CN109503718B - 包含免疫检查点抑制剂的融合物及其制备方法和应用 - Google Patents

包含免疫检查点抑制剂的融合物及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109503718B
CN109503718B CN201811348564.9A CN201811348564A CN109503718B CN 109503718 B CN109503718 B CN 109503718B CN 201811348564 A CN201811348564 A CN 201811348564A CN 109503718 B CN109503718 B CN 109503718B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
cancer
gly
leu
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811348564.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109503718A (zh
Inventor
魏辉
韩化敏
张叔人
高荣凯
魏晓莉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biocells Beijing Biotech Co Ltd
Original Assignee
Biocells Beijing Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biocells Beijing Biotech Co Ltd filed Critical Biocells Beijing Biotech Co Ltd
Publication of CN109503718A publication Critical patent/CN109503718A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109503718B publication Critical patent/CN109503718B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本申请提供了包含免疫检查点抑制剂和细胞因子的融合物、编码该融合物的核酸分子、相应的表达载体、宿主细胞以及包含制备该融合物的方法。此外，本申请还提供了检测该融合物的活性的方法以及使用该融合物治疗疾病、改善或缓解不适的方法。

Description

包含免疫检查点抑制剂的融合物及其制备方法和应用
技术领域
本申请属于免疫治疗领域，涉及癌症的免疫治疗药物，具体涉及一种用于免疫治疗的免疫检查点和细胞因子的融合结构。
背景技术
近年来，癌症免疫治疗产品和技术的临床应用取得了显著进展，已经成为继手术、放疗、化疗、靶向治疗后的另一有效的癌症治疗手段。
在癌症免疫治疗领域中，细胞因子是重要的免疫治疗产品。细胞因子作为分子信使，允许免疫系统的细胞彼此通信，以产生对靶抗原的协调，以在许多疾病中发挥调节和效应功能。细胞因子作为一种免疫调节剂，可以用于激活免疫疗法、抑制免疫疗法等。临床应用细胞因子治疗癌症和其他疾病已有20多年的历史了，如干扰素(IFN)、白介素(IL)等细胞因子已广泛用于毛细胞白血病的治疗。使用细胞因子的治疗归纳起来主要有以下几方面的特点：(1)无简单的剂量反应关系：细胞因子主要是通过免疫调节起作用，剂量过高可能会抑制预期的免疫反应，而剂量过低又无法有效引起免疫反应；(2)长期每天用药会诱发免疫耐受现象；(3)疗效显示缓慢但长久：生物免疫疗法与放疗、化疗不同，即便是对细胞因子很敏感的肿瘤，也不完全在接受治疗后很快消失，治疗效果可能要几个月后方能显示出来，在细胞因子停止施用后病情仍会持续好转；(4)联合疗法比单一疗法效果更佳：各种细胞因子联合应用比只用一种细胞因子治疗更有效，因为多种细胞因子之间可以互相弥补不足，发挥各自的长处，使疗效更好；(5)可延长患者的寿命：细胞因子能抑制肿瘤细胞生长，且毒副作用小，因而可显著延长患者的寿命。
然而，细胞因子虽具有高效性，但同时仍具有组分单一，靶向性和杀伤性不能兼顾的弊端。
因此，本领域仍需要开发有效增强细胞因子的抗肿瘤效果的融合物作为改良的治疗剂来解决上述现有技术的弊端。
发明内容
本申请的目的是提供一种可将抗肿瘤细胞因子的高效抗肿瘤作用和免疫检查点抑制作用的特点相结合的新的疾病治疗产品，以为肿瘤治疗提供一种新的选择。
示例性地，本申请的实现上述目的实施方案包括以下：
1.一种用于免疫治疗的融合物，其包括免疫检查点抑制剂和细胞因子。
2.根据实施方案1所述的融合物，其中所述免疫检查点抑制剂包括但不限于PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)抑制剂、4-1BB(CD137)抑制剂、OX40(CD134)抑制剂、B细胞和T细胞衰减器(B and T cell attenuator，BTLA)抑制剂、T细胞免疫球蛋白抑制剂、TIM-3抑制剂以及表达在NK细胞和部分T细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor，KIR)抑制剂。
3.根据实施方案1所述的融合物，其中所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)抑制剂、4-1BB(CD137)抑制剂、OX40(CD134)抑制剂、B细胞和T细胞衰减器、T细胞免疫球蛋白、TIM-3以及表达在NK细胞和部分T细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体。
4.根据实施方案1所述的融合物，其中，所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的融合物，其中所述免疫检查点抑制剂是抗免疫检查点抗体。
6.根据实施方案5所述的融合物，其中所述抗免疫检查点抗体是抗PD-1抗体。
7.根据实施方案6所述的融合物，所述抗PD-1抗体包括特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域和来自免疫球蛋白恒定区(Fc)的恒定区域，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域包括具有3个CDR的轻链可变区(抗-PD-1VL)和具有3个CDR的重链可变区(抗PD-1VH)，其中，所述轻链可变区(抗-PD-1VL)包含选自SEQ ID NO：1-16所示的氨基酸序列的轻链CDR(LCDR)；并且所述重链可变区(抗PD-1VH)包含选自SEQ IDNO：17-31所示的氨基酸序列的重链CDR(HCDR)。
8.根据实施方案7所述的抗体或其功能性片段，其中所述轻链可变区包括：
LCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2、3、4和5中任一个所列，
LCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6、7、8、9和10中任一个所列，和
LCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16中任一个所列；并且
所述重链可变区包括：
HCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：17、18、19、20和21中任一个所列，
HCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：22、23、24、25和26所列中任一个所列，和
HCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：27、28、29、30和31中任一个所列。
9.根据实施方案7或8所述的抗体或其功能性片段，其包括选自下组的轻链可变区：
a)轻链可变区VL1，其包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13；
b)轻链可变区VL2，其包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:12；
c)轻链可变区VL3，其包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:16；
d)轻链可变区VL4，其包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11；
e)轻链可变区VL5，其包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13；以及
f)轻链可变区VL6，其包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:14。
10.根据实施方案7或8所述的抗体或其功能性片段，其包括选自下组的重链可变区：
g)重链可变区VH1，其包括SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27；
h)重链可变区VH2，其包括SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:30；
i)重链可变区VH3，其包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:29；
j)重链可变区VH4，其包括SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:30；
k)重链可变区VH5，其包括SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:31。
11.根据实施方案7或8所述的抗体或其功能性片段，其包括选自VL1、VL2、VL3、VL4、VL5和VL6中的任一个的轻链可变区和选自VH1、VH2、VH3、VH4和VH5中的任一个的重链可变区。
12.根据实施方案7所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包含：
分别为SEQ ID NO:1、7和11所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:17、22和27所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；或
分别为SEQ ID NO:4、9和15所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:18、23和28所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；或
分别为SEQ ID NO:5、10和16所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:19、24和29所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；或
分别为SEQ ID NO:2、6和12的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3；以及分别为SEQ ID NO:21、26和31的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；或
分别为SEQ ID NO:3、7和13所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:21、26和31所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3，并且
其中所述抗体或其功能性片段特异性地结合位于人PD-1的胞外结构域内的表位。
13.根据实施方案7所述的融合物，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:47、48、49、50、51、58所示氨基酸序列。
14.根据实施方案7所述的融合物，其编码核苷酸序列包含：SEQ ID NO:53、54、55、56、57、59所示核苷酸序列。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的融合物，其中所述细胞因子能够抑制肿瘤生长。
16.根据实施方案15所述的融合物，其中所述细胞因子选自：白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、集落刺激因子(colony stimμlating factor，CSF)、转化生长因子、生长因子(growth factor，GF)和趋化因子家族(chemokine family)。
17.根据实施方案16所述的融合物，其中所述集落刺激因子(colony stimμlatingfactor,CSF)包括G(粒细胞)-CSF、M(巨噬细胞)-CSF、GM(粒细胞、巨噬细胞)-CSF、Multi(多重)-CSF(IL-3)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、红细胞生成素(erythropoietin，EPO)；
所述肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)选自TNF-α和TNF-β；
所述转化生长因子为转化生长因子β家族(transforming growth factor-βfamily,TGF-βfamily)的TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGFβ1β2或骨形成蛋白(BMP)；
所述生长因子(growth factor，GF)包括表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)；
所述趋化因子家族(chemokine family)选自C-X-C/α亚族、C-C/β亚族、C型亚家族和CX3C亚家族；其中所述C-X-C/α亚族包括IL-8、生长调节致癌基因/黑素瘤生长刺激因子(GRO/MGSA)、血小板因子-4(PF-4)、血小板碱性蛋白(PBP/CXCL7)、蛋白水解来源的产物CTAP-Ⅲ和β-血小板球蛋白(β-thromboglobulin，β-TG)、趋化因子IP-10(interferon-inducible protein-10)、上皮粒细胞激活蛋白78(Epithelial Neutrophil-ActivatingProtein78，ENA-78)；所述C-C/β亚族包括巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、MIP-1β、RANTES(regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted，CCL5)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/MCAF)、MCP-2、MCP-3和I-309；所述C型亚家族包括淋巴细胞趋化蛋白；所述CX3C亚家族包括趋化因子分形素(Fractalkine)。
18.根据实施方案16所述的融合物，其中所述细胞因子选自IFN-α、IFN-β和IFN-γ中的任一种，优选IFN-γ。
19.根据权利要求18所述的融合物，其中所述所述细胞因子是IFN-γ，优选为IFN-γ双体。
20.根据权利要求18或19所述的融合物，其中所述抗体或其功能性片段包含：分别为SEQ ID NO:3、7和13所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:21、26和31所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；或者分别为SEQ ID NO:2、6和12的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3；以及分别为SEQ ID NO:21、26和31的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3。
21.一种制备实施方案1-20中任一项所述的融合物的方法，包括步骤：
(1)制备免疫检查点抑制剂；
(2)测定步骤(1)所得的免疫检查点抑制剂的氨基酸序列；
(3)根据步骤(2)所得的免疫检查点抑制剂的氨基酸序列确定编码所述免疫检查点抑制剂的核苷酸序列；
(4)以步骤(3)所得的编码所述免疫检查点抑制剂的核苷酸序列和编码细胞因子的核苷酸序列为模板，分别设计扩增所述免疫检查点抑制剂的引物和扩增所述细胞因子的引物；
(5)重组构建免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白表达载体；
(6)将免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白表达载体转化到受体菌株中；
(7)筛选免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白的表达菌株；
(8)表达免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白并测序；
(9)纯化免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白。
22.根据实施方案21所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗免疫检查点抗体，所述抗免疫检查点抗体通过噬菌体库筛选法、杂交瘤法制备，优选通过噬菌体库筛选法制备。
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述抗免疫检查点抗体是抗PD-1抗体。
24.根据实施方案21～23任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ，优选为IFN-γ双体。
25.编码根据实施方案1-20中任一项所述的融合物的核酸分子。
26.包含根据实施方案25所述的核酸分子的表达载体，所述表达载体选自真核表达载体和原核表达载体。
27.包含根据实施方案26所述的表达载体的宿主细胞。
28.包含根据实施方案1-20中任一项所述的融合物的蛋白质或多肽。
29.检测根据实施方案1-20中任一项所述的免疫检查点抑制剂-细胞因子融合物的活性的方法。
30.实施方案1～20任一项所述的免疫检查点抑制剂-细胞因子融合物在制备治疗疾病、改善或缓解不适的药物中的应用。
31.一种用于治疗疾病、改善或缓解不适的方法，所述方法包括施用实施方案1～20任一项所述的免疫检查点抑制剂-细胞因子融合物。
32.根据实施方案30所述的应用或权利要求31所述的方法，所述疾病和不适为PD-1介导的疾病和不适。
33.根据实施方案30所述的应用或权利要求31所述的方法，其中，所述疾病和不适包括癌症、炎性疾病和感染性疾病。
34.根据实施方案33所述的应用或方法，所述癌症、炎性疾病和感染性疾病为PD-1介导的。
35.根据实施方案33所述的应用或方法，其中所述癌症选自胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肾上腺癌、肛区癌、阴户癌、尿道癌、阴茎癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、表皮样癌、鳞状细胞癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、内分泌系统的癌症、软组织肉瘤、中枢神经系统的赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、T细胞淋巴瘤、慢性或急性白血病(其包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤和淋巴细胞性淋巴瘤中的一种或更多种。
36.根据实施方案33所述的用途或方法，其中所述感染性疾病选自HIV、流行性感冒、疱疹、贾第虫病、疟疾、利什曼病，或以下病毒引起的感染性疾病：肝炎病毒(例如甲型、乙型或丙型肝炎病毒)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV或埃巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、JC病毒或虫媒病毒性脑炎病毒，或以下细菌引起的感染性疾病：肺炎球菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、脑膜炎球菌、conococci、沙雷氏菌、克雷伯氏菌、变形菌、假单胞菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、白喉杆菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、破伤风梭菌、军团菌、鼠疫杆菌、钩端螺旋体病或莱姆氏病细菌，或以下真菌引起的感染性疾病：曲霉(例如烟曲霉、黑曲霉等)、假丝酵母(例如白色假丝酵母)、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、新型隐球酵母、皮炎芽酵母、毛霉目的属(例如毛霉属、犁头霉属或根霉属)、申克氏孢子丝菌、巴西副球孢子菌、粗球孢菌或加膜组织胞浆菌，或以下寄生虫引起的感染性疾病：痢疾内变形虫、结肠肠袋虫、福纳氏虫、棘变形虫、间日疟原虫、田鼠巴贝虫、吸吮贾第虫、隐孢子虫、卡氏肺囊虫、布鲁斯锥虫、克鲁兹锥虫、多氏利什曼虫、鼠弓浆虫或巴西日圆线虫。
37.根据实施方案33所述的用途或方法，其中所述疾病为癌症；所述癌症选自肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、头颈癌、肠癌、和非小细胞肺癌；所述感染性疾病为慢性病毒感染、细菌感染或寄生虫感染疾病，所述慢性病毒为HIV、HBV或HCV。
附图说明
图1是菌落PCR鉴定ID1融合蛋白基因的DNA电泳图。DNA分子量标准-(M)：DL5000(TAKARA,3428A)
图2是重组表达ID1融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。泳道1：ID1融合蛋白表达菌株的超声破壁上清液；泳道2：阴性对照BL21菌株的超声破壁上清液。蛋白分子量标准(M)：彩虹245广谱蛋白Marker(索莱宝，PR1920)
图3GST亲和层析纯化ID1融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。泳道1：未经纯化的样品；泳道2：未结合蛋白，即，洗脱流出液中的蛋白；泳道3：洗脱得到的ID1融合蛋白。蛋白分子量标准(M：彩虹245广谱蛋白Marker(索莱宝，PR1920)
图4显示了不同稀释倍数的转有pGEX-6p-1-ID1的E.coli BL21(DE3)细胞培养物及对照E.coli BL21(DE3)菌株(简称BL21)的裂解上清液处理HepG2-Luc的平均荧光强度(MFI)。
图5显示了纯化的ID1融合蛋白促进CTL细胞对HepG2-Luc细胞的杀伤。
图6显示了效靶比50比1和不同浓度的ID1融合蛋白对CTL杀伤HepG2-Luc细胞的效率的影响。**表示p<0.01；***表示p<0.001。
图7显示了活体成像检测的效靶比50比1和不同浓度的ID1融合蛋白对CTL杀伤HepG2-Luc细胞的效率的影响，其中，荧光强度越高，代表活细胞越多，杀伤效率越低。
图8显示了效靶比10比1和不同浓度的ID1融合蛋白对CTL杀伤HepG2-Luc细胞的效率的影响。*表示p<0.05
图9显示了活体成像检测的效靶比10比1和不同浓度的ID1融合蛋白对CTL杀伤HepG2-Luc细胞的效率的影响，其中，荧光强度越高，代表活细胞越多，杀伤效率越低。
图10显示了效靶比50比1和不同浓度的ID1融合蛋白对CTL杀伤THP-1细胞的效率的影响。****表示p<0.0001
图11显示了使用层析柱Superdex 200 10/30纯化tID1融合蛋白。
图12显示了SDS-PAGE检测tID1融合蛋白的结果。M:彩虹245广谱蛋白Marker(索莱宝，PR-1920)；泳道1为图11所示第2管洗脱液，泳道2为图11所示第3管收集液，泳道3为图11所示第4管收集液，泳道4为第2-4管合并后的收集液。
图13显示了tID1融合蛋白与PD-1蛋白的ELISA结合曲线。
图14显示了tID1融合蛋白与IFNGR的ELISA结合曲线。A图为tID1融合蛋白与IFNGR结合曲线，B图为IFN-γ与IFNGR结合曲线。
图15显示了SPR法检测tID1融合蛋白与PD1抗原和IFNGR结合的常数。
图16显示了tID1融合蛋白与不同种属PD-1的ELISA结合曲线。
图17显示了tID1融合蛋白阻断PD-1与PD-L1结合的ELISA曲线。
图18显示了tID1融合蛋白与293T-PD-1细胞的结合曲线。
图19显示了tID1融合蛋白阻断293T-EGFP/PD-1与PD-L2的结合曲线。
图20通过流式细胞术(FACS)显示了tID1融合蛋白促进肿瘤细胞表达PD-L1。
图21和图22分别显示了tID1融合蛋白对hepG2细胞和Hela细胞的增殖抑制作用。
图23显示了tID1融合蛋白与CD3诱导的CD4+T细胞的结合。
图24显示了tID1融合蛋白促进PBMC对hepG2细胞的杀伤作用。
图25显示了tID1促进PBMC对人膀胱癌细胞系T24的杀伤作用。
具体实施方式
本申请涉及以下定义：
融合物指具有不同作用机理和靶向目标的功能性结构通过生物遗传操作例如重组或者通过化学合成得到的结构。在本申请中是抗肿瘤细胞因子与免疫检查点抑制剂的融合物，更具体地，是IFN-γ与抗PD-1抗体的融合蛋白。
免疫治疗(immunotherapy)指针对低下或亢进的机体免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗。在本申请中，特别指采用细胞因子与免疫检查点抑制剂的融合物针对肿瘤和癌症疾病的免疫治疗，特别是采用IFN-γ与PD-1抗体的融合蛋白对肿瘤的抑制疗法。
肿瘤抑制指通过与肿瘤相关基因或与肿瘤产生相关的调控因子特异性结合的药物在分子水平上操纵免疫学通路而抑制肿瘤的发生或发展。在本申请中，特别地是指通过PD-1抗体结合PD-1抗原，解除PD-1对T细胞活性的弱化调控，提供T细胞的抗肿瘤活性，从而达到遏制肿瘤细胞生长、繁殖并减缓肿瘤生长速度的目的。
细胞因子(cytokine)是由免疫细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞及其相关细胞产生的与肿瘤免疫相关的物质。与肿瘤生物治疗有关的细胞因子主要有：肿瘤坏死因子TNF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干扰素等。在本申请的优选实施方案中，细胞因子是干扰素。
干扰素，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，也是一种具有广泛免疫调节作用的淋巴因子，是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种高效的抗病毒生物活性物质。干扰素并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制，其类型分为三类，α-(白细胞)型、β-(成纤维细胞)型，γ-(淋巴细胞)型；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。
淋巴细胞型干扰素，即IFN-γ由人T细胞和NK细胞产生，其合成的相关基因位于人的12号染色体上。人IFN-γ属于II型干扰素，又称γ-IFN或免疫干扰素，属于分泌型蛋白，去除信号肽后由143个氨基酸组成，以同源二聚体或四聚体的形式存在，相对分子量为40kDa。
IFN-γ在临床上常用于抗病毒和抗肿瘤。IFN-γ可抑制多种病毒的繁殖，从而在病毒感染的治疗方面应用广泛。IFN-γ在体内能抑制肿瘤细胞生长，防治肿瘤的转移和复发。临床应用表明，IFN-γ对毛细胞白血病、黑色素瘤、皮肤瘤、慢性髓样白血病、神经胶质瘤、淋巴瘤及骨髓瘤等均具有良好疗效。IFN-γ既可通过诱导肿瘤细胞凋亡和干扰肿瘤细胞的生长周期等方式直接杀死肿瘤细胞，也可通过抑制肿瘤组织的血管生长从而抑制肿瘤生长，还可通过调节人体免疫系统增强人体自身对肿瘤细胞的清除能力。
IFN-γ激活免疫系统作用是通过以下途径：(1)激活树突状细胞(DC细胞)的功能，促进造血细胞向DC细胞的分化以及DC细胞的成熟，增强DC细胞向肿瘤部位的浸润，加强DC细胞向T细胞的抗原呈递；(2)激活的T细胞产生对肿瘤细胞的特异性免疫；同时通过NF-κB途径，使T细胞免于凋亡，维持T细胞的长期存活状态；(3)还可以通过激活单核细胞使其转变为巨噬细胞，巨噬细胞通过释放肿瘤坏死因子(如TNF-α)产生肿瘤杀伤效应。IFN-γ抗血管生成作用主要是通过下调促血管生成因子的表达，来抑制肿瘤血管的生成。
然而，目前，在肿瘤治疗领域中，单纯的IFN-γ等细胞因子的治疗具有靶向性差的缺陷，细胞因子在肿瘤治疗中的效果不够理想。
作为重要的细胞免疫功能增强剂，细胞因子已经应用于制备多种-偶联物和融合蛋白药物。但是，本领域尚未设想到将细胞因子与在抗肿瘤研究中具有重要的应用前景的免疫检查点抑制剂融合。出乎意料地，本申请的发明人发现，两个药物的融合不仅使其较好地保持各自的功能，而且具有协同效果。因此，细胞因子与免疫检查点抑制剂的融合蛋白具有良好的开发和肿瘤治疗应用前景。
免疫检查点是一类免疫抑制性的分子，可以调节免疫反应的强度和广度，避免正常组织被损伤和破坏。这些“检查点”抑制免疫调节信号通路，在正常情况下能抑制T细胞的功能，同时在肿瘤组织中可能被肿瘤细胞利用形成免疫逃逸。因此，在肿瘤的发生、发展过程中，免疫检查点成为免疫耐受的主要原因之一。
基于免疫检查点的疗法就是通过共抑制或共刺激相应信号来调节T细胞活性，从而增强抗肿瘤免疫反应的治疗方法。与之前的药物相比，作用于免疫检查点的药物在抗癌方面具有完全不同的特性。首先，它们并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过作用于T细胞来间接杀伤肿瘤细胞；另外，它们并不是针对肿瘤表面的某些特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫反应。
程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)与CTLA-4、BTLA、细胞免疫球蛋白以及TIM-3、T细胞免疫球蛋白等分子均属于“免疫检查点”分子，在肿瘤组织中可能被肿瘤细胞利用形成免疫逃逸，它们通过控制胞外以及胞内信号来控制细胞周期进程。
阻断免疫检查点如PD-1通路的策略主要从以下几个方面增强对肿瘤细胞的杀伤效果：(1)通过增强归巢能力促使效应T细胞在肿瘤部位的聚集；(2)减少肿瘤微环境中调节性T细胞的数量或降低其活性；(3)增加效应T细胞的数量；(4)提高肿瘤特异性T细胞的细胞毒作用，肿瘤特异性细胞毒T细胞到达肿瘤部位后，通过TCR识别肿瘤细胞，释放IFN-γ以及T细胞颗粒杀伤肿瘤细胞，以增强对肿瘤细胞的杀伤；(5)增强促炎细胞因子的产生；和(6)下调潜在的抑制性细胞因子如IL-10。
本申请的免疫检查点抑制剂指可与免疫检查点靶向结合、将免疫检查点失活的结构。该抑制剂既可以是与免疫检查点非特异性结合的有机化合物，也可以是与免疫检查点特异性结合的配体或抗体。在本申请中，免疫检查点抑制剂优选抗体。
在一些示例性实施方式中，免疫检查点抗体是与免疫检查点特异性结合的免疫球蛋白或其功能性片段，例如抗原结合片段。在一些示例性实施方式中，本申请的抗体可以是全抗体，也可以是单链抗体。在一些示例性实施方式中，本申请的免疫检查点抑制剂可以是抗体的功能性片段、抗原结合片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd或dAb。
在本申请的一些示例性实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。PD-1表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞和单核细胞之上。PD-1的配体为B7家族成员PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。PD-1与其配体的相互作用，可下调中枢和外周免疫应答，抑制T细胞的抗肿瘤活性。
本领域尚未设想到将在抗肿瘤研究中具有重要的应用前景的免疫检查点抑制剂与细胞因子融合来治疗疾病。出乎意料地，本申请的发明人发现，阻断免疫检查点通路可通过在肿瘤环境中抑制免疫反应而有效地进行抗癌治疗。免疫检查点抑制剂与细胞因子的融合不仅使其较好地保持各自的功能，而且具有协同效果。
基于细胞因子如IFN-γ的抗肿瘤作用的缺陷以及免疫检查点在肿瘤微环境中作用机制等方面的综合考虑，本申请在一个实施例中使用原核表达系统将免疫检查点抑制剂与IFN-γ融合表达，实现靶向集中到肿瘤细胞的效果，从而使得IFN-γ和免疫检查点抑制剂例如抗免疫检查点抗体，可协同增强抗肿瘤效果；本申请在另外一个实施例中使用真核表达系统将IFN-γ的双体结构与免疫检查点抑制剂融合，同样实现了协同抗肿瘤的效果。
因此，本申请提供了具有高效抗肿瘤活性的新产品和用途。具体地，本申请将具有特异性序列的抗免疫检查点抗体(在一些示例性实施方式中为抗PD-1抗体)与细胞因子(在一些示例性实施方式中为IFN-γ免疫调节因子)偶联形成融合蛋白作为具有高效抗肿瘤活性的新药物。
在本申请的免疫检查点抑制剂与细胞因子融合物中，IFN-γ可以激活抗原提呈细胞，通过上调转录因子T-bet而促进I型辅助T细胞(ThI细胞)的分化，是一种重要的免疫增强剂，具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性。它可以直接抑制肿瘤的增殖，促进其凋亡，并可以通过抗血管生成促进肿瘤组织坏死，还可以促进肿瘤细胞MHC分子表达，有利于T细胞识别杀伤。但IFN-γ也能刺激肿瘤细胞增强PD-L1的表达水平，通过PD-1/PD-L1信号导致肿瘤细胞对免疫细胞杀伤的抑制。PD-1单抗通过阻断PD-1/PD-L1信号传导，解除了肿瘤细胞对T细胞免疫杀伤的抑制，适用于PD-L1高表达的肿瘤类型。因此本申请的ID1融合蛋白将二者有机整合起来，既可以发挥IFN-挥和PD-1单抗各自的正向肿瘤杀伤作用，同时PD-1单抗又可以有效阻断因IFN-以诱导肿瘤细胞表达PD-L1导致的免疫抑制，与IFN-疫和PD-1单抗单独使用相比，既增强了对肿瘤的杀伤作用，又弥补了各自的不利特性，进一步扩大了抗肿瘤的应用范围，有望成为一种肿瘤杀伤力更强，适用范围更广的人工免疫治疗药物。
下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。
以下实施例中所使用的药品和试剂，无特别说明，均为普通市售商品。
实施例1：具备高的PD-1结合活性的PD-1scFv抗体的制备
(1)使用人源噬菌体抗体库筛选法筛选出多个包含抗PD-1scFv的单克隆候选噬菌体，使用ELISA方法对筛选获得的噬菌体与PD-1结合能力进行检验。
方法如下：以50μL/孔2μg/mL的人PD-1重组蛋白(ACRO Biosystems,PD1-H5221)包被ELISA板，4℃过夜；用200μL 3％的MPBS封闭ELISA板，37℃3h；将50μL筛选得到的噬菌体抗体加入ELISA板孔，37℃孵育1.5h；PBST洗板3遍，加入抗M13单克隆抗体-HRP(北京义翘神州科技有限公司,11973-MM05-50)，37℃孵育1h；TMB显色剂显色，2M硫酸终止后测A450值。同时用M13KO7辅助噬菌体作为阴性对照。
结果如下表1中示出。
表1
Figure GDA0002133965060000161
表1的ELISA实验证明，通过噬菌体筛选方法得到的人源抗PD-1scFv(其氨基酸序列如SEQ ID NO.32-36所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.42-46所示)能够以高的亲和力与PD-1结合。
(2)具有高的PD-1结合活性的PD-1scFv抗体的重链和轻链以及CDR区的序列例示如下：
特异性轻链，其包含SEQ NO.1～16的任一种CDR，其中
LCDR1：选自SEQ ID NO.1～5的任一种
LCDR2：选自SEQ ID NO.6～10的任一种
LCDR3：选自SEQ ID NO.11～16的任一种
重链序列：包含SEQ NO.17～31中的任一种HCDR。
重链CDR序列：
HCDR1：SEQ ID NO.17～21的任一种
HCDR2：SEQ ID NO.22-26的任一种
HCDR3：SEQ ID NO.27-31的任一种
以上抗体是全人源抗体或鼠源抗体，优选全人源抗体。
实施例2.包含IFN-γ-PD-1scFv抗体(ID1)融合蛋白的构建和表达
一、包含ID1基因的表达载体构建
1.模板：人源抗PD-1scFv序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO.32-36所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.42-46所示)及截短的人源IFN-γ序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示)，由金唯智生物技术有限公司合成。
2.引物：
IFN-γ扩增引物：
pIFN-F:5’-gcggatccCAGGACCCATATGTTAAAG-3’(SEQ ID No.37)
pIFN-R:5’-CTCCACCAGCTGCACCTG-3’(SEQ ID No.38)
抗PD-1ScFv扩增引物：
pNFV-F:5’-CAGGTGCAGCTGGTGGAG-3’(SEQ ID No.39)
pNFV-R:5’-GCCTCGAGttaACGTTTGATCTCCACGTTG-3’(SEQ ID No.40)。
3.表达载体：pGEX-6p-1。
4.方法：
(1)采用Primestar聚合酶mix(TAKARA，R045A)分别对IFN-γ及抗PD-1ScFv进行扩增。
扩增体系：引物F：1μl，引物R：1μl，模板1μl，Primestar聚合酶mix 25μl，补ddH2O至50μl。
扩增条件：94℃90s，(94℃15s，50℃5s，72℃10s)×30个循环，72℃5min。
(2)对扩增片段进行胶回收试剂盒(QIAGEN，28704)，并进行重叠(overlap)PCR。
扩增体系：IFN-γ回收片段：100ng，抗PD-1scFv回收片段：100ng，聚合酶12.5μl，补ddH2O至25μl。
扩增条件：94℃90s，(94℃15s，50℃5s，72℃5s)×10个循环，72℃5min。
(3)取上一步产物5μl作为模板，以IFN-γ上游引物pIFN-F和抗PD-1ScFv下游引物pNFV-R继续进行PCR扩增。
反应体系：pINF-F：1μl，pNFV-R：1μl，模板5μl，Primestar聚合酶mix 25μl，补ddH2O至50μl。
扩增条件：94℃90s，(94℃15s，55℃5s，72℃5s)×30个循环，72℃5min。
(4)将pGEX-6P-1与融合目的片段分别采用核酸限制性内切酶BamHI(NEB,R3136S)和XhoI(NEB,R0146S)进行双酶切，37℃条件下酶切2h，并进行DNA回收。
(5)将载体与片段采用T4连接酶(NEB，M0202L)进行连接，连接体系为：pGEX-6P-1载体片段：1μl，融合目的片段：4μl，缓冲液：1μl，T4连接酶：1μl，补ddH2O至10μl。室温连接4h，后转染至大肠杆菌Trans-T1感受态细胞(北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司，CD501)。涂板于含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的2YT培养基琼脂平板。
(6)挑取克隆进行菌落PCR验证并提取质粒进行测序验证。
(7)将测序正确的重组载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。
5.结果：扩增出的ID1基因全长序列如SEQ ID No.53～57所示(其分别编码如SEQID No.47～51所示的氨基酸序列)，菌落PCR验证及测序结果显示重组载体pGEX-6p-1-ID1构建成功。
实施例3.ID1融合蛋白的原核表达及纯化
1.培养基：
(1)种子培养基(g·L-1)：胰蛋白胨16、酵母粉10、NaCl 5、pH 7.0-7.4。
(2)表达培养基(g·L-1)：胰蛋白胨12、酵母粉24、甘油4、KH2PO4 2.31、K2HPO412.54、pH 7.0。
2.方法：
(1)取重组菌pGEX-6p-1-ID1/E.coli BL21(DE3)进行过夜培养，第二天转接至100ml的表达培养基，37℃、200rpm进行培养。设置阴性对照组为pGEX-6p-1/E.coli BL21(DE3)。
(2)待OD600＝0.6-1.0时，添加终浓度为0.2mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，并转移至16℃、200rpm进行诱导，过夜培养。
(3)第二天收集菌体离心，去除上清，添加30ml 50mM Tris-HCl并加入终浓度为1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)和二硫苏糖醇(DTT)进行超声破碎使细胞破壁，200w功率，3/6s，15min。于10000rpm离心15min，取上清再于10000rpm离心15min。收集上清0.45μm滤膜过滤纯化。
(4)GSTrap HP纯化柱纯化：
结合液：50mM Tris-HCl pH 7.5-8.0；
洗脱液:50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0。
采用5倍柱体积的结合液平衡柱子；0.5ml/min上样；5倍柱体积，1ml/min流速清洗柱子；3-5倍柱体积洗脱液，1ml/min流速洗脱收集蛋白。
3.结果：由图2可以看出，与对照组相比，可以发现大小约为70kD的目的条带(包含GST标签26kD)，说明有可溶性目的蛋白成分存在。纯化结果见图3。
实施例4.酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测ID1融合蛋白活性
(一)抗PD-1活性检测
1.实验设计
取氨基酸序列为SEQ ID No.50的融合蛋白(包含SEQ ID NO:35的抗PD-1scFv和IFN-γ)检测其抗PD-1活性。设置阳性对照1为抗PD-1scFv(如实施例1的方法由噬菌体表达获得)，阳性对照2-人源抗PD-1抗体(crobiosystems,anti-PD-1mAb,Human IgG4)(浓度2.5μg/ml)，阴性对照:BL21(DE3)菌破壁上清液，样品1为纯化ID1蛋白。
2.所使用的溶液
①包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)
0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml。
②0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)
0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml。
③抗体稀释液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2％BSA
④封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0％BSA
⑤洗涤液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20
⑥显色液：TMB-过氧化氢尿素溶液
A液(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，TMB):称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。
B液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4):称取Na2HPO414.6g，柠檬酸9.33g溶于180ml双蒸水，加0.75％过氧化氢尿素6.4ml，定容至1000ml，调pH至5.0-5.4。
将A液和B液按1：l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液。
⑦终止液：2mol/L H2SO4溶液
3.方法
(1)将样品加入已用PD-1抗原包被的ELISA板，于37℃孵育1.5h；
(2)用10％Tween-20储备液(TPBS)的100倍稀释液清洗ELISA板5遍，向样品组加入1:1000稀释的一抗：鼠源抗GST抗体(康威试剂生物科技有限公司，CW0084)，孵育40min；阳性对照组不加；
(3)用TPBS清洗5遍后，样品组加入1:3000稀释的二抗：羊抗鼠抗体(康为世纪生物科技有限公司，CW0102S)，孵育40min(阳性对照1加入anti-M13抗体(北京义翘神州生物技术有限公司，11973-MM05-50))，阳性对照2加入羊抗人抗体(Abcam，ab6858)；
(4)TMB显色5min，添加2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪检测A450nm吸光值。
2.结果：结果显示与对照组相比，ID1融合蛋白具有抗PD-1活性
表1：ID1融合蛋白的抗PD-1活性
样品 阳性对照1 纯化ID1蛋白 阴性对照
A450 0.957±0.073901 0.9675±0.098727 0.1525±0.001732
样品 阳性对照2 纯化ID1蛋白 阴性对照
A450 0.933±0.064663 1.1055±0.00866 0.152±0.008083
说明：基于篇幅考虑发明人仅展示噬菌体筛选获得的A450数值居中的scFv序列SEQ ID NO:35制备获得ID1融合蛋白作为范例展示，噬菌体筛选获得的其他scFv序列当制备成ID1融合蛋白时也有良好的效果。
(二)检测ID1融合蛋白的IFN-γ活性
通过验证ID1融合蛋白作用HepG2-Luc细胞一定时间后的PD-L1表达水平来验证其IFN-γ活性。
实验方案：
1、将肝癌细胞HepG2-Luc培养于24孔板中，每孔2×104个细胞，500μl/孔。
2、HepG2-Luc细胞贴壁6-8个小时后加入不同浓度pGEX-6p-1-ID1/E.coli BL21(DE3)菌株和对照E.coli BL21(DE3)菌株的裂解上清液、IFN-γ，每种浓度3个复孔。
不同浓度pGEX-6p-1-ID1/E.coli BL21(DE3)菌株(ID1菌上清液)和对照E.coliBL21(DE3)菌株的裂解上清液(BL21菌上清液)的制备：将ID1菌上清液和BL21(DE3)菌上清液冷冻干燥(大约24h)，干燥后的样品按照干燥前样品体积使用等体积的DMEM完全培养基复溶，再按如下稀释：
A：5μl ID1菌上清液+495μl DMEM
B：50μl ID1菌上清液+495μl DMEM
C：500μl ID1菌上清液+0μl DMEM
D：5μl BL21菌上清液+495μl DMEM
E：50μl BL21菌上清液+495μl DMEM
F：500μl BL21菌上清液+0μl DMEM
IFN-γ：母液浓度50ng/mL，工作浓度为25ng/mL
3、各取0.5mL稀释好的样品和对照品，加入到HepG2-Luc细胞贴壁良好的24孔培养板中，补加0.5mL的DMEM完全培养基，至终体积1mL/孔。
4、37℃5％CO2培养箱中孵育24h。
5、CCK8检测细胞增殖抑制作用：按每孔终体积的1/20体积加入CCK8，37℃5％CO2培养箱放置1h，吸取对应孔上清100μL至新的96孔板，在450nm波长检测待测ID1融合蛋白和阳性对照及阴性对照溶液的OD；将各孔细胞消化收集于1.5mL离心管中，用流式细胞术检测HepG2-Luc细胞的PD-L1表达水平。
6、结果
表达ID1的重组菌的裂解上清液及细菌BL21(DE3)菌上清裂解液对HepG2-Luc表达PD-L1表达的影响参见图4。
结果表明，1)与阴性对照相比，BL21(DE3)菌液超声裂解上清未见对HepG2-Luc细胞PD-L1表达有影响；而含ID1融合蛋白的BL21(DE3)菌液超声裂解液上清对HepG2-Luc细胞PD-L1的表达有影响，并且存在量效关系；2)证明ID1融合蛋白中组成元件IFN-γ具有活性作用。
实施例5.ID1融合蛋白促进CTL杀伤肿瘤细胞
实验操作：
1、外周血单核细胞(PBMC)分离
(1)采血：在无菌条件下采取供血者外周血50mL，加入肝素为30U/mL，并分装到两个无菌50mL离心管中。
(2)以3000rpm(加速度7，减速度6)10min，将上层血浆吸出，下层细胞加入等体积生理盐水稀释。
(3)取一支50mL离心管，先加入与步骤(2)的稀释的细胞等体积的人外周血淋巴分离液(Ficoll,天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，LTS1077)，然后用吸管小心吸取细胞加于Ficoll液面上。
(4)以1800rpm，离心10min，离心后，离心管中由上至下分为四层，第二层的环状乳白色物质即为淋巴细胞。
(5)用吸管小心吸取第二层的淋巴细胞将其转移到新的15mL离心管中，并向所得离心管中加入10mL生理盐水，混匀。
(6)1800rpm，离心10min，弃上清，每个15mL离心管加入1mL红细胞裂解液，轻轻吹吸混匀后室温静置5min。
(7)加入9mL生理盐水，混匀，1800rpm离心10min，弃上清，加入GT-T551完全培养基重悬细胞，计数。
2、HepG2-Luc、THP-1与PBMC细胞的混合培养
(1)丝裂霉素C处理HepG2-Luc和THP-1细胞：将丝裂霉素C用无血清培养基(sigma，M0503)复溶，工作浓度为10μg/mL，于37℃5％CO2培养箱中孵育，每10min，共孵育1.5h；收集刺激后的HepG2、THP-1细胞用，PBS洗3次，以去除残余的丝裂霉素C，作为刺激细胞。
(2)按照PBMC细胞与HepG2-Luc或THP-1肿瘤细胞10:1比例接种于T75培养瓶中，用含10％自体血浆的GT-T551培养基培养并补加IL-2(100u/ml)(同立海源，货号：TL-104)和CD3(50u/ml)(同立海源，货号：TL-101)，于37℃5％CO2培养箱培育3天。
3、CTL对HepG2-Luc和THP-1的特异性杀伤实验
(1)收集步骤2中共培养后的细胞，即为特异性的CTL细胞，用PBS洗2次，计数，调整细胞浓度。
(2)在96孔板中，将HepG2-Luc和THP-1细胞(1×104/孔)与特异性的CTL按照50:1或10:1比例进行混合，并按表2分组，加入的纯化的ID1融合蛋白样品和对照品，总体积200μL，各组3个复孔。
表2
Figure GDA0002133965060000241
Figure GDA0002133965060000251
(3)各组混合后，37℃5％CO2培养箱中孵育18h，小心吸取100μL上清，置于新的96孔板，此后分别如下处理：
靶细胞为THP-1的组使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(碧云天，C0016)，在490nm处检测吸光度，统计分析各组样品和对照品对细胞的杀伤效率；
靶细胞为HepG2-Luc的组，剩余100μL培养基的细胞孔中加入100μL的D-luciferin(0.075mg/mL)(MCE，HY-12591A)避光孵育5min后通过活体成像仪(spectral Amix)检测HepG2-Luc(带有Fg-Luc荧光基因)检测细胞荧光强度，统计分析各组的细胞杀伤效率。
纯化的ID1融合蛋白促进CTL细胞对HepG2-Luc细胞的杀伤结果如图5所示。采用分别检测效靶比50:1和10:1时不同浓度的ID1融合蛋白对CTL杀伤HepG2-Luc细胞的效率的影响，结果如图6(**表示p<0.01；***表示p<0.001)和图8(*表示p<0.05)所示。采用活体成像检测分别检测效靶比50:1和10:1时不同浓度的ID1融合蛋白对CTL杀伤HepG2-Luc细胞的效率的影响，结果如图7和图9所示，其中，荧光强度越高，代表活细胞越多，杀伤效率越低。效靶比50:1时ID1融合蛋白对CTL杀伤THP-1细胞的效率的影响如图10所示(****表示p<0.0001)。
结果表明，本申请的ID1融合蛋白可以促进特异性CTL对HepG2-Luc、THP-1的杀伤作用，并且添加ID1融合蛋白的实验组与阳性对照相比较，具有显著性差异。
实施例6.包含(IFN-γ)2-PD-1scFv2的tID1融合蛋白基因的真核表达载体pBudCE4.1的构建
我们选择SEQ ID No:36的抗PD-1scFv2序列(其包含分别为SEQ ID NO:3、7和13所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:21、26和31所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；)与两个IFN-γ分子融合，形成(IFN-γ)2-PD-1scFv2结构，进一步考查带有两个IFN-γ分子的PD-1scFv融合蛋白的性质和功能。基于此，我们合成了含有(IFN-γ)2-PD-1scFv2基因的序列SEQ ID NO:60。
具体构建过程如下：
(1)基因合成含有(IFN-γ)2-PD-1scFv2基因的序列SEQ ID NO:60，其在所述序列(IFN-γ)2-PD-1scFv2基因序列的5’端设置有HindIII酶切位点，且在3’端设置有XbaI酶切位点；
(2)使用HindIII和XbaI内切酶处理合成的序列SEQ ID NO:60和pBudCE4.1载体，37℃条件下酶切2h，并进行DNA回收；
(3)将载体与片段采用T4连接酶(NEB，M0202L)进行连接，连接体系为：pBudCE4.1载体片段：1μL，融合目的片段：4μL，缓冲液：1μL，T4连接酶：1μL，补ddH2O至10μL。室温连接4h，后转染至大肠杆菌Trans-T1感受态细胞(北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司，CD501)。涂板于含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的2YT培养基琼脂平板。
(4)挑取克隆进行测序验证。
结果：测序结果显示重组载体pBudCE4.1-tID1融合蛋白构建成功，扩增出的tID1融合蛋白基因全长DNA序列如SEQ ID No.59所示，其编码如SEQ ID No.58所示的氨基酸序列，包含分别为SEQ ID NO:3、7和13所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:21、26和31所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3。
实施例7：tID1融合蛋白的真核表达及纯化
(1)将pBudCE4.1-tID1构建体以电穿孔转入293T/17细胞，7天后收集细胞培养液获得表达tID1融合蛋白(带有His纯化标签)的上清液。
(2)Ni柱亲和层析纯化：
平衡液：20mM的PB缓冲液(16.8mM Na2HPO4·12H2O+3.2mM NaH2PO4·2H2O，pH＝7.4)，150mM NaCl；
洗杂液：20mM的PB缓冲液(16.8mM Na2HPO4·12H2O+3.2mM NaH2PO4·2H2O，pH＝7.4)，150mM NaCl，10mM咪唑；
洗脱液:20mM的PB缓冲液(16.8mM Na2HPO4·12H2O+3.2mM NaH2PO4·2H2O，pH＝7.4)，150mM NaCl，500mM咪唑；
操作步骤：
采用20倍柱体积的平衡液平衡Ni柱(GE Healthcare Ni SepharoseTM excel,GE货号45-003-011)；
将收集的融合蛋白表达上清液以0.5ml/min上样；使用5倍柱体积的洗杂液以1ml/min流速清洗Ni柱；
使用3-5倍柱体积洗脱液以1ml/min流速洗脱Ni柱以收集得到tID1融合蛋白；
使用超滤离心管对洗脱液进行浓缩，得到浓度8.9mg/mL的tID1融合蛋白。
(3)分子筛层析纯化：
使用平衡液即20mM的PB缓冲液(16.8mM Na2HPO4·12H2O+3.2mM NaH2PO4·2H2O，pH＝7.4)，150mMNaCl)，平衡分子筛层析柱Superdex200 10/30(GE)，然后对层析住上样0.5mL的以上洗脱得到的8.9mg/mL的tID1融合蛋白，流速为0.3ml/min。根据A280吸收值分别收集到2号管1ml、3号管1mL、4号管0.68mL(图11)。每管取20μL进行SDS-PAGE电泳检测。
3.结果：由图12可以看出，与对照组相比，可以发现大小约为63kD的目的条带，说明可溶性目的蛋白tID1融合蛋白成分的存在。目的条带上方的72kD条带指示糖基化形式的tID1融合蛋白。
实施例8：tID1融合蛋白融合蛋白阻断PD-1与PD-L1的结合
(一)通过ELISA测定tID1融合蛋白与PD1的结合
方法：
1、对ELISA板包被抗原PD1(His-tag)：2ug/mL 100μL/孔；2、将tID1融合蛋白(0.257mg/mL，纯度98％)，按照下表2系列稀释，以100μL/孔加入ELISA板，37℃孵育1.5h
3、添加一抗：APC-anti human IFNG Ab(1:400)100μL/孔，37℃孵育1h；
4、添加二抗：Goat-anti-mouse IgG(H+L)(1:2000)100μL/孔，37℃孵育1h。
5、波长450nm下检测检测OD值，对于每个tID1融合蛋白浓度，设置3个复孔。
表2
Figure GDA0002133965060000281
结合曲线参见图13。
(二)通过ELISA测定tID1融合蛋白与IFNGR的结合
方法：
1、将抗原IFNGR(Fc-tag)以2.5ug/mL、100μL/包被于ELISA板上；
2、将tID1融合蛋白(0.257mg/mL纯度98％)按照下表3A系列稀释；将阳性对照IFN-γ按照下表3B系列稀释；
3、将tID1融合蛋白与阳性对照分别以100μL/孔加入ELISA平板的对应孔中，37℃孵育1.5h；
4、添加一抗：APC-anti human IFNG Ab(1:400)，100μL/孔，37℃孵育1h；
5、添加二抗：Goat-anti-mouse IgG(H+L)(1:2000)，100μL/孔，37C℃孵育1h；
6、波长450nm下检测检测OD值，对于每个tID1融合蛋白浓度，设置3个复孔。
结果参见下表3A。
表3A ELISA检测tID1融合蛋白与IFNGR的结合
Figure GDA0002133965060000291
按照同样的方法检测了IFNG与IFNGR的结合。结果参见表3B。
表3B ELISA检测IFNG与IFNGR的结合
结合曲线参见图14，其中A图为tID1融合蛋白与IFNGR结合曲线，B图为IFN-γ与IFNGR结合曲线。
结果表明：tID1融合蛋白与IFN受体结合的EC50低于阳性对照IFN-γ的10倍以上，表明tID1融合蛋白与IFNGR有很好的结合活性。
(三)通过SPR法检测tID1融合蛋白与PD1抗原和IFNGR的结合
结果参见图15可见，tID1融合蛋白与PD-1抗原结合的ka(1/(M*s))为8.17e+05，Kd(1/s)为5.17e-03，KD(M)为6.32e-09，阳性对照抗PD-1抗体(Pdab)与PD-1抗原结合的ka(1/(M*s))为3.88e+05，Kd(1/s)为1.21e-03，KD(M)值为3.11e-09；tID1融合蛋白与IFN-γ受体结合的ka(1/(M*s))为2.04e+06，Kd(1/s)为1.64e-03，KD(M)为8.05e-10。以上数据表明tID1融合蛋白与PD-1抗原和IFN-γ受体的亲和力良好，能够满足治疗需求。
(四)通过ELISA测定tID1融合蛋白与不同动物PD-1的结合
方法：ELISA法检测tID1融合蛋白与人、小鼠、犬、猴PD-1的结合
1、将抗原人PD-1小鼠PD-1,犬PD-1,猴PD-1分别以2ug/mL的浓度包被ELISA板
2、样品稀释：将tID1融合蛋白(初始浓度0.257mg/mL，纯度98％)按照下表4稀释至不同浓度，以100μL/孔加入ELISA平板，37℃孵育1.5h
3、加入一抗：APC-anti IFN-gamma Ab(1:400)，100μL/孔，37℃孵育1h。
4、加入二抗：Goat anti mouse IgG HRP(1:2000)，100μL/孔，37℃孵育1h。
5、波长450nm下检测检测OD值，见表4
表4
Figure GDA0002133965060000311
结合曲线参见图16。根据结合曲线可知：tID1融合蛋白与人PD-1和猴PD-1结合，与小鼠PD-1和犬PD-1均不结合，由此可见本发明获得的融合tID1融合蛋白为人类PD-1特异性的。
(五)在分子水平上通过ELISA检测tID1融合蛋白融合蛋白对PD-1与PD-L1结合的阻断作用
方法：利用生物素标记的PD-1:PD-L1抑制剂筛选试剂盒(Acro Biosystems，EP-101)检测tID1融合蛋白对PD-1/PD-L1结合的阻断作用。参照产品说明书进行，简要来说，以100μL/孔2μg/mL的PD-L1包被ELISA板，4℃过夜；加入200μL/孔3％MPBS，37℃封闭3h；在离心管中加入0.6μL生物素化PD-1(100μg/mL)和不同稀释度tID1融合蛋白待测样品溶液100μL，37℃孵育1.5h；将测试样品和对照样品加入ELISA板，37℃孵育1.5h；PBST洗涤4遍，加100μL/孔HRP标记的链霉亲和素(0.4μg/mL)，37℃孵育1h；PBST洗涤4遍后显色；测A450值。
波长450nm下的OD值如下表5所示：
表5
Figure GDA0002133965060000312
Figure GDA0002133965060000321
阻断曲线参见图17
结果表明：tID1融合蛋白对PD-1与PD-L1的结合具有阻断作用。(六)通过流式细胞术在细胞水平上测定tID1融合蛋白与PD-1的结合实验
293T-PD-1细胞系是由申请人自行构建的可以稳定表达PD-1抗原的细胞系，构建所使用的293T细胞系为ATCC货号CRL-11268。
表6：tID1融合蛋白与293T-PD-1细胞的结合的EC50
Figure GDA0002133965060000322
通过流式细胞术检测tID1融合蛋白与293T-PD-1细胞的结合的结果如图18的结合曲线所示。
结果表明：本申请的tID1融合蛋白能够与293T-PD-1细胞系结合。
(七)tID1融合蛋白阻断293T-EGFP/PD-1与PD-L2的结合实验
方法中使用的PD-L2为HumanB7-DC/CD273protain-His(Cat：10292-H08H，SinoBiological)。检测通过流式细胞术进行。
tID1融合蛋白阻断293T-EGFP/PD-1与PD-L2的结合的OD450检测结果见下表7
表7
PDL2：3.5μg/mL
tID1融合蛋白阻断293T-EGFP/PD-1与PD-L2的结合曲线参见图19。
结果表明，tID1融合蛋白能够阻断293T-EGFP/PD-1与PD-L2的结合。
实施例9tID1融合蛋白促进肿瘤细胞表达PD-L1
测试了tID1融合蛋白对肝癌细胞hepG2和宫颈癌细胞hela的PD-L1表达水平的影响。方法如下：
1.将肝癌细胞hepG2和宫颈癌细胞hela分别以合适的密度接种于24孔培养板中。
2.配制2×稀释的tID1融合蛋白样品(tID1融合蛋白原浓度4.3μM，纯度98％。稀释方法如：用完全培养基稀释为272nM(2×136)，再2倍系列稀释，取500μL/孔，则终浓度为136nM)。
3对步骤1的24孔板中的细胞更换新的完全培养基，500μL/孔。
4取500μL配制好的样品及阳性对照品IFN-γ，加入对应的细胞孔中，于37℃5％CO2培养中孵育24h。
5.收集各孔细胞于1.5ml离心管中，PBS洗2次。
6.用100μL PBS重悬细胞后加入1μL的APC-CD274抗体(APC anti-humanCD274(PDL1，B7H1)Antibody APC，eBioscience)，于冰上避光孵育30min。
7.用PBS缓冲液洗涤2次，使用流式细胞术分析PD-L1的表达水平。
结果示于图20中。
结果表明：tID1融合蛋白的浓度与肿瘤细胞株的PD-L1表达水平存在量效关系。
对于hepG2细胞，随着tID1融合蛋白的浓度增加，PD-L1表达增加，但当tID1融合蛋白的浓度增大到2.72nM以上时，PD-L1表达水平达到饱和而不再增加(图A)；对于hela细胞，tID1融合蛋白以0.34nM的较低浓度就导致hela细胞高于阳性对照IFN-γ的PD-L1的表达水平(参见图B)，但随浓度继续增大，并未提高PD-L1的表达水平的。
因此，对于tID1融合蛋白，在低于同摩尔IFN-γ时，就能更有效地促进肝癌细胞hepG2和宫颈癌细胞hela表达PD-L1，这说明tID1融合蛋白的靶向特异性更优。
另一方面，图1数据还表明，tID1融合蛋白促进肝癌细胞hepG2和宫颈癌细胞hela表达与IFN-γ阳性对照相当的PD-L1时所需的浓度不同，前者为2.72nM，后者低于0.34nM，这也为后续筛选不同肿瘤细胞系的药物浓度提供了依据。
实施例9：tID1融合蛋白对肿瘤细胞增殖的影响
使用肝癌细胞hepG2和宫颈癌细胞hela测试了tID1融合蛋白对肿瘤细胞增殖的影响。方法如下:
1、将肝癌细胞hepG2和宫颈癌细胞hela以合适的密度分别接种于96孔培养板。
2、次日配制tID1融合蛋白的2×稀释样品(原始浓度：6.3μM纯度98％)。
3、对96孔板中的细胞更换新的完全培养基，50μL/孔。
4、取50μL配制好的样品，加入对应的细胞孔中，
于37℃5％CO2培养箱中孵育。
5、在24h和48h后采用增强型CCK8检测试剂盒(碧云天生物技术公司，货号C0041)进行细胞增殖检测。
结果示于图21和图22中。
如图2和图3所示，当浓度分别为84.7nM、169.4nM和338.8nM时，tID1融合蛋白对hepG2细胞作用48h的增殖抑制作用逐渐增强，但作用24h反而增加了细胞增殖；对于hela细胞，随tID1融合蛋白浓度增加，对细胞的增殖抑制作用逐渐增强，且随着作用时间延长，对增殖的抑制作用也明显增强。
实施例10：tID1融合蛋白与CD3诱导的CD4+T细胞的结合
通过流式检测术检测tID1融合蛋白与CD3诱导的CD4+T细胞的结合。方法如下：
1.PBMC的分离：淋巴细胞分离液Ficoll分离人外周血单个核细胞PBMC.
2.CD4+T细胞的诱导：向PBMC细胞中加入50ng/mL的CD3和100U/mL IL-2诱导并培养CD4+T细胞。
3.将2步骤的CD4+T细胞以3×105/50μL接种到V型96孔板中。
4.按照实验分组，加入不同浓度的tID1融合蛋白，同时设立调整补偿对照孔，每孔终体积为100μL，冰上水平摇床孵育90min。
5.PBS洗两次，500g离心5min。
6.向tID1融合蛋白组加入流式检测抗体His-tag，antiCD4和antiCD8各1μL，相应的调整补偿组也加入这些流式检测抗体，冰上水平摇床孵育30min。
7.PBS洗两次，500g离心5min。
8.将各孔细胞重悬于100μL PBS中，转至1.5mL离心管中，在流式细胞仪上检测tID1融合蛋白与CD3诱导的CD4+T细胞的结合。
结果参见如下表8和图23。结果表明，tID1融合蛋白能够与CD3诱导的CD4+T细胞的结合。
表8
Figure GDA0002133965060000361
实施例11.tID1融合蛋白促进PBMC对靶细胞的杀伤
(一)检测tID1融合蛋白对PBMC杀伤HepG2-luc细胞的影响。方法如下：
1)PBMC的分离：使用淋巴细胞分离液Ficoll分离人外周血单个核细胞PBMC；
2)细胞计数：计数HepG2-luc细胞，调整浓度至2×105/mL；计数PBMC，调整浓度至107/mL；
3)将PBMC细胞以50μL/孔加入圆底96孔板中，按照实验分组加入不同浓度的tID1融合蛋白，并加入50U/mL的IL-2进行刺激，调整每孔的终体积至100μL；
4)将HepG2-luc细胞以50μL/孔加入圆底96孔板中，同样按照实验分组加入不同浓度的tID1融合蛋白样品，调整每孔的终体积至100μL；
5)将步骤3)和4)的细胞分别于37℃培养箱静置10min；
6)把步骤4)的HepG2-luc细胞移至3)步骤的PBMC中，混合均匀，制备成效靶比为50:1的杀伤孔，每孔终体积为200μL，置于37℃培养箱培养；
7)分别在16h和24h取出96孔板，每孔加入100μL D-luc底物，使用小动物成像仪(AMIX，型号：SI-Image AMIX)检测生物发光的荧光强度。
结果如图24所示。
tID1融合蛋白以1.02nM，10.2nM和102nM三个浓度与PBMC和肝癌细胞hepG2共孵育16h和24h的结果表明：与阳性对照(抗PD1抗体：Anti-PD1mAb，Human(IgG4)Lot No.B52-63NS1-AS,ACRO Biosystems)组相比，这三个浓度均表现出明显的促进PBMC杀伤hepG2细胞的活性，以10.2nM浓度杀伤效果最强；10.2nM的tID1融合蛋白较同摩尔的抗PD1抗体具有更强促进PBMC对hepG2的杀伤活，且具有统计学意义。
(二)检测tID1融合蛋白对PBMC杀伤人膀胱癌细胞系T24细胞的作用
方法如本实施例的实验(一)所述。人膀胱癌细胞系T24细胞系购自ATCC货号HTB-4。结果参见图25。
tID1融合蛋白以10.2nM和102nM两个浓度与PBMC和人膀胱癌细胞系T24共孵育24h的结果表明：10.2nM的tID1融合蛋白较同摩尔的阳性对照(抗PD1抗体，来源同上)具有更强地促进PBMC对人膀胱癌细胞系T24的杀伤活性，且具有统计学意义。
本申请的以上实验数据证明，本申请提供的免疫治疗产品既具备抗肿瘤细胞因子的肿瘤杀伤作用，又具备免疫检查点抑制剂的精确靶向优势。因此，细胞因子与免疫检查点抑制剂的融合不仅使其较好地保持各自的功能，而且具有协同效果，从而本申请的融合物是在肿瘤治疗领域具有重要开发前景的新的肿瘤治疗方案。
虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
序列表
<110> 拜西欧斯（北京）生物技术有限公司
<120> 包含免疫检查点抑制剂的融合物及其制备方法和应用
<150> 201711123036.9
<151> 2017-11-14
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Val Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Arg Thr Ser Gln Thr Ile Arg Lys His Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser His Leu Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Asp Ile Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Gln Gln Arg Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
Gln Arg Tyr Asp Thr Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
Leu Gln Asp Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
Thr Tyr Asn Met His
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
Asn Tyr Asp Met His
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
Asn Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Asn Ser Gly Met His
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
Ser Ile Ser Arg Ser Ser Asp Tyr Ile
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Val Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
Pro Ile Ile Pro Ile His Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
Asp Ser Trp Ile Tyr Asp Gly Ser
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
Gln Ala His Tyr Tyr Asn Tyr Ser
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
Pro Leu Pro Lys Asn Gly Val Tyr Pro
1 5
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
Gly Asp Asp Ile Ala Thr Gly Gly Ile Arg Arg Tyr Tyr Tyr Asn Gly
1 5 10 15
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
Asn Asp Asp Tyr
1
<210> 32
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Arg Ser Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Trp Ile Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr Ser Ser Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
180 185 190
Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245
<210> 33
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu His Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ala His Tyr Tyr Asn Tyr Ser Thr Gly His Phe Ser
100 105 110
Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
130 135 140
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gln Arg
145 150 155 160
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Thr Ile Arg Lys His Leu Ala
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val Tyr Asp
180 185 190
Ile Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asp Thr Tyr Pro Arg Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245 250
<210> 34
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Lys Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Pro Leu Pro Lys Asn Gly Val Tyr Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ser Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg
180 185 190
Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys Arg
245
<210> 35
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
145 150 155 160
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
165 170 175
Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
195 200 205
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Arg
210 215 220
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
225 230 235
<210> 36
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
145 150 155 160
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
165 170 175
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
195 200 205
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Leu
210 215 220
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
225 230 235
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
gcggatccca ggacccatat gttaaag 27
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
ctccaccagc tgcacctg 18
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
caggtgcagc tggtggag 18
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
gcctcgagtt aacgtttgat ctccacgttg 30
<210> 41
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly
130 135
<210> 42
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
caggtccagc tggtacagtc tgggggagac ctggtcaagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcga cgtctggatt caccttcagt acctataaca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcg attagtcgta gcagtgatta catttattac 180
gcagactcag tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagac gtcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggctgtgt attattgtgc gagagattca 300
tggatctatg atggtagtgg ttattcctct gatgcttttg atatctgggg ccaagggaca 360
atggtcaccg tctctggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 420
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 480
ctctcctgca gggccagtca gagcattagc agctacttat cctggtatca gcagaaacct 540
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 600
aggttcagtg gcggtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 660
gaggattttg cagtttatta ctgtcaacag cgtaacagct ggccgctcac tttcggcgga 720
gggaccaagg tggagatcaa acgt 744
<210> 43
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaagtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt cagtttccgt aattatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaggg ggctggagtg ggtggcagtt acatggtatg atggaagtaa caaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cacagtatat 240
ctgcacataa acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagatcaa 300
gctcattatt acaattattc tactggtcat ttttcctact attttgactc ctggggccag 360
ggaaccctgg tcactgtctc cggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420
ggatcggaaa ttgtgttgac gcagtctcca gccaccctgt ctttgtctcc agggcaaaga 480
gccaccctct cctgcaggac cagtcagact attaggaaac acttagcctg gtatcaacaa 540
aaacctgggc aggctccccg tctcctcgtt tatgatattt ctagtagggc cacaggcatc 600
ccagccaggt ttagtggcag tgggtctggg acagacttca ctctcaccat cagcagcctg 660
caacctgatg attttgcaac ttattactgc caacgatatg atacatatcc gcggacgttc 720
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgt 750
<210> 44
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
aaggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc ggcacccctc 300
ccgaaaaatg gggtttaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtgga 360
ggcggttcag gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcggaaatt 420
gtgatgacac agtctccagc taccctgtct tcctctccag gggaaagagt caccctctcc 480
tgcagggcca gtcagagcgt tactagtcac ttagcctggt accaacaaag acctggccag 540
gctcccaggc tcctcattta tgatgcatcc aagagggcca ctggcatccc agccaggttc 600
agtggcagtg gatccgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat 660
tttgcaactt attactgtct acaggattac agataccccc ggacgttcgg ccaagggacc 720
aaggtggaaa tcaaacgt 738
<210> 45
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
caggtccagc tggtacagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt aactctggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttggtatg atggaagtaa aagatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gacaaacgac 300
gactactggg gccagggcac cctggtcact gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga 360
ggtggctctg gcggtggcgg atcggaaatt gtgatgacgc agtctccagc caccctgtct 420
ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc tgcagggcca gtcagagtgt tagcagcaac 480
ttagcctggt accagcaaaa acctggccag gctcccagac tcctcatcta tgatgcttcg 540
acccgggcca ctggcatccc agccaggttc agcggcagtg gatctggcac cgatttcact 600
ctcaccatca gcagcctaca gcctgaagat tttgcgactt attactgtct gcaagattac 660
aattaccctc ggacgttcgg ccaggggacc aagctggaaa tcaaacgt 708
<210> 46
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
gactgtaaag cgtctggaat caccttcagt aactctggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttggtatg atggaagtaa aagatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gacaaacgac 300
gactactggg gccagggaac cctggtcact gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga 360
ggtggctctg gcggtggcgg atcggaaatt gtgatgacac agtctccagc caccctgtcc 420
ttgtctccag gtgaaagagc caccctctcc tgcagggcca gtcagagtgt tagcagctcc 480
gtatcctggt accaacagaa acttggccag gctcccaggc tcctcatcta tgatgcatcc 540
aacagggcca ctggcatccc agccaggttc agtggcagtg ggtctgggac agacttcact 600
ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat tttgcagttt attactgtca gcagcgtagc 660
aagtggccgc tcactttcgg cgcagggacc aaggtggaga tcaaacgt 708
<210> 47
<211> 396
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Thr Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Arg Ser Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Trp Ile Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr
245 250 255
Ser Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
290 295 300
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
305 310 315 320
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
325 330 335
Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
355 360 365
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Ser Trp Pro
370 375 380
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
385 390 395
<210> 48
<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Thr Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Arg Ser Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Trp Ile Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr
245 250 255
Ser Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
290 295 300
Gly Gln Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Thr Ile Arg Lys
305 310 315 320
His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
325 330 335
Val Tyr Asp Ile Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
340 345 350
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
355 360 365
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asp Thr Tyr Pro
370 375 380
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
385 390 395
<210> 49
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 49
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
165 170 175
Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr
195 200 205
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
210 215 220
Ser Thr Ala Tyr Lys Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Pro Leu Pro Lys Asn Gly Val Tyr Pro Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
275 280 285
Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ser Ser Pro Gly Glu Arg
290 295 300
Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser His Leu Ala
305 310 315 320
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp
325 330 335
Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
340 345 350
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp
355 360 365
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr Phe
370 375 380
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
385 390
<210> 50
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
275 280 285
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
290 295 300
Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr
355 360 365
Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
370 375 380
<210> 51
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 51
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr
165 170 175
Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
275 280 285
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
290 295 300
Val Ser Ser Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
325 330 335
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
355 360 365
Lys Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
370 375 380
<210> 52
<211> 444
<212> DNA
<213> Human
<400> 52
caggacccat atgtaaaaga agcagaaaac cttaagaaat attttaatgc aggtcattca 60
gatgtagcgg ataatggaac tcttttctta ggcattttga agaattggaa agaggagagt 120
gacagaaaaa taatgcagag ccaaattgtc tccttttact tcaaactttt taaaaacttt 180
aaagatgacc agagcatcca aaagagtgtg gagaccatca aggaagacat gaatgtcaag 240
tttttcaata gcaacaaaaa gaaacgagat gacttcgaaa agctgactaa ttattcggta 300
actgacttga atgtccaacg caaagcaata catgaactca tccaagtgat ggctgaactg 360
tcgccagcag ctaaaacagg gaagcgaaaa aggagtcaga tgctgtttcg aggtggcggt 420
ggcggttctg gcggtggcgg ttct 444
<210> 53
<211> 1191
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
caggacccat atgtaaaaga agcagaaaac cttaagaaat attttaatgc aggtcattca 60
gatgtagcgg ataatggaac tcttttctta ggcattttga agaattggaa agaggagagt 120
gacagaaaaa taatgcagag ccaaattgtc tccttttact tcaaactttt taaaaacttt 180
aaagatgacc agagcatcca aaagagtgtg gagaccatca aggaagacat gaatgtcaag 240
tttttcaata gcaacaaaaa gaaacgagat gacttcgaaa agctgactaa ttattcggta 300
actgacttga atgtccaacg caaagcaata catgaactca tccaagtgat ggctgaactg 360
tcgccagcag ctaaaacagg gaagcgaaaa aggagtcaga tgctgtttcg aggtggcggt 420
ggcggttctg gcggtggcgg ttctcaggtc cagctggtac agtctggggg agacctggtc 480
aagccggggg ggtccctgag actctcctgt gcgacgtctg gattcacctt cagtacctat 540
aacatgcact gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtctc atcgattagt 600
cgtagcagtg attacattta ttacgcagac tcagtgaagg gccgattcac catgtccaga 660
gacaacgcca agacgtcact gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga cgacacggct 720
gtgtattatt gtgcgagaga ttcatggatc tatgatggta gtggttattc ctctgatgct 780
tttgatatct ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt caggtggagg cggttcaggc 840
ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggaa attgtgttga cacagtctcc agccaccctg 900
tctttgtctc caggggaaag agccaccctc tcctgcaggg ccagtcagag cattagcagc 960
tacttatcct ggtatcagca gaaacctggc caggctccca ggctcctcat ctatgatgca 1020
tccaacaggg ccactggcat cccagccagg ttcagtggcg gtgggtctgg gacagacttc 1080
actctcacca tcagcagcct agagcctgag gattttgcag tttattactg tcaacagcgt 1140
aacagctggc cgctcacttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaacg t 1191
<210> 54
<211> 1191
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
caggacccat atgtaaaaga agcagaaaac cttaagaaat attttaatgc aggtcattca 60
gatgtagcgg ataatggaac tcttttctta ggcattttga agaattggaa agaggagagt 120
gacagaaaaa taatgcagag ccaaattgtc tccttttact tcaaactttt taaaaacttt 180
aaagatgacc agagcatcca aaagagtgtg gagaccatca aggaagacat gaatgtcaag 240
tttttcaata gcaacaaaaa gaaacgagat gacttcgaaa agctgactaa ttattcggta 300
actgacttga atgtccaacg caaagcaata catgaactca tccaagtgat ggctgaactg 360
tcgccagcag ctaaaacagg gaagcgaaaa aggagtcaga tgctgtttcg aggtggcggt 420
ggcggttctg gcggtggcgg ttctcaggtc cagctggtac agtctggggg agacctggtc 480
aagccggggg ggtccctgag actctcctgt gcgacgtctg gattcacctt cagtacctat 540
aacatgcact gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtctc atcgattagt 600
cgtagcagtg attacattta ttacgcagac tcagtgaagg gccgattcac catgtccaga 660
gacaacgcca agacgtcact gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga cgacacggct 720
gtgtattatt gtgcgagaga ttcatggatc tatgatggta gtggttattc ctctgatgct 780
tttgatatct ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt caggtggagg cggttcaggc 840
ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggaa attgtgttga cgcagtctcc agccaccctg 900
tctttgtctc cagggcaaag agccaccctc tcctgcagga ccagtcagac tattaggaaa 960
cacttagcct ggtatcaaca aaaacctggg caggctcccc gtctcctcgt ttatgatatt 1020
tctagtaggg ccacaggcat cccagccagg tttagtggca gtgggtctgg gacagacttc 1080
actctcacca tcagcagcct gcaacctgat gattttgcaa cttattactg ccaacgatat 1140
gatacatatc cgcggacgtt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaacg t 1191
<210> 55
<211> 1181
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 55
caggacccat atgtaaaaga agcagaaaac cttaagaaat attttaatgc aggtcattca 60
gatgtagcgg ataatggaac tcttttctta ggcattttga agaattggaa agaggagagt 120
gacagaaaaa taatgcagag ccaaattgtc tccttttact tcaaactttt taaaaacttt 180
aaagatgacc agagcatcca aaagagtgtg gagaccatca aggaagacat gaatgtcaag 240
tttttcaata gcaacaaaaa gaaacgagat gacttcgaaa agctgactaa ttattcggta 300
actgacttga atgtccaacg caaagcaata catgaactca tccaagtgat ggctgaactg 360
tcgccagcag ctaaaacagg gaagcgaaaa aggagtcaga tgctgtttcg aggtggcggt 420
ggcggttctg gcggtggcgg ttccaggtcc agctggtgca gtctggggct gaggtgaaga 480
agcctgggtc ctcggtgaag gtctcctgca aggcttctgg aggcaccttc agcagctatg 540
ctatcagctg ggtgcgacag gcccctggac aagggcttga gtggatggga aggatcatcc 600
ctatccttgg tatagcaaac tacgcacaga agttccaggg cagagtcacg attaccgcgg 660
acaaatccac gagcacagcc tacaaggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 720
tgtattactg tgcggcaccc ctcccgaaaa atggggttta cccctggggc cagggaaccc 780
tggtcaccgt ctcctcaggt ggaggcggtt caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct 840
ctggcggtgg cggatcggaa attgtgatga cacagtctcc agctaccctg tcttcctctc 900
caggggaaag agtcaccctc tcctgcaggg ccagtcagag cgttactagt cacttagcct 960
ggtaccaaca aagacctggc caggctccca ggctcctcat ttatgatgca tccaagaggg 1020
ccactggcat cccagccagg ttcagtggca gtggatccgg gacagacttc actctcacca 1080
tcagcagcct agagcctgaa gattttgcaa cttattactg tctacaggat tacagatacc 1140
cccggacgtt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaacg t 1181
<210> 56
<211> 1151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 56
caggacccat atgtaaaaga agcagaaaac cttaagaaat attttaatgc aggtcattca 60
gatgtagcgg ataatggaac tcttttctta ggcattttga agaattggaa agaggagagt 120
gacagaaaaa taatgcagag ccaaattgtc tccttttact tcaaactttt taaaaacttt 180
aaagatgacc agagcatcca aaagagtgtg gagaccatca aggaagacat gaatgtcaag 240
tttttcaata gcaacaaaaa gaaacgagat gacttcgaaa agctgactaa ttattcggta 300
actgacttga atgtccaacg caaagcaata catgaactca tccaagtgat ggctgaactg 360
tcgccagcag ctaaaacagg gaagcgaaaa aggagtcaga tgctgtttcg aggtggcggt 420
ggcggttctg gcggtggcgg ttccaggtcc agctggtaca gtctggggga ggcttggtca 480
agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg tagcgtctgg attcaccttc agtaactctg 540
gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca gttatttggt 600
atgatggaag taaaagatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag 660
acaattccaa gaacacgctg tttctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg 720
tgtattactg tgcgacaaac gacgactact ggggccaggg caccctggtc actgtctcct 780
caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggaa attgtgatga 840
cgcagtctcc agccaccctg tctttgtctc caggggaaag agccaccctc tcctgcaggg 900
ccagtcagag tgttagcagc aacttagcct ggtaccagca aaaacctggc caggctccca 960
gactcctcat ctatgatgct tcgacccggg ccactggcat cccagccagg ttcagcggca 1020
gtggatctgg caccgatttc actctcacca tcagcagcct acagcctgaa gattttgcga 1080
cttattactg tctgcaagat tacaattacc ctcggacgtt cggccagggg accaagctgg 1140
aaatcaaacg t 1151
<210> 57
<211> 1151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 57
caggacccat atgtaaaaga agcagaaaac cttaagaaat attttaatgc aggtcattca 60
gatgtagcgg ataatggaac tcttttctta ggcattttga agaattggaa agaggagagt 120
gacagaaaaa taatgcagag ccaaattgtc tccttttact tcaaactttt taaaaacttt 180
aaagatgacc agagcatcca aaagagtgtg gagaccatca aggaagacat gaatgtcaag 240
tttttcaata gcaacaaaaa gaaacgagat gacttcgaaa agctgactaa ttattcggta 300
actgacttga atgtccaacg caaagcaata catgaactca tccaagtgat ggctgaactg 360
tcgccagcag ctaaaacagg gaagcgaaaa aggagtcaga tgctgtttcg aggtggcggt 420
ggcggttctg gcggtggcgg ttccaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcgtggtcc 480
agcctgggag gtccctgaga ctcgactgta aagcgtctgg aatcaccttc agtaactctg 540
gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca gttatttggt 600
atgatggaag taaaagatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag 660
acaattccaa gaacacgctg tttctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg 720
tgtattactg tgcgacaaac gacgactact ggggccaggg aaccctggtc actgtctcct 780
caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggaa attgtgatga 840
cacagtctcc agccaccctg tccttgtctc caggtgaaag agccaccctc tcctgcaggg 900
ccagtcagag tgttagcagc tccgtatcct ggtaccaaca gaaacttggc caggctccca 960
ggctcctcat ctatgatgca tccaacaggg ccactggcat cccagccagg ttcagtggca 1020
gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa gattttgcag 1080
tttattactg tcagcagcgt agcaagtggc cgctcacttt cggcgcaggg accaaggtgg 1140
agatcaaacg t 1151
<210> 58
<211> 537
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu
145 150 155 160
Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala
165 170 175
Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu
180 185 190
Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys
195 200 205
Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu
210 215 220
Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys
225 230 235 240
Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu
245 250 255
Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu
260 265 270
Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu
275 280 285
Phe Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
290 295 300
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
305 310 315 320
Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His
325 330 335
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
340 345 350
Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
355 360 365
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met
370 375 380
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn
385 390 395 400
Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
420 425 430
Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
435 440 445
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Trp
450 455 460
Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
485 490 495
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe
500 505 510
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Leu Thr Phe Gly
515 520 525
Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
530 535
<210> 59
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
caggacccct acgtgaagga ggccgagaac ctgaagaagt acttcaacgc tggccacagc 60
gacgtggccg acaacggcac cctgttcctg ggcatcctga agaactggaa ggaggagagc 120
gaccgcaaga tcatgcagag ccagatcgtg agcttctact tcaagctgtt caagaacttc 180
aaggacgacc agagcatcca gaagagcgtg gagaccatca aggaggacat gaacgtgaag 240
ttcttcaaca gcaacaagaa gaagcgcgac gacttcgaga agctgaccaa ctacagcgtg 300
accgacctga acgtgcagcg caaggccatc cacgagctga tccaggtgat ggccgagctg 360
agccctgctg ccaagaccgg caagcgcaag cgcagccaga tgctgttcag aggcggaggc 420
ggaggcagcg gcggaggcgg aagcggaggc ggaggcagcc aggaccccta cgtgaaggag 480
gccgagaacc tgaagaagta cttcaacgct ggccacagcg acgtggccga caacggcacc 540
ctgttcctgg gcatcctgaa gaactggaag gaggagagcg accgcaagat catgcagagc 600
cagatcgtga gcttctactt caagctgttc aagaacttca aggacgacca gagcatccag 660
aagagcgtgg agaccatcaa ggaggacatg aacgtgaagt tcttcaacag caacaagaag 720
aagcgcgacg acttcgagaa gctgaccaac tacagcgtga ccgacctgaa cgtgcagcgc 780
aaggccatcc acgagctgat ccaggtgatg gccgagctga gccctgctgc caagaccggc 840
aagcgcaagc gcagccagat gctgttcaga ggcggaggag gcggatccgg aggaggcggc 900
agccaggtgc agctggtgga gagcggaggc ggcgtggtgc agcccggcag aagcctgcgc 960
ctggactgca aggccagcgg catcaccttc agcaacagcg gcatgcactg ggtgcgccag 1020
gcccctggca agggcctgga gtgggtggcc gtgatctggt acgacggcag caagcgctac 1080
tacgccgaca gcgtgaaggg ccgcttcacc atcagccgcg acaacagcaa gaacaccctg 1140
ttcctgcaga tgaacagcct gagagccgag gacaccgccg tgtactactg cgccaccaac 1200
gacgactact ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gcggaggagg cggcagcgga 1260
ggcggaggct ccggaggcgg aggcagcgag atcgtgatga cccagagccc tgccaccctg 1320
agcctgagcc ctggcgagag agccaccctg agctgcagag ccagccagag cgtgagcagc 1380
agcgtgagct ggtatcagca gaagctgggc caggccccca gactgctgat ctacgacgcc 1440
agcaaccgcg ccaccggcat ccctgccaga ttcagcggca gcggcagcgg caccgacttc 1500
accctgacca tcagcagcct ggagcccgag gacttcgccg tgtactactg ccagcagcgc 1560
agcaagtggc ccctgacctt cggcgctggc accaaggtgg agatcaagcg c 1611
<210> 60
<211> 1747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cgctcgagaa gcttgccgcc accatgaagt acaccagcta catcctggcc ttccagctgt 60
gcatcgtgct gggcagcctg ggctgctact gccaggaccc ctacgtgaag gaggccgaga 120
acctgaagaa gtacttcaac gctggccaca gcgacgtggc cgacaacggc accctgttcc 180
tgggcatcct gaagaactgg aaggaggaga gcgaccgcaa gatcatgcag agccagatcg 240
tgagcttcta cttcaagctg ttcaagaact tcaaggacga ccagagcatc cagaagagcg 300
tggagaccat caaggaggac atgaacgtga agttcttcaa cagcaacaag aagaagcgcg 360
acgacttcga gaagctgacc aactacagcg tgaccgacct gaacgtgcag cgcaaggcca 420
tccacgagct gatccaggtg atggccgagc tgagccctgc tgccaagacc ggcaagcgca 480
agcgcagcca gatgctgttc agaggcggag gcggaggcag cggcggaggc ggaagcggag 540
gcggaggcag ccaggacccc tacgtgaagg aggccgagaa cctgaagaag tacttcaacg 600
ctggccacag cgacgtggcc gacaacggca ccctgttcct gggcatcctg aagaactgga 660
aggaggagag cgaccgcaag atcatgcaga gccagatcgt gagcttctac ttcaagctgt 720
tcaagaactt caaggacgac cagagcatcc agaagagcgt ggagaccatc aaggaggaca 780
tgaacgtgaa gttcttcaac agcaacaaga agaagcgcga cgacttcgag aagctgacca 840
actacagcgt gaccgacctg aacgtgcagc gcaaggccat ccacgagctg atccaggtga 900
tggccgagct gagccctgct gccaagaccg gcaagcgcaa gcgcagccag atgctgttca 960
gaggcggagg aggcggatcc ggaggaggcg gcagccaggt gcagctggtg gagagcggag 1020
gcggcgtggt gcagcccggc agaagcctgc gcctggactg caaggccagc ggcatcacct 1080
tcagcaacag cggcatgcac tgggtgcgcc aggcccctgg caagggcctg gagtgggtgg 1140
ccgtgatctg gtacgacggc agcaagcgct actacgccga cagcgtgaag ggccgcttca 1200
ccatcagccg cgacaacagc aagaacaccc tgttcctgca gatgaacagc ctgagagccg 1260
aggacaccgc cgtgtactac tgcgccacca acgacgacta ctggggccag ggcaccctgg 1320
tgaccgtgag cagcggagga ggcggcagcg gaggcggagg ctccggaggc ggaggcagcg 1380
agatcgtgat gacccagagc cctgccaccc tgagcctgag ccctggcgag agagccaccc 1440
tgagctgcag agccagccag agcgtgagca gcagcgtgag ctggtatcag cagaagctgg 1500
gccaggcccc cagactgctg atctacgacg ccagcaaccg cgccaccggc atccctgcca 1560
gattcagcgg cagcggcagc ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc ctggagcccg 1620
aggacttcgc cgtgtactac tgccagcagc gcagcaagtg gcccctgacc ttcggcgctg 1680
gcaccaaggt ggagatcaag cgcggaggcc accaccacca tcaccactga taatctagag 1740
gtaccgc 1747

Claims (15)

1.一种用于免疫治疗的融合物，其包括免疫检查点抑制剂和细胞因子，其中所述抗免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包括
分别为SEQ ID NO:3、7和13所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQID NO:21、26和31所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3。
2.根据权利要求1所述的融合物，其中所述细胞因子选自：白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)、转化生长因子、生长因子(growth factor，GF)和趋化因子家族(chemokine family)。
3.根据权利要求2所述的融合物，其中所述集落刺激因子(colony stimulatingfactor,CSF)选自G(粒细胞)-CSF、M(巨噬细胞)-CSF、GM(粒细胞、巨噬细胞)-CSF、Multi(多重)-CSF(IL-3)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)和红细胞生成素(erythropoietin，EPO)；
所述肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)选自TNF-α和TNF-β；
所述转化生长因子选自转化生长因子β家族(transforming growth factor-βfamily,TGF-βfamily)的TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGFβ1β2和骨形成蛋白(BMP)；
所述生长因子(growth factor，GF)选自表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)；
所述趋化因子家族(chemokine family)选自C-X-C/α亚族、C-C/β亚族、C型亚家族和CX3C亚家族；其中所述C-X-C/α亚族选自IL-8、生长调节致癌基因/黑素瘤生长刺激因子(GRO/MGSA)、血小板因子-4(PF-4)、血小板碱性蛋白(PBP/CXCL7)、蛋白水解来源的产物CTAP-Ⅲ和β-血小板球蛋白(β-thromboglobulin，β-TG)、趋化因子IP-10(interferon-inducible protein-10)和上皮粒细胞激活蛋白78(Epithelial Neutrophil-ActivatingProtein 78，ENA-78)；所述C-C/β亚族选自巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、MIP-1β、RANTES(regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted，CCL5)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/MCAF)、MCP-2、MCP-3和I-309；所述C型亚家族选自淋巴细胞趋化蛋白；所述CX3C亚家族选自趋化因子分形素(Fractalkine)。
4.根据权利要求2所述的融合物，其中所述干扰素选自IFN-α、IFN-β和IFN-γ中的任一种。
5.根据权利要求4所述的融合物，其中所述细胞因子是IFN-γ。
6.根据权利要求5所述的融合物，其氨基酸序列由SEQ ID NO:58组成。
7.根据实施方案5所述的融合物，其编码核苷酸序列由：SEQ ID NO:59组成。
8.一种制备权利要求1-7中任一项所述的融合物的方法，包括步骤：
(1)测定根据权利要求1-7的任一项中的免疫检查点抑制剂的氨基酸序列；
(2)根据步骤(1)所得的免疫检查点抑制剂的氨基酸序列确定编码所述免疫检查点抑制剂的核苷酸序列；
(3)以步骤(2)所得的编码所述免疫检查点抑制剂的核苷酸序列和编码细胞因子的核苷酸序列为模板，分别设计扩增所述免疫检查点抑制剂的引物和扩增所述细胞因子的引物；
(4)组构建免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白表达载体；
(5)将免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白表达载体转化到受体菌株中；
(6)筛选免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白的表达菌株；
(7)表达免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白并测序；
(8)纯化免疫检查点抑制剂-细胞因子融合蛋白。
9.编码根据权利要求1-7中任一项所述的融合物的核酸分子。
10.包含根据权利要求1-7中任一项所述的融合物的蛋白质或多肽。
11.检测根据权利要求1-7中任一项所述的免疫检查点抑制剂-细胞因子融合物的活性的方法。
12.权利要求1～7任一项所述的免疫检查点抑制剂-细胞因子融合物在制备治疗疾病、改善或缓解不适的药物中的应用，所述疾病和不适为癌症。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述癌症选自子宫癌、鳞状细胞癌、内分泌系统的癌症、非何杰金氏淋巴瘤和慢性或急性白血病。
14.根据权利要求12所述的应用，其中所述癌症选自肝癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肾上腺癌、肛区癌、阴户癌、尿道癌、阴茎癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、表皮样癌、何杰金氏病、软组织肉瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、T细胞淋巴瘤、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病的一种或更多种。
15.根据权利要求12所述的应用，其中所述癌症选自儿童期实体瘤和淋巴细胞性淋巴瘤。
CN201811348564.9A 2017-11-14 2018-11-13 包含免疫检查点抑制剂的融合物及其制备方法和应用 Active CN109503718B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2017111230369 2017-11-14
CN201711123036 2017-11-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109503718A CN109503718A (zh) 2019-03-22
CN109503718B true CN109503718B (zh) 2020-02-21

Family

ID=65748366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811348564.9A Active CN109503718B (zh) 2017-11-14 2018-11-13 包含免疫检查点抑制剂的融合物及其制备方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN109503718B (zh)
WO (1) WO2019096137A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3946471B1 (en) * 2019-03-29 2024-05-15 Taipei Medical University Porous hollow fiber membrane and methods of using it to select immune checkpoint inhibitor
CN113368217B (zh) * 2020-03-09 2024-02-27 四川大学华西医院 IFN-γ在制备抗肿瘤辅助药物中的应用
CN112341538A (zh) * 2020-10-27 2021-02-09 苏州复融生物技术有限公司 一种Fc单体多肽及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103536917B (zh) * 2013-10-30 2015-03-11 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 干扰素在治疗肿瘤中的用途及相关的产品和方法
JP2017509319A (ja) * 2014-01-15 2017-04-06 カドモン コーポレイション，リミティド ライアビリティ カンパニー 免疫調節剤
CN104479020B (zh) * 2014-12-26 2019-08-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种抗pd-1人源抗体
CN104479019B (zh) * 2014-12-26 2020-07-21 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种抗ctla-4人源抗体
AU2016297583A1 (en) * 2015-07-22 2018-02-01 Hznp Limited Combination of immunomodulatory agent with PD-1-or PD-L1 checkpoint inhibitors in the treatment of cancer
CN108250303B (zh) * 2016-12-19 2023-01-03 南京金斯瑞生物科技有限公司 单域抗体融合蛋白及其应用
CN107082812B (zh) * 2017-03-29 2018-11-13 上海科医联创生物科技有限公司 一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019096137A1 (zh) 2019-05-23
CN109503718A (zh) 2019-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022200257B2 (en) Chimeric antigen receptors and methods of use thereof
US11161904B2 (en) Anti-PD-1 antibody and use thereof
US10889648B2 (en) Anti-PD-L1 antibodies and uses thereof
CN107405397B (zh) 抗tim-3抗体
CN113039205B (zh) 靶向cll1的抗体及其应用
JP2019001789A (ja) ヒトｃｓｆ−１ｒに対する抗体とヒトｐｄ−ｌ１に対する抗体の併用療法
KR20200080270A (ko) 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체
CN113365660A (zh) 对受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)具特异性的抗体及嵌合抗原受体
KR20180132751A (ko) Bcma 결합 분자 및 그의 사용 방법
KR20170102167A (ko) 항-pd-l1 항체
CN107428839A (zh) 针对CD3ε和BCMA的双特异性抗体
EA036779B1 (ru) Моноклональное антитело к pd-1 и способ его получения
CN109503718B (zh) 包含免疫检查点抑制剂的融合物及其制备方法和应用
KR20230024984A (ko) Cd70-지시 암 면역요법용 유전적으로 변형된 자연 살해 세포
WO2019096136A1 (zh) 抗pd-1抗体及其制备方法和应用
CN116120465B (zh) 一种靶向bcma和/或fcrh5的嵌合抗原受体及其应用
JP2021501575A (ja) 二重特異性抗体並びにその製造方法及び使用方法
CN113754770B (zh) 一种特异性结合人ctla4的抗体及包含其的药物和试剂盒
CN113321735B (zh) 一种多功能融合蛋白
CN116178545A (zh) 一种抗人pd-l1人源化抗体或其抗原结合片段及其应用
TW202229358A (zh) 前列腺癌嵌合抗原受體
TWI826995B (zh) Ｔａｃｉ結合分子
CN114805581B (zh) 靶向il13ra2的抗体、嵌合抗原受体及其用途
CN115785269B (zh) 抗pd-l1的抗体及其应用
WO2023030311A1 (zh) 靶向Siglec15的抗原结合蛋白及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wei Hui

Inventor after: Han Huamin

Inventor after: Zhang Shuren

Inventor after: Gao Rongkai

Inventor after: Wei Xiaoli

Inventor before: Han Huamin

Inventor before: Zhang Shuren

Inventor before: Gao Rongkai

Inventor before: Chu Lixin

Inventor before: Xu Yi

Inventor before: Jin Jin

Inventor before: Wei Xiaoli

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant