CN108250303B - 单域抗体融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种单域抗体融合蛋白，包括与细胞因子融合的一个或多个单域抗体，尤其是与IL‑12或IL‑2融合的一个或多个抗PD‑1单域抗体。本发明还提供了该单域抗体融合蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明的融合蛋白将单域抗体的分子小、渗透性好、稳定性高等优点与细胞因子的免疫调节等活性结合，具有更佳的抗肿瘤效果。

Description

单域抗体融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，尤其是包括抗PD-1单域抗体和细胞因子的融合蛋白。

背景技术

哺乳动物细胞中，免疫系统要受到免疫检查点的调控。有两类免疫调控因子参与这个通路，包括共刺激信号和共抑制信号分子(1)。在健康的人体细胞中，免疫系统的 T细胞活性因为受到免疫检查点抑制因子的严密调节而被抑制，从而避免自身免疫和过度活跃的炎症应答的摧毁效应。但是，癌变的细胞也会利用这种抑制通路来躲避免疫识别和摧毁。为了能够利用免疫系统摧毁癌细胞，就需要消除这种免疫抑制效应，从而移除免疫检查点的抑制作用(2,3)。当前，能够特异性的结合抑制因子的单克隆抗体已经被用来重新激活受到抑制的T细胞，并且恢复它们的抗肿瘤活性。因此，这种治疗方案就发展成了最近的癌症免疫疗法。

有一大类免疫检查点的分子能够结合相应的受体蛋白，其中包括细胞毒性T淋巴细胞相关联抗原4(CTLA-4)分子、程序性死亡1(PD-1)分子、淋巴细胞活化基因 3(LAG-3)分子、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白3(TIM-3)、以及其它分子(4)。它们中的一些已经被用于开发治疗癌症的抗体。作为一种结合CTLA-4分子的全人免疫球蛋白G1单克隆抗体，Ipilimumab(商品名为Yervoy)抗体是第一款用于治疗转移性黑素瘤病人并显著提高其生存率的抗体治疗措施。尤其是最近，作为一种结合PD-1分子的人源化的IgG4单克隆抗体，pembrolizumab(商品名为Keytruda)抗体已经被加速通过审批用于治疗病人，包括不可切除的或转移性黑色素瘤病人或肺癌病人，或者经过 Ipilimumab疗程后BRAF V600突变指标是阳性的病人。此外，抗PD-1的另外一种 IgG4单克隆抗体nivolumab(商品名为Opdivo)最近也获得了FDA通过并用于免疫治疗。

目前上市的治疗性PD-1抗体，例如pembrolizumab和nivolumab都是IgG4单克隆抗体，与IgG1类抗体相比，具有非常有限的抗体依赖的细胞毒(ADCC)活性和补体依赖的细胞毒(CDC)活性(5)。既然以上两种PD-1单克隆抗体的活性都不依赖于调控IgG 受体功能的Fc区域，所以针对这类PD-1单克隆抗体的改造优化，其中一种方式就是设计没有Fc区域的抗体片段，比如单链抗体(scFv)或Fab片段等。即便如此，现有治疗性抗体依然存在分子量过大、稳定性差以及治疗量效果有限等问题。

发明内容

为了克服上述问题，在一方面，本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的单域抗体融合蛋白，其包括与细胞因子融合的一个或多个单域抗体。

在一个实施方案中，所述单域抗体为抗PD-1单域抗体。

在一个实施方案中，所述细胞因子选自IL-2、IL-12和GM-CSF。

在一个实施方案中，所述单域抗体和所述细胞因子之间通过接头序列连接。

在一个实施方案中，所述IL-12的两个亚基P35和P40通过接头序列连接形成IL-12单链蛋白而存在于所述单域抗体融合蛋白中。

在一个实施方案中，所述细胞因子为IL-12，所述抗PD-1单域抗体为两个，它们在所述单域抗体融合蛋白中位于IL-12的同侧或者分别位于IL-12的两侧。

在一个实施方案中，所述接头序列为(Gly4Ser)3。

在一个具体实施方案中，所述抗PD-1单域抗体具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，所述IL-12单链蛋白具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO：16或18所示的氨基酸序列或它们去掉末端his标签后的相应氨基酸序列。

在另一具体实施方案中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO：26或28所示的氨基酸序列或它们去掉末端his标签后的相应氨基酸序列。

另一方面，本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码任一种如上所述的单域抗体融合蛋白。

在具体实施方案中，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO：15、17、25或27所示的核苷酸序列或它们去掉末端his标签编码序列后的相应核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了表达载体，其包括任一种如上所述的多核苷酸。

另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包括所述表达载体。

另一方面，本发明提供了上述单域抗体融合蛋白、多核苷酸、表达载体、或宿主细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

在一个实施方案中，所述肿瘤为黑色素瘤或肺癌。

另一方面，本发明提供了抗肿瘤药物组合物，其包含任一种如上所述的单域抗体融合蛋白和药学上可接受的载体。

另一方面，本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本发明的单域抗体融合蛋白或者本发明的抗肿瘤药物组合物。

另一方面，本发明还提供了抗PD-1单域抗体本身，其具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

本发明的单域抗体融合蛋白将单域抗体的分子小、渗透性好、稳定性高等优点与细胞因子的免疫调节等活性结合，具有更佳的抗肿瘤效果。

附图简要说明

图1显示与对照IL-2相比，本发明SC205和SC206融合蛋白的IL-2活性。

图2显示与对照IL-12相比，本发明SC1208融合蛋白的IL-2活性。

图3显示与对照IL-12相比，本发明SC1206和SC1210融合蛋白的IL-12活性。

图4显示与对照IL-12相比，本发明SC1211和SC1212融合蛋白的IL-12活性。

图5显示与对照SC01相比，本发明SC205和SC1208融合蛋白以及Keytruda的 PD-1/PD-L1通路阻断活性。

图6显示与对照SC01相比，本发明SC206和SC1206融合蛋白的PD-1/PD-L1通路阻断活性。

图7显示与对照SC01相比，本发明SC1210、SC1211和SC1212融合蛋白的PD- 1/PD-L1通路阻断活性。

具体实施方式

除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。

本发明用于杀伤肿瘤细胞的融合蛋白的前面提到的和其它目的以及各种特点可以从下面的描述中进一步理解。

1.抗体和细胞因子：

抗体(antibody)是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，在过去的10多年里越来越多的单克隆抗体被广泛的应用到肿瘤治疗中。本发明中提到的抗体将包括但不限于：能够特异性的结合肿瘤相关抗原、通过抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)来诱导肿瘤细胞的免疫杀伤的免疫球蛋白。

单域抗体(sdAb或nanobody)是另一种形式的抗体片段，只含有一个单体形式的抗体可变区(6)。与完整的抗体一样，它也可以特异性的结合抗原，但是质量却比传统抗体小的多(大约15kDa)。更重要的是，正是得益于单域抗体的小尺寸，它能够更便利的穿透组织或者进入肿瘤内部，而这对于完整的抗体来说是很难做到的。

细胞因子(cytokine，CK)是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质。在生物体内通过与其特异的细胞表面受体结合，传递细胞内信号，从而改变细胞功能(7)，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种作用。白细胞介素(比如IL-2或IL-12) 作为其中的一组细胞因子，通过调控免疫系统来调节免疫应答。细胞因子不仅可以单独作用行使功能，也可以与抗体融合，形成抗体-细胞因子融合蛋白，也被称为免疫细胞因子(8)。这种新的蛋白形式将抗体特有的靶向性与细胞因子的免疫调节有机的结合了起来，从而增强了抗体的免疫治疗效果(9)。更重要的是，融合的细胞因子通过抗体的靶向性被运输并富集到肿瘤部位，从而有效的避免了单独使用高剂量的细胞因子引起的副作用(10-12)。因此，为了利用免疫细胞因子和单域抗体的优势来提高免疫治疗的效果，我们将细胞因子融合到PD-1单域抗体上，开发出了针对PD-1的单域抗体-细胞因子融合蛋白，并且通过体外和体内的分析评估融合蛋白的功能。

本发明中提到的细胞因子包括白细胞介素，例如白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素- 12(IL-12)，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等，其中白细胞介素-2和白细胞介素-12由于参与免疫调节，在癌症免疫治疗中具有十分积极的意义。

2.融合蛋白在CHO细胞的设计、构建、表达和纯化:

细胞因子IL-2或IL-12可通过接头序列(Gly4Ser)3连接到带有his-tag亲和标签(his 标签)的PD-1单域抗体的的N端或者C端，所形成的融合蛋白保持了抗体和细胞因子的双重效果。由于功能性的IL-12由P35和P40两个亚基构成，IL-12将以两个亚基的形式单独融合到抗体上，或者先将IL-12的两个亚基通过接头序列(Gly4Ser)3形成IL- 12单链蛋白，然后融合到抗体上。

通过以上方法构建的单域抗体-细胞因子融合蛋白将在CHO-3E7细胞里面表达，然后通过镍柱和分子筛纯化得到用于体内体外分析的融合蛋白。

3.抗体-细胞因子融合蛋白的体外实验：

3.1：细胞基础的靶点亲和力实验

抗体/细胞因子融合蛋白对PD-1受体的靶点亲和力实验在表达PD-1蛋白的细胞系中采用FACS方法来确定。

实验步骤：

1.首先培养表达PD-1蛋白的Jurkat细胞系，即Jurkat-PD1-5细胞系；

2.取1.0×106细胞，用PBS洗细胞3次；

3.加入100μl 10μg/ml的一抗(1μg)，轻轻混匀，4℃孵育2小时；

4.用PBS洗细胞3次，加入100μl荧光标记二抗(山羊抗人IgG(H+L)-FITC)，轻轻混匀，4℃孵育1小时；

5.用PBS洗细胞3次，加入200μl PBS，轻轻混匀；

6.进行BD FACSCalibur流式细胞仪的上机分析。

3.2：功能性测定

3.2.1：细胞增殖和γ-干扰素以及IL-2分泌实验

IL-2和IL-12可以促进人T细胞的增殖，也可以激活各种淋巴细胞，从而促进T 细胞增殖和γ-干扰素的分泌。通过检测T细胞增殖或者IFN-γ的分泌，就可以评估抗体-细胞因子融合蛋白的细胞因子活性。

本实验中，抗体-细胞因子融合蛋白的细胞因子活性将采用融合蛋白刺激NK92细胞释放γ-干扰素(IFN-γ)来验证融合蛋白中的细胞因子的体外生物活性。具体的做法是，由于本实验构建的融合蛋白中含有细胞因子，于是将不同的融合蛋白与NK92细胞一起孵育，然后检测γ-干扰素的释放。

3.2.2：PD-1抑制实验

概述：PD-1抑制实验(Promega)将按照标准步骤进行。下面是PD-1抑制实验的简要步骤。

实验步骤：

1.融化和接种PD-L1细胞在96孔板，37度孵育16小时；

2.准备等倍稀释的抗PD-1抗体对照和待测定抗体；

3.从二氧化碳培养箱中取出96孔培养板，吸取培养液，加入稀释好的抗体到PD-L1细胞孔中。

4.融化和加PD-1效应细胞到含有抗体的96孔板中，37度保温6小时。

5.荧光素酶法检测，准备Bio-GloTM检测试剂，加80μl到含抗体和细胞的96孔板里，室温5-30分钟，在GloMax系统检测冷光。

6.数据分析：计算诱导倍数＝RLU抗体稀释/RLU抗体阴性对照；以RLU和Log10 以及诱导倍数和Log10；通过GraphPad计算EC50。

采用SPSS软件分析。数据均以“均数±标准差”的形式表示。使用one-way ANOVA分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3.3实验结果及分析

3.3.1单域抗体-细胞因子融合蛋白的构建

本研究构建了不同的单域抗体-细胞因子融合蛋白，见表1。SC01为PD-1单域抗体，SC205和SC206分别将细胞因子IL-2融合到单域抗体的N端或C端，SC1206和 SC1208分别将细胞因子IL-12融合到单域抗体的N端或C端，SC1210是将细胞因子 IL-12的两个亚基分别连接到单域抗体的N端，SC1211是将两个单域抗体分别连接到细胞因子IL-12的两端，SC1212是将两个串联的单域抗体连接到细胞因子IL-12的C 端。这些融合蛋白通过(Gly4Ser)3接头序列(或缩写为G4S)连接起来，然后通过Gibson 组装插入到pTT5载体的多克隆位点上。同时在在融合蛋白基因前面还加入KOZAK序列GCCGCCACC和信号肽序列帮助把融合蛋白分泌到细胞外。各个融合蛋白组成的具体信息见表1：

表1：融合蛋白构成

将以上构建到pTT5表达载体上的融合蛋白质粒通过PEI转染试剂瞬转CHO-3E7 细胞，然后37度培养6天。通过离心收取培养液上清，首先通过Protein A亲和柱纯化融合蛋白，然后通过分子筛进一步纯化融合蛋白，最终纯度达到95％以上。

本研究中使用的信号肽DNA序列(SEQ ID NO：1)如下：

ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCTACCGGCGTGCA CTCT

本研究中使用的抗PD-1单域抗体SC01的DNA序列(SEQ ID NO：2)如下：

CAAGTTCAACTGGTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGCC TGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTGGTACCCTGGACTACTATGCGATCGGTTG GTTCCGTCAGGCGCCGGGCAAGGAGCGTGAGGCGGTGAGCTGCATTAGCAGCAG CGACGGTAGCACCTACTATGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAGCCGTGATAACAGCAAAAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGAC ACCGCGGTGTATCACTGCGCGACCGATCGTGCGTGCGGTAGCAGCTGGCTGGGCG CGGAGAGCTGGGCGCAAGGCACCCTGGTTACCGTGAGCAGC

SC01的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)如下：

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTLDYYAIGWFRQAPGKEREAVSCISSS DGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCATDRACGSSWLGAE SWAQGTLVTVSS

本研究中使用的G4S接头的DNA序列(SEQ ID NO：4)如下：

GGTGGAGGCGGTAGTGGCGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGCGGATCT

本研究中使用的细胞因子IL-12全长DNA序列(SEQ ID NO：5)如下： ATTTGGGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTCGAGCTGGACTGGTACCCTGATG CCCCAGGCGAGATGGTCGTGCTGACCTGCGATACACCAGAGGAAGATGGTATCA CCTGGACACTGGATCAGTCCTCAGAGGTGCTGGGCTCTGGTAAAACACTGACCAT TCAGGTGAAGGAGTTCGGTGACGCTGGACAGTACACTTGTCATAAGGGCGGGGA GGTGCTGTCTCACTCCCTGCTGCTGCTGCATAAGAAGGAGGATGGAATCTGGTCC ACTGACATCCTGAAAGACCAGAAGGAGCCAAAGAACAAAACCTTCCTGCGATGC GAGGCTAAGAACTACAGCGGCCGCTTTACATGCTGGTGGCTGACAACCATCAGCA CCGATCTGACCTTTAGCGTGAAGTCATCCAGGGGCAGTTCAGACCCTCAGGGAGT CACATGTGGCGCCGCAACCCTGTCAGCAGAGCGAGTGCGGGGAGACAATAAGGA ATACGAGTACAGCGTCGAGTGTCAGGAGGATTCCGCATGTCCAGCTGCAGAAGA ATCCCTGCCTATCGAAGTCATGGTGGACGCTGTGCATAAACTGAAGTACGAGAAT TACACCAGCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGATCCACCTAAGAATC TGCAGCTGAAGCCTCTGAAAAATAGCCGACAGGTCGAAGTGTCATGGGAATACC CAGACACCTGGTCAACACCACACTCCTACTTCTCCCTGACCTTCTGTGTGCAGGTC CAGGGAAAAAGCAAGCGGGAAAAGAAAGATCGGGTGTTCACCGACAAGACCAG TGCTACAGTGATTTGCCGGAAGAATGCCAGCATTTCTGTCAGAGCTCAGGACCGG TACTATAGCTCTTCCTGGAGCGAGTGGGCTTCAGTGCCATGTTCTGGaGGCGGtGG ATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGATCTAGAAACCTGCCCGTCGCAACCCCTGATCCAGGGATGTTCCCCTGTCTGCATCACAGCCAGAATCTGCTGAGGGCT GTCTCCAACATGCTGCAGAAGGCTCGACAGACCCTGGAGTTCTACCCATGTACCA GCGAAGAGATCGACCACGAGGATATCACAAAGGATAAAACCAGCACAGTGGAA GCATGCCTGCCTCTGGAACTGACCAAGAATGAGAGCTGCCTGAATAGCAGGGAG ACCTCCTTCATCACCAACGGCTCATGCCTGGCTTCAAGGAAGACCAGCTTCATGA TGGCTCTGTGTCTGAGCTCTATCTATGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAGTT CAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGATCCAAAGAGGCAGATCTTCCTGGA TCAGAATATGCTGGCAGTGATCGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTTAACAGT GAGACAGTGCCTCAGAAGAGCTCTCTGGAAGAGCCAGACTTTTACAAAACTAAG ATCAAGCTGTGCATTCTGCTGCACGCTTTCCGCATCAGAGCTGTCACTATCGATAG AGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCA

IL-12全长氨基酸序列(SEQ ID NO：6)如下：

IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTL TIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE AKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEY SVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKN SRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNAS ISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHH SQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLN SRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLD QNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS

本研究中使用的细胞因子人IL-12的亚基p35DNA序列(SEQ ID NO：7)如下：

AGAAACCTGCCCGTCGCAACCCCTGATCCAGGGATGTTCCCCTGTCTGCATC ACAGCCAGAATCTGCTGAGGGCTGTCTCCAACATGCTGCAGAAGGCTCGACAGA CCCTGGAGTTCTACCCATGTACCAGCGAAGAGATCGACCACGAGGATATCACAA AGGATAAAACCAGCACAGTGGAAGCATGCCTGCCTCTGGAACTGACCAAGAATG AGAGCTGCCTGAATAGCAGGGAGACCTCCTTCATCACCAACGGCTCATGCCTGGC TTCAAGGAAGACCAGCTTCATGATGGCTCTGTGTCTGAGCTCTATCTATGAGGAC CTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGAT CCAAAGAGGCAGATCTTCCTGGATCAGAATATGCTGGCAGTGATCGATGAGCTGA TGCAGGCCCTGAATTTTAACAGTGAGACAGTGCCTCAGAAGAGCTCTCTGGAAGA GCCAGACTTTTACAAAACTAAGATCAAGCTGTGCATTCTGCTGCACGCTTTCCGC ATCAGAGCTGTCACTATCGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCA

人IL-12的亚基p35的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)如下：

RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKD KTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQ VEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTK IKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS

本研究中使用的细胞因子人IL-12的亚基p40DNA序列(SEQ ID NO：9)如下：

ATTTGGGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTCGAGCTGGACTGGTACCCTG ATGCCCCAGGCGAGATGGTCGTGCTGACCTGCGATACACCAGAGGAAGATGGTA TCACCTGGACACTGGATCAGTCCTCAGAGGTGCTGGGCTCTGGTAAAACACTGAC CATTCAGGTGAAGGAGTTCGGTGACGCTGGACAGTACACTTGTCATAAGGGCGG GGAGGTGCTGTCTCACTCCCTGCTGCTGCTGCATAAGAAGGAGGATGGAATCTGG TCCACTGACATCCTGAAAGACCAGAAGGAGCCAAAGAACAAAACCTTCCTGCGA TGCGAGGCTAAGAACTACAGCGGCCGCTTTACATGCTGGTGGCTGACAACCATCA GCACCGATCTGACCTTTAGCGTGAAGTCATCCAGGGGCAGTTCAGACCCTCAGGG AGTCACATGTGGCGCCGCAACCCTGTCAGCAGAGCGAGTGCGGGGAGACAATAA GGAATACGAGTACAGCGTCGAGTGTCAGGAGGATTCCGCATGTCCAGCTGCAGA AGAATCCCTGCCTATCGAAGTCATGGTGGACGCTGTGCATAAACTGAAGTACGAG AATTACACCAGCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGATCCACCTAAGA ATCTGCAGCTGAAGCCTCTGAAAAATAGCCGACAGGTCGAAGTGTCATGGGAAT ACCCAGACACCTGGTCAACACCACACTCCTACTTCTCCCTGACCTTCTGTGTGCAG GTCCAGGGAAAAAGCAAGCGGGAAAAGAAAGATCGGGTGTTCACCGACAAGACCAGTGCTACAGTGATTTGCCGGAAGAATGCCAGCATTTCTGTCAGAGCTCAGGAC CGGTACTATAGCTCTTCCTGGAGCGAGTGGGCTTCAGTGCCATGTTCT

人IL-12亚基p40的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)如下：

IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTL TIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE AKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEY SVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKN SRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS

本研究中使用的细胞因子人IL-2的DNA序列(SEQ ID NO：11)如下：

GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTAC TGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACT CACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAA CATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGT AATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGAT GAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCA TCATCTCAACACTGACT

人IL-2的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)如下：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETAT IVEFLNRWITFCQSIISTLT

本研究中构建的SC205DNA序列(SEQ ID NO：13)如下：

GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTAC TGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACT CACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAA CATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGT AATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGAT GAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCA TCATCTCAACACTGACTGGTGGaGGCGGTAGTGGCGGAGGCGGTTCAGGCGGAGG CGGATCTCAAGTTCAACTGGTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGT AGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTGGTACCCTGGACTACTATGCGATCG GTTGGTTCCGTCAGGCGCCGGGCAAGGAGCGTGAGGCGGTGAGCTGCATTAGCA GCAGCGACGGTAGCACCTACTATGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAG CCGTGATAACAGCAAAAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGA AGACACCGCGGTGTATCACTGCGCGACCGATCGTGCGTGCGGTAGCAGCTGGCTG GGCGCGGAGAGCTGGGCGCAAGGCACCCTGGTTACCGTGAGCAGCCACCATCAC CATCACCAT

SC205氨基酸序列(SEQ ID NO：14)如下：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETAT IVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGGTLDYYAIGWFRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYHCATDRACGSSWLGAESWAQGTLVTVSSHHHHHH

本研究中构建的SC206的DNA序列(SEQ ID NO：15)如下：

CACCATCACCATCACCATCAAGTTCAACTGGTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGG TTCAGCCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTGGTACCCTGGA CTACTATGCGATCGGTTGGTTCCGTCAGGCGCCGGGCAAGGAGCGTGAGGCGGTG AGCTGCATTAGCAGCAGCGACGGTAGCACCTACTATGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAGCCGTGATAACAGCAAAAACACCCTGTACCTGCAAATGAACA GCCTGCGTGCGGAAGACACCGCGGTGTATCACTGCGCGACCGATCGTGCGTGCGG TAGCAGCTGGCTGGGCGCGGAGAGCTGGGCGCAAGGCACCCTGGTTACCGTGAG CAGCGGTGGaGGCGGTAGTGGCGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGCGGATCTGCACC TACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGAT TTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGA TGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCA GTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAG CAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTT CTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACA GCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTC AACACTGACT

SC206的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)如下：

HHHHHHQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTLDYYAIGWFRQAPGKEREA VSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCATDRACGS SWLGAESWAQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQM ILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHL RPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

本研究中构建的SC1206的DNA序列(SEQ ID NO：17)如下：

CACCATCACCATCACCATCAAGTTCAACTGGTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGG TTCAGCCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTGGTACCCTGGA CTACTATGCGATCGGTTGGTTCCGTCAGGCGCCGGGCAAGGAGCGTGAGGCGGTG AGCTGCATTAGCAGCAGCGACGGTAGCACCTACTATGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAGCCGTGATAACAGCAAAAACACCCTGTACCTGCAAATGAACA GCCTGCGTGCGGAAGACACCGCGGTGTATCACTGCGCGACCGATCGTGCGTGCGG TAGCAGCTGGCTGGGCGCGGAGAGCTGGGCGCAAGGCACCCTGGTTACCGTGAG CAGCGGTGGaGGCGGTAGTGGCGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGCGGATCTATTTG GGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTCGAGCTGGACTGGTACCCTGATGCCCC AGGCGAGATGGTCGTGCTGACCTGCGATACACCAGAGGAAGATGGTATCACCTG GACACTGGATCAGTCCTCAGAGGTGCTGGGCTCTGGTAAAACACTGACCATTCAG GTGAAGGAGTTCGGTGACGCTGGACAGTACACTTGTCATAAGGGCGGGGAGGTG CTGTCTCACTCCCTGCTGCTGCTGCATAAGAAGGAGGATGGAATCTGGTCCACTG ACATCCTGAAAGACCAGAAGGAGCCAAAGAACAAAACCTTCCTGCGATGCGAGG CTAAGAACTACAGCGGCCGCTTTACATGCTGGTGGCTGACAACCATCAGCACCGATCTGACCTTTAGCGTGAAGTCATCCAGGGGCAGTTCAGACCCTCAGGGAGTCACA TGTGGCGCCGCAACCCTGTCAGCAGAGCGAGTGCGGGGAGACAATAAGGAATAC GAGTACAGCGTCGAGTGTCAGGAGGATTCCGCATGTCCAGCTGCAGAAGAATCC CTGCCTATCGAAGTCATGGTGGACGCTGTGCATAAACTGAAGTACGAGAATTACA CCAGCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGATCCACCTAAGAATCTGCA GCTGAAGCCTCTGAAAAATAGCCGACAGGTCGAAGTGTCATGGGAATACCCAGA CACCTGGTCAACACCACACTCCTACTTCTCCCTGACCTTCTGTGTGCAGGTCCAGG GAAAAAGCAAGCGGGAAAAGAAAGATCGGGTGTTCACCGACAAGACCAGTGCTA CAGTGATTTGCCGGAAGAATGCCAGCATTTCTGTCAGAGCTCAGGACCGGTACTA TAGCTCTTCCTGGAGCGAGTGGGCTTCAGTGCCATGTTCTGGaGGCGGtGGATCTG GCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGATCTAGAAACCTGCCCGTCGCAACCCCTG ATCCAGGGATGTTCCCCTGTCTGCATCACAGCCAGAATCTGCTGAGGGCTGTCTC CAACATGCTGCAGAAGGCTCGACAGACCCTGGAGTTCTACCCATGTACCAGCGAA GAGATCGACCACGAGGATATCACAAAGGATAAAACCAGCACAGTGGAAGCATGC CTGCCTCTGGAACTGACCAAGAATGAGAGCTGCCTGAATAGCAGGGAGACCTCCTTCATCACCAACGGCTCATGCCTGGCTTCAAGGAAGACCAGCTTCATGATGGCTCT GTGTCTGAGCTCTATCTATGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACC ATGAACGCCAAGCTGCTGATGGATCCAAAGAGGCAGATCTTCCTGGATCAGAAT ATGCTGGCAGTGATCGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTTAACAGTGAGACAG TGCCTCAGAAGAGCTCTCTGGAAGAGCCAGACTTTTACAAAACTAAGATCAAGCT GTGCATTCTGCTGCACGCTTTCCGCATCAGAGCTGTCACTATCGATAGAGTGATG AGCTATCTGAATGCCTCA

SC1206的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)如下：

HHHHHHQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTLDYYAIGWFRQAPGKEREA VSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCATDRACGS SWLGAESWAQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGE MVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSL LLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSS RGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVH KLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCV QVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGG GSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTS EEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLS SIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKS SLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS

本研究中构建的SC1208的DNA序列(SEQ ID NO：19)如下：

ATTTGGGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTCGAGCTGGACTGGTACCCTG ATGCCCCAGGCGAGATGGTCGTGCTGACCTGCGATACACCAGAGGAAGATGGTA TCACCTGGACACTGGATCAGTCCTCAGAGGTGCTGGGCTCTGGTAAAACACTGAC CATTCAGGTGAAGGAGTTCGGTGACGCTGGACAGTACACTTGTCATAAGGGCGG GGAGGTGCTGTCTCACTCCCTGCTGCTGCTGCATAAGAAGGAGGATGGAATCTGG TCCACTGACATCCTGAAAGACCAGAAGGAGCCAAAGAACAAAACCTTCCTGCGA TGCGAGGCTAAGAACTACAGCGGCCGCTTTACATGCTGGTGGCTGACAACCATCA GCACCGATCTGACCTTTAGCGTGAAGTCATCCAGGGGCAGTTCAGACCCTCAGGG AGTCACATGTGGCGCCGCAACCCTGTCAGCAGAGCGAGTGCGGGGAGACAATAA GGAATACGAGTACAGCGTCGAGTGTCAGGAGGATTCCGCATGTCCAGCTGCAGA AGAATCCCTGCCTATCGAAGTCATGGTGGACGCTGTGCATAAACTGAAGTACGAG AATTACACCAGCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGATCCACCTAAGA ATCTGCAGCTGAAGCCTCTGAAAAATAGCCGACAGGTCGAAGTGTCATGGGAAT ACCCAGACACCTGGTCAACACCACACTCCTACTTCTCCCTGACCTTCTGTGTGCAG GTCCAGGGAAAAAGCAAGCGGGAAAAGAAAGATCGGGTGTTCACCGACAAGACCAGTGCTACAGTGATTTGCCGGAAGAATGCCAGCATTTCTGTCAGAGCTCAGGAC CGGTACTATAGCTCTTCCTGGAGCGAGTGGGCTTCAGTGCCATGTTCTGGaGGCGG tGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGATCTAGAAACCTGCCCGTCGCA ACCCCTGATCCAGGGATGTTCCCCTGTCTGCATCACAGCCAGAATCTGCTGAGGG CTGTCTCCAACATGCTGCAGAAGGCTCGACAGACCCTGGAGTTCTACCCATGTAC CAGCGAAGAGATCGACCACGAGGATATCACAAAGGATAAAACCAGCACAGTGGA AGCATGCCTGCCTCTGGAACTGACCAAGAATGAGAGCTGCCTGAATAGCAGGGA GACCTCCTTCATCACCAACGGCTCATGCCTGGCTTCAAGGAAGACCAGCTTCATG ATGGCTCTGTGTCTGAGCTCTATCTATGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAGT TCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGATCCAAAGAGGCAGATCTTCCTGG ATCAGAATATGCTGGCAGTGATCGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTTAACAG TGAGACAGTGCCTCAGAAGAGCTCTCTGGAAGAGCCAGACTTTTACAAAACTAA GATCAAGCTGTGCATTCTGCTGCACGCTTTCCGCATCAGAGCTGTCACTATCGATA GAGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCAGGTGGaGGCGGTAGTGGCGGAGGCGGTTC AGGCGGAGGCGGATCTCAAGTTCAACTGGTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTGGTACCCTGGACTAC TATGCGATCGGTTGGTTCCGTCAGGCGCCGGGCAAGGAGCGTGAGGCGGTGAGC TGCATTAGCAGCAGCGACGGTAGCACCTACTATGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTT TTACCATCAGCCGTGATAACAGCAAAAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGCCT GCGTGCGGAAGACACCGCGGTGTATCACTGCGCGACCGATCGTGCGTGCGGTAG CAGCTGGCTGGGCGCGGAGAGCTGGGCGCAAGGCACCCTGGTTACCGTGAGCAG CCACCATCACCATCACCAT

SC1208的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)如下:

IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTL TIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE AKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEY SVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKN SRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNAS ISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHH SQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLN SRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLD QNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMS YLNASGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTLDYYAIGW FRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YHCATDRACGSSWLGAESWAQGTLVTVSSHHHHHH

本研究中构建的SC1210的表达P35-sdAb融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO：21) 如下：

AGAAACCTGCCCGTCGCAACCCCTGATCCAGGGATGTTCCCCTGTCTGCATC ACAGCCAGAATCTGCTGAGGGCTGTCTCCAACATGCTGCAGAAGGCTCGACAGA CCCTGGAGTTCTACCCATGTACCAGCGAAGAGATCGACCACGAGGATATCACAA AGGATAAAACCAGCACAGTGGAAGCATGCCTGCCTCTGGAACTGACCAAGAATG AGAGCTGCCTGAATAGCAGGGAGACCTCCTTCATCACCAACGGCTCATGCCTGGC TTCAAGGAAGACCAGCTTCATGATGGCTCTGTGTCTGAGCTCTATCTATGAGGAC CTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGAT CCAAAGAGGCAGATCTTCCTGGATCAGAATATGCTGGCAGTGATCGATGAGCTGA TGCAGGCCCTGAATTTTAACAGTGAGACAGTGCCTCAGAAGAGCTCTCTGGAAGA GCCAGACTTTTACAAAACTAAGATCAAGCTGTGCATTCTGCTGCACGCTTTCCGC ATCAGAGCTGTCACTATCGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCAGGTGGaG GCGGTAGTGGCGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGCGGATCTCAAGTTCAACTGGTGG AAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGC GAGCGGTGGTACCCTGGACTACTATGCGATCGGTTGGTTCCGTCAGGCGCCGGGC AAGGAGCGTGAGGCGGTGAGCTGCATTAGCAGCAGCGACGGTAGCACCTACTAT GCGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAGCCGTGATAACAGCAAAAACACCC TGTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGACACCGCGGTGTATCACTGCGC GACCGATCGTGCGTGCGGTAGCAGCTGGCTGGGCGCGGAGAGCTGGGCGCAAGG CACCCTGGTTACCGTGAGCAGCCACCATCACCATCACCAT

SC1210的表达P35-sdAb融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)如下：

RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKD KTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQ VEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTK IKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPG GSLRLSCAASGGTLDYYAIGWFRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCATDRACGSSWLGAESWAQGTLVTVSSHHHHHH 本研究中构建的SC1210的表达P40-sdAb融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO：23) 如下：

ATTTGGGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTCGAGCTGGACTGGTACCCTG ATGCCCCAGGCGAGATGGTCGTGCTGACCTGCGATACACCAGAGGAAGATGGTA TCACCTGGACACTGGATCAGTCCTCAGAGGTGCTGGGCTCTGGTAAAACACTGAC CATTCAGGTGAAGGAGTTCGGTGACGCTGGACAGTACACTTGTCATAAGGGCGG GGAGGTGCTGTCTCACTCCCTGCTGCTGCTGCATAAGAAGGAGGATGGAATCTGG TCCACTGACATCCTGAAAGACCAGAAGGAGCCAAAGAACAAAACCTTCCTGCGA TGCGAGGCTAAGAACTACAGCGGCCGCTTTACATGCTGGTGGCTGACAACCATCA GCACCGATCTGACCTTTAGCGTGAAGTCATCCAGGGGCAGTTCAGACCCTCAGGG AGTCACATGTGGCGCCGCAACCCTGTCAGCAGAGCGAGTGCGGGGAGACAATAA GGAATACGAGTACAGCGTCGAGTGTCAGGAGGATTCCGCATGTCCAGCTGCAGA AGAATCCCTGCCTATCGAAGTCATGGTGGACGCTGTGCATAAACTGAAGTACGAG AATTACACCAGCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGATCCACCTAAGA ATCTGCAGCTGAAGCCTCTGAAAAATAGCCGACAGGTCGAAGTGTCATGGGAAT ACCCAGACACCTGGTCAACACCACACTCCTACTTCTCCCTGACCTTCTGTGTGCAG GTCCAGGGAAAAAGCAAGCGGGAAAAGAAAGATCGGGTGTTCACCGACAAGACCAGTGCTACAGTGATTTGCCGGAAGAATGCCAGCATTTCTGTCAGAGCTCAGGAC CGGTACTATAGCTCTTCCTGGAGCGAGTGGGCTTCAGTGCCATGTTCTGGTGGaGG CGGTAGTGGCGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGCGGATCTCAAGTTCAACTGGTGGA AAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCG AGCGGTGGTACCCTGGACTACTATGCGATCGGTTGGTTCCGTCAGGCGCCGGGCA AGGAGCGTGAGGCGGTGAGCTGCATTAGCAGCAGCGACGGTAGCACCTACTATG CGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAGCCGTGATAACAGCAAAAACACCCT GTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGACACCGCGGTGTATCACTGCGC GACCGATCGTGCGTGCGGTAGCAGCTGGCTGGGCGCGGAGAGCTGGGCGCAAGG CACCCTGGTTACCGTGAGCAGC

SC1210的表达P40-sdAb融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)如下：

IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTL TIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE AKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEY SVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKN SRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNAS ISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSL RLSCAASGGTLDYYAIGWFRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYHCATDRACGSSWLGAESWAQGTLVTVSS

本研究中构建的SC1211的DNA序列(SEQ ID NO：25)如下：

CAAGTTCAACTGGTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGCC TGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTGGTACCCTGGACTACTATGCGATCGGTTG GTTCCGTCAGGCGCCGGGCAAGGAGCGTGAGGCGGTGAGCTGCATTAGCAGCAG CGACGGTAGCACCTACTATGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAGCCGTGATAACAGCAAAAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGAC ACCGCGGTGTATCACTGCGCGACCGATCGTGCGTGCGGTAGCAGCTGGCTGGGCG CGGAGAGCTGGGCGCAAGGCACCCTGGTTACCGTGAGCAGCGGTGGaGGCGGTA GTGGCGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGCGGATCTATTTGGGAGCTGAAGAAAGACG TGTACGTGGTCGAGCTGGACTGGTACCCTGATGCCCCAGGCGAGATGGTCGTGCT GACCTGCGATACACCAGAGGAAGATGGTATCACCTGGACACTGGATCAGTCCTCA GAGGTGCTGGGCTCTGGTAAAACACTGACCATTCAGGTGAAGGAGTTCGGTGAC GCTGGACAGTACACTTGTCATAAGGGCGGGGAGGTGCTGTCTCACTCCCTGCTGC TGCTGCATAAGAAGGAGGATGGAATCTGGTCCACTGACATCCTGAAAGACCAGA AGGAGCCAAAGAACAAAACCTTCCTGCGATGCGAGGCTAAGAACTACAGCGGCC GCTTTACATGCTGGTGGCTGACAACCATCAGCACCGATCTGACCTTTAGCGTGAAGTCATCCAGGGGCAGTTCAGACCCTCAGGGAGTCACATGTGGCGCCGCAACCCTG TCAGCAGAGCGAGTGCGGGGAGACAATAAGGAATACGAGTACAGCGTCGAGTGT CAGGAGGATTCCGCATGTCCAGCTGCAGAAGAATCCCTGCCTATCGAAGTCATGG TGGACGCTGTGCATAAACTGAAGTACGAGAATTACACCAGCAGCTTTTTCATCCG GGACATCATCAAGCCCGATCCACCTAAGAATCTGCAGCTGAAGCCTCTGAAAAAT AGCCGACAGGTCGAAGTGTCATGGGAATACCCAGACACCTGGTCAACACCACAC TCCTACTTCTCCCTGACCTTCTGTGTGCAGGTCCAGGGAAAAAGCAAGCGGGAAA AGAAAGATCGGGTGTTCACCGACAAGACCAGTGCTACAGTGATTTGCCGGAAGA ATGCCAGCATTTCTGTCAGAGCTCAGGACCGGTACTATAGCTCTTCCTGGAGCGA GTGGGCTTCAGTGCCATGTTCTGGaGGCGGtGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGA GGCGGTGGATCTAGAAACCTGCCCGTCGCAACCCCTGATCCAGGGATGTTCCCCT GTCTGCATCACAGCCAGAATCTGCTGAGGGCTGTCTCCAACATGCTGCAGAAGGC TCGACAGACCCTGGAGTTCTACCCATGTACCAGCGAAGAGATCGACCACGAGGA TATCACAAAGGATAAAACCAGCACAGTGGAAGCATGCCTGCCTCTGGAACTGAC CAAGAATGAGAGCTGCCTGAATAGCAGGGAGACCTCCTTCATCACCAACGGCTC ATGCCTGGCTTCAAGGAAGACCAGCTTCATGATGGCTCTGTGTCTGAGCTCTATCT ATGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGC TGATGGATCCAAAGAGGCAGATCTTCCTGGATCAGAATATGCTGGCAGTGATCGA TGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTTAACAGTGAGACAGTGCCTCAGAAGAGCTCT CTGGAAGAGCCAGACTTTTACAAAACTAAGATCAAGCTGTGCATTCTGCTGCACG CTTTCCGCATCAGAGCTGTCACTATCGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCCTC AGGTGGaGGCGGTAGTGGCGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGCGGATCTCAAGTTCA ACTGGTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGC TGCGCGGCGAGCGGTGGTACCCTGGACTACTATGCGATCGGTTGGTTCCGTCAGG CGCCGGGCAAGGAGCGTGAGGCGGTGAGCTGCATTAGCAGCAGCGACGGTAGCA CCTACTATGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAGCCGTGATAACAGCAA AAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGACACCGCGGTGTA TCACTGCGCGACCGATCGTGCGTGCGGTAGCAGCTGGCTGGGCGCGGAGAGCTG GGCGCAAGGCACCCTGGTTACCGTGAGCAGCCACCATCACCATCACCAT

SC1211的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)如下：

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTLDYYAIGWFRQAPGKEREAVSCISSS DGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCATDRACGSSWLGAE SWAQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTC DTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKK EDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDP QGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYE NYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGK SKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGG SGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDI TKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKM YQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYK TKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGGTLDYYAIGWFRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCATDRACGSSWLGAESWAQGTLVTVSSHHHH HH

本研究中构建的SC1212的DNA序列(SEQ ID NO：27)如下：

ATTTGGGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTCGAGCTGGACTGGTACCCTG ATGCCCCAGGCGAGATGGTCGTGCTGACCTGCGATACACCAGAGGAAGATGGTA TCACCTGGACACTGGATCAGTCCTCAGAGGTGCTGGGCTCTGGTAAAACACTGAC CATTCAGGTGAAGGAGTTCGGTGACGCTGGACAGTACACTTGTCATAAGGGCGG GGAGGTGCTGTCTCACTCCCTGCTGCTGCTGCATAAGAAGGAGGATGGAATCTGG TCCACTGACATCCTGAAAGACCAGAAGGAGCCAAAGAACAAAACCTTCCTGCGA TGCGAGGCTAAGAACTACAGCGGCCGCTTTACATGCTGGTGGCTGACAACCATCA GCACCGATCTGACCTTTAGCGTGAAGTCATCCAGGGGCAGTTCAGACCCTCAGGG AGTCACATGTGGCGCCGCAACCCTGTCAGCAGAGCGAGTGCGGGGAGACAATAA GGAATACGAGTACAGCGTCGAGTGTCAGGAGGATTCCGCATGTCCAGCTGCAGA AGAATCCCTGCCTATCGAAGTCATGGTGGACGCTGTGCATAAACTGAAGTACGAG AATTACACCAGCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGATCCACCTAAGA ATCTGCAGCTGAAGCCTCTGAAAAATAGCCGACAGGTCGAAGTGTCATGGGAAT ACCCAGACACCTGGTCAACACCACACTCCTACTTCTCCCTGACCTTCTGTGTGCAG GTCCAGGGAAAAAGCAAGCGGGAAAAGAAAGATCGGGTGTTCACCGACAAGACCAGTGCTACAGTGATTTGCCGGAAGAATGCCAGCATTTCTGTCAGAGCTCAGGAC CGGTACTATAGCTCTTCCTGGAGCGAGTGGGCTTCAGTGCCATGTTCTGGaGGCGG tGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGATCTAGAAACCTGCCCGTCGCA ACCCCTGATCCAGGGATGTTCCCCTGTCTGCATCACAGCCAGAATCTGCTGAGGG CTGTCTCCAACATGCTGCAGAAGGCTCGACAGACCCTGGAGTTCTACCCATGTAC CAGCGAAGAGATCGACCACGAGGATATCACAAAGGATAAAACCAGCACAGTGGA AGCATGCCTGCCTCTGGAACTGACCAAGAATGAGAGCTGCCTGAATAGCAGGGA GACCTCCTTCATCACCAACGGCTCATGCCTGGCTTCAAGGAAGACCAGCTTCATG ATGGCTCTGTGTCTGAGCTCTATCTATGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAGT TCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGATCCAAAGAGGCAGATCTTCCTGG ATCAGAATATGCTGGCAGTGATCGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTTAACAG TGAGACAGTGCCTCAGAAGAGCTCTCTGGAAGAGCCAGACTTTTACAAAACTAA GATCAAGCTGTGCATTCTGCTGCACGCTTTCCGCATCAGAGCTGTCACTATCGATA GAGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCAGGTGGaGGCGGTAGTGGCGGAGGCGGTTC AGGCGGAGGCGGATCTCAAGTTCAACTGGTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTGGTACCCTGGACTAC TATGCGATCGGTTGGTTCCGTCAGGCGCCGGGCAAGGAGCGTGAGGCGGTGAGC TGCATTAGCAGCAGCGACGGTAGCACCTACTATGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTT TTACCATCAGCCGTGATAACAGCAAAAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGCCT GCGTGCGGAAGACACCGCGGTGTATCACTGCGCGACCGATCGTGCGTGCGGTAG CAGCTGGCTGGGCGCGGAGAGCTGGGCGCAAGGCACCCTGGTTACCGTGAGCAG CGGTGGaGGCGGTAGTGGCGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGCGGATCTCAAGTTCA ACTGGTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGC TGCGCGGCGAGCGGTGGTACCCTGGACTACTATGCGATCGGTTGGTTCCGTCAGG CGCCGGGCAAGGAGCGTGAGGCGGTGAGCTGCATTAGCAGCAGCGACGGTAGCA CCTACTATGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAGCCGTGATAACAGCAA AAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGACACCGCGGTGTA TCACTGCGCGACCGATCGTGCGTGCGGTAGCAGCTGGCTGGGCGCGGAGAGCTG GGCGCAAGGCACCCTGGTTACCGTGAGCAGCCACCATCACCATCACCAT

SC1212的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)如下：

IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTL TIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE AKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEY SVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKN SRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNAS ISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHH SQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLN SRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLD QNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMS YLNASGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTLDYYAIGW FRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YHCATDRACGSSWLGAESWAQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGL VQPGGSLRLSCAASGGTLDYYAIGWFRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCATDRACGSSWLGAESWAQGTLVTVSSHH HHHH

3.3.2.融合蛋白的亲和力分析

将单域抗体与细胞因子进行融合后，抗体的亲和力是否会受到影响？本研究基于细胞水平分析融合蛋白与单域抗体对应的PD-1抗原之间的亲和力，这样更能反映接近于生理条件下的亲和力。

FACS分析结果显示，与游离的单域抗体SC01相比，细胞因子与一个单域抗体融合后，会在一定程度上降低单域抗体与PD-1抗原结合的亲和力。而且，细胞因子融合到单域抗体的N端(SC205和SC1208)比融合到C端(SC206和SC1206)对降低单域抗体的亲和力更明显。这种位置效应可能与细胞因子融合到单域抗体的N端后造成的空间位阻有关。

当一个细胞因子IL-12与两个单域抗体融合后，融合蛋白的亲和力都与SC01相当或者更高。拿SC1212举例说明，尽管IL-12融合到了两个串联的PD-1单域抗体的N 端，但是融合蛋白的亲和力仍然高于SC01，当然也高于SC1208。可能串联的单域抗体在一定程度上弥补了抗体N端融合带来的空间位阻的影响。

3.3.3γ-干扰素释放实验结果分析

本实验采用细胞因子刺激NK92细胞释放γ-干扰素(IFN-γ)来验证融合蛋白中的细胞因子的体外生物活性。具体的做法是，由于本实验构建的融合蛋白中含有细胞因子，于是将不同的融合蛋白与NK92细胞一起孵育，然后检测γ-干扰素的释放。与游离的细胞因子IL-12或IL-2活性相比，本实验构建的绝大部分融合蛋白的细胞因子活性相当，甚至更强(参见图1至4)。这说明抗PD-1抗体的融合基本不会降低细胞因子的活性，甚至在一定程度上可以促进细胞因子的活性。但是，其中一个融合蛋白SC- 1210，是将IL-12的两个亚基p35和p40分开与PD-1抗体融合表达，然后形成IL-12 二聚体蛋白，其活性则受到严重影响(图3)，可能的原因是PD-1抗体的融合位点阻碍了IL-12二聚体发挥功能。

3.3.4.PD-1抑制实验结果分析

PD-1/PD-L1通路阻断的生物测定是一种基于生物学上相关的作用机制的检测分析，能用于测量那些能阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗体和其他生物制剂的效力和稳定性。这个检测系统包括以下两个基因编辑的细胞系：能稳定的表达人源PD-1的细胞和稳定的表达人源PD-L1蛋白的细胞。

当这两种细胞共培养时，PD-1/PD-L1相互作用会抑制T细胞受体(TCR)信号途径以及NFAT调控的荧光素酶活性。当加入相应的PD-1或PD-L1抗体阻断PD-1/PD- L1相互作用，就会解除抑制信号，从而激活T细胞受体(TCR)信号途径和NFAT诱导的荧光素酶活性。

本实验中将带有PD-1单域抗体的各种融合蛋白与细胞孵育，从而检测融合蛋白的抗体活性。结果显示，与游离的单域抗体SC01相比，当细胞因子融合到单域抗体的N 端产生融合蛋白SC205和SC1208时，PD-1抗体活性大大降低到检测不到活性(图5)。可能的原因是单域抗体的N端融合细胞因子后，会阻碍抗体-抗原相互作用，从而降低抗体活性。之前FACS分析抗体-抗原亲和力也显示了类似的结果。与之相对的，当细胞因子融合到单域抗体的C端产生融合蛋白SC206和SC1206时，PD-1抗体活性有所增强(图6)，虽然与游离的单域抗体SC01相比还有一定差距。

当一个细胞因子IL-12与两个单域抗体融合后，产生融合蛋白SC1210、SC1211和SC1212。PD-1抑制实验结果显示，这一类融合蛋白的抗体活性在SC206和SC1206的基础上又有了一定程度的提高(图7)。更出乎意料的是，对SC1212融合蛋白来说，尽管IL-12融合到了两个串联的PD-1单域抗体的N端，但是融合蛋白的抗体活性远远高于SC1208(图7)。可能串联的单域抗体在一定程度上弥补了抗体N端融合带来的空间位阻的影响，从而提高了抗体活性。

从上述实验结果可知，本发明提供的抗PD-1单域抗体融合蛋白可同时具有抗PD-1单域抗体的抗体活性和细胞因子免疫调节活性。

为了方便蛋白纯化，以上的融合蛋白在氨基或羧基末端带有his标签。实验显示，这些his标签是否存在，对融合蛋白的功能试验结果无明显影响(数据未示出)。

相应地，本发明提供了治疗肿瘤(例如黑色素瘤或肺癌)的药物组合物。该药物组合物可以包括本发明提供的单域抗体融合蛋白和药学上可接受的载体。这里使用的术语“药学上可接受的载体”是指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质。依照给药途径，可以施用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水、和/或无热原水等。本发明所提供的药物组合物可以制成粉末、注射剂等临床可接受的剂型。可以使用任何适当的途径给受试者施用本发明的药物组合物，例如可通过口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下，或经吸入、透皮等途径给药。本发明还提供了治疗肿瘤的方法，包括给予受试者治疗有效量的所述单域抗体融合蛋白或包含所述单域抗体融合蛋白的药物组合物。这里使用的术语“治疗有效量”指的是足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。本发明单域抗体融合蛋白的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg 至100mg活性成分。

本发明还提供了编码本发明的单域抗体融合蛋白的分离的多核苷酸。这里使用的术语“分离的多核苷酸”指非自然界中天然存在状态的多核苷酸，包括通过生物学技术从自然界(包括生物体内)分离出的多核苷酸，也包括人工合成的多核苷酸。分离的多核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、mRNA或合成的其它RNA，或者它们的组合。本文提供了多个用于编码本发明的单域抗体融合蛋白以及其它氨基酸序列的核苷酸序列，需要指出的是，本领域技术人员可以根据本文所提供的相应氨基酸序列，基于密码子简并性，设计出与以上提供的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列，但都编码相同的氨基酸序列。这些经改动的核苷酸序列也包括在本发明的范围内。

当涉及多核苷酸时，本文所用的术语“载体”指用于将核苷酸编码信息转移到宿主细胞内的任一种分子(例如，核酸、质粒、或病毒等)。术语“表达载体”指适于在宿主细胞内表达目的基因(待表达核苷酸序列)的载体，通常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。

本文所用的术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同，只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等，例如CHO-3E7细胞。

本发明所属领域技术员应理解，以上描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。

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Claims (5)

1.一种单域抗体融合蛋白，包括与细胞因子融合的一个或多个单域抗体，其中所述单域抗体融合蛋白具有如SEQ ID NO：16、18、26或28所示的氨基酸序列或它们去掉末端his标签后的相应氨基酸序列。

2.分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的单域抗体融合蛋白。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其具有如SEQ ID NO：15、17、25或27所示的核苷酸序列，或者它们去掉末端his标签编码序列后的相应核苷酸序列。

4.权利要求1所述的单域抗体融合蛋白、权利要求2或3所述的多核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.一种抗PD-1单域抗体，其具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

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