CN111995689A

CN111995689A - 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用

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Publication number: CN111995689A
Application number: CN202010878531.6A
Authority: CN
Inventors: 李鹏; 李尚霖; 汤朝阳; 赵若聪; 姚瑶; 胡朵
Original assignee: Shenzhen In Vivo Biomedicine Technology Ltd
Current assignee: Shenzhen In Vivo Biomedicine Technology Ltd
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN111995689B

Abstract

本发明提供了一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括DAP10和信号传导结构域，所述信号传导结构域连接在所述DAP10的C端；所述DAP10为所述嵌合抗原受体的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；所述嵌合抗原受体还包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域连接在所述DAP10的N端。本发明的嵌合抗原受体对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有靶向作用，构建的表达嵌合抗原受体的免疫细胞在靶向表达特异性抗原的肿瘤细胞的同时，还调动内源NKG2D的功能，靶向具有异质性的肿瘤细胞，实现对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞的清除杀伤作用。

Description

一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗技术领域，涉及一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞亦称为CAR-T细胞，是利用基因工程技术将特异性识别抗原的单链可变区(scFv)与T细胞共刺激和激活信号(如CD28、4-1BB、OX40、CD3ζ等)相串联，表达于T细胞上，从而赋予T细胞特异性识别靶标蛋白的功能，并针对表达靶标蛋白的细胞产生杀伤作用。将制备好的CAR-T细胞回输到肿瘤患者体内，通过发挥CAR-T细胞靶向特定肿瘤抗原的功效，从而达到消除肿瘤细胞的目的。目前，使用靶向CD19的CAR-T细胞治疗白血病已经获得了良好的疗效，细胞疗法在肿瘤治疗领域展现出广阔的前景。针对实体瘤GPC3、Mesothelin和Muc1等靶标，研究人员设计了相应的CAR-T细胞，以期望将CAR-T细胞疗法应用于实体肿瘤治疗。

尽管CAR-T细胞可以靶向表达特异性抗原的肿瘤细胞，但是很多肿瘤细胞并不表达专一、特异的肿瘤抗原，肿瘤异质性是细胞疗法治疗实体肿瘤面临的一大障碍。增加嵌合抗原受体分子识别不同靶标的能力是解决以上问题的方案之一，例如可以借鉴固有免疫中的识别广谱抗原蛋白的受体构建CAR-T细胞，从而增强传统CAR-T细胞对无特异性抗原表达肿瘤的识别能力。

NK细胞具有快速发现和清除癌变或被病毒感染的细胞的功能，这一过程不需要抗原呈递细胞的介导，而是依赖一系列NK细胞激活受体的活化，如NKG2D、NKp30、NKp46和DNAM1等。目前，已经发现的可被NKG2D(natural-killer group 2，member D)受体识别的人源抗原有8个，包括MICA/B和ULBP家族。作为细胞压力应激分子，这些抗原在正常组织细胞中的表达量很低，只有当细胞发生癌变或受到感染时才会表达上调，向NK细胞提供识别和清除病变细胞的信号。NKG2D受体表达于NK细胞中，激活后的CD8αβT细胞和γδT细胞。NKG2D受体本身没有胞内信号转导域，需要借助转接分子DAP10向细胞传递激活信号。DAP10作为I型膜蛋白，与NKG2D形成二聚体后，通过招募PI3K激酶的p85亚基和Grb2-Vav1复合物，向下游传递信号。目前，已有将NKG2D胞外段同传统CAR分子信号转导域相结合的技术方案，构建得到靶向多种抗原的嵌合抗原受体T细胞或NK细胞。但是该技术仅能靶向NKG2D可识别的抗原，受病毒载体载量限制无法添加更多的功能元件，无法近一步丰富CAR-T或CAR-NK细胞的功能。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，通过使用小片段编码基因构建表达CAR分子的免疫细胞，使得免疫细胞在靶向特异性肿瘤相关抗原的同时，兼顾识别和清除异质性肿瘤，所述基因修饰的免疫细胞针对肿瘤特异性抗原表达量少、但是表达一定NKG2D配体的肿瘤具有显著的治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括DAP10蛋白和信号传导结构域，所述信号传导结构域连接在所述DAP10蛋白的C端；

所述DAP10蛋白为所述嵌合抗原受体的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。

本发明中，采用完整的DAP10作为胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，与常规的信号传导结构域连接后构建嵌合抗原受体，对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，所述嵌合抗原受体的编码基因长度短，有利于实现对免疫细胞的高效转染。

优选地，所述信号传导结构域包括CD3ζ。

优选地，所述信号传导结构域还包括4-1BB、CD28、TLR1、TLR2或OX40中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB。

优选地，所述DAP10包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVF。

优选地，所述嵌合抗原受体由DAP10蛋白、4-1BB和CD3ζ串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

SEQ ID NO:2：

MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

优选地，所述嵌合抗原受体还包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域连接在所述DAP10蛋白的N端。

本发明中，将DAP10同抗肿瘤表面抗原的单链可变区(scFv)和信号传导结构域相嵌合，构建的嵌合抗原受体对表达特异性抗原的肿瘤细胞和表达NKG2D配体的肿瘤细胞均具有靶向作用，所述嵌合抗原受体的编码基因长度短，在不增加嵌合抗原受体分子大小的前提下，丰富了嵌合抗原受体的功能。

优选地，所述抗原结合结构域包括靶向肿瘤表面抗原的单链可变区。

优选地，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种或至少两种的组合，优选为GPC3或Mesothelin。

优选地，所述嵌合抗原受体由靶向肿瘤表面抗原的单链可变区、DAP10、4-1BB和CD3ζ串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；

SEQ ID NO:3：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEFQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGTRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；

SEQ ID NO:4：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCVISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSGILEQQGGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEFQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGTRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的编码基因。

优选地，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的病毒载体。

优选地，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为含有第二方面所述的编码基因的慢病毒载体。

第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。

第五方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。

在本发明的一个实施例中，利用完整的DAP10与常规的信号传导结构域连接构建嵌合抗原受体，将所述嵌合抗原受体的编码基因导入免疫细胞，获得的表达CAR分子的免疫细胞对异质性肿瘤细胞具有显著的清除作用。

在本发明的另一个实施例中，将DAP10同抗肿瘤表面抗原的单链可变区(scFv)和信号传导结构域相嵌合构建嵌合抗原受体，将所述嵌合抗原受体的编码基因导入免疫细胞，获得的基因修饰的免疫细胞在靶向表达特异性抗原的肿瘤细胞的同时，还调动内源NKG2D的功能，靶向具有异质性的肿瘤细胞，实现对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞的清除杀伤作用。

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞为表达第一方面所述的嵌合抗原受体的T细胞。

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞为表达第一方面所述的嵌合抗原受体的NK细胞。

第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入免疫细胞的步骤。

第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒、第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第七方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括肿瘤。

优选地，所述肿瘤包括肝癌、胆管癌、肺癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用完整的DAP10作为胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，与常规的信号传导结构域连接后构建嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体可以激活免疫细胞上调表达的NKG2D受体，增强免疫细胞对异质性肿瘤的清除作用；

(2)本发明将DAP10同抗肿瘤表面抗原的scFv和信号传导结构域相嵌合构建嵌合抗原受体，表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞不仅具有靶向清除表达特异性抗原的肿瘤细胞的作用，还可以发挥内源NKG2D受体识别MICA/B抗原、ULBP家族抗原等细胞压力应激蛋白的作用，对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有显著的清除杀伤作用；

(3)本发明的表达CAR的免疫细胞使用的是天然状态下存在的NKG2D受体，通过NKG2D受体激活而转导的信号强度小于通过基因工程技术制作的CAR-NKG2D T细胞或NK细胞，产生的副作用一定程度上小于现有的CAR-NKG2D T细胞或NK细胞；

(4)本发明的嵌合抗原受体的编码基因大小与传统的嵌合抗体受体的编码基因大小相当，并且小于现有特异性串联双CAR分子的基因片段，在构建基因修饰的免疫细胞的过程中不会影响转染效率，成功率高，同时为进一步添加功能元件(如分泌趋化细胞因子)提供了可能性，有利于进一步丰富CAR-T或CAR-NK细胞的功能。

附图说明

图1A为DAP10-CAR分子的结构示意图，图1B为联合肿瘤抗原scFv和内源性NKG2D的双靶点CAR分子的结构示意图；

图2为DAP10-CAR-T和CAR19-T的杀伤功能对比；

图3为传统NKG2D-CAR分子的结构示意图；

图4为DAP10-CAR-T和传统NKG2D-CAR-T的体外杀伤对比；

图5为不同效靶比的CAR-T细胞和肝癌细胞HepG2-GL共培养24小时的体外杀伤结果；

图6为不同效靶比的CAR-T细胞和肝癌细胞Huh7-GL共培养24小时的体外杀伤结果；

图7为不同效靶比的CAR-T细胞和肝癌细胞SK-Hep-1共培养24小时的体外杀伤结果；

图8为靶向GPC3的双靶点CAR-T同Huh7-GL和SK-HEP-1-GL细胞共培养后，最高ET比的培养上清中细胞因子IFN-γ和颗粒酶B的检测结果；

图9为不同效靶比的CAR-T细胞和胃癌细胞系BGC823-GL共培养24小时的体外杀伤结果；

图10为不同效靶比的CAR-T细胞和肺癌细胞系H460-GL共培养24小时的体外杀伤结果；

图11为不同CAR-T细胞对体内肿瘤细胞的抑制作用；

图12为不同CAR-T细胞回输治疗体内肿瘤后，解剖小鼠取出肿瘤后的肿瘤称重结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 CAR分子载体的设计与构建

本实施例首先合成带有完整DAP10分子以及4-1BB和CD3ζ胞内信号转导结构域的片段，连接在pWPXLD-EGFP载体上构建表达质粒DAP10BB3(简称DAP10)，如图1A所示；

随后PCR特异性扩增靶向GPC3和Meothelin的scFv(包括IgG-CH3区域)，并将其分别克隆到上述表达质粒DAP10中，得到靶向GPC3(磷脂酰肌醇蛋白3)的嵌合DAP10胞外和跨膜区、4-1BB和CD3ζ信号转导域的CAR分子antiGPC3-DAP10ec+tm+cd-BB3(简称GPC3-DAP10)，和靶向Mesothelin(间皮素)的嵌合DAP10胞外和跨膜区、4-1BB和CD3ζ信号转导域的CAR分子antiMSLN-DAP10ec+tm+cd-BB3(简称MSLN-DAP10)，如图1B所示，靶向GPC3和MSLN的抗原识别区scFv位于完整的DAP10分子前，4-1BB和CD3ζ信号转导域紧跟在DAP10分子后。

实施例2过表达CAR的病毒包装

将构建好的质粒转入大肠杆菌，挑选带有目的质粒的单克隆进行过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，进行病毒包装；

使用293T细胞进行病毒包装，将辅助质粒和带有CAR分子的表达质粒同时转染293T细胞，分别于48h和72h后收取第一和第二次病毒，过滤后冻于-80℃，以备T细胞转导使用。

实施例3表达CAR的基因修饰T细胞的构建

首先从成人外周血中分离单个核细胞(PBMC)，使用T细胞分选试剂盒将总T细胞分选出来，经过CD3和CD28抗体体外刺激24小时后，加入实施例2制备的过表达CAR分子的病毒；转导12h后，对T细胞进行离心换液；转导三天后，利用流式细胞术测定GFP阳性细胞含量，评估CAR-T的比例；按照每毫升培养基培养2×10⁶个细胞的密度培养扩增CAR-T细胞，获得DAP10-CAR-T(DAP10-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、antiGPC3-DAP10-CAR-T(antiGPC3-DAP10-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)、antiMSLN-DAP10-CAR-T(antiMSLN-DAP10-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)细胞，十天后将细胞冻存，待体内实验使用。

实施例4 DAP10-CAR-T细胞的功能评估

本实施例采用实施例3制备的DAP10-CAR-T细胞实施体外杀伤，并设置阴性对照CAR19-T细胞对照组，步骤如下：

首先，计数胃癌靶细胞BGC823-GL、DAP10-CAR-T细胞和阴性对照CAR19-T，于白色平底96孔板中，将CAR-T细胞与胃癌靶细胞按照2:1、1:1、1:2、1:4和1:8比例接种，使用200μL含5％胎牛血清的IMDM培养基共培养24h；

共培养结束后，向每孔中加入100μL含有Luciferase荧光底物的PBS，使用多功能酶标仪测定发光强度，经计算后得到体外杀伤效果折线图，直观对比DAP10-CAR-T和阴性对照CAR19-T的体外杀伤能力。

如图2所示，加装了DAP10-CAR分子的T细胞针对NKG2D配体表达阳性的靶细胞具有显著的杀伤作用，杀伤能力较阴性对照CAR19-T得到明显提高。

实施例5 DAP10-CAR-T细胞与传统NKG2D-CAR-T的体外杀伤能力比较

本实施例采用实施例3制备的DAP10-CAR-T细胞和如图3所示的传统NKG2D-CAR-T细胞开展体外杀伤功能对比实验，并设置了CAR19-T细胞对照组，步骤如下：

首先，计数胃癌靶细胞BGC823-GL、DAP10-CAR-T细胞、NKG2D-CAR-T细胞和CAR19-T细胞，于白色平底96孔板中，将CAR-T细胞/CAR19-T细胞与胃癌靶细胞按照2:1、1:1、1:2、1:4和1:8比例接种，使用200μL含5％胎牛血清的IMDM培养基共培养24h；

共培养结束后，向每孔中加入100μL含有Luciferase荧光底物的PBS，使用多功能酶标仪测定发光强度，经计算后得到体外杀伤效果折线图，直观对比DAP10-CAR-T、NKG2D-CAR-T和CAR19-T的体外杀伤能力。

如图4所示，DAP10-CAR-T和传统NKG2D-CAR-T对NKG2D配体表达阳性的肿瘤细胞具有几乎等效的体外杀伤作用，杀伤能力较CAR19-T细胞得到明显提高。

实施例6 antiGPC3-DAP10-CAR-T细胞的体外杀伤作用和肝癌抑制作用

本实施例评估antiGPC3-DAP10-CAR-T细胞(简称GPC3-DAP10-T)的体外杀伤作用，并采用传统的靶向GPC3的CAR-T细胞antiGPC3BB3-T(简称GPC3-T)和靶向NKG2D配体的CAR-T细胞DAP10BB3(简称DAP10-T)作为阳性对照，胞内结构域均为4-1BB和CD3ζ信号转导域，采用靶向人CD19抗原的CAR-T细胞作为阴性对照，步骤如下：

首先，计数肝癌靶细胞(HepG2-GL、Huh7-GL、SK-Hep-1-GL)和CAR-T细胞，于白色平底96孔板中，将CAR-T细胞与肝癌靶细胞按照2:1、1:1、1:2、1:4和1:8比例接种，使用200μL含5％胎牛血清的IMDM培养基共培养24h；

共培养结束后，向每孔中加入100μL含有Luciferase荧光底物的PBS，使用多功能酶标仪测定发光强度，经计算后得到体外杀伤效果折线图，直观对比antiGPC3-DAP10-CAR-T和传统CAR-T的体外杀伤能力。

图5、图6和图7所示分别为CAR-T细胞对不同肝癌细胞系的杀伤结果，可以看出，相对于阴性对照和仅能识别单一靶点的antiGPC3BB3和DAP10BB3的CAR-T，协同内源NKG2D的双靶点antiGPC3-DAP10-CAR-T对多种肝癌细胞系都体现出了杀伤作用，并且从对Huh7-GL细胞系的杀伤结果中可以看出，双靶点antiGPC3-DAP10-CAR-T表现出协同作用，针对肿瘤特异性抗原GPC3表达量较少、但是表达一定NKG2D配体的肿瘤细胞，antiGPC3-DAP10-CAR-T具有较单靶点CAR-T更强的杀伤能力。

检测完杀伤结果后，采用ELISA试剂盒检测细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ和颗粒酶B(Granzyme B)的含量。结果如图8所示，在CAR-T细胞对肿瘤细胞具有较强杀伤作用的实验组中，培养基上清中的IFN-γ和颗粒酶B的含量显著高于阴性对照组，该结果和前期杀伤结果一致，提示GPC3-DAP10-T在杀伤肿瘤细胞的同时能够分泌多种细胞因子发挥杀伤功能。

实施例7 antiMSLN-DAP10-CAR-T细胞的体外杀伤作用和肺癌、胃癌细胞抑制作用

本实施例评估antiMSLN-DAP10-CAR-T细胞(简称MSLN-DAP10-T)的体外杀伤作用，并采用传统的靶向MSLN的CAR-T细胞antiMSLNBB3-T(简称MSLN-T)和靶向NKG2D配体的CAR-T细胞DAP10BB3(简称DAP10-T)作为阳性对照，胞内结构域均为4-1BB和CD3ζ信号转导域，采用靶向人CD19抗原的CAR-T细胞作为阴性对照，步骤如下：

首先，计数胃癌靶细胞(BGC823-GL)、肺癌细胞系(H460-GL)和CAR-T细胞，于白色平底96孔板中，将CAR-T细胞与靶细胞按照2:1、1:1、1:2、1:4和1:8比例接种，使用200μL含5％胎牛血清的IMDM培养基共培养24h；

共培养结束后，向每孔中加入100μL含有Luciferase荧光底物的PBS，使用多功能酶标仪测定发光强度，经计算后得到体外杀伤效果折线图，直观对比antiMSLN-DAP10-CAR-T和传统CAR-T的体外杀伤能力。

图9和图10所示分别为CAR-T细胞对胃癌细胞系和肺癌细胞系的杀伤结果，可以看出，相对于阴性对照和仅能识别单一靶点的antiMSLNBB3和DAP10BB3的CAR-T，协同内源NKG2D的双靶点antiMSLN-DAP10-CAR-T对胃癌细胞系和肺癌细胞系都体现出了杀伤作用。

将antiMSLN-DAP10-CAR-T和肿瘤靶细胞体外共培养24h后，ET比为2:1的培养孔的培养基中，IFN-γ和颗粒酶B的含量明显高于阴性对照组。

实施例8 antiGPC3-DAP10-CAR-T细胞的体内杀伤作用和肝癌、胃癌抑制作用

本实施例评估antiGPC3-DAP10-CAR-T细胞(简称GPC3-DAP10-T)的体内杀伤作用，步骤如下：

首先，向免疫缺陷鼠NSI皮下注射肿瘤细胞系，一周后，通过观察和触摸移植部位，将模型小鼠按照肿瘤大小平均分为五组，每组6只，分别癌旁注射antiGPC3-DAP10-CAR-T(GPC3-DAP10-T)、antiGPC3BB3CAR-T(GPC3-T)、DAP10BB3(DAP10-T)、antihCD19 CAR-T(CAR19-T)，同时设置对照组(NT)不做任何处理；每三天进行一次肿瘤大小测量，通过长×宽²/2计算肿瘤体积，连续观察肿瘤进展情况并对肿瘤体积进行统计，定期抽取小鼠外周血，流式细胞术监测CAR-T细胞在体内的扩增情况；

对肿瘤大小达到伦理极限的小鼠实施安乐死，取出肿瘤组织并称量统计肿瘤重量，对肿瘤进行研磨，流式细胞术检测注射过T细胞的小鼠体内肿瘤内部T细胞的浸润情况，统计各组小鼠的存活率，综合小鼠存活率、体内T细胞的扩增情况以及肿瘤组织中T细胞浸润情况，评估CAR-T的体内疗效。

结果发现，带有靶向GPC3的DAP10双CAR-T细胞对肿瘤进展具有最明显的抑制作用，其次为单一靶点的CAR-T细胞，肿瘤进展最快速的为对照CAR19-T组和不处理组。如图11和图12所示，由于BGC823细胞系不带有GPC3靶点，但是带有可被NKG2D识别的配体，所以同对照组相比，GPC3-DAP10和DAP10组均显示出对体内肿瘤明显的抑制效果。

实施例9antiMSLN-DAP10-CAR-T细胞的体内杀伤作用和胃癌、肺癌细胞抑制作用

本实施例评估antiMSLN-DAP10-CAR-T细胞(简称MSLN-DAP10-T)的体内杀伤作用，步骤如下：

首先，向免疫缺陷鼠NSI腹腔注射表达Luciferase的肿瘤细胞系，三周后，通过活体成像系统评估建模情况；将模型小鼠平均分为五组，每组5只，分别腹腔注射antiMSLN-DAP10-CAR-T(MSLN-DAP10-T)、antiMSLNBB3 CAR-T(MSLN-T)、DAP10BB3(DAP10-T)、antihCD19 CAR-T(CAR19-T)，同时设置对照组不做任何处理；每周进行一次活体成像，连续观察肿瘤进展情况，定期抽取小鼠外周血，流式细胞术监测CAR-T细胞在体内的扩增情况；

对肿瘤大小达到伦理极限的小鼠实施安乐死，取出肿瘤组织进行研磨，流式细胞术检测注射过T细胞的小鼠体内肿瘤内部T细胞的浸润情况，统计各组小鼠的存活率，综合小鼠存活率、体内T细胞的扩增情况以及肿瘤组织中T细胞浸润情况，评估CAR-T的体内疗效。

结果发现，带有靶向MSLN的DAP10双CAR-T细胞对肿瘤进展具有最明显的抑制作用，其次为单一靶点的CAR-T细胞，肿瘤进展最快速的为对照CAR19-T组和不处理组。

综上所述，本发明利用完整的DAP10作为胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，与抗肿瘤表面抗原的scFv和/或信号传导结构域相嵌合构建嵌合抗原受体，制备的基因修饰的免疫细胞对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有显著的抑制生长和清除杀伤作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司

<120> 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用

<130> 20200826

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr

20 25 30

Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro

35 40 45

Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile

50 55 60

Val Gly Ala Val Phe

65

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr

20 25 30

Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro

35 40 45

Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile

50 55 60

Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln

65 70 75 80

Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Lys Arg Gly

85 90 95

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

100 105 110

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

115 120 125

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

130 135 140

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

145 150 155 160

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

165 170 175

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

180 185 190

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

195 200 205

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

210 215 220

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

225 230 235 240

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

245

<210> 3

<211> 614

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser

20 25 30

Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

35 40 45

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu

50 55 60

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

85 90 95

Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly

115 120 125

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

145 150 155 160

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His

180 185 190

Gly Leu Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala

195 200 205

Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

210 215 220

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

275 280 285

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

290 295 300

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

305 310 315 320

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

325 330 335

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

340 345 350

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

355 360 365

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Phe Gln

370 375 380

Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly Thr

385 390 395 400

Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu Ala

405 410 415

Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala

420 425 430

Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly

435 440 445

Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Thr Arg Lys Arg Gly Arg

450 455 460

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

465 470 475 480

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

485 490 495

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

500 505 510

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

515 520 525

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

530 535 540

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

545 550 555 560

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

565 570 575

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

580 585 590

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

595 600 605

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

610

<210> 4

<211> 639

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro

20 25 30

Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Ile Ser

35 40 45

Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln

50 55 60

Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser

65 70 75 80

Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile

85 90 95

Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val

100 105 110

Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr

115 120 125

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu

165 170 175

Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser

180 185 190

Gly Ile Asn Val Gly Pro Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

195 200 205

Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys

210 215 220

Gln Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala

225 230 235 240

Ser Ala Asn Ala Gly Val Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp

245 250 255

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe

260 265 270

Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gly Ile Leu Glu Gln Gln

275 280 285

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu

290 295 300

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

305 310 315 320

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

325 330 335

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

340 345 350

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

355 360 365

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

370 375 380

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

385 390 395 400

Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Phe Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser

405 410 415

Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys

420 425 430

Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala

435 440 445

Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro

450 455 460

Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro

465 470 475 480

Gly Arg Gly Thr Arg Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

485 490 495

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

500 505 510

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

515 520 525

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

530 535 540

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545 550 555 560

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

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Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

625 630 635

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括DAP10蛋白和信号传导结构域，所述信号传导结构域连接在所述DAP10蛋白的C端；

所述DAP10蛋白为胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号传导结构域包括CD3ζ；

优选地，所述信号传导结构域还包括4-1BB、CD28、TLR1、TLR2或OX40中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB；

优选地，所述DAP10蛋白包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

优选地，所述嵌合抗原受体由DAP10蛋白、4-1BB和CD3ζ串联组成；

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域连接在所述DAP10蛋白的N端；

优选地，所述抗原结合结构域包括靶向肿瘤表面抗原的单链可变区；

优选地，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种或至少两种的组合，优选为GPC3或Mesothelin；

优选地，所述嵌合抗原受体由靶向肿瘤表面抗原的单链可变区、DAP10蛋白、4-1BB和CD3ζ串联组成；

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

4.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求4所述的编码基因；

优选地，所述表达载体为含有权利要求4所述的编码基因的病毒载体；

优选地，所述表达载体为含有权利要求4所述的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为含有权利要求4所述的编码基因的慢病毒载体。

6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒为转染有权利要求5所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。

7.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体；

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有权利要求4所述的编码基因；

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括权利要求5所述的表达载体和/或权利要求6所述的重组慢病毒；

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞为表达权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体的T细胞；

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞为表达权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体的NK细胞。

8.一种权利要求7所述的嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体的编码基因导入免疫细胞的步骤。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求7所述的嵌合抗原受体免疫细胞；

10.一种权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的编码基因、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的重组慢病毒、权利要求7所述的嵌合抗原受体免疫细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用；

优选地，所述疾病包括肿瘤；

优选地，所述肿瘤包括肝癌、胆管癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。