CN112111013A

CN112111013A - 一种靶向claudin 18.2的通用型嵌合抗原受体T细胞、构建方法及其用途

Info

Publication number: CN112111013A
Application number: CN201910545705.4A
Authority: CN
Inventors: 贺小宏; 王延宾; 任江涛
Original assignee: Nanjing Bioheng Biotech Co Ltd
Current assignee: Nanjing Bioheng Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-06-22
Filing date: 2019-06-22
Publication date: 2020-12-22

Abstract

本发明涉及一种靶向claudin 18.2的通用型嵌合抗原受体T细胞、构建方法及其用途，属于分子生物医学技术领域。本发明提供了一种靶向Claudin18.2的单链抗体，以及包括所述靶向Claudin18.2的单链抗体的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体可以专一性地靶向Claudin18.2，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，并且几乎不对正常细胞造成损伤。

Description

一种靶向claudin 18.2的通用型嵌合抗原受体T细胞、构建方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种靶向claudin 18.2的通用型嵌合抗原受体T细胞、构建方法及其用途，属于分子生物医学技术领域。

背景技术

胃癌是全球第三致死率的恶性肿瘤，根据世界卫生组织2015年数据，全球每年有75.4万例胃癌患者死亡；我国每年胃癌新发病例超过60余万，高居恶性肿瘤发病率第二位，严重危害人类生命健康。现有治疗手段对于晚期胃癌的疗效仍不尽如人意，五年生存率只有5~20%，因此，迫切寻求安全、有效的治疗手段。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor T-cellimmunotherapy)，简称CAR-T疗法治疗被誉为最有希望治愈肿瘤的手段，通过基因工程的方法，在T细胞的细胞膜上嵌合上某种特定肿瘤抗原受体基因形成修饰的T细胞，从而特异性识别和结合肿瘤细胞表面的抗原并实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。1989年，CAR-T技术的第一篇文章发表，其后二十多年，CAR-T疗法历经四代技术革新。经过多年研究，CAR-T疗法在临床上获得巨大成功，2017年诺华Kymriah和凯特医药Yescarta相继上市，开启了免疫细胞疗法产业化新时代。2017年美国FDA已经被批准了两款针对CD19靶点治疗白血病与淋巴瘤的CAR-T细胞药物。但在实体瘤领域，CAR-T细胞治疗仍面临着缺乏特异性靶点等问题。

Claudin蛋白是细胞间紧密连接的骨架蛋白,在细胞中的正常表达是稳定细胞之间相互作用动态平衡的前提条件。claudin蛋白的异常表达可破坏上皮细胞及内皮细胞的结构,并导致其功能受损,从而有利于肿瘤的发生、发展。

大量研究表明，Claudin18.2是一种仅在胃短寿细胞表达的紧密连接蛋白，但在胃癌、胰腺癌等肿瘤组织中高度表达。在高表达Claudin18.2晚期胃癌患者中，IMAB362与化疗组合生存期是化疗的两倍（16.7对9个月），这是一个惊人的改进。Claudin家族蛋白发现不到20年，现在已知27个基因，但多数功能未知。Claudin18.2调控细胞膜性质，控制物质交换。对于胃癌高发区的中国，这个靶点更加重要。

发明内容

本发明提供了一种靶向Claudin18.2的单链抗体，以及包括所述靶向Claudin18.2的单链抗体的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体可以专一性地靶向Claudin18.2，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，并且几乎不对正常细胞造成损伤。

本发明的第一个方面，提供了：

一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的抗原结合区和信号传导区；其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。

在一个实施方式中，所述的抗原结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

在一个实施方式中，所述的信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。

本发明的第二个方面，提供了：

用于编码所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体的核酸分子。

在一个实施方式中，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示。

本发明的第三个方面，提供了：

一种载体，其包括上述核酸分子。

所述载体为是慢病毒表达载体。

本发明的第四个方面，提供了：

一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体T细胞，其表达上述嵌合抗原受体。

本发明的第五个方面，提供了：

上述的嵌合抗原受体T细胞的构建方法，包括如下步骤：

第1步，获得上述的核酸分子，并构建出能够表达靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体；

第2步，通过所述的慢病毒表达载体感染T细胞，得到慢病毒；

第3步，分离T淋巴细胞，并用所述慢病毒感染所述T淋巴细胞，获得所述靶向Claudin18.2嵌合抗原受体T细胞。

本发明的第六个方面，提供了：

上述的嵌合抗原受体T细胞在用于治疗癌症治疗药物中的用途。

在一个实施方式中，所述的癌症是指胃癌或者胰腺癌。

在一个实施方式中，所述的癌症是指Claudin18.2表达的癌症。

有益效果

1、本发明提供了一种靶向claudin 18.2的嵌合抗原受体，受体可用于靶向claudin18.2的通用型嵌合抗原受体T细胞的构建，所述靶向claudin 18.2的嵌合抗原受体结构简单，对claudin 18.2蛋白进行有效结合，能简单、有效的制备具有特异性识别和杀伤肿瘤的CAR-T细胞。2、本发明提供的靶向claudin 18.2的的嵌合抗原受体T细胞对于表达claudin18.2的癌细胞具有高效的肿瘤杀伤活性，尤其是对于表达claudin 18.2的癌症，例如于表达claudin 18.2的胃癌。

附图说明

图1是本发明提供的嵌合抗原受体T细胞的体内抗肿瘤实验效果对比。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在本说明书中所述及到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施方式”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本申请所要保护的范围内。

实施例1 构建慢病毒表达载体

合成出含有用于编码所述的信号传导区的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，命名为pGSI。

用BamHI和SalI限制性内切酶分别双酶切3ug pGSI和重组慢病毒载体质粒pCDH-EF1，酶切产物胶回收后用T4 DNA连接酶连接，4℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，取100μL菌液涂布至含有氨苄抗性的LB板上，37℃过夜培养。挑取单克隆进行菌落PCR，将阳性克隆送样测序，保存测序结果正确的克隆并提取质粒，命名为pCDH-EF1-emCAR。

合成出含有用于编码所述的抗原结合区的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，命名为pScFv。

用EcoRI和NheI限制性内切酶分别双酶切3ug pScFv和骨架质粒pCDH-EF1-emCAR，酶切产物胶回收后用T4 DNA连接酶连接，4℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，取100μL菌液涂布至含有氨苄抗性的LB板上，37℃过夜培养。挑取单克隆进行菌落PCR，将阳性克隆送样测序，保存测序结果正确的克隆并提取质粒，命名为claudin CAR载体。

实施例2 慢病毒包装

从液氮中取出1支冻存的293T细胞迅速放到37℃水浴中直至冰块消失，逐滴加入含有5ml预热培养基的15ml离心管中，1200rpm离心3min，弃上清，用293T培养基(10％FBS+DMEM)重悬细胞接种至150mm培养皿中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养。待细胞汇合度达90％以上时，弃去旧培养基，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞后弃去PBS溶液，加入2ml 0.25％Trypsin-EDTA消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。加入含血清的培养基终止消化，细胞悬液1200rpm离心3min，离心所得细胞用培养基重悬，每个150mm培养皿细胞接种1 .2× 107细胞用于包装慢病毒，37℃、5％CO₂饱和湿度培养，20ml培养基/皿。

转染前2h，将293T细胞培养基更换为18ml DMEM培养基，向A灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，然后加入所制备的claudin CAR载体、pHelper1质粒和pHelper2质粒(claudin CAR载体：pHelper1：pHelper2的质量比＝1：1：1，共54μg，pHelper1和pHelper2质粒为慢病毒包装的辅助质粒)，混合均匀。向B灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，然后加入108μl Lipofectamin2000(脂质体)溶液，混合均匀。A管和B管在室温下温育5分钟。将B管中的液体成滴的加入到A管中，混合均匀，室温孵育20min，得到DNA-脂质体转染复合物。

将DNA-脂质体转染复合物转移至预先换液的293T细胞中，混匀，37℃、5％CO2饱和湿度培养。培养6-8h后吸弃含有转染混和物的培养基，每皿细胞加入20ml预热的含5％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度培养，得到携带claudin CAR序列的慢病毒(claudinCAR)。

实施例3 慢病毒纯化

换液后分别在24h和48h，收集上清液暂存储于4℃，并换20ml新鲜培养基。将收集到的液体4℃、3500rpm离心15min，弃沉淀，将上清用Millipore蛋白超滤柱(10KD)进行浓缩同时进行病毒滴度测定，根据测定结果将慢病毒claudin CAR)稀释为1*10⁸TU/ml，分装后的慢病毒(claudin CAR)置于-80℃保存。

实施例4 CD3+T细胞的分离

全血倒入50ml离心管，室温离心20分钟，控制离心力为700g；取上述离心下部细胞成分，加杜氏磷酸盐缓冲液DPBS至50ml；分别取25ml上述液体加到20ml人淋巴细胞分离液，将离心管室温离心15分钟，控制离心力为800g；取白膜层细胞，加入DPBS，补足至50ml；离心10分钟，控制离心力为600g，弃上清液，得外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，简称：PBMC)。

实施例5慢病毒载体感染T淋巴细胞

用质量分数为10％FBS的RPMI1640完全培养基培养分离得到的外周血单个核细胞，第一天加入抗CD3单克隆抗体活化；第三天加入80 MOI的纯化后的慢病毒(claudin CAR)，1000g离心1h，然后将培养基更换为含有700IU/ml重组人IL-2的X-Vivo15无血清培养基，继续培养7天，得到靶向claudin 18.2的嵌合抗原受体T细胞。

实施例6靶向claudin 18.2嵌合抗原受体T细胞抗肿瘤效果

18-22g雄性SCID小鼠于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50%±10%)，收集对数期的胃癌细胞KATOⅢ细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至2×10⁵个/mL。无菌条件下，小鼠左腋下接种0.2mL胃癌细胞KATOⅢ细胞悬浮液，观察3-5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。

SCID胃癌模型小鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm³)随机分成5组，每组20只，开始注射治疗实验。实验组分别为：

a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；

b.治疗一组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只正常T细胞；

c.治疗二组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只靶向claudin 18.2的嵌合抗原受体T细胞。

每周免疫上述各组小鼠一次，连续免疫两周，统计100天内小鼠生存状态，做生存率曲线。结果如图1所示，结果表明，靶向claudin 18.2嵌合抗原受体T细胞相对于正常T细胞以及对照组可延迟claudin 18.2高表达细胞系KATOⅢ细胞移植瘤小鼠模型的生存期。

应当理解，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞，利用所述宿主细胞制备表达蛋白的方法等。所述该序列经替换一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，是指该序列的活性功能域之外的位点进行有限氨基酸的保护替换所得的序列仍能保持原来的活性。

序列表

<110> 南京北恒生物科技有限公司

<120> 一种靶向claudin18.2的通用型嵌合抗原受体T细胞、构建方法及其用途

<130> 无

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Gly Gln Lys

130 135 140

Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu

145 150 155 160

Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly

165 170 175

Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala

180 185 190

Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys

195 200 205

Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu

210 215 220

Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val

245 250 255

Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu

260 265 270

Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys

275 280 285

Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu

290 295 300

Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile

305 310 315 320

Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe

325 330 335

Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr

340 345 350

Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn

355 360 365

Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg

370 375 380

Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile

385 390 395 400

Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val

405 410 415

Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp

420 425 430

Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn

435 440 445

Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His

450 455 460

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys

130

<210> 3

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Gly Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys

1 5 10 15

Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu

20 25 30

Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys

35 40 45

Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly

50 55 60

Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala

65 70 75 80

Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr

85 90 95

Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr

100 105 110

Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser

115 120 125

Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly

130 135 140

Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr

165 170 175

Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His

180 185 190

Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro

195 200 205

Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr

210 215 220

Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His

225 230 235 240

Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly

245 250 255

Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu

260 265 270

Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn

275 280 285

Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly

290 295 300

Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser

305 310 315 320

Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His

325

<210> 4

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60

gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120

ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180

gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240

accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300

ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360

gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420

cagggccaaa agtgtgatcc aagctgtccc aatgggagct gctggggtgc aggagaggag 480

aactgccaga aactgaccaa aatcatctgt gcccagcagt gctccgggcg ctgccgtggc 540

aagtccccca gtgactgctg ccacaaccag tgtgctgcag gctgcacagg cccccgggag 600

agcgactgcc tggtctgccg caaattccga gacgaagcca cgtgcaagga cacctgcccc 660

ccactcatgc tctacaaccc caccacgtac cagatggatg tgaaccccga gggcaaatac 720

agctttggtg ccacctgcgt gaagaagtgt ccccgtaatt atgtggtgac agatcacggc 780

tcgtgcgtcc gagcctgtgg ggccgacagc tatgagatgg aggaagacgg cgtccgcaag 840

tgtaagaagt gcgaagggcc ttgccgcaaa gtgtgtaacg gaataggtat tggtgaattt 900

aaagactcac tctccataaa tgctacgaat attaaacact tcaaaaactg cacctccatc 960

agtggcgatc tccacatcct gccggtggca tttaggggtg actccttcac acatactcct 1020

cctctggatc cacaggaact ggatattctg aaaaccgtaa aggaaatcac agggtttttg 1080

ctgattcagg cttggcctga aaacaggacg gacctccatg cctttgagaa cctagaaatc 1140

atacgcggca ggaccaagca acatggtcag ttttctcttg cagtcgtcag cctgaacata 1200

acatccttgg gattacgctc cctcaaggag ataagtgatg gagatgtgat aatttcagga 1260

aacaaaaatt tgtgctatgc aaatacaata aactggaaaa aactgtttgg gacctccggt 1320

cagaaaacca aaattataag caacagaggt gaaaacagct gcaaggccac aggccaggtc 1380

tgccat 1386

<210> 5

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccaacactg tcaagtttcg ctgcccagcc ggggggaacc caatgccaac catgcggtgg 60

gagctgccca tgagaaattt acagggccaa aagtgtgatc caagctgtcc caatgggagc 120

tgctggggtg caggagagga gaactgccag aaactgacca aaatcatctg tgcccagcag 180

tgctccgggc gctgccgtgg caagtccccc agtgactgct gccacaacca gtgtgctgca 240

ggctgcacag gcccccggga gagcgactgc ctggtctgcc gcaaattccg agacgaagcc 300

acgtgcaagg acacctgccc cccactcatg ctctacaacc ccaccacgta ccagatggat 360

gtgaaccccg agggcaaata cagctttggt gccacctgcg tgaagaagtg tccccgtaat 420

tatgtggtga cagatcacgg ctcgtgcgtc cgagcctgtg gggccgacag ctatgagatg 480

gaggaagacg gcgtccgcaa gtgtaagaag tgcgaagggc cttgccgcaa agtgtgtaac 540

ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 600

ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 660

gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta 720

aaggaaatca cagggttttt gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat 780

gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt 840

gcagtcgtca gcctgaacat aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat 900

ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa 960

aaactgtttg ggacctccgg tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc 1020

tgcaaggcca caggccaggt ctgccatttc tgcagagcca ccaaccaaat accaaatctc 1080

tcaaccagaa gtgtacgtgg ctgcgcc 1107

<210> 6

<211> 518

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcctttcttc cctctctcca ccagagcgat cgcctcaccg gcccatcctc caagccggac 60

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 120

gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 180

ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 240

gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 300

accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 360

ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 420

gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agcaccatac tggaccaaca 480

cagaaaagat ggaaaagcgg ctccatgctg tgcctgcg 518

Claims

1.一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的抗原结合区和信号传导区；其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.根据权利要求1所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的抗原结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

3.根据权利要求1所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。

4.一种用于编码权利要求1所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO .4所示。

6.一种载体，其特征在于，其包括权利要求4所述的核酸分子。

7.一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其表达权利要求1所述的嵌合抗原受体。

8.权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞的构建方法，包括如下步骤：第1步，获得上述的核酸分子，并构建出能够表达靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体；第2步，通过所述的慢病毒表达载体感染T细胞，得到慢病毒；第3步，分离T淋巴细胞，并用所述慢病毒感染所述T淋巴细胞，获得所述靶向Claudin18.2嵌合抗原受体T细胞。

9.权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞在用于治疗癌症治疗药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的癌症是指胃癌或者胰腺癌；所述的癌症是指Claudin18.2表达的癌症。