CN111733161B - circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用。本发明采用具有较低的免疫原性、较高的多向分化潜能且易于取材，一次取材获取细胞量大的羊膜间充质干细胞，实验表明在hAMSC‑CM刺激后HUVEC中circ6148表达增高，HUVEC迁移，成管能力均增加，细胞内circ6148表达降低可以抑制hAMSC‑CM导致的血管生成作用。在HUVEC中导入circ6148重组质粒可模拟hAMSC‑CM介导的HUVEC迁移，成管能力增加，促进血管生成效果更优。另外，通过重组质粒技术获得促进血管生长的重组质粒，获得方法简单，且稳定性好，弥补了hAMSC获取困难，有效成分易分解等缺点，在促进HUVEC成血管中有着重要作用，为拓展干细胞疗法奠定基础。

Description

circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用
技术领域
本发明属于血管生成研究领域，具体涉及circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用。
背景技术
血管生成在生长发育、器官和组织再生以及许多生理病理条件下都发挥着重要作用。致密的血管系统为高度合成代谢的组织细胞提供氧气和营养并运输代谢废物。血管新生过程中，需要氧气和营养的组织会分泌促血管生成分子，触发内皮细胞延伸出丝状伪足，称之为尖端细胞。这些尖端细胞引导萌芽，并将它们的丝状足向血管生成信号的来源延伸，随后细胞增殖以完成血管出芽。最终，尖端细胞与相邻芽中的尖端细胞相连，建立新的导管环路。由此看来，由生长因子介导的血管内皮细胞增殖在血管新生中十分重要。
干细胞由于其具有自我更新和多向分化潜能，近年来被用于细胞和组织再生。由于干细胞获取困难，目前干细胞疗法多采用异体细胞，由于其来源及排异反应，安全性有待评估，且干细胞产量较低。
干细胞疗法作为近十年来再生医学的热点，在促进成血管方面也取得了很大进展。干细胞是指机体具有自我更新和直接分化成其他细胞的双重能力的细胞。天然的干细胞种类有:胚胎多能或全能干细胞和成人干细胞。成人干细胞主要包括骨髓(骨髓多能干细胞)、内皮祖细胞(EPC)、各种组织细胞(组织多能干细胞)和血液循环干细胞等。间充质细胞(MSCs)具有多潜能、免疫应答和旁分泌等特性，可分化为多种细胞系，具有促进血管生成的潜能，有望成为再生医学的候选细胞。羊膜间充质干细胞(hAMSC)是娩后废弃的胎盘中获得的干细胞，其具有较低的免疫原性、较高的多向分化潜能及无伦理学限制等优点，且易于取材，一次取材获取细胞量大。近年来，使用间充质干细胞条件培养基(CM)代替细胞共培养研究间充质干细胞对研究细胞的单项作用的排除细胞互作干扰。已有研究显示间充质基质细胞条件培养基有促进血管生成的作用。而条件培养基(CM)组分复杂，性质不稳定，易分解，故而我们希望找出在羊膜间充质干细胞促进血管内皮细胞成血管过程中发挥关键作用的生物分子，能大部分代替羊膜间充质干细胞的促血管生成作用。
环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种共价闭合环状单链RNA，无poly尾巴，由pre-mRNA通过反向剪切行成，性质稳定可以抵抗RNaseR降解，是近几年研究兴起的一种新型非编码RNA。其具有独特的通过共价键结合的环状封闭结构，无5’末端帽子结构及3’末端poly(A)尾巴。随着第二代测序的发展成熟以及生物信息学的快速发展，越来越多的circRNA被发现，并且有越来越多文章表明，如circHIPK3可作为RNA海绵吸附miR-558抑制膀胱癌血管新生有研究表明，circRNA可以通过多种机制促进成血管，但大多数集中于肿瘤成血管研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供circ6148(hsa-circ0006148)及其重组载体在促进血管生成上的应用，本发明以刺激血管内皮细胞前后的羊膜间充质干细胞条件培养基进行外泌体芯片分析，根据表达值筛选合适的circRNA。并在血管内皮细胞中验证，再利用由大肠杆菌内获取的circ6148重组质粒代替hAMSC的促成血管作用，该应用有效提高了血管生成的效率。另外，circ6148及其重组质粒的获取方法简单，操作简便，弥补了hAMSC获取困难、有效成分易分解等缺点，在促进HUVEC成血管中有着重要作用。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
circ6148在促进血管生成上的应用，所述circ6148的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
一种重组质粒，所述重组质粒整合了权利要求1中所述的circ6148核苷酸序列。
一种重组载体，转化权利要求2中所述的重组质粒。
上述的重组载体在制备预防或治疗与血管生成相关疾病的产品中应用。
一种促进血管生成的药物组合物，所述药物组合物的有效成分为上述的circ6148或重组载体。
上述药物组合物在制备预防或治疗与血管生成相关疾病的产品中应用。
进一步改进的是，所述与血管生成相关的疾病为肿瘤、眼科疾病、脑部退行性病变，缺血性心血管疾病、伤口愈合及组织损伤修复或组织工程技术。
进一步改进的是，所述眼科疾病为糖尿病视网膜病变或老年黄斑变性；所述脑部退行性病变为帕金森、多发性硬化症、脊髓损伤或中风。
有益效果：
与现有技术相比，本发明circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用，通过发现在干细胞促进血管生成作用中的关键分子，并探究其变化对干细胞介导的血管生成的影响，为拓展干细胞疗法奠定基础。具有如下优势：
1、本发明采用具有较低的免疫原性、较高的多向分化潜能且易于取材，一次取材获取细胞量大的羊膜间充质干细胞(hAMSC)，以刺激血管内皮细胞前后的羊膜间充质干细胞条件培养基进行外泌体芯片分析，根据表达值筛选合适的circ6148，并在血管内皮细胞中验证，circ6148确实具有促进血管生成的功效，且HUVEC迁移，成管能力均增加。因此，新分子circ6148属于首次被发现在血管生成上具有促进作用，且从其他母源基因转路形成的，未有报道指出其母源基因SAMD8与成血管相关，来源广泛；
2、本发明通过设计特异性circ6148引物，利用PCR技术扩增出circ6148，并通过一代测序的方法测定circ6148的准确的环化位点，再利用由大肠杆菌内获取的circ6148重组质粒，在细胞内过表达circ6148比hAMSC-CM有更好的促进HUVEC迁移及血管生成的作用。在HUVEC中导入circ6148重组质粒可模拟hAMSC-CM介导的HUVEC迁移，成管能力增加，且细胞内circ6148表达降低可以抑制hAMSC-CM导致的血管生成作用。更重要的是，重组质粒获得简便，稳定性好。重组质粒技术已十分成熟但利用circRNA重组质粒替代hAMSC的促血管生成作用鲜少应用。本发明利用由大肠杆菌内获取的circ6148重组质粒代替hAMSC的促成血管该应用有效提高了血管生成的效率，之前未出现在任何研究报道中。
附图说明
图1为外泌体芯片的热图；
图2为外泌体芯片的散点图；
图3为hAMSC-CM刺激后HUVEC胞内circ6148表达值变化的Q-PCR检测结果；
图4为在HUVEC内转染circ6148重组质粒的转染效率的Q-PCR检测结果；
图5为hAMSC-CM刺激及转染circ6148重组质粒及小干扰RNA后检测HUVEC细胞迁移率的TRANSWELL实验，(a-g)为HUVEC在小室中培养12小时后结晶紫染色的40倍物镜图，(h)为数据统计结果；
图6为hAMSC-CM刺激及转染circ6148重组质粒及小干扰RNA后检测HUVEC成管能力的成管实验，(a-g)为HUVEC在matrigel培养6小时后的40倍物镜图，(h)为数据统计结果。
具体实施方式
以下各个实施例所用的材料都是常规商业化的材料，引物均购于上海生工生物工程有限公司。
实施例1
从健康足月产妇(南京市妇幼保健院)(伦理文件：No.PJ2013-037-001，南京医科大学)羊膜中提取hAMSC。
实验步骤：1)将置于冰盒保存的胎盘组织通过无菌操作置于紫外消毒完善后的超净台中，用含5％HPL及1％双抗的α-MEM的完全培养基(其中，α-MEM为常规的基础培养基α)完全培养基漂洗3遍后，在10cm培养皿内剥离羊膜层，分离后的薄层羊膜组织置于含5％HPL的α-MEM完全培养基中暂存；2)灭菌眼科剪多次剪切分离后的面积较大的羊膜组织至大小约4cm×4cm组织薄片，在含有1％双抗的PBS中漂洗，充分去除羊膜组织片表面的血凝块以及蜕膜组织；3)将清洁的羊膜组织薄片轻柔转移至含有1％双抗的新鲜PBS中，继续用新的灭菌眼科剪剪切至面积约为1cm×1cm的组织薄片；4)将剪切后尺寸合适的羊膜组织薄片轻柔转移至2.4U/mL浓度的中性蛋白酶-PBS室温溶液中，然后迅速置于37℃孵箱混匀消化10分钟；5)置于含5％HPL及1％双抗的α-MEM完全培养基中静置10分钟；6)将组织轻柔转移至含1mg/mL浓度胶原酶D及20μg/mL浓度DNA酶的α-MEM完全培养液中，迅速置于37℃细胞培养箱混匀消化2.5-3h；7)将过滤后含有hAMSCs的悬液转移至15mL无菌离心管中，低速离心机中以200×g速度离心10分钟；8)以5％HPL及1％双抗的α-MEM完全培养基重悬细胞团接种至10cm培养皿；9)24至48小时后，显微镜下观察细胞贴壁形态舒展情况，酌情予以换液。本实验方法获得的羊膜干细胞活性高，纯度好，具体可参考Jiang F,Ma J,Liang Y,Niu Y,ChenN,Shen M.Amniotic Mesenchymal Stem Cells Can Enhance Angiogenic Capacity viaMMPs In Vitro and In Vivo.Biomed Res Int.2015；2015:324014.doi:10.1155/2015/324014.Epub 2015 Sep 27.PMID:26491665。
hAMSC培养上清收集：1)第二代hAMSC复苏至含5％HPL、1％双抗及2U/mL肝素的α-MEM完全培养液中培养；2)待细胞汇合度达到90％左右时按1:4比例传代；3)待细胞汇合度达到80％左右时予以吸除皿中培养液，PBS漂洗三遍，然后加入对应体积的无血清基培(50％<v/v>DMEM(改良伊格尔培养基)高糖+50％<v/v>α-MEM)，转移至细胞培养箱；4)24小时后收集细胞培养皿中上清至无菌50ml离心管中，弃细胞及培养皿，封口膜处理50ml离心管后室温下3000×g予以离心20分钟后转移上清至新的50ml离心管，注意避免吸入管底细胞碎片；5)收集的上清进一步用50ml无菌注射器加0.22μm规格无菌滤器过滤，所得上清按需分装至15ml离心管并用封口膜隔离后储存在-80℃医用低温冰箱备用，使用时取体积合适的储存上清避免二次冻融，使用时4℃冰箱过夜解冻。
hAMSC条件培养基(hAMSC-CM)配制：用80％体积的hAMSC培养上清+20％体积1:1混合的α-MEM+DMEM糖培养基配置成hAMSC条件培养基(hAMSC-CM)。
hAMSC-CM刺激脐静脉内皮细胞(HUVEC)：用hAMSC-CM置换在对数生长期汇合度达到50％的HUVEC的培养基以施加刺激，HUVEC在37℃细胞培养箱培养24小时后再次收集上清，设置为实验组(CM-aft)。取未刺激HUVEC的相同体积的hAMSC-CM作为对照组(CM-bef)。送往伯豪公司进行外泌体芯片分析，所得结果如图1和图2所示。
从图1中可以看出实验组(CM-aft)中circ6148低表达，对照组(CM-bef)中circ6148高表达，图2中同样可以看出实验组(CM-aft)circ6148低表达，对照组(CM-bef)circ6148高表达；
通过外泌体芯片的热图和散点图可以证明circ6148被HUVEC消耗，使外泌体中circ6148减少，进而证明circ6148参与HUVEC血管生成。
实施例2
我们对hAMSC-CM刺激的HUVEC进行三次独立重复细胞内hsa-circ0006148表达水平检测，实验方法如下：
细胞培养：HUVEC细胞培养在含有10％胎牛血清(Gibico)，1％三抗(Gibico)的DMEM(HYCLON)培养液中；
hAMSC-CM刺激血管内皮细胞:实验步骤：1)用80％体积的hAMSC培养上清+20％体积1:1混合的α-MEM+DMEM高糖培养基配置成hAMSC条件培养基(hAMSC-CM)；对照组(CTR)为无hAMSC培养上清、体积1:1的α-MEM+DMEM高糖培养基；2)给两皿在对数生长期汇合度达到50％的HUVEC的培养基分别换液，在37℃细胞培养箱培养24小时后提取RNA；
细胞总RNA提取：总RNA提取采用Trizol法，收集一大皿细胞，加入1mlTrizol。加入200μl氯仿，剧烈振摇，使上下两相充分混合，室温静置5min后，在4℃下，以12000rpm的速度离心5min。小心吸取上层水相400μl于新的RNase freeEP管中，加入等体积异丙醇(400μl),颠倒混匀，室温放置10min后，4℃下以12000rpm的速度离心15min，离心后可见管内白色RNA斑块。弃尽上清，使用75％乙醇(DEPC水稀释)洗涤斑块一次，在4℃下，以7800rpm的速度离心5min。弃尽上清，室温放置晾干(10～15min),使得酒精挥发干净。之后加入50μl DEPC水溶解，测定浓度备用；
RNA逆转成cDNA；逆转录使用诺唯赞(vazyme)公司的逆转录试剂盒(去基因组DNA)，每个样本取1μgRNA进行逆转录，体系如下：
Figure BDA0002565562300000061
上述混合物混匀，42℃、2min
Figure BDA0002565562300000062
混匀后，进行逆转录PCR，条件如下：
(1)50℃,15min
(2)85℃,5s
cDNA产物可用于Real-time PCR，
PCR反应：将得到的cDNA作为模板进行Real-time PCR,使用诺唯赞(vazyme)公司的SYBR Green Mix,体系为10μl体系：
Figure BDA0002565562300000071
上述混合物混匀后，进行Real-time PCR，反应条件如下：
(1)95℃，5min
(2)95℃，10s-60℃，30s；40个循环
本次所用的引物包括两对，分别为circ6148和actin，所述circ6148的上游引物如序列Q-h-circ6148-F所示，下游引物如Q-h-circ6148-R所示；所述actin的上游引物序列如Q-h-actin-F所示，下游引物如Q-h-actin-R所示，具体序列如下：
Figure BDA0002565562300000072
数据分析：circ6148/actin＝2^-(Ctcirc6148-Ctactin)。统计学组间差异用双尾Student’s t检验，计算P值。结果图3所示，从图中可以看出经实验组(hAMS C-CM)HUVEC胞内circ6148表达量高于对照组(CTR)，进一步验证了hAMSC-CM刺激下HUVEC胞内circ6148表达升高，参与hAMSC-CM介导的HUVEC成血管相关行为。
实施例3
circ6148重组质粒的构建和提取
1.circ6148重组质粒的构建
1.1化学合成5’端含有KpnI酶切位点，3’端含有BamHI酶切位点的目的基因，序列如SEQ ID NO：2示：
GGTACCAGGCAGCGGAGGAGGAAATGGCAGGTCCTAATCAACTCTGCATTCGCCGCTGGACTACCAAGCATGTAGCTGTGTGGCTGAAGGATGAAGGCTTTTTTGAATATGTGGACATTTTATGCAATAAGCACCGACTTGATGGAATCACATTGCTAACATTGACTGAATATGATCTCCGGTCTCCTCCTCTGGAAATCAAAGTCTTAGGGGACATTAAAAGGTTAATGCTCTCAGTCCGAAAATTGCAGAAAATACATATTGATGTTTTAGAAGAGATGGGCTACAACAGTGACAGTCCCATGGGTTCCATGACCCCTTTCATCAGTGCTCTTCAGAGTACAGACTGGCTCTGTAATGGGGAGCTTTCCCATGACTGTGACGGACCCATAACTGACTTGAATTCTGATCAGTACCAGTACATGAATGGTAAAAACAAACATTCTGTTCGAAGATTGGACCCAGAATACTGGAAGACTATACTGAGTTGTATATATGTTTTTATAGTATTTGGATTTACATCTTTCATTATGGTTATAGTCCATGAGCGAGTGCCTGACATGCAGACCTATCCACCACTCCCAGATATATTCTTAGACAGGTGGATCC
1.2GV486载体，KpnI/BamHI酶切，购自上海吉凯基因化学技术有限公司。用KpnI/BamHI酶切化学合成的含有目的基因的质粒：制备如下酶切反应体系(50μl)，置于37℃，2h。
Figure BDA0002565562300000081
1.3重组质粒构建：于冰水浴中配制如下反应体系(10μl)。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。
Figure BDA0002565562300000082
Figure BDA0002565562300000091
1.4转化：将10μL交换反应产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。用无菌的枪头挑取单个菌落进行PCR鉴定，对比序列证明重组质粒构建成功。
2.circ6148重组质粒的提取
将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，详细操作步骤如下：收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；弃上清，加入250μl细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；加入250μl细胞裂解液，再加入10μl蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；
静置1-2min，致使菌体裂解澄清；加入350μl中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5ml EP管；12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清转移至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；加入600μl预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；在超净台中将回收柱转移至新的1.5ml EP管中，静置10-20min，自然晾干；回收柱中加入95μl Nuclease-Free Water，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品即为重组质粒。
实施例4
circ6148对HUVEC细胞迁移和成管能力的影响
1.circ6148重组质粒及小干扰RNA转染
提前24小时在六孔板中每孔种上HUVEC细胞，HUVEC要求汇合度约80％左右,每孔用脂质体(lipo 2000)5μl+2μg重组质粒或每孔用脂质体(lipo 2000)5ul+siRNA(20um)5ul的转染复合物进行片段的转染，24H后收获细胞，获取方法为常规技术手段。
干扰片段序列如下：
Figure BDA0002565562300000101
2.circ6148过表达或敲低效率鉴定
2.1细胞总RNA提取：总RNA提取采用Trizol法，收集一大皿细胞，加入1mlTrizol，再加入200μl氯仿，剧烈振摇，使上下两相充分混合，室温静置5min后，4℃下以12000rpm的速度离心15min。小心吸取上层水相400μl于新的RNase freeEP管中，加入等体积异丙醇(400μl),颠倒混匀，室温放置10min后，在4℃下以12000rpm的速度离心15min，离心后可见管内白色RNA斑块。弃尽上清，使用75％乙醇(DEPC水稀释)洗涤斑块一次，4℃下以7800rpm的速度离心5min。弃尽上清，室温放置晾干(10～15min),使得酒精挥发干净。之后加入50μlDEPC水溶解，测定浓度备用。
2.2 RNA逆转成cDNA:逆转录使用诺唯赞(vazyme)公司的逆转录试剂盒(去基因组DNA)，每个样本取1μg RNA进行逆转录，体系如下：
Figure BDA0002565562300000102
上述混合物混匀，42℃，2min
Figure BDA0002565562300000103
混匀后，进行逆转录PCR，条件如下：
(1)50℃,15min
(2)85℃,5s
cDNA产物可用于Real-time PCR
2.3 PCR反应：将得到的cDNA作为模板进行Real-time PCR,使用诺唯赞(vazyme)公司的SYBR Green Mix,体系为10μl体系：
Figure BDA0002565562300000111
上述混合物混匀后，进行Real-time PCR，反应条件如下：
(1)95℃，5min
(2)95℃，10s—60℃，30s；40个循环
本次使用引物序列如下：
Figure BDA0002565562300000112
数据分析：circ6148/actin＝2^-(Ctcirc6148-Ctactin)。统计学组间差异用双尾Student’s t检验，计算P值。结果如图4所示，图4(a)结果表明经重组质粒转染后HUVEC胞内circ6148水平增高，证明重组质粒构建有效。图4(b)结果表明经小干扰RNA转染后HUVEC胞内circ6148水平降低，证明利用小干扰RNA敲低circ6148有效。
3.HUVEC小室迁移实验：1)胰酶消化HUVEC制备无血清细胞悬液(50％<v/v>DMEN高糖+50％<v/v>α-MEM)于无菌EP管，200μl悬液含15000个内皮细胞用于接种小室上室；2)在小室下室(24孔板)加入600μl体积含5％胎牛血清的培养基体系，轻柔放入小室避免小室底面产生气泡；3)轻轻吹匀EP管内200μl细胞悬液，沿小室侧壁加入上室，轻柔转移至细胞培养箱；4)培养12小时后小心取出小室，去除上室剩余液体及小室底液体后在24孔板内结晶紫甲醛溶液固定1小时；5)固定染色完成后的小室用棉签轻轻搽除小室上室残留细胞，漂洗后自然干燥；6)干燥完成后的小室在显微镜下40倍物镜随机收集5个视野，计数后统计分析。
结果如图5所示，图5(a)和图5(b)可以看出CM组(即hAMSC-CM组)较CTR组细胞迁移率较高，图5(c)和图5(d)中可以看出，用重组质粒过表达circ6148(OE-6148)也能提高细胞迁移率，甚至超过CM组。转染对照质粒(OE-NC)不能提高细胞迁移率，其中图5(c)和图5(d)所用的培养基为无hAMSC培养上清、体积1:1的α-MEM+DMEM高糖培养基。图5(e)-5(g)可以看出使用针对不同位点的小干扰RNA敲低circ6148(即si-1组，si-2组)较不敲低circ6148(即si-NC组)细胞迁移率较高，证明在hAMSC-CM培养条件下使细胞内circ6148表达降低可以显著抑制hAMSC-CM引起的细胞迁移率增高，进一步证明了circ6148在成促进细胞迁移中的重要作用。图5(h)为图5(a)-5(g)的统计结果。
总的来说，重组质粒过表达circ6148(OE-6148)可以提高细胞迁移率的效果，甚至超过CM组。
4.HUVEC成管实验，具体步骤为：
1)Matrigel基质胶(growth factor reduced)从-20℃转移至4℃冰箱过夜解冻，100μl枪头盒及96孔板均4℃冰箱过夜预冷；
2)第二天用预冷100μl枪头将冰盒上解冻成液体的Matrigel基质胶按50μL/孔悬空近孔底加入96孔板并避免产生气泡，水平轻柔转移至37℃孵箱放置30分钟等待Matrigel基质胶凝固完成；
3)取出Matrigel基质胶铺胶凝固完成的96孔板，超净台内每孔按实验逻辑分组接种含4000个HUVEC细胞的100μl体积的细胞悬液(含2％胎牛血清)，迅速转移入细胞培养箱中培养，转移过程中避免96孔板产生离心力以免影响内皮细胞分布；
4)2h、4h及6h时间点分别显微镜下观察并取五个随机视野拍照；Image J软件分析成管相关指标。
结果如图6所示，图6(a)和图6(b)CM组(即hAMSC-CM组)较CTR组的HUVEC血管生成比例高，图6(c)和图6(d)中可以看出，重组质粒过表达circ6148(OE-6148)也能提高细胞血管生成比例，转染对照质粒(OE-NC)不能提高HUVEC血管生成比例，其中图6(c)和图6(d)所用的培养基为无hAMSC培养上清、体积1:1的α-MEM+DMEM高糖培养基。
图6(e)-6(g)可以看出使用针对不同位点的小干扰RNA敲低circ6148(即si-1组，si-2组)较不敲低circ6148(即si-NC组)总管长较高，证明在hAMSC-CM培养条件下使细胞内circ6148表达降低可以显著抑制hAMSC-CM引起的细胞成管，进一步证明了circ6148在成血管中的重要作用。图6(h)为图6(a)-6(g)的统计结果。
总的来说，重组质粒过表达circ6148(OE-6148)可以起到提高细胞血管生成比例，与用hAMSC-CM刺激HUVEC所得效果相同。
综合芯片及实验结果表明在hAMSC-CM刺激后HUVEC中circ6148表达增高，HUVEC迁移，成管能力均增加，在细胞内导入circ6148重组质粒可以模拟hAMSC-CM介导的HUVEC迁移，成管能力增加。因此，circ6148可作为促进血管生成的新分子，在实际应用中可通过增加HUVEC中circ6148表达水平而促进血管生成。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 南京医科大学附属口腔医院
<120> circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 593
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagcggagg aggaaatggc aggtcctaat caactctgca ttcgccgctg gactaccaag 60
catgtagctg tgtggctgaa ggatgaaggc ttttttgaat atgtggacat tttatgcaat 120
aagcaccgac ttgatggaat cacattgcta acattgactg aatatgatct ccggtctcct 180
cctctggaaa tcaaagtctt aggggacatt aaaaggttaa tgctctcagt ccgaaaattg 240
cagaaaatac atattgatgt tttagaagag atgggctaca acagtgacag tcccatgggt 300
tccatgaccc ctttcatcag tgctcttcag agtacagact ggctctgtaa tggggagctt 360
tcccatgact gtgacggacc cataactgac ttgaattctg atcagtacca gtacatgaat 420
ggtaaaaaca aacattctgt tcgaagattg gacccagaat actggaagac tatactgagt 480
tgtatatatg tttttatagt atttggattt acatctttca ttatggttat agtccatgag 540
cgagtgcctg acatgcagac ctatccacca ctcccagata tattcttaga cag 593
<210> 2
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaccaggc agcggaggag gaaatggcag gtcctaatca actctgcatt cgccgctgga 60
ctaccaagca tgtagctgtg tggctgaagg atgaaggctt ttttgaatat gtggacattt 120
tatgcaataa gcaccgactt gatggaatca cattgctaac attgactgaa tatgatctcc 180
ggtctcctcc tctggaaatc aaagtcttag gggacattaa aaggttaatg ctctcagtcc 240
gaaaattgca gaaaatacat attgatgttt tagaagagat gggctacaac agtgacagtc 300
ccatgggttc catgacccct ttcatcagtg ctcttcagag tacagactgg ctctgtaatg 360
gggagctttc ccatgactgt gacggaccca taactgactt gaattctgat cagtaccagt 420
acatgaatgg taaaaacaaa cattctgttc gaagattgga cccagaatac tggaagacta 480
tactgagttg tatatatgtt tttatagtat ttggatttac atctttcatt atggttatag 540
tccatgagcg agtgcctgac atgcagacct atccaccact cccagatata ttcttagaca 600
ggtggatcc 609
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcatgaagtg tgacgtggac at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcaggagga gcaatgatct tg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attcttagac aggcagcgga g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agccacacag ctacatgctt 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tatattctta gacaggcag 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcttagacag gcagcggag 19

Claims (1)

1.circ6148在制备促进血管生成的药物中的应用，其特征在于，所述circ6148的核苷酸序列具体为SEQ ID NO：1所示。
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Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expressed;AgnieszkaRybak-Wolf et al.;《Molecular Cell》;20151231;第870-885页 *
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