CN117304343B - Gpc3靶向的car-nk细胞的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了GPC3靶向的CAR‑NK细胞的制备及其应用，本发明提供了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，包括依次串联的信号肽、特异识别GPC3的单链抗体、跨膜结构域和胞内信号转导结构域，本发明提供了一种表达mIL‑15融合蛋白的结构，该结构包括CD8信号肽、IL‑15、CD8铰链区和CD8跨膜区。本发明提供了一种表达mIL‑15融合蛋白的靶向GPC3的嵌合抗原受体，特异识别GPC3的CAR分子与mIL‑15通过P2A、T2A或E2A相连。本发明提供了一种包含可表达mIL‑15融合蛋白的靶向GPC3的嵌合抗原受体的腺病毒载体。一种基因改造的NK细胞，该NK细胞表达特异性识别GPC3的嵌合抗原受体和膜结合型IL‑15。本发明提供了一种组合物，包括改造的宿主细胞和腺病毒载体。

Description

GPC3靶向的CAR-NK细胞的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及GPC3靶向的CAR-NK细胞的制备及其应用。
背景技术
原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)，国家癌症中心公布的2022年度全国癌症报告显示，HCC发病率高居癌症发病率的第4位、死亡率的第2位。目前，HCC已经形成了成熟的诊疗体系，其中，手术治疗仍然是首选的治疗方案，然而，大部分HCC患者确诊即为晚期，失去了手术机会；放化疗、靶向治疗、免疫治疗是常用的系统治疗手段，其可在一定程度上提高晚期患者的生存期，但临床需求远未被满足。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖(Glypican-3，GPC3)是一种膜表达的硫酸乙酰肝素糖蛋白，其可以通过激活下游的Wnt信号通路，进一步调控肿瘤细胞的增殖和转移等。研究发现，GPC3高表达于HCC、肺鳞状细胞癌(Squamous-cell carcinoma,SCC)，卵巢透明细胞癌等肿瘤细胞表面，且在正常组织细胞中不表达。因此，GPC3作为生物标志物，已经被广泛应用于HCC的诊断以及预后判断等。GPC3靶向抗体药物研发起步较早，但进展缓慢。其中，罗氏的单抗产品GC33 II期临床宣布失败，而双抗产品ERY974也基本处于停顿状态。近年来，GPC3靶向的细胞治疗迅速崛起，截止2023年2月，共有37项临床研究在clinical trial上登记注册，其中原启生物的Ori-C101注射液已经进入临床Ⅱ期；而科济药业的CT011处于Ⅰ期临床试验阶段。
自然杀伤细胞(Natural Killer，NK)是机体免疫系统的第一道防线，具有抵御病毒入侵，清除衰老及突变细胞等作用，被誉为人体内的“宪兵”。NK细胞具有广谱抗肿瘤活性，早在20年前，NK细胞疗法就被认为是晚期白血病治疗的一种安全、有效的手段。近年来，随着培养技术、抗体技术和基因转导技术的进步，CAR-NK细胞已经开始崭露头角。与CAR-T疗法相比，CAR-NK细胞具有以下优势：(1)无主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibility Complex，MHC)限制，异体使用不会产生GVHD，可制备“货架”产品；(2)CAR-NK细胞主要分泌γ干扰素(interferonγ，IFN-γ)、白细胞介素3(interleukin 3，IL-3)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor，GM-CSF)等，不会引起细胞因子风暴和神经毒性；(3)NK细胞除CAR分子介导的途径外，还可通过自然杀伤途径、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-DependentCell-Medicated Cytotoxicity，ADCC)等发挥多机制抗肿瘤作用，可对肿瘤实行“全方位、立体式”杀伤；(4)活化NK细胞表面的PD1等免疫抑制分子的表达水平低，对肿瘤微环境引起的免疫抑制信号不敏感。基于上述优势，CAR-NK细胞具有巨大的潜能，有望成为突破实体瘤治疗瓶颈的一大利器。
发明内容
为了解决现有技术中的技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种靶向GPC3的CAR，所述CAR包括靶向GPC3的胞外抗原结合域，所述胞外抗原结合域包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些具体的实施方案中，所述胞外抗原结合域包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
进一步，所述胞外抗原结合域中scFv区的抗体骨架区为人源胚系抗体骨架区。
进一步，所述CAR还包括信号肽、铰链区和跨膜区、共刺激信号域、胞内信号传导结构域中的一种或多种。
进一步，所述信号肽为CD8α，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述CAR包括一个或多个信号肽。
进一步，所述CAR包括一个或多个如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些具体的实施方案中，所述信号肽包括与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
进一步，所述铰链区和跨膜区为CD8，包括天然的CD8α铰链区和CD8跨膜区，铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在某些具体的实施方案中，所述铰链区和跨膜区包括与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
进一步，所述共刺激信号域为4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在某些具体的实施方案中，所述共刺激信号域包括与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
进一步，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在某些具体的实施方案中，所述胞内信号传导结构域包括与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
如本文所用，“序列同一性”通常是指使用具有各种加权参数的算法将第一多核苷酸或多肽分别与第二多核苷酸或多肽进行比较的核苷酸碱基或氨基酸的同一性百分比。可以通过经由万维网在包括但不限于GENBANK(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和EMBL-EBI(www.ebi.ac.uk.)的网址可获得的各种方法和计算机程序(例如，BLAST、CS-BLAST、FASTA、HMMER、L-ALIGN等)测定两个多核苷酸或两个多肽之间的序列同一性。通常使用各种方法或计算机程序的标准默认参数来计算两个多核苷酸或两个多肽序列之间的序列同一性。在参考多肽的长度上，两个多核苷酸或两个多肽之间高程度的序列同一性通常为约90％同一性至100％同一性，例如，约90％同一性或更高，优选约95％同一性或更高，更优选约98％同一性或更高。在参考多肽的长度上，两个多核苷酸或两个多肽之间中等程度的序列同一性通常为约80％同一性至约85％同一性，例如，约80％同一性或更高，优选约85％同一性。在参考多肽的长度上，两个多核苷酸或两个多肽之间低程度的序列同一性通常为约50％同一性至75％同一性，例如，约50％同一性，优选约60％同一性，更优选约75％同一性。
进一步，所述CAR包括CD8α信号肽、靶向GPC3胞外抗原结合域、CD8铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号域、CD3ζ胞内信号传导结构域顺次相连。
本发明提供了一种核酸分子或包含其的载体，所述核酸分子包括编码前面所述的CAR的核苷酸序列。
进一步，所述载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
进一步，所述载体为腺病毒载体。
进一步，所述腺病毒载体是pKAd.NK腺病毒载体。
在本发明中，所述pKAd.NK腺病毒载体是指来源于申请号202110677612.4的发明专利，其原理为HAdV-5fiber基因改造为人工改造的f11p228R基因的人5型腺病毒，其中f11p228R基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
本文所用的“载体”是指将遗传物质引入细胞的多核苷酸媒介物。载体可以是线性的或圆形的。载体可以含有能够在合适的宿主细胞中实现载体复制的复制序列(例如，复制起点)。在转化合适的宿主时，载体可以独立于宿主基因组复制和发挥功能或整合到宿主基因组中。载体设计尤其取决于载体的预期用途和宿主细胞，并且用于特定用途和宿主细胞的载体设计在本领域技术水平内。四种主要类型的载体为质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。通常，载体包含复制起点、多克隆位点和/或选择性标志物。
进一步，所述核酸分子包括编码靶向GPC3胞外抗原结合域SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步，所述编码靶向GPC3胞外抗原结合域的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在某些具体的实施方案中，所述编码靶向GPC3胞外抗原结合域的核苷酸序列与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
进一步，所述编码前面所述的CAR的核苷酸序列还包括编码信号肽、铰链区和跨膜区、共刺激信号域、胞内信号传导结构域中一种或多种的核苷酸序列。
进一步，所述信号肽为CD8α，其核苷酸序列编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
进一步，所述编码信号肽CD8α的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在某些具体的实施方案中，所述编码信号肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
进一步，所述铰链区和跨膜区为CD8，包括天然的CD8α铰链区和CD8跨膜区，铰链区和跨膜区核苷酸序列编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
术语“野生型”、“天然存在的”和“未修饰的”在本文中用于意指天然存在的典型(或最常见)形式、外观、表型或菌株；例如，细胞、有机体、多核苷酸、蛋白质、大分子复合物、基因、RNA、DNA或基因组的典型形式在它们在自然界中出现时，并且可以从自然界来源分离。在有意修饰之前，野生型形式、外观、表型或菌株用作原始亲本。因此，突变体、变体、工程化的、重组的和修饰的形式不是野生型形式。
术语“工程化的”、“基因工程化的”、“基因修饰的”、“重组的”、“修饰的”、“非天然存在的”和“非天然的”表示有意的人类操纵有机体或细胞的基因组。该术语涵盖基因组修饰的方法，其包括本文定义的基因组编辑，以及改变基因表达或失活、酶工程、定向进化、基于知识的设计、随机诱变方法、基因改组、密码子优化等的技术。用于基因工程的方法为本领域已知的。
进一步，所述编码铰链区和跨膜区CD8的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在某些具体的实施方案中，所述编码铰链区和跨膜区的核苷酸序列与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
进一步，所述共刺激信号域为4-1BB，其核苷酸序列编码如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
进一步，所述编码共刺激信号域为4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在某些具体的实施方案中，所述编码共刺激信号域的核苷酸序列与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
进一步，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ，其核苷酸序列编码如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
进一步，所述编码胞内信号传导结构域为CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在某些具体的实施方案中，所述编码胞内信号传导结构域的核苷酸序列与SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
进一步，所述核酸分子还包括编码mIL-15蛋白分子的核苷酸序列，所述mIL-15蛋白分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述mIL-15分子的结构包括CD8α信号肽、成熟IL-15编码区、CD8铰链区和跨膜区。
进一步，所述编码mIL-15分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在某些具体的实施方案中，所述编码mIL-15分子的核苷酸序列与SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
进一步，所述核酸分子包括CD8α信号肽、靶向GPC3胞外抗原结合域、CD8铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号域、CD3ζ胞内信号传导结构域、CD8α信号肽、成熟IL-15编码区、CD8铰链区和跨膜区顺次相连。
进一步，所述核酸分子中CAR结构、mIL-15分子或其他部分之间由P2A、T2A或E2A连接。
进一步，所述核酸分子编码的完整CAR结构和mIL-15分子的氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示。
进一步，所述编码完整CAR结构和mIL-15分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在某些具体的实施方案中，所述编码完整CAR结构和mIL-15分子的核苷酸序列与SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
如本文所用，术语“核酸序列”、“核苷酸序列”和“寡核苷酸”是可互换的，并且是指核苷酸的聚合形式。如本文所用，术语“多核苷酸”是指核苷酸的聚合形式，其具有一个N端和一个C端并且可以包含一个或多个核酸序列。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)、其类似物或其组合，并且可以是任何长度。多核苷酸可以执行任何功能并且可以具有各种二级和三级结构。该术语涵盖在碱基、糖和/或磷酸部分中被修饰的天然核苷酸和核苷酸的已知类似物。特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性(例如，AT碱基对的类似物)。多核苷酸可以包含一个修饰的核苷酸或多个修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的实例包括氟化核苷酸、甲基化核苷酸、化学修饰的糖和核苷酸类似物。核苷酸结构可以在聚合物组装之前或之后进行修饰。在聚合之后，可以经由例如与标记组分或靶结合组分缀合来另外修饰多核苷酸。核苷酸序列可掺入非核苷酸组分。该术语还涵盖包含修饰的主链残基或连键的核酸，其是合成的、天然存在的和/或非天然存在的，并且具有与参考多核苷酸(例如DNA或RNA)类似的结合特性。
本发明提供了一种经过改造的宿主细胞，所述改造的宿主细胞包括前面所述的CAR、或前面所述的核酸分子或包含其的载体。
进一步，所述改造的宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞。
进一步，所述哺乳动物细胞包括上皮细胞、成髓细胞、成纤维细胞、淋巴细胞。
进一步，所述淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞。
如本文所用，“淋巴细胞”是指作为脊椎动物免疫系统的一部分的白细胞(白血细胞)。术语“淋巴细胞”还包括造血干细胞或产生淋巴样细胞的诱导多能干细胞(iPSC)。淋巴细胞包括用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫的T细胞，如CD4+和/或CD8+细胞毒性T细胞；α/βT细胞和γ/δT细胞；调节性T细胞，如Treg细胞；在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用的NK细胞；用于体液、抗体驱动的适应性免疫的B细胞；NK/T细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)；以及抗原呈递细胞(APCs)，如树突细胞。淋巴细胞可以是哺乳动物细胞，如人(智人；H.sapiens)细胞。术语“淋巴细胞”还包括经遗传改良的T细胞和NK细胞，其被修饰以在T或NK细胞表面(CAR-T细胞和CAR-NK细胞)上产生嵌合抗原受体(CARs)。这些CAR-T细胞识别特定的可溶性抗原或靶标细胞表面，如肿瘤细胞表面，或肿瘤微环境中的细胞上的抗原。
如本文所用，“宿主细胞”通常是指生物细胞。细胞是生物的基本结构、功能和/或生物学单元。细胞可以源自具有一个或多个细胞的任何生物。宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古菌细胞、单细胞真核生物的细胞、真核生物的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞、藻类细胞(例如，布朗葡萄藻、莱茵衣藻、拟微绿球藻、蛋白核小球藻、展枝马尾藻圆干变种等)、海藻(例如，巨藻)、真菌细胞(例如，酵母细胞或来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自包括哺乳动物在内的脊椎动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人的灵长类动物、人类等)的细胞。此外，宿主细胞可以是干细胞或祖细胞，以及免疫细胞，如本文所述的任何免疫细胞。宿主细胞可以是人类细胞。
在一些实施方案中，人类细胞在人体外部。在一些实施方案中，对活的生物体(例如人体)的体细胞进行离体操作(即在活体外)。离体通常是指从活体(例如，人体)采集器官、细胞或组织以进行治疗或手术，然后再返回活体的医疗程序。
本发明提供了一种制备前面所述的改造的宿主细胞的方法，所述方法包括将前面所述的CAR，或前面所述的核酸分子或包含其的载体转导进入宿主细胞。
进一步，所述转导是慢病毒载体转导。
如本文所用，“转导”是指将外源多核苷酸插入宿主细胞，而与用于插入的方法无关。例如，可以通过直接摄取、转染、感染等来进行转导。外源多核苷酸可以维持为非整合载体，例如附加体，或者可选地，可以整合到宿主基因组中。如本文所用，“改造的宿主细胞”是指含有遗传物质的生物体，其中已人工引入了来自不相关生物体的DNA。该术语包括改造的宿主细胞的后代(任何世代)，只要该后代具有遗传修饰。在一些实施方案中，改造的宿主细胞是非人的宿主细胞。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的改造的宿主细胞。
进一步，所述药物组合物包括药学上可接受的辅料。
进一步，所述药物组合物包括药学上可接受的注射剂用辅料。
进一步，所述药物组合物的剂型为水剂。
本发明提供了前面所述的CAR、或前面所述的核酸分子或包含其的载体在制备治疗GPC3阳性肿瘤的药物组合物中的应用。
进一步，所述肿瘤包括血液瘤、或实体瘤。
进一步，所述实体瘤包括肺癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、皮肤癌、胰腺癌、骨癌。
进一步，所述血液瘤包括白血病、骨髓瘤、淋巴瘤。
进一步，所述药物组合物包括治疗有效量的前面所述的CAR、或前面所述的核酸分子或包含其的载体制备的药物。
术语“有效量”或“治疗有效量”的组合物或试剂，如本文提供的改造的CAR-NK细胞，是指足够提供所需反应，如预防或消除GPC3阳性肿瘤一种或多种有害作用的组合物或试剂的量。此类反应将取决于特定目标疾病。所需的确切量将因对象而异，这取决于对象的种类、年龄和一般状况、所治疗病况的严重程度、所用的特定改良淋巴细胞、给药方式等。在任何个别情况下，本领域普通技术人员可以使用常规实验确定适当的“有效”量。
“治疗”疾病的定义包括：(1)预防疾病，例如，预防疾病的发展或在可能易患该疾病，但尚未经历或未显示该疾病的症状的对象中使疾病以较低的强度发生；(2)抑制疾病，例如，降低发展速度，阻止发展或逆转疾病状态；和/或(3)减轻疾病的症状，例如，减少对象经历的症状的数量。
本发明提供了前面所述的改造的宿主细胞在制备杀伤体外癌细胞的药剂中的应用，所述体外癌细胞包括GPC3阳性的肿瘤细胞系。
本发明提供了前面所述的CAR、或前面所述的核酸分子或包含其的载体在制备GPC3靶向的CAR-NK、CAR-T细胞中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供一种表达mIL-15的GPC3靶向CAR-NK细胞的制备方案及其用途，该GPC3靶向CAR-NK细胞具有特异杀伤GPC3+肿瘤细胞的能力，具有强大的体内抗肿瘤作用，有望成为GPC3+肿瘤治疗的重要手段。
附图说明
图1是CAR39结构示意图；
图2是Ad.NK.CAR39基因组结构示意图；
图3是Ad.NK.CAR39在NK细胞中的转导效率图；
图4是Ad.NK.CAR39在NK细胞中表达IL-15的能力图；
图5是GPC3阳性靶细胞Huh7及Hep3B上GPC3的表达图；
图6是GPC3 CAR-NK对GPC3阳性靶细胞Huh7及Hep3B的杀伤效率图；
图7是GPC3 CAR-NK与靶细胞Huh7及Hep3B共培养后细胞因子分泌能力图；
图8是GPC3 CAR NK对荷瘤小鼠的肿瘤抑制效果图。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的其它方法和材料可用于本发明内容中，但本文描述了优选的材料和方法。
实施例1CAR分子的设计
本实施例以设计具有信号肽、抗原识别域(胞外抗原结合域，scFv)、共刺激信号域和CD3ξ信号域(胞内信号传导结构域)的GPC3嵌合抗原受体和mIL-15结构的CAR分子为例，其具体结构如图1所示。
1、抗原识别域(胞外抗原结合域，scFv)设计：在不改变GPC3 scFv性质和功能的同时，将scFv的抗体骨架区序列更换为人源胚系抗体骨架区序列，以降低免疫原性，改善scFv与GPC3靶点的亲和力，减少CAR NK细胞自激活的可能性，增加向胞内传递信号的效率，抑制CAR NK的终末分化，延长CAR NK细胞在体内的存活时间，增加CAR NK细胞抗瘤性能。
2、共刺激信号域设计：在不改变4-1BB共刺激域性质和功能的同时，降低CAR NK细胞自激活的可能性，增加4-1BB向胞内传递信号的效率，延长CAR-NK细胞在体内的存活时间，增加CAR-NK细胞抗瘤性能。
3、CD3ζ信号域设计：通过对CD3ζ胞内信号区与信号传递相关的氨基酸位点进行改造，最终达到改善CAR-NK细胞胞内信号传递通路，提升CAR-NK细胞在体内的扩增能力、持续能力、改善细胞因子分泌状况，进而提升CAR-NK细胞抗瘤性能。
4、mIL-15结构设计：膜结合型IL-15的结构包括CD8信号肽、成熟的天然IL-15氨基酸、CD8铰链区和CD8跨膜区，这种表达膜结合型IL-15存在更长的铰链区，活动空间大，能容易地与NK细胞自身的IL-15受体(IL-15Rβγ)结合，从而激活IL-15受体下游信号通路，促进CAR-NK细胞的自我增殖，同时避免了分泌型IL-15带来的细胞因子毒性。
5、将CD8信号肽、scFv、4-1BB共刺激信号域、CD3ζ信号域、P2A以及mIL-15结构顺序连接形成嵌合抗原受体CAR39，得到如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
6、各部件氨基酸序列及核苷酸序列参见表1。
表1具体氨基酸序列和核苷酸序列
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实施例2表达mIL-15和靶向GPC3 CAR分子的重组腺病毒(Ad.NK.GPC3)制备
1、实验方法
1)合成含有CD8α信号肽、GPC3 scFv、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB的胞内区、CD3ζ胞内区以及mIL-15融合蛋白的全长核酸序列(即CAR39)。
2)将pKAd.NK质粒进行PmeI单酶切，将酶切后Ad.NK片段去磷酸化，回收载体；通过末端同源重组，将完整的CAR39核酸片段插入腺病毒载体Ad.NK，获得携带靶向GPC3靶向CAR基因的腺病毒质粒pAd.NK.CAR39。
3)PacI线性化的腺病毒质粒pAd.NK.CAR39转染P20-P30代次HEK293细胞。
4)转染7～10天左右出现噬斑，待完全病变后，1800rpm离心5min，收集细胞和上清。标明代次(P0)，于-80℃保存。
5)将P0病毒反复冻融3次，1800rpm离心5min，取上清感染293A细胞，进行病毒扩增，细胞完全病变后，收集病毒，标记好名称、代次、批号，于-80℃保存。
6)将收集的病毒CsCl纯化，-80℃保存。
7)纯化的病毒感染K562细胞进行滴度测定。
2、实验结果
制备获得了重组腺病毒Ad.NK.CAR39，其基因组结构示意图如图2所示。重组腺病毒Ad.NK.CAR39经扩增和纯化后，进行颗粒滴度和感染滴度检测，颗粒滴度>1×1012VPs/ml，感染滴度>1×1010VPs/ml，复合质量标准。表面大片段插入对病毒的产量及活性无显著影响。
实施例3CAR-NK细胞的制备
1、实验方法
1)NK细胞的激活和扩增
通过Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，将分离的PBMC使用NK细胞激活培养基(含5％的自体血浆、1000IU/mL的IL-2、500IU/mL的IL-15的NK MACS，Miltenyi)和NK细胞扩增培养基(含5％的血清替代物、1000IU/mL的IL-2、500IU/mL的IL-15的NK MACS，Miltenyi)在体外激活培养至第12天。
2)细胞的转导
(1)NK细胞铺板：1500rpm离心10min收集第12天的NK细胞，用NK细胞培养基重悬后，计数，以2×106/mL的密度接种在T225细胞培养瓶中。
(2)重组腺病毒感染NK细胞：取融化混匀后的重组腺病毒，按照2500VP感染剂量感染NK细胞。
(3)换液：24h后，离心换液，按1×106/mL的细胞密度添加NK细胞完全培养基，培养箱中(37℃，CO2浓度为5％)培养。
(4)检测：细胞培养3天后，收集培养体系中的所有细胞，得到CAR39-NK细胞。取1×106个细胞用流式细胞仪检测细胞CAR含量。
2、实验结果
转导后第3天计数后取1×106个细胞，流式细胞术检测CAR表达，结果如图3、图4所示，CAR表达效率可稳定达到50％以上，表明重组腺病毒可高效转导NK细胞并表达携带的外源基因。同时，也可以检测到细胞膜表面IL-15的表达，但其表达水平显著弱于CAR分子。
实施例4GPC3 CAR-NK对靶细胞的杀伤效率
本实施例以检测CAR39-NK细胞(制备方法如实施例3所示)对表达GPC3的靶细胞的杀伤效率为例。
1、实验方法
1)靶细胞制备
取足量的靶细胞(Huh7及Hep3B)，500g离心10min，弃掉上清，用1640基础培养基重悬计数计活率。按照计数密度将靶细胞调整密度为1×106Cells/mL，加浓度为1mM的Calcein-AM溶液(10uL/1×106cells/mL)，染色30min。染色结束后，用PBS洗涤2次，加1640基础培养基重悬计数计活率。按照计数密度将靶细胞调整密度为2×105Cells/mL，备用。
2)效应细胞制备
取足量的CAR39-NK，500g离心10min，弃掉上清，用1640基础培养基重悬计数计活率。按照效靶比0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1，将效应细胞稀释至相应浓度。
3)铺板
自发孔(100μL培养基+100μL靶细胞)、最大孔(100μL靶细胞+50μL最大释放孔+50μL基础培养基)、实验孔(100μL靶细胞+100μL效应细胞)，设置3个复孔，CO2培养箱中避光孵育4h。
4)上机
最大释放孔加入终浓度为0.1％的Triton-X-100 50μL，400g离心5min，将150μL上清转移至不透光的酶标板中，上机检测(激发波长：488nm，发射波长：520nm)。
2、实验结果
如图5所示，GPC3在不同的肝癌细胞系上呈现不同水平的表达。图6结果显示，表达GPC3靶向CAR分子的NK细胞(NK.CAR39细胞)能显著增强对GPC3+肿瘤细胞(Huh7及Hep3B)的杀伤活性。
实施例5GPC3 CAR-NK与靶细胞共培养后的细胞因子释放实验
本实施例以检测GPC3 CAR-NK细胞与靶细胞共孵育后TNF-α和颗粒酶(GZMB)的分泌情况为例。
1、实验方法
1)靶细胞及效应细胞制备
(1)取足量的靶细胞(Huh7及Hep3B)，500g离心10min，弃掉上清，用1640基础培养基重悬计数计活率。调整细胞密度，备用。
(2)取足量的效应细胞，离心收细胞，弃上清，用1640基础培养基重悬细胞，按效靶比(0.25:1或0.5:1)，将效应细胞稀释至相应浓度。
2)靶细胞与效应细胞共孵育
取足量的CAR39-NK，500g离心10min，弃掉上清，用1640基础培养基重悬计数计活率。按效靶比(0.5:1)分别将效应细胞与靶细胞铺至96孔板中，对照组为未感染病毒的NK细胞。同时设置本底孔(只有效应细胞)。37℃、5％ CO2，孵育4小时。
3)样本收集
孵育结束后，离心，取上清于EP管中，备用。
4)细胞因子检测
按多因子流式检测试剂盒说明书操作检测TNFα和Granzyme B的含量。
2、实验结果
如图7显示，与未感染病毒的NK细胞相比，CAR-NK细胞与Huh7和Hep3B共孵育后，其分泌TNFα和Granzyme B的能力明显增强。
实施例6GPC3 CAR-NK细胞在荷瘤小鼠中的抗瘤能力
本实施例以检测包含GPC3 scFv、天然的4-1BB共刺激信号域、天然的CD3ζ信号域以及mIL-15结构域连接形成的嵌合抗原受体CAR(CAR39)对荷瘤小鼠的抗瘤能力为例。
1、实验方法
1)将激活培养至第十二天的NK细胞感染GPC3-CAR的腺病毒以制备GPC3-CAR-NK细胞(同时培养不感染腺病毒的NK细胞以供对照实验使用)。
2)病毒感染24小时后，细胞离心换液，计数，按1.0×106个细胞/mL接种培养至NK细胞扩增培养基(含5％的血清替代物、1000IU/mL的IL-2、500IU/mL的IL-15的NK MACS，Miltenyi)中培养。
3)培养至第3天时，收获细胞并计数，同时留取相应细胞样品进行流式检测分析CAR表达率。冻存细胞保存至液氮中待用。
4)6-8周龄NCG小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司)共24只，分为8只/组，共3组。每只小鼠从皮下接种1.0×106个Huh7细胞(协和细胞资源中心)和Hep3B细胞(协和细胞资源中心)。
5)小鼠建模成功后，分别于第7、14、21、28天进行给药注射。CAR-NK组小鼠分别从尾静脉注射CAR-NK细胞(1×107个细胞/只)，同时在另外两组小鼠分别注射相应细胞数的NK细胞及相应体积的生理盐水作为对照。
6)小鼠于CAR NK细胞注射后每隔3天进行小鼠肿瘤体积测量。
2、实验结果
结果如图8所示，与注射NK细胞组的荷瘤小鼠相比，CAR-NK细胞具有更加显著抑制肿瘤的生长，其对肿瘤的抑制效果与细胞表面GPC3的表达具有一定的相关性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (31)

1.一种靶向GPC3的CAR，其特征在于，所述CAR包含顺次相连的CD8α信号肽、靶向GPC3的胞外抗原结合域、CD8铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号域、CD3ζ胞内信号传导结构域；
所述靶向GPC3的胞外抗原结合域为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述CD8α信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CD8铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述4-1BB共刺激信号域氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述CD3ζ胞内信号传导结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述靶向GPC3的胞外抗原结合域的scFv区的抗体骨架区为人源胚系抗体骨架区。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-2任一项所述的CAR的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码靶向GPC3的胞外抗原结合域的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述编码靶向GPC3的胞外抗原结合域的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
6.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包含编码权利要求1-2任一项所述的CD8α信号肽、靶向GPC3的胞外抗原结合域、CD8铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号域、CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
8.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码CD8铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
9.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码4-1BB共刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
10.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
11.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包含编码mIL-15蛋白分子的核苷酸序列，所述mIL-15蛋白分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述mIL-15蛋白分子的结构包含CD8α信号肽、成熟IL-15编码区、CD8铰链区和跨膜区。
12.根据权利要求11所述的核酸分子，其特征在于，所述编码mIL-15蛋白分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
13.根据权利要求11所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子中CAR、mIL-15蛋白分子的编码核苷酸序列之间由P2A、T2A或E2A的编码核苷酸序列连接。
14.根据权利要求13所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
15.根据权利要求14所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO:14所示。
16.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求3-15任一项所述的核酸分子。
17.根据权利要求16所述的载体，其特征在于，所述载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
18.根据权利要求17所述的载体，其特征在于，所述载体为腺病毒载体。
19.根据权利要求18所述的载体，其特征在于，所述腺病毒载体是pKAd.NK腺病毒载体。
20.一种经过改造的宿主细胞，其特征在于，所述经过改造的宿主细胞包含权利要求1-2任一项所述的CAR、权利要求3-15任一项所述的核酸分子、或权利要求16-19任一项所述的载体。
21.根据权利要求20所述的经过改造的宿主细胞，其特征在于，所述经过改造的宿主细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞。
22.一种制备权利要求20-21任一项所述的经过改造的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求3-15任一项所述的核酸分子、或权利要求16-19任一项所述的载体转导进入宿主细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述转导是慢病毒载体转导。
24.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求20-21任一项所述的经过改造的宿主细胞。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含药学上可接受的辅料。
26.根据权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含药学上可接受的注射剂用辅料。
27.根据权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为水剂。
28.权利要求1-2任一项所述的CAR、权利要求3-15任一项所述的核酸分子、或权利要求16-19任一项所述的载体在制备治疗GPC3阳性肿瘤的药物组合物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体瘤。
29.根据权利要求28所述的应用，其特征在于，所述实体瘤选自肺癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、皮肤癌、胰腺癌、骨癌。
30.权利要求20-21任一项所述的经过改造的宿主细胞在制备杀伤体外癌细胞的药剂中的应用，其特征在于，所述体外癌细胞选自GPC3阳性的肿瘤细胞系。
31.权利要求1-2任一项所述的CAR、权利要求3-15任一项所述的核酸分子、或权利要求16-19任一项所述的载体在制备GPC3靶向的CAR-NK、CAR-T细胞中的应用。
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