CN113354739A - 一种靶向表达Claudin18.2细胞的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向表达Claudin 18.2(CLDN 18.2)的细胞的嵌合抗原受体。具体地公开了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.:14所示的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：靶向Claudin 18.2的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域。本发明的靶向Claudin 18.2的嵌合抗原受体，能够有效并且特异性地靶向表达Claudin 18.2表面抗原的恶性细胞(例如肿瘤细胞)，从而为治疗一些表达Claudin18.2表面抗原的肿瘤提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。

Description

一种靶向表达Claudin18.2细胞的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种靶向表达CLDN 18.2的细胞 的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构 建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的表达载体，并将该表达载体 导入到从人体分离的免疫细胞中，使其细胞表面表达CAR后进行扩增培养，将 其回输至人体。表达CAR的免疫细胞能够特异性识别并结合靶细胞，通过释放 特异的免疫因子对其进行杀伤。第一代CAR-T虽然能够介导对肿瘤细胞的杀伤 作用，但是不转导增殖信号和诱导细胞因子产生，并且体内持续作用时间不长， 只能引起短暂的T细胞增殖，因此，抗肿瘤效果甚微；第二代CAR-T通过增加 共刺激分子(例如4-1BB或CD28)的胞内结构域以延长其体内存活时间，促进其 迅速扩增能力，通过构建scFv/4-1BB(或CD28)/CD3-z的CAR-T可以裂解靶细胞， 传递活化信号，产生大量的IFN-γ、IL-2等细胞因子；第二代CAR-T较第一代具 有更好的增强T细胞活化、扩增、抗肿瘤以及促进转基因表达的能力。

CAR-T在杀伤肿瘤方面具有的主要优势是：第一，由于其抗原识别结合域 能够识别肿瘤抗原，因此针对肿瘤的特异性很高；第二，由于其胞内信号传导 域可以迅速同时开启CAR-T的杀伤和扩增的下游信号，因此肿瘤杀伤效率高， CART细胞能够在体内持续扩增；第三，由于CAR-T不需要通过TCR和MHC分 子相结合的方式开启肿瘤杀伤，因此具有非MHC限制性，可以直接识别肿瘤表 面抗原，因此肿瘤的识别效率高特异性强，同时能够杀伤MHC下调的肿瘤细胞。 基于CAR-T的这些优势，CAR-T在B细胞急性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤等血 液肿瘤的治疗上已取得了显著的疗效，已获得了FDA的审批，并且在实体肿瘤 的治疗中已经显示了初步的疗效。

胃肠道和胰腺肿瘤对于人类生命是很大的威胁，虽然手术治疗、放化疗、 介入治疗等治疗手段对于该类肿瘤有一定疗效，但患者生存率仍无显著改善。 目前，备受关注的CAR-T细胞治疗技术有望成为治疗的突破口。

由于癌胚抗原Claudin 18.2(CLDN18.2)在正常组织表达的高度特异性及在 多种癌症中被激活表达，因此针对上皮性肿瘤，CLDN18.2成为极具潜力的靶点， CLDN 18.2是一种广谱性肿瘤标志物，可在多种肿瘤中表达。

因此，本领域亟待开发一种新的有效治疗多种表达CLDN18.2的肿瘤的免疫 治疗方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向表达Claudin 18.2的细胞的嵌合抗原受体 及其在肿瘤治疗中的应用。

本发明的第一方面，提供了一种靶向表达Claudin 18.2的细胞的嵌合抗原 受体，所述嵌合抗原受体氨基酸序列如SEQ ID NO.:14所示，并且其包含：靶 向CLDN 18.2的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域，其中所 述的靶向CLDN 18.2的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的CAR具有如式I所示的结构：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (式I)

其中，

L为无或信号肽序列；

scFv为靶向CLDN 18.2的单链抗体可变区序列；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

各“-”独立地表示连接上述各元件的连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述单链抗体包含如SEQ ID NO.:17所示的抗体重链可变区 和如SEQ ID NO.:18所示的抗体轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

如SEQ ID NO.:19所示的CDR1；

如SEQ ID NO.:20所示的CDR2；

如SEQ ID NO.:21所示的CDR3。

在另一优选例中，所述抗体轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

如SEQ ID NO.:22所示的CDR1’；

如SEQ ID NO.:23所示的CDR2’；

如SEQ ID NO.:24所示的CDR3’。

在另一优选例中，所述的H为选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、 或其组合。

在另一优选例中，所述铰链区为CD8 Hinge，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所 示。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、 CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，所述的跨膜结构域为CD8 TM，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、 CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、 CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、 或其组合。

在另一优选例中，所述的细胞内信号结构域由4-1BB和CD3ζ组成，其氨 基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述的细胞内信号结构域由CD28和CD3ζ组成或由 4-1BB、CD28和CD3ζ组成。

在另一优选例中，CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

在另一优选例中，4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。

在另一优选例中，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示。

本发明的第二方面，提供了一种编码如本发明第一方面所述的嵌合抗原受 体的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:13所示。

在另一优选例中，所述核酸分子含有编码如式I所示的CAR构建物的核苷酸序 列；

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (式I)

其中，

L为无或信号肽序列；

scFv为靶向CLDN 18.2的人源化单链抗体可变区序列；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

各“-”独立地表示连接上述各元件的连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述多核苷酸分子编码如SEQ ID NO.:14所示的嵌合抗 原受体的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述多核苷酸分子的核苷酸序列包含编码CD8 Hinge铰 链区的核苷酸序列、编码跨膜结构域CD8 TM的核苷酸序列、编码细胞内信号 结构域4-1BB、CD28和CD3ζ的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述编码CD8 Hinge铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述编码跨膜结构域CD8 TM的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

在另一优选例中，所述编码CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示。

在另一优选例中，所述编码4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示。

在另一优选例中，所述编码CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.:11所示。

本发明的第三方面，提供了一种表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体 的重组表达载体，所述的重组表达载体的启动子后连接有前导肽和编码所述的 嵌合抗原受体的核酸片段。

在另一优选例中，所述的启动子为EF1alpha启动子。

在另一优选例中，编码所述前导肽的核酸序列如SEQ ID NO.:15所示。

在另一优选例中，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

本发明的第四方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述免疫细胞含有本 发明第三方面所述的重组表达载体、或染色体中整合有本发明第二方面所述的 多核苷酸分子、或表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或其组合。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞。

在另一优选例中，所述免疫细胞为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明 第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明 第三方面所述的重组表达载体或本发明第四方面所述的工程化的免疫细胞，以 及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明的第六方面，提供了一种本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本 发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体或本 发明第四方面所述的工程化的免疫细胞或本发明第五方面所述的药物组合物 在预防和/或治疗含有表达Claudin 18.2的肿瘤细胞的癌症中的用途。

在另一优选例中，所述癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、 卵巢癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、小肠腺癌、 口腔癌或鼻咽癌。

本发明的第七方面，提供了一种制备本发明第四方面所述的工程化的免疫 细胞的方法，包括以下步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸分子或本发明 第二方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或其组合。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞。

本发明的第八方面，提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括给需要对 象施用治疗有效量的本发明第一方面所述的靶向表达CLDN 18.2的细胞的嵌合 抗原受体、本发明第四方面所述的工程化的免疫细胞、或本发明第五方面所述 的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、 卵巢癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、小肠腺癌、 口腔癌或鼻咽癌。

在另一优选例中，所述需要的对象为人或非人哺乳动物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明的嵌合抗原受体的3种结构的示例图。

图2为本发明的实施例采用的慢病毒表达载体的结构示意图。

图3为插入有编码靶向CLDN 18.2的嵌合抗原受体的核酸片段的慢病毒表 达载体的限制性内切酶XbaI酶切电泳鉴定图。

图4为CLDN 18.2-CART细胞和对照T细胞对CLDN 18.2阳性的K562肿瘤细 胞的杀伤情况。

图5为CLDN 18.2-CART细胞和对照T细胞对CLDN 18.2阴性的K562肿瘤细 胞的杀伤情况。

图6为表达靶向CLDN 18.2嵌合抗原受体的T细胞分泌IL-2的结果图。

图7为表达靶向CLDN 18.2嵌合抗原受体的T细胞分泌IFN-γ的结果图。

图8为慢病毒转染第九天的CAR-T细胞的CAR病毒检测结果图。

图9为慢病毒转染第十六天的CAR-T细胞的CAR病毒检测结果图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地研发了一种靶向表达Claudin 18.2(CLDN 18.2)的细胞的嵌合抗原受体。通过体外实验证明，所述靶向CLDN 18.2的嵌合抗原受体，能够有效并且特异性地靶向表达CLDN 18.2表面抗原的恶 性细胞(例如肿瘤细胞)，并可表达于免疫细胞例如T细胞表面，对表达CLDN 18.2表面抗原的恶性细胞进行特异性杀伤。在此基础上完成了本发明。

术语

Claudin 18.2(CLDN 18.2)

CLDN 18.2在正常组织表达的高度特异性及在多种癌症中被激活表达，因 此针对上皮性肿瘤，CLDN 18.2成为极具潜力的靶点，CLDN 18.2是一种广谱性 肿瘤标志物，可在多种肿瘤中表达。开发针对CLDN 18.2的CAR-T细胞疗法可 能是一种有效治疗多种实体肿瘤的有效治疗方法。

如本文所用，“CLDN 18.2阳性”指细胞表面高表达CLDN 18.2，“CLDN 18.2阴性”是指细胞表面低表达或不表达CLDN 18.2。

本发明的嵌合抗原受体或CAR-T细胞可特异性靶向肿瘤细胞表面表达的 CLDN18.2，从而杀伤肿瘤细胞。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000 道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。 每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间 的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的 一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一 端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链 的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不 同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不 均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定 区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。 天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由 形成连接环的三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)相连，在某些情况下可形成 部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I， 647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同 的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为 明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫 球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM， 其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。 对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免 疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部 分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链 可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上， 最佳地98％以上)的同源性。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“V_L”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

单链抗体

如本文所用，术语“单链抗体”、“scFv”，是由抗体重链可变区和轻链 可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。scFv能较好地保 留其对抗原的亲和活性,并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。

本发明所述的靶向表达CLDN 18.2的细胞的嵌合抗原受体其包含靶向 CLDN 18.2的单链抗体，所述的靶向CLDN 18.2的单链抗体的氨基酸序列如 SEQ ID NO.:1所示。

并且，所述单链抗体包含如SEQ ID NO.:17所示的抗体重链可变区和如SEQ IDNO.:18所示的抗体轻链可变区。

嵌合抗原受体(CAR)

本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内 结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内 结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分 子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要 的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结 构

域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结 构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可 包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括 靶向Claudin 18.2的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够 基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞， 导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负 荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个 的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域、和 CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”、“单链抗体片段”均指具有抗原结合 活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体 重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗 体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成 抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷 酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述抗原结合结构域 包含特异性识别CLDN 18.2的抗体，较佳地为单链抗体。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞 外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一 相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换 进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构 域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR中的胞内结构域包括4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信 号传导结构域。

多核苷酸分子和载体

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白以及上述嵌合抗原 受体的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA 形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链 的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.：13、2、4、7、9和11所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本 文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨 基酸序列，但与SEQ ID NO.：13、2、4、7、9和11所示的编码区序列有差别的 核酸序列。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成 熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编 码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以 是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至 少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与 本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或 (2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等； 或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂 交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO..14、3、5、6、8、10和 12所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法 或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获 得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在 一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通 常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中 分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形 式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白 (或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已 知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突 变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的 载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属； 鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、 COS7、293细胞、T细胞、NK细胞的动物细胞等。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞” 包括本发明第四方面中包含的CAR-T细胞。

CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的 作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某 一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利 用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范 围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆 功能，可以长期在体内存活。

如本文所用，术语“CLDN 18.2-CART细胞”、“Claudin18.2 CAR-T细胞” 表示靶向CLDN 18.2的CAR-T细胞，即在细胞表面表达结合CLDN 18.2的单链抗 体的T细胞。

本发明提供了包含靶向CLDN 18.2的CAR的CAR-T细胞，如本发明第四方 面所述。

在本发明的一个优选实施方式中，本发明利用人源化CLDN 18.2scFv构建 的CAR-T细胞，可以进一步提高其杀伤效果和肿瘤清除能力。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，包含本发明第一方面所述的嵌合抗原受 体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载 体或本发明第四方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、赋 形剂或稀释剂。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的 水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配 制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常 规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静 脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％， 更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)、嵌合抗原受体、或嵌合 抗原受体T细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限 于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给 药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或 含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、 溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微 克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫物施用于哺乳动物，其中该安 全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/ 千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具 体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围 之内的。

治疗性应用

本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第 二方面所述的多核苷酸分子、如本发明第三方面所述的重组表达载体、如本发 明第四方面所述的工程化的免疫细胞或如本发明第五方面所述的药物组合物 在预防和/或治疗含有表达CLDN 18.2的肿瘤细胞的癌症中的用途。

所述癌症为实体瘤，所述癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、 卵巢癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、小肠腺癌、 口腔癌或鼻咽癌。

对于离体免疫细胞制备，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前 在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细 胞。

离体细胞处理程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简 单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体对上 述细胞进行基因修饰(即体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用于哺乳动 物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，CAR-修饰的细胞相对于 接受者可为自体，也可为同种异基因的、同基因的(syngeneic)。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要的对象以有效量的本发 明的通用型CAR-T细胞。

本发明的通用型CAR-T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/ 或与其他组分诸如IL-2、IL-15、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单 地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞，与一种或多种药学或 临床上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中 性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或 葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如 EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配 制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的 数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症的特征、疾病的类型和严重度, 尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量” 时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、 重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文 描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁷个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可 以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如 Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳 剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象，治疗方案由医学领域技术人员确 定。

对象组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞 咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊 髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内、胸膜内施用给患者。在另一个 实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.静脉内注射施用。T细胞的组 合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。(CART细胞产品以静脉输注为主， 可采用直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置)

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将 T细胞扩增至治疗性水平的方法活化和扩增细胞，与任何数量的有关治疗形式 结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以 下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦、白细胞介素-2、IFN-γ、 阿糖胞苷(也已知为ARA-C)等其它细胞毒化疗药物、检验点抑制剂，如PD-1抗 体、抗CTLA-4抗体和抑制细胞因子风暴的药物，如抗IL-6受体的托珠抗体等其 他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、 辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和，抗 体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移 植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如， 之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂 量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植 后，对象接受本发明的扩增的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩 增的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受 者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗 或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明的通用型CAR-DNT细胞，通过例 如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点：

(1)本发明根据胃肠道肿瘤特异性高表达CLDN 18.2肿瘤抗原的特点，设计 靶向识别CLDN 18.2的特异性抗体，采用第二代或第三代CAR骨架作为载体， 设计靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体以及CAR-T细胞，可有效杀伤CLDN18.2阳 性的肿瘤细胞，能够用于肿瘤的靶向治疗。

(2)本发明的Claudin18.2 CAR-T细胞拥有比阳性对照CAR-T细胞更强的杀 伤和细胞因子释放功能，预示着CAR-T细胞在体内更有效的效果。

(3)本发明的Claudin 18.2 CAR-T细胞在整个体外培养过程中，持续保持着 很高比例的CAR阳性表达，表明CAR-T细胞在体外培养中能够保持着高比例增 长，同样预示着CAR-T细胞能够在体内有很好的疗效。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅以阐释 为目的而非限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、 变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法可采用本领域中的常规方法，例 如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York： Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。实施 例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。DNA、 蛋白的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

实施例1

含有靶向CLDN 18.2的scFv的嵌合抗原受体表达质粒的构建

通过人工合成SEQ ID NO.:13所示的长度为1461bp的DNA片段，其中，第 1-63位的核苷酸编码leader，第64-789位的核苷酸编码CLDN 18.2scFv(靶向癌 胚抗原的scFv)，第790-924位的核苷酸编码CD8铰链区，第925-996位的核苷酸 编码CD8跨膜区，第997-1122位的核苷酸编码4-1BB，第1123-1458位的核苷酸 编码CD3ζ。

将上述DNA片段插入慢病毒表达载体的EF1alpha启动子下游，得到靶向 CLDN18.2的嵌合抗原受体表达质粒(pLV-CLDN 18.2-scFv-BBz)。图3为插入 靶向CLDN 18.2的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体的限制性内切酶Xba I酶切电 泳鉴定图。

实施例2

靶向CLDN 18.2的嵌合抗原受体表达质粒转染T细胞

(1)慢病毒的包装制备

将嵌合抗原受体表达质粒和结构质粒、包膜质粒以3:2:1的比例用磷酸钙转 法转染293T/17细胞。转染12小时后，更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基，同 时加入终浓度为5mM的丁酸钠。转染48小时后，将含有病毒的细胞培养上清吸 入离心管中，4℃1500rpm离心10min，转移上清至新的离心管中，0.45μm滤器 过滤后-80℃保存。

(2)T细胞的制备

取10ml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(韵飞生物)分离外周血单核 细胞，具体方法见说明书。用含4％自体血清的T551培养基调整细胞密度至 2x10⁶/ml并加入终浓度为300U/ml的IL-2、100ng/ml的CD3单抗诱导培养24h，得 到T细胞。

(3)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养

用该慢病毒液以MOI 10加入含有2×10⁶个上述诱导培养的T细胞的6孔板的 1个孔中，在37℃，5％CO₂培养箱内共培养。三天之后，离心洗涤细胞，加入 新鲜的含有300IU/ml的IL-2、100ng/ml的CD3单抗和4％人自体血清的T551培养 基，并调整细胞密度至2x10⁶/ml继续培养。每2-3天检测一次细胞密度，离心并 用新鲜培养基调整细胞密度，持续扩大培养。如此反复，直至细胞扩增至足够 的用量。

检验嵌合抗原受体在T细胞中有效表达后，即获得针对CLDN18.2的CAR-T 细胞。

实施例3

CAR-T细胞对CLDN18.2阳性的恶性细胞的特异性杀伤活性

取5×10⁴个高表达CLDN18.2的K562细胞(CLDN18.2阳性，以 CLDN18.2-K562表示)和对照高表达CLDN18.1的K562细胞(CLDN18.2阴性，以 CLDN18.1-K562表示)接种于96孔板，分别向两种细胞培养孔中按效应细胞 (Effector)：靶细胞(Target)＝10:1、3:1、1:1三个比例加入CAR-T细胞 (CLDN18.2-CART)、CAR-T阳性对照细胞(CLDN18.2-CART阳性对照)和 未加修饰的T细胞(T)。孵育18h后，按照LDH细胞毒性分析试剂盒(碧云天)说明 书进行操作，检测CAR-T细胞对高表达CLDN18.2的K562细胞的特异杀伤活性。 结果显示CAR-T细胞组(组1)与CAR-T阳性对照细胞组(组2)和未加修饰的T细胞 组(组3)相比，对高表达CLDN18.2的K562细胞具有更强的杀伤作用，且这种差 异具有显著性(p<0.05)(图4)；对表达CLDN18.1的K562细胞的杀伤作用无显著性 差异(p>0.05)(图5)。

实施例4

ELISA检测IFN-γ,IL-2的表达。

取5×10⁴个高表达CLDN18.2的K562靶细胞(CLDN18.2阳性)和对照 CLDN18.1-K562靶细胞(CLDN18.2阴性)接种于96孔板，分别向两种细胞培养孔 中按效应细胞(Effector)：靶细胞(Target)＝3:1的比例加入CAR-T细胞 (CLDN18.2-CART)、CLDN18.2-CART阳性对照细胞(CLDN18.2-CART阳 性对照)和未加修饰的T细胞(T)等效应细胞。孵育18h后，按照Human IL-2ELISA Kit(达科为)说明书进行操作，取上清检测IL-2和IFN-γ含量。如图6和图7所示， 结果显示CAR-T细胞组与CAR-T阳性对照细胞组和T细胞组相比，在效靶比为 3:1的情况下，对高表达CLDN18.2的K562细胞产生大量的IL-2和IFN-γ，且这种 差异具有显著性(p<0.05)；高表达CLDN18.1的K562的细胞对细胞因子没有诱导 作用，而且无显著性差异(p>0.05)。因此CAR-T细胞对高表达CLDN18.2的肿瘤 细胞具有特异细胞因子诱导的作用。

实施例5

流式细胞术检测CAR-T细胞表面的CAR的表达

在慢病毒感染T细胞的第九天和第十六天，分别取3×10⁵Claudin18.2 CAR-T 细胞和阳性对照细胞，使用FITC-labeled goat anti-mouse-F(ab)2antibody在流式 细胞仪上检测CAR-T细胞表面的CAR的表达。

图8显示了病毒转染第九天的CAR-T细胞的流式细胞仪检测图(上方是 CLDN CAR-T细胞的阳性比例39.59％；下方是阳性对照的阳性比例35.92％)。 图9显示了病毒转染第十六天的CAR-T细胞的流式细胞仪检测图(上方是CLDN CAR-T细胞的阳性比例34.89％；下方是阳性对照的阳性比例44.66％)

结果显示CAR-T细胞始终维着恒定的高表达，表明CAR-T细胞始终维持着 恒定的高比例。

综上所述，本发明的靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体，能够有效并且特异性 地靶向表达CLDN 18.2表面抗原的恶性细胞，从而为治疗一些表达CLDN 18.2 表面抗原的肿瘤提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。

本发明涉及的序列信息如下表所示：

序列信息

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到 上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容 后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范 围应由所附的权利要求来限定。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海莱馥医疗科技有限公司

<120> 一种靶向表达Claudin 18.2细胞的嵌合抗原受体及其应用

<130> P2020-1998

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu

20 25 30

Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln

35 40 45

Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln

50 55 60

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr

65 70 75 80

Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr

85 90 95

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Gln Asn Asn Tyr Phe Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly

115 120 125

Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

145 150 155 160

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys

180 185 190

Ser Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Thr Asn

195 200 205

Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

210 215 220

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Val Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

260 265

<210> 2

<211> 135

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 3

<211> 45

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 6

<211> 154

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

35 40 45

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

50 55 60

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

65 70 75 80

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

85 90 95

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

100 105 110

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

115 120 125

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

130 135 140

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

145 150

<210> 7

<211> 123

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 8

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 9

<211> 126

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 10

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 11

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 13

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60

ccggacattg tgatgacaca gtctccatcc ttcctgactg tgacagcagg agagaaggtc 120

actttgaact gcaagtccag tcagagtctg ttaaacagtg gaaatcaaaa gagctacttg 180

acctggtacc aacagaaacc agggcagcct cctaaactgt tgatctactg ggcatccact 240

agggaatctg gggtccctga tcgcttcata ggcagtggat ctggaacaga tttcactctc 300

accatcagca gtgtgcaggc tgaagacctg gcagtttatt actgtcagaa taattatttt 360

tatccggtca cgttcggtgc tgggaccaag ctggagctga aaggtggagg aggcagcggc 420

ggtggagggt ctggtggagg tggttctgag gtccagctgc aacaatctgg acctgagctg 480

gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc tgtcaggctt ctggatacac gttcactgac 540

tactacatga actgggtgaa gcagagccat gtaaagagcc ttgagtggat tggacatatt 600

aatcctaaaa atggtggtac taactacaac cagaacttca aggacaaggc cacattgact 660

gtagacaagt cctccagtac agcctacatg gagctccgca gcctgacatc tgaggactct 720

gcagtctatt attgtgcaag aatctactat ggtaattcct ttgtttactg gggccaaggg 780

actctggtca ctgtctctgc aaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 1473

<210> 14

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu

20 25 30

Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln

35 40 45

Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln

50 55 60

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr

65 70 75 80

Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr

85 90 95

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Gln Asn Asn Tyr Phe Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly

115 120 125

Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

145 150 155 160

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys

180 185 190

Ser Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Thr Asn

195 200 205

Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

210 215 220

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Val Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 15

<211> 63

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60

ccg 63

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 17

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 17

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly His Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 18

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 19

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 20

His Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Thr Asn

1 5 10

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 21

Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Val Tyr

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 22

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 23

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 24

Gln Asn Asn Tyr Phe Tyr Pro Val Thr

1 5

Claims (10)

1.一种靶向表达Claudin 18.2的细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:14所示，并且所述嵌合抗原受体包含：靶向Claudin 18.2的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域，其中所述的靶向Claudin 18.2的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述单链抗体包含如SEQ ID NO.:17所示的抗体重链可变区和如SEQ ID NO.:18所示的抗体轻链可变区。

3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

如SEQ ID NO.:19所示的CDR1；

如SEQ ID NO.:20所示的CDR2；和

如SEQ ID NO.:21所示的CDR3。

4.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗体轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

如SEQ ID NO.:22所示的CDR1’；

如SEQ ID NO.:23所示的CDR2’；和

如SEQ ID NO.:24所示的CDR3’。

5.一种编码如权利要求1所述的嵌合抗原受体的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:13所示。

6.一种表达如权利要求1中所述的嵌合抗原受体的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体的启动子后连接有前导肽和编码所述的嵌合抗原受体的核酸片段。

7.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞含有如权利要求6所述的重组表达载体、或染色体中整合有如权利要求5所述的核酸分子、或表达如权利要求1所述的嵌合抗原受体。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求5所述的多核苷酸分子、如权利要求6所述的重组表达载体或如权利要求7所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

9.一种如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求5所述的多核苷酸分子、如权利要求6所述的重组表达载体、如权利要求7所述的工程化的免疫细胞或如权利要求8所述的药物组合物在预防和/或治疗含有表达Claudin 18.2的肿瘤细胞的癌症中的用途。

10.一种制备如权利要求7所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求5所述的多核苷酸分子或如权利要求6所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。

Images