CN109593725A - 一种重组间充质干细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体公开一种重组间充质干细胞及其应用。该重组间充质干细胞是通过将表达白细胞介素‑21的cDNA整合到间充质干细胞的基因组中，得到用于杀伤肿瘤的间充质干细胞，其可有效定位肿瘤位置，同时该间充质干细胞可高水平表达白细胞介素‑21，当其准确定位肿瘤位置后，分泌的白细胞介素‑21可快速激活免疫细胞，快速有效的抑制和杀死肿瘤细胞，在肿瘤和癌症的治疗领域有着非常重要的研究意义。

Description

一种重组间充质干细胞及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种重组间充质干细胞及其应用。
背景技术
肿瘤是当今严重威胁人类健康的疾病，近年来，居全球统计，肿瘤的发病率也呈现出逐年攀升的趋势，肿瘤恶化后可发展为癌症。全球每年仅死于肝癌的患者就达到50万人以上。
截至目前，手术仍然是治疗肿瘤最有效的手段，可这仅仅是对良性肿瘤患者而言，而在实际临床诊疗过程中，部分肿瘤患者确证后已经发展为恶性肿瘤。例如被确诊的肝癌患者往往已经进行到了中晚期，此时只有10％—30％的患者可进行根治性切除，然而根治性切除后的患者五年生存率也仅有70％—80％，虽然对于未发生转移的患者而言，肝移植或许是最理想的选择，然而由于肝移植本身手术价格昂贵、移植肝的匹配要求严格且术后需长期医疗维持等因素，肝移植也只能适用于极少部分的肝癌患者。对大多无法接受根治性手术治疗的肿瘤患者，只能采取射频消融、微波消融、冷冻治疗、酒精注射和放疗等方法进行姑息治疗，而这些疗法往往副作用极大，在杀伤肿瘤细胞的同时，又给患者健康带来了新的伤害。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种成体干细胞，MSCs在人体的分布较为广泛，人体的脂肪组织、外周血、骨髓、骨膜、骨骼肌、真皮、皮肤、肝脏以及新生儿的脐带、胎盘、脐血都存在着大量的MSCs，研究表明：MSCs所特有的低免疫原性、多分化潜能、旁分泌效应以及归巢效应可以很好的调节机体的免疫平衡以及机体组织的修复与再生，特别是MSCs的趋化性，可以使MSCs细胞定向迁移到机体的炎症反应灶，而肿瘤的病灶部位往往炎症反应十分剧烈，但MSCs缺乏有效杀伤肿瘤细胞的功能。
发明内容
针对现有MSCs细胞可定向迁移到机体的肿瘤发生部位但缺乏有效杀伤肿瘤细胞的能力，本发明提供一种重组间充质干细胞及其应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种重组间充质干细胞，将表达白细胞介素-21的cDNA整合到间充质干细胞的基因组中得到。
相对于现有技术，本发明从表达白细胞介素-21(IL-21)的自然杀伤细胞中提取总RNA，根据IL-21的cDNA的基因序列SEQ ID NO:1设计出用于反转录IL-21的cDNA的特异性引物，将反转录得到的IL-21的cDNA重组到慢病毒载体中，用293T细胞对慢病毒载体进行包装后，转染培养至第三代的MSCs细胞，通过绿色荧光蛋白的表达筛选出转染成功的MSCs细胞。IL-21是一种细胞因子，由自然杀伤细胞(NK细胞)合成，可以调解人体内的免疫细胞和NK细胞的激活和增值，本发明将表达IL-21的cDNA整合到慢病毒载体中，再将携带IL-21的cDNA的慢病毒转染MSCs细胞，使IL-21的cDNA整合到MSCs的基因组中，得到可以表达IL-21的MSCs细胞，该MSCs和IL-21相互配合，可以准确定位到体内的肿瘤发生部位，并快速有效的将肿瘤细胞杀死，且不会伤害体内其他组织。
优选地，所述白细胞介素-21的cDNA的获取包括以下步骤：
a、反转录获取自然杀伤细胞的cDNA；
b、用白细胞介素-21的基因序列设计白细胞介素-21的上下游引物，并在上下游引物上引入慢病毒载体上的两个酶切位点；
c、以自然杀伤细胞的cDNA为模板，用引入酶切位点的白细胞介素-21的上下游引物进行扩增，得到白细胞介素-21的cDNA。
本发明通过在IL-21的上下游引物上引入慢病毒上的两个酶切位点，使反转录得到的IL-21的cDNA两端与慢病毒相同的酶切位点，通过两个限制性内切酶的剪切，使慢病毒载体线性片段两端与IL-21的cDNA两端连接互补，通过连接酶的作用将IL-21的cDNA重组到慢病毒载体中。
优选地，所述自然杀伤细胞的cDNA获取方法为：用细胞分离液从人体外周血中分离出自然杀伤细胞，加入Trizol试剂和氯仿提取RNA，离心得到含自然杀伤细胞的总RNA上清液，加入异丙醇离心沉淀RNA、去除上清液，得到自然杀伤细胞的总RNA，反转录得到自然杀伤细胞的cDNA。IL-21由自然杀伤细胞分泌，因此自然杀伤细胞的cDNA中包含IL-21的cDNA。
优选地，所述慢病毒载体为包含EcoR1和BamH1两个酶切位点的pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puro，其具有高效转染细胞和高水平表达目的基因的能力；所述含酶切位点的白细胞介素-21的上下游引物为：
上游引物：5’—ATGGAATTCATGAGATCCAGTCCTGGC—3’；
下游引物：5’—CTAGGATCCTCAGGAATCTTCACTTCCG—3’。
优选地，所述间充质干细胞从人的骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织和脂肪组织中分离培养得到。
优选地，所述白细胞介素-21的cDNA整合到间充质干细胞的基因组中的方法为：将白细胞介素-21的cDNA重组到慢病毒载体中，并扩增携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体；用293T细胞对携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体进行包装，得到慢病毒；用得到的慢病毒转染间充质干细胞。
优选地，白细胞介素-21的cDNA重组到慢病毒载体中的方法为：使用限制性内切酶EcoR1和BamH1分别酶切白细胞介素-21的cDNA和慢病毒载体；分离纯化白细胞介素-21的cDNA和慢病毒载体的酶切片段，用T4连接酶进行连接；携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体的扩增方法为：将携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，进行平板培养，挑选氨苄青霉素抗性菌落、摇菌，抽提质粒，得到携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体。
优选地，用293T细胞对携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体进行包装的方法为：将携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体以及psPAX2和PMG2.G两种辅助载体混合后共转染293T细胞，对转染后的293T细胞进行细胞培养，收集细胞培养液中含慢病毒的上清液，进行浓缩和纯化。
进一步地，本发明还提供了该重组间充质干细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
进一步地，本发明还提供了该重组间充质干细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。
附图说明
图1是本发明实施例1中PCR扩增得到的IL-21的cDNA经1％的琼脂糖电泳检测图；
图2是本发明实施例1中IL-21的cDNA重组到慢病毒载体中的重组质粒；
图3是实施例1中在倒置荧光显微镜下观察hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs和IL-21/hUC-MSCs的荧光蛋白表达图；
图4是是实施例1中检测hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs和IL-21/hUC-MSCs的IL-21的表达水平图；
图5是实施例2中hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs、IL-21/hUC-MSCs体外抑瘤效果图；
图6是实施例3中hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs、IL-21/hUC-MSCs在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种重组间充质干细胞，将表达白细胞介素-21的cDNA整合到间充质干细胞的基因组中。具体的是：
1)获取IL-21的cDNA：采集成年男性外周血400ml，用NK细胞分离液(天津灏洋公司产，NK2011H)经密度梯度离心获得NK细胞，加入Trizol试剂裂解，再加入氯仿提取RNA，离心得到含自然杀伤细胞的总RNA上清液，加入异丙醇离心沉淀RNA、去除上清液，得到自然杀伤细胞的总RNA，反转录得到自然杀伤细胞的cDNA。IL-21由自然杀伤细胞分泌，因此由自然杀伤细胞的RNA经反转录得到的cDNA中包含大量IL-21的cDNA。其中的反转录体系如下表所示：
按上表在冰上配制反转录体系，将配置好的反转录体系，37℃水浴孵育2min后立即置于冰上，加入6μl DEPC水和4μlBeyoRTTMШcDNA第一链合成预混液(5X)，轻轻混匀，随后离心沉降液体；42℃孵育10min；80℃孵育10min；灭活反转录酶，终止反转录反应，分离纯化得到NK细胞的总的cDNA。
用IL-21的基因序列设计白细胞介素-21的上下游引物，并在上下游引物上引入慢病毒载体上的EcoR1和BamH1两个酶切位点，设计的上游引物IL-21-F为：5’—ATGGAATTCATGAGATCCAGTCCTGGC—3’；下游引物IL-21-R为5’—CTAGGATCCTCAGGAATCTTCACTTCCG—3’；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，以反转录得到的NK细胞的总的cDNA为模板经过PCR反应获得IL-21的cDNA，PCR反应体系如下表：
将上述PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应，PCR反应参数的设置如下：
STEP1(起始变性):94℃3min；
STEP2(变性):94℃30s；
STEP3(退火):60℃30s；
STEP4(延伸):72℃1min；
STEP5(循环):STEP2-4，反应30个循环；
STEP6(最终延伸):72℃10min；
STEP7(临时保存):4℃forever。
PCR反应产物经1％的琼脂糖电泳检测，如图1所示，在泳道500bp处出现清晰条带，片段大小与IL-21外显子大小的理论值相符合，然后用DNA回收试剂盒回收PCR反应产物，得到IL-21的cDNA，该IL-21的cDNA的两端分别包含EcoR1和BamH1酶切位点。
2)将获得的IL-21的cDNA重组到慢病毒载体质粒pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puro中：使用限制性内切酶EcoR1和BamH1分别酶切IL-21的cDNA和慢病毒载体质粒；酶切产物经纯化后，将线性化的载体与双酶切后的IL-21片段按照1:3的浓度混合，45℃水浴5min，冰浴3min，加入T4连接酶及其Buffer各1μl，于22℃条件下连接过夜，得到携带IL-21的cDNA的慢病毒载体质粒，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，进行平板培养，挑选氨苄青霉素抗性菌落、摇菌，抽提质粒，得到大量携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体质粒，如图2所示。
3)用293T细胞对携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体进行包装：
将293T细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞汇合度达到50％时，将携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体以及psPAX2和PMG2.G两种辅助载体混合，混合质粒的浓度比为4:3:1，混合后共转染293T细胞；同时，作为对照，将空载慢病毒载体与psPAX2和PMG2.G两种辅助载体混合，混合质粒的浓度比为4:3:1，混合后转染293T细胞；对转染后的293T细胞进行细胞培养，若转染成功会表达绿色荧光蛋白，根据绿色荧光蛋白的表达情况，判断转染是否成功，收集细胞培养液中含慢病毒的上清液，进行浓缩和纯化，得到慢病毒悬液。
4)获取脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)：无菌条件下采集健康产妇脐带，将脐带置于75％酒精中浸泡消毒5min，用无菌生理盐水将脐带外周冲洗干净，剪成大约2cm的小段，然后用镊子分别夹住脐带边缘，小心的撕去脐带外膜，同时将去除外膜的脐带再小心抽除两条脐静脉和一条脐动脉，剩余的组织块用无菌生理盐水冲3次，剪成约0.5cm，取3小块散落放置于T75细胞培养瓶中，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置1h，使组织块紧贴于培养瓶上，向培养瓶中缓慢贴壁注入人间充质干细胞培养液，当培养液浸没一半组织块时即停止加液；将培养瓶小心置于培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长状态，隔3天半量换液一次，7天后全量换液，去除未贴壁细胞，以后每隔3天半量换液，当hUC-MSCs汇合度达到80％时，常规消化，按1:3传代，取培养至第3代的hUC-MSCs，常规消化、计数、洗涤后加入适量0.01M PBS重悬细胞。
5)将获取的hUC-MSCs，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞汇合度达到50％时，常规消化，按1:3传代，向培养至第3代的hUC-MSCs中加入Polybrene(终浓度5μg/ml)(增加病毒感染效率)和病毒悬液20μl，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养；转染24h后，弃去含病毒的感染液，并以新鲜的间充质干细胞完全培养基继续培养，倒置荧光显微镜镜检慢病毒转染情况；转染48h后，若在荧光显微镜下观察到hUC-MSCs发出绿色荧光，则表明转染成功，进行常规传代处理。
经流式细胞仪检测，连续培养至第3代的hUC-MSCs，其生长状态为梭形、贴壁生长；其细胞表面抗原CD73、CD90、CD105的阳性率均＞98％；CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR的阳性率均＜2％，符合人脐带间充质干细胞的一般标准。
对hUC-MSCs、空载慢病毒感染的hUC-MSCs以及携带IL-21表达序列的慢病毒感染的hUC-MSCs分别在倒置荧光显微镜下观察，观察结果如图3所示，空载慢病毒感染的hUC-MSCs和携带IL-21表达序列的慢病毒感染的hUC-MSCs均可表达绿色荧光蛋白，说明慢病毒转染成功。
用人源IL-21ELISA试剂盒分别检测hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs和IL-21/hUC-MSCs分泌IL-21的能力，发现与hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs相比较IL-21/hUC-MSCs具有很强的分泌IL-21的能力，其分泌IL-21的水平远高于hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs，如图4所示。其中Vector/hUC-MSCs为空载慢病毒感染后的hUC-MSCs；IL-21/hUC-MSCs为携带IL-21表达序列的慢病毒感染后的hUC-MSCs。
实施例2
分别用实施例1中得到的hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs、IL-21/hUC-MSCs进行体外杀瘤实验。其中Vector/hUC-MSCs为空载慢病毒感染后的hUC-MSCs；IL-21/hUC-MSCs为携带IL-21表达序列的慢病毒感染后的hUC-MSCs。
试验方法为：采用人源SMMC-7721肝癌细胞为靶细胞，将hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs、IL-21/hUC-MSCs三种肿瘤杀伤细胞分别与5x104个SMMC-7721肝癌细胞共培养，其中hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs、IL-21/hUC-MSCs三种细胞加入数量为2x104个，72h后，用CCK8法检测各组肝癌细胞的增殖情况。
检测结果如图5所示，纵坐标代表肝癌细胞的OD值，与不加肿瘤杀伤细胞的空白对照组相比，hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs、IL-21/hUC-MSCs都能够显著抑制SMMC-7721肝癌细胞的增殖，其中IL-21/hUC-MSCs的抑瘤效果要显著优于hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs的抑瘤效果。
实施例3
分别用实施例1中得到的hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs、IL-21/hUC-MSCs进行体内杀瘤实验。
试验方法为：构建SMMC-7721皮下移植瘤裸鼠模型，种瘤5天后，分别以尾静脉输注的方式向不同裸鼠体内输入200μl的生理盐水(Saline)、hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs、IL-21/hUC-MSCs，进行抗瘤实验，每周输注2次，连续治疗3周，其中hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs和IL-21/hUC-MSCs三种细胞重悬于200μl的生理盐水中，注入小鼠体内，每次注入数量为1×106个。
抗瘤结果如图6所示：相比于生理盐水(Saline)组，hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs和IL-21/hUC-MSCs组肿瘤体积增长明显变缓，而IL-21/hUC-MSCs组比hUC-MSCs、Vector/hUC-MSCs组的肿瘤增长速度又进一步变缓，具有明显的抗肿瘤效果。
对比例1
IL-12与IL-21高度同源，有激活体内免疫细胞的功能，将IL-12按实施例1的方法得到IL-12/hUC-MSCs，IL-12/hUC-MSCs和IL-21/hUC-MSCs用实施例2的方法检测其体外杀瘤效果，72h后，经检测，加入IL-12/hUC-MSCs的培养体系中肝癌细胞的OD值为5.1；加入IL-21/hUC-MSCs的培养体系中肝癌细胞的OD值为2.5。L-12/hUC-MSCs和IL-21/hUC-MSCs用实施例3的方法检测其体内杀瘤效果，20天后，经测量，注入IL-12/hUC-MSCs的裸鼠体内肿瘤细胞的体积为81mm3，注入IL-21/hUC-MSCs的裸鼠体内肿瘤细胞的体积为59mm3。说明IL-12/hUC-MSCs的抑瘤杀瘤的效果低于IL-21/hUC-MSCs。
对比例2
IL-15与IL-21高度同源，有激活体内免疫细胞的功能，将IL-15按实施例1的方法得到IL-15/hUC-MSCs，IL-15/hUC-MSCs和IL-21/hUC-MSCs用实施例2的方法检测其体外杀瘤效果，72h后，经检测，加入IL-15/hUC-MSCs的培养体系中肝癌细胞的OD值为4.8；加入IL-21/hUC-MSCs的培养体系中肝癌细胞的OD值为2.3。L-15/hUC-MSCs和IL-21/hUC-MSCs用实施例3的方法检测其体内杀瘤效果，20天后，经测量，注入IL-15/hUC-MSCs的裸鼠体内肿瘤细胞的体积为77mm3，注入IL-21/hUC-MSCs的裸鼠体内肿瘤细胞的体积为54mm3。说明IL-15/hUC-MSCs的抑瘤杀瘤的效果低于IL-21/hUC-MSCs。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北生命原点生物科技有限公司
<120> 一种重组间充质干细胞
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 489
<212> cDNA
<213> IL-21
<400> 1
atgagatcca gtcctggcaa catggagagg attgtcatct gtctgatggt catcttcttg 60
gggacactgg tccacaaatc aagctcccaa ggtcaagatc gccacatgat tagaatgcgt 120
caacttatag atattgttga tcagctgaaa aattatgtga atgacttggt ccctgaattt 180
ctgccagctc cagaagatgt agagacaaac tgtgagtggt cagctttttc ctgctttcag 240
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<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> IL-21-F
<400> 2
atggaattca tgagatccag tcctggc 27
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> IL-21-R
<400> 3
ctaggatcct caggaatctt cacttccg 28

Claims (10)

1.一种重组间充质干细胞，其特征在于：将表达白细胞介素-21的cDNA整合到间充质干细胞的基因组中得到。
2.如权利要求1所述的一种重组间充质干细胞，其特征在于：所述白细胞介素-21的cDNA的获取包括以下步骤：
a、反转录获取自然杀伤细胞的cDNA；
b、用白细胞介素-21的cDNA序列SEQ ID NO:1设计白细胞介素-21的上下游引物，并在上下游引物上引入慢病毒载体上的两个酶切位点；
c、以自然杀伤细胞的cDNA为模板，用引入酶切位点的白细胞介素-21的上下游引物进行扩增，得到白细胞介素-21的cDNA。
3.如权利要求2所述的一种重组间充质干细胞，其特征在于：所述自然杀伤细胞的cDNA获取方法为：用细胞分离液从人体外周血中分离出自然杀伤细胞，加入Trizol试剂和氯仿提取RNA，离心得到含自然杀伤细胞的总RNA上清液，加入异丙醇离心沉淀RNA、去除上清液，得到自然杀伤细胞的总RNA，反转录得到自然杀伤细胞的cDNA。
4.如权利要求2所述的一种重组间充质干细胞，其特征在于：所述慢病毒载体为包含EcoR1和BamH1两个酶切位点的pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puro；所述含酶切位点的白细胞介素-21的上下游引物为：
上游引物：5’—ATGGAATTCATGAGATCCAGTCCTGGC—3’；
下游引物：5’—CTAGGATCCTCAGGAATCTTCACTTCCG—3’。
5.如权利要求1所述的一种重组间充质干细胞，其特征在于：所述间充质干细胞从人的骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织和脂肪组织中分离培养得到。
6.如权利要求1所述的一种重组间充质干细胞，其特征在于：所述白细胞介素-21的cDNA整合到间充质干细胞的基因组中的方法为：将白细胞介素-21的cDNA重组到慢病毒载体中，并扩增携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体；用293T细胞对携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体进行包装，得到慢病毒；用得到的慢病毒转染间充质干细胞。
7.如权利要求6所述的一种重组间充质干细胞，其特征在于：白细胞介素-21的cDNA重组到慢病毒载体中的方法为：使用限制性内切酶EcoR1和BamH1分别酶切白细胞介素-21的cDNA和慢病毒载体；分离纯化白细胞介素-21的cDNA和慢病毒载体的酶切片段，用T4连接酶进行连接；携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体的扩增方法为：将携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，进行平板培养，挑选氨苄青霉素抗性菌落、摇菌，抽提质粒，得到携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体。
8.如权利要求6所述的一种重组间充质干细胞，其特征在于：用293T细胞对携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体进行包装的方法为：将携带白细胞介素-21的cDNA的慢病毒载体以及psPAX2和PMG2.G两种辅助载体混合后共转染293T细胞，对转染后的293T细胞进行细胞培养，收集细胞培养液中含慢病毒的上清液，进行浓缩和纯化。
9.权利要求1-8任一项所述的一种重组间充质干细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1-8任一项所述的一种重组间充质干细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。
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