粒载体的基因编码区序列设计用于扩增FT106的第二引物对；
分别以所述pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒为模板，进行聚合酶链式反应扩增，分别扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链；
通过DNA连接反应将所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链连接到所述FT106寡核苷酸链中，得到连接产物FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒；
获取慢病毒载体psPAX2和pMD.2G，将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒；
获取间质干细胞，用所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。
2.如权利要求1所述的TSP4过表达的骨髓间质干细胞制作为制备治疗糖尿病足药物的应用，其特征在于，所述第一引物对包括：第一上游引物: 5’ TATATAAGCAGAGCTATGCCGGCCCCACGCGCG 3’
第一下游引物: 5’ATGGTCTTTGTAGTCATTATCCAAGCGGTCGAAACTCTGG 3’。
3.如权利要求1所述的TSP4过表达的骨髓间质干细胞制作为制备治疗糖尿病足药物的应用，其特征在于，所述第二引物对包括：
第二上游引物: 5’GACTACAAAGACCATGACGG 3’
第二下游引物: 5’AGCTCTGCTTATATAAACCTCCC 3’。
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Promoting therapeutic angiogenesis of focal cerebral ischemia using thrombospondin-4 (TSP4) gene-modified bone marrow stromal cells (BMSCs) in a rat model;Qian Zhang等;《Journal of Translational Medicine》;20190404;第2页右栏倒数第1段-第3页左栏第1段，第4页左栏倒数第1段，附加文件1：图1 *
Qian Zhang等.Promoting therapeutic angiogenesis of focal cerebral ischemia using thrombospondin-4 (TSP4) gene-modified bone marrow stromal cells (BMSCs) in a rat model.《Journal of Translational Medicine》.2019, *

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