CN116178545A - 一种抗人pd-l1人源化抗体或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

一种抗人pd-l1人源化抗体或其抗原结合片段及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种抗人PD‑L1人源化抗体或其抗原结合片段及其应用。本发明中的抗体或其抗原结合片段与PD‑L1的亲和力高，结合特异性强，能有效阻断PD‑L1与PD‑1、CD80的结合，并刺激细胞因子产生，且抗肿瘤作用显著，能够与单独或与其它试剂组合用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病。

Description

一种抗人PD-L1人源化抗体或其抗原结合片段及其应用
优先权声明
本申请要求申请号为202111123520.8，申请日为2021年9月24日，发明名称为一种抗人PD-L1人源化抗体或其抗原结合片段及其应用的中国发明专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种抗人PD-L1人源化抗体或其抗原结合片段及其应用。
背景技术
程序化细胞死亡蛋白1(PD-1，也称为CD279)是一种表达在抗原刺激T细胞表面的共刺激受体。PD-L1(CD274)和PD-L2(CD273)是PD-1的两种配体。PD-L1表达在包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞、巨大细胞等造血细胞，及血管内皮细胞、角质细胞、胰岛细胞、星形胶质细胞、胎盘合包体滋养层、角膜表皮和内皮细胞在内的非造血细胞。PD-L1和PD-L2在多种肿瘤细胞和肿瘤基质中表达。PD-1和PD-L1均属于免疫超家族蛋白中的I形跨膜蛋白，由Ig-V和Ig-C样胞外结构域、跨膜结构域和短序列的胞内结构域组成。PD-L1和PD-1胞外区的相互作用能诱导PD-1蛋白构象变化，从而诱导胞内免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转化基序(ITSM)被Src家族激酶磷酸化。磷酸化的酪氨酸基序随后招募SHP-2和SHP-1蛋白酪氨酸磷酸酶下调T胞活化信号。除PD-1外，PD-L1与CD80相互作用，从而传递抑制T细胞活性的信号。PD-1和PD-L1相互作用可在多方面下调T细胞活性，包括抑制T细胞增殖，细胞因子的释放和其他效应功能。
PD-1和PD-L1相互作用对于免疫系统的稳态至关重要。不同基因型的PD-1缺陷型小鼠倾向于发生狼疮样自体免疫病或致命性自体免疫心肌病。PD-1缺陷型小鼠改变了胸腺T细胞的驯化，PD-L1的阻断能够破坏胎儿和母体之间的耐受性。同时，抑制PD-1和PD-L1的相互作用增强了宿主对病原体的免疫作用。PD-L1表达在多种不良预后的肿瘤(例如，肾癌、胃癌、尿道上皮癌、卵巢癌和黑色素瘤)上，使用PD-L1抗体能杀死肿瘤细胞或抑制杀伤性T细胞CTLs的活性。
鉴于PD-1、CD80和PD-L1在下调免疫反应方面的重要性，开发阻断PD-L1蛋白与PD-1、CD80相互作用，同时免疫原性风险低的抗PD-L1抗体，从而将其用于肿瘤免疫治疗具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明提供了一种抗人PD-L1人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链CDR区和轻链CDR区，重链CDR区由HCDR1、HCDR2、HCDR3组成，轻链CDR区由LCDR1、LCDR2、LCDR3组成，HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:14～16，LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:17～19，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3～7任一所示。
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本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段相关的核酸、载体、细胞。
本发明还提供了一种生产所述抗体或其抗原结合片段的方法。
本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段相关的药物组合物。
本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞、所述药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病的药物中的应用。
附图说明
图1是13株抗人PD-L1人源化抗体与CHO-FP1空细胞的结合活性图。
图2是13株抗人PD-L1人源化抗体与CHO-mPD-L1稳定细胞株的结合活性图。
图3是抗人PD-L1人源化抗体176L1H1、176L1H2、176L1H3、176L2H1、176L2H2、176L2H3与CHO-hPD-L1稳定细胞株的结合活性图。
图4是抗人PD-L1人源化抗体176L3H2、176L4H1、176L4H2、176L4H3、176L4H4、176L5H2、176L6H5与CHO-hPD-L1稳定细胞株的结合活性图。
图5是抗人PD-L1人源化抗体176L1H1、176L1H2、176L1H3、176L2H1、176L2H2、176L2H3与CHO-cynoPD-L1稳定细胞株的结合活性图。
图6是抗人PD-L1人源化抗体176L3H2、176L4H1、176L4H2、176L4H3、176L4H4、176L5H2、176L6H5与CHO-cynoPD-L1稳定细胞株的结合活性图。
图7是抗人PD-L1人源化抗体176L1H1、176L1H2、176L1H3、176L2H1、176L2H3、176L3H2与hIFNγ刺激的A375细胞的结合活性图。
图8是抗人PD-L1人源化抗体176L4H1、176L4H2、176L4H3、176L4H4、176L5H2、176L6H5与hIFNγ刺激的A375细胞的结合活性图。
图9是抗人PD-L1人源化抗体176L1H1、176L1H2、176L1H3、176L2H1、176L2H3、176L3H2阻断PD-1与PD-L1结合的阻断活性图。
图10是抗人PD-L1人源化抗体176L4H1、176L4H2、176L4H3、176L4H4、176L5H2、176L6H5阻断PD-1与PD-L1结合的阻断活性图。图11是抗人PD-L1人源化抗体176L1H1、176L1H2、176L1H3、176L2H1、176L2H3、176L3H2阻断CD80与PD-L1结合的阻断活性图。
图12是抗人PD-L1人源化抗体176L4H1、176L4H2、176L4H3、176L4H4、176L5H2、176L6H5阻断CD80与PD-L1结合阻断活性图。
图13是荧光素酶报告基因法分析抗人PD-L1人源化抗体176L2H3、176L3H2、176L4H2、176L4H4的体外活性图。
图14是荧光素酶报告基因法分析抗人PD-L1人源化抗体176L4H1、176L4H3、176L5H2、176L6H5的体外活性图。
图15是抗人PD-L1人源化抗体176L4H1、176L4H3介导的混合淋巴细胞反应中IL-2的分泌结果图。
图16是抗人PD-L1人源化抗体176L4H2、176L6H5介导的混合淋巴细胞反应中IL-2的分泌结果图。
图17是抗人PD-L1人源化抗体176L4H4、176L5H2介导的混合淋巴细胞反应中IL-2的分泌结果图。
图18是抗人PD-L1人源化抗体176L4H1、176L4H3介导的混合淋巴细胞反应中IFNγ的分泌结果图。
图19是抗人PD-L1人源化抗体176L4H2、176L6H5介导的混合淋巴细胞反应中IFNγ的分泌结果图。
图20是抗人PD-L1人源化抗体176L4H4、176L5H2介导的混合淋巴细胞反应中IFNγ的分泌结果图。
图21是13株抗人PD-L1人源化抗体与重组人PD-L1蛋白的结合活性图。
图22是13株抗人PD-L1人源化抗体与重组人PD-L2蛋白的结合活性图。
图23是13株抗人PD-L1人源化抗体与重组人PD-1蛋白的结合活性图。
图24是13株抗人PD-L1人源化抗体与重组人ICOS蛋白的结合活性图。
图25是13株抗人PD-L1人源化抗体与重组人ICOSLG蛋白的结合活性图。
图26是13株抗人PD-L1人源化抗体与重组人CD276蛋白的结合活性图。
图27是13株抗人PD-L1人源化抗体与重组人CD86蛋白的结合活性图。
图28是13株抗人PD-L1人源化抗体与重组人CD28蛋白的结合活性图。
图29是13株抗人PD-L1人源化抗体与重组人CTLA-4蛋白的结合活性图。
图30是抗人PD-L1人源化抗体176L6H5、176L5H2和176L4H1的体内抗肿瘤活性结果图；其中，(a)图是抗人PD-L1人源化抗体对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响结果图；(b)图是抗人PD-L1人源化抗体对荷瘤小鼠生存率的影响结果图；(c)图是抗人PD-L1人源化抗体对荷瘤小鼠体重的影响结果图。
具体实施方式
本发明涉及一种抗人PD-L1人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链CDR区和轻链CDR区，重链CDR区由HCDR1、HCDR2、HCDR3组成，轻链CDR区由LCDR1、LCDR2、LCDR3组成，HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:14～16，LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:17～19，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3～7任一所示。
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本发明的抗体或其抗原结合片段具有以下如下至少一种特性：1.阻断PD-1、CD80与PD-L1的结合，与稳定表达人PD-L1的CHO、稳定表达猕猴PD-L1的CHO的结合活性高，与人PD-L1的结合动力学常数在pM级别；2.可介导IL-2和IFNγ细胞因子的产生；3.特异性高，不与除PD-L1外的其他B7家族蛋白及其他相关性蛋白结合；4.具有显著的抗肿瘤活性。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段能够与单独或与其它试剂组合用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病。
在本发明中，术语“抗体或其抗原结合片段”是结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段。“抗体”特别指全长抗体。“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，术语“抗原结合片段”是包含抗体CDR的一部分或全部的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因此可结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。
在本发明中，术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。有三种重链CDR和三种轻链CDR。此处，取决于情况，术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或其抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。
在本发明中，重链的互补决定区用HCDR表示，轻链的互补决定区用LCDR表示。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在他们的“免疫学蛋白质序列”(Sequences of Proteins of Immunological Interest)的汇编中，轻链(λ，κ)可变区和抗体重链的氨基酸序列，以及T细胞受体的可变区(α，β，γ，δ)对齐并编号。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。
在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8～13任一所示。
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在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如下表任一项所示：
抗人PD-L1人源化抗体 重链可变区 轻链可变区
176L1H1 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.8
176L1H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.8
176L1H3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.8
176L2H1 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.9
176L2H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.9
176L2H3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.9
176L3H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.10
176L4H1 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.11
176L4H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.11
176L4H3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.11
176L4H4 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.11
176L5H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.12
176L6H5 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.13
在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3～6任一、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在一些实施方式中，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD中的任一种的恒定区序列。
在一些实施方式中，所述轻链恒定区为κ或λ链。
在一些实施方式中，所述重链恒定区和轻链恒定区的种属来源选自牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人中的任一种。
在一些实施方式中，所述抗体为双特异性抗体、CDR移植抗体或多聚体抗体中的任一种或几种。
在本发明中，术语“双特异性抗体”是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可通过多种方法产生，包括，但不限于杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，所述表位存在于相同或不同的蛋白质靶标上。
在本发明中，术语“CDR移植抗体”，也称为“人源化抗体”，具体是指将小鼠的CDR区序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。目的是克服嵌合抗体由于携带大量其他物种例如小鼠的蛋白成分从而在人体中诱导强烈的免疫副反应。
在一些实施方式中，所述抗原结合片段为scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv中的任一种或几种。
在本发明中，术语“F(ab’)2”含有两条轻链和两条含有CH1与VH结构域之间的部分的重链，以便在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段从而由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连；术语“Fab”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段，通常被认为是能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。
本发明还涉及核酸，所述核酸编码所述抗体或其抗原结合片段。
在本发明中，核酸通常是RNA或DNA，核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时优选采用DNA。此外，鉴于抗体为膜蛋白，所以核酸通常带有信号肽序列。
本发明还涉及载体，所述载体包含所述核酸。
在本发明中，术语“载体(vector)”是可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
本发明还涉及细胞，所述细胞携带所述核酸、含有所述载体或表达所述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述细胞为真核哺乳动物细胞。
在一些实施方式中，所述细胞为中国仓鼠CHO细胞。
本发明还涉及一种生产所述抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在培养基中培养所述细胞；以及从培养基中或从所培养的细胞中回收如此产生的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及药物组合物，所述组合物含有所述抗体或其抗原结合片段、或所述核酸、或所述载体或所述细胞。
在本发明中，术语“药物组合物”是以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。
在一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在本发明中，术语“药学可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等，用来延长抗体的保存限期或效力。
本发明还涉及所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞、所述药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病的药物中的应用。
本发明包括以下有益效果：
本发明的抗人PD-L1人源化抗体或其抗原结合片段与稳定表达人PD-L1的CHO、稳定表达猕猴PD-L1的CHO的结合活性高，与人PD-L1的结合动力学常数在pM级别，具有很好的阻断PD-1、CD80与PD-L1的结合活性，能够介导IL-2和IFNγ细胞因子的产生，特异性高，不与除PD-L1外的其他B7家族蛋白及其他相关性蛋白结合，具有显著的抗肿瘤活性，与阳性对照抗体的抗肿瘤效果相当或更好；且本发明人源化后得到的抗人PD-L1人源化抗体的免疫源性风险低；因此，本发明的抗体或其抗原结合片段能够与单独或与其它试剂组合用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病。
实施例
实施例1抗人PD-L1人源化抗体的制备
1、人源化抗体设计
申请号为202011541107.9的专利中的抗人PD-L1鼠单抗(重链可变区的氨基酸如SEQ ID NO:1所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)与PD-L1蛋白的亲和力和特异性高，能阻断细胞表面表达的PD-L1与PD-1的相互作用，并显示出刺激细胞因子产生的生物学功能活性；因此，本实施例对以上抗人PD-L1鼠单抗进行人源化，共设计5条重链可变区和6条轻链可变区序列，其氨基酸序列如下表1所示。其中，抗人PD-L1鼠单抗以下简称为176F9。
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRISFTRDTSKNQYYLQLSSVTTEDTATYYCARSRAWIRTYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1)
EIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKSETSPKPWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO:2)
表1抗人PD-L1人源化抗体的氨基酸序列
抗人PD-L1人源化抗体 重链可变区 轻链可变区
176L1H1 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.8
176L1H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.8
176L1H3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.8
176L2H1 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.9
176L2H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.9
176L2H3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.9
176L3H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.10
176L4H1 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.11
176L4H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.11
176L4H3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.11
176L4H4 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.11
176L5H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.12
176L6H5 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.13
2、抗人PD-L1人源化抗体的生产
本文披露的嵌合抗体由人IgG1恒定结构域组合小鼠重链可变区和轻链可变区而成。在嵌合抗体表达序列前端增加分泌信号肽表达序列，将其克隆到哺乳动物表达载体，并转染到Expi293细胞中以生成嵌合(鼠类-人类)抗体。收集含嵌合抗体的培养基上清，使用蛋白质A纯化。
本文披露的人源化抗体轻链和重链设计遵循以下披露的普遍接受的规则：“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析]”，于以下中：Antibody Engineering Lab Manual,eds.S.Duebel and R.Kontermann,Springer-Verlag,Heidelberg(2001)[抗体工程化实验室手册，S.Duebel和R.Kontermann编辑，施普林格公司，海德尔堡(2001)])。在人源化抗体的重链表达序列和轻链表达序列的前端增加分泌信号肽表达序列，将连接信号肽序列后的重链表达序列和轻链表达序列克隆到哺乳动物表达载体中，并且转染到293细胞中以生成人源化单克隆抗体(mAb)。收集含人源化抗体的培养上清，使用蛋白质A纯化。
在Expi293细胞中表达以及纯化实施例中使用的avelumab阳性对照抗体是指在Expi293细胞中瞬时表达的人PD-L1抗体(国际发明专利WO 2013/079174 A1)。
使用载体pCDNA3.4对Expi293细胞中抗体进行瞬时表达。首先将抗体的重链和轻链克隆到单独的pCDNA3.4载体中。然后，使用化学转染的方法将带有抗体分子重链和轻链的pCDNA3.4载体转入Expi293细胞中。采用的化学转染试剂为PEI(购自Polysciences)，按照生产产商提供的方案瞬时转染培养Expi293。
瞬时转染前一天对Expi293(ThermoFisher Scientific，Cat.A14635)进行细胞传代，用Dynamis培养基(Gibco，Cat.A2617502)按2E6的密度接种1L摇瓶(Corning，Cat.431147)，放入细胞培养摇床(Adolf Kuhner，Cat.ISF4-XC)中37℃，8％CO2，120rpm培养；转染当天，用细胞计数仪(Countstar，Cat.IC1000)对Expi293细胞进行计数，用新鲜Dynamis培养基稀释调整细胞密度为2.9E6；准备转染；PEI：DNA＝3:1；混匀5min，将二者轻柔混匀20次，静置15-30min，不要超过30min。将DNA-PEI混合物加入Expi293细胞中，混匀，放入细胞培养摇床(Adolf Kuhner，Cat.ISF4-XC)中37℃，8％CO2，120rpm培养；转染4h之后补加双抗(Gibco，Cat.15140122)和抗凝剂(Gibco，Cat.0010057)；收获上清纯化，转染连续培养7天。之后收样，先低速1000rpm，10min，4℃离心(湘仪，Cat.H2050R)，再高速12000rpm，30min，4℃；收集细胞培养上清，0.22μm过滤。将培养上清应用于Protein ASepharose柱(GEHealthcare)。柱用PBS洗涤，然后用洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 3.0)洗脱蛋白质，收集的组分用1M Tris pH9.0中和。最后，将纯化的样品使用0.22μm滤膜(Pall，Cat.4612)进行过滤除菌，得到抗人PD-L1人源化抗体。
实施例2抗人PD-L1人源化抗体的结合活性分析
1、抗人PD-L1人源化抗体与中国仓鼠细胞(CHO)和稳定表达全长小鼠PD-L1的CHO的结合活性
测定实施例1制备得到的13株抗人PD-L1人源化抗体与CHO-FP1空细胞及稳定表达全长小鼠PD-L1的CHO(CHO-mPD-L1稳定细胞株)的结合活性，并设置avelumab-hIgG1阳性对照抗体、hIgG1同型对照抗体和PE抗人IgG对照抗体，流程如下：
用1×FCM缓冲液(1×PBS+3％BSA)重悬CHO-FP1空细胞和CHO-mPD-L1稳定细胞株至2×10E6/ml，按100μl/孔加入到96孔V底板中。用1×FCM缓冲液稀释抗人PD-L1人源化抗体至浓度为20μg/ml。按100μl/孔加入到细胞中，冰上静置孵育30min后，250×g离心5min后，吸弃上清。用1×FCM洗涤2次后，按100μl/孔加入用1×FCM缓冲液稀释的PE抗体人IgG荧光二抗(稀释倍数为1:500)(Biolegend，Cat.409304)，冰上孵育30min。250×g离心5min后，吸弃上清，加入1×FCM洗涤2次后，按100μl/孔加入1×PBS重悬细胞，采用流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)进行检测。
抗人PD-L1人源化抗体与CHO-FP1空细胞及CHO-mPD-L1稳定细胞株的结合活性如图1和图2所示，结果显示：13株抗人PD-L1人源化抗体均不与CHO-FP1空细胞和CHO-mPD-L1稳定细胞株结合。
2、抗人PD-L1人源化抗体与稳定表达人PD-L1的CHO的结合活性
为表征抗人PD-L1人源化抗体与稳定表达人PD-L1的CHO(CHO-hPD-L1稳定细胞株)的结合亲和力，用1×FCM缓冲液(1×PBS+3％BSA)将实施例1制备得到的13株抗人PD-L1人源化抗体进行3倍倍比稀释，起始浓度为30μg/ml，然后与CHO-hPD-L1稳定细胞株共孵育。并设置avelumab-hIgG1阳性对照抗体、hIgG1同型对照抗体和PE抗人IgG对照抗体，具体方法流程同上。
抗人PD-L1人源化抗体与CHO-hPD-L1稳定细胞株的结合活性如图3和图4所示，结果显示：13株抗人PD-L1人源化抗体与CHO-hPD-L1稳定细胞株的结合活性EC50为2-8nM。
3、抗人PD-L1人源化抗体与稳定表达猕猴PD-L1的CHO的结合活性
为表征抗人PD-L1人源化抗体与稳定表达猕猴PD-L1的CHO(CHO-cynoPD-L1稳定细胞株)的结合亲和力，用1×FCM缓冲液(1×PBS+3％BSA)将实施例1制备得到的13株抗人PD-L1人源化抗体进行3倍倍比稀释，起始浓度为30μg/ml，然后与CHO-cynoPD-L1稳定细胞株共孵育。并设置avelumab-hIgG1阳性对照抗体、hIgG1同型对照抗体和PE抗人IgG对照抗体，具体方法流程同上。
抗人PD-L1人源化抗体与CHO-cynoPD-L1稳定细胞株的结合活性如图5和图6所示，结果显示：13株抗人PD-L1人源化抗体与CHO-cynoPD-L1稳定细胞株的结合活性EC50为1-12nM。
4、抗人PD-L1人源化抗体与IFNγ刺激的A375细胞的结合活性
用人IFNγ刺激肿瘤细胞表面PD-L1的表达，检测实施例1制备得到的13株抗人PD-L1人源化抗体与PD-L1膜蛋白的结合活性。并设置avelumab-hIgG1阳性对照抗体、hIgG1同型对照抗体和PE抗人IgG对照抗体，实验流程如下：
用50ng/ml人IFNγ(R&D，Cat.285-IF-100)过夜刺激人黑色素瘤细胞A375(上海细胞库，Cat.SCSP-533)上人PD-L1的表达，次日，用0.25％胰酶(Gibco，Cat.25200-056)消化处理A375细胞，用DPBS洗涤一次后，调整活细胞密度至2E6/ml，按100μl/孔加入到96孔V底板中。用1×FCM缓冲液稀释抗人PD-L1人源化抗体至浓度为20μg/ml。按100μl/孔加入到细胞中，冰上静置孵育30min后，250×g离心5min后，吸弃上清。用1×FCM洗涤2次后，按100μl/孔加入用1×FCM缓冲液稀释的PE抗体人IgG荧光二抗(稀释倍数为1:500)(Biolegend，Cat.409304)，冰上孵育30min。250×g离心5min后，吸弃上清，加入1×FCM洗涤2次后，按100μl/孔加入1×PBS重悬细胞，采用流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)进行检测。
抗人PD-L1人源化抗体与IFNγ刺激的A375细胞的结合活性如图7和图8所示，结果显示：13株抗人PD-L1人源化抗体与IFNγ刺激的A375细胞表达的PD-L1膜蛋白的结合EC50约为0.2nM。
5、抗人PD-L1人源化抗体的结合动力学分析
采用MD ForteBIO QKe平台进行抗人PD-L1人源化抗体与人PD-L1的结合动力学常数分析。实验方法如下：
用平衡缓冲液(1×PBS+0.02％吐温20)稀释携带his标签的人PD-L1胞外区重组蛋白hPD-L1-his至终浓度为5μg/ml。用平衡缓冲液(1×PBS+0.02％吐温20)2倍倍比稀释抗人PD-L1人源化抗体，起始浓度为10μg/ml，共7个浓度。待anti-Penta-HIS生物传感器(ForteBIO，Cat.18-5122)充分水化后，先固化hPD-L1-his重组蛋白150秒，平衡90秒后，与抗人PD-L1鼠抗结合，其中结合时间为180秒，解离时间为600秒。整个反应在25，1000rpm条件下进行。最后用Octet分析软件进行曲线拟合，获得抗人PD-L1人源化抗体的结合动力学常数KD。
13株抗人PD-L1人源化抗体与人PD-L1的结合动力学常数分析结果如表2所示，结果显示：结合动力学常数均在pM级别。
表2
抗体名称 KD，(M)
176L4H1 8.40E-12
176L4H2 8.48E-11
176L4H3 8.00E-11
176L4H4 8.81E-11
176L5H2 1.09E-10
176L6H5 3.02E-11
F016-870-hIgG1 <1.0E-12
Avelumab-hIgG1 <1.0E-12
实施例3抗人PD-L1人源化抗体介导的配体阻断实验
1、抗人PD-L1人源化抗体与PD-1结合阻断活性
肿瘤细胞或抗原递呈细胞表达的PD-L1蛋白，通过与淋巴细胞表面表达的PD-1蛋白结合，抑制淋巴细胞的刺激活性。本实施例对抗人PD-L1人源化抗体阻断PD-1与PD-L1结合的阻断活性进行评价，并设置avelumab-hIgG1阳性对照抗体、hIgG1同型对照抗体和PE抗鼠IgG对照抗体，实验方法如下：
用1×FCM缓冲液3倍倍比稀释抗人PD-L1人源化抗体，起始浓度为200μg/ml。用1×FCM缓冲液稀释自产的携带mFc的重组人PD-1蛋白至浓度为4μg/ml。用1×FCM缓冲液重悬CHO-hPD-L1细胞至2×10E6/ml细胞密度，按100μl/孔均分于96孔V底板中。按50μl/孔将抗体加入到CHO-hPD-L1细胞中，冰上孵育30min后，按50μl/孔加入重组人PD-1-mFc蛋白，冰上孵育30min。250×g离心5min后，吸弃上清，用1×FCM洗涤1次后，按100μl/孔加入用1×FCM缓冲液稀释的PE抗鼠IgG荧光二抗(稀释倍数为1:500)(Biolegend，Cat.405307)，冰上孵育30min。250×g离心5min后，吸弃上清，加入1×FCM洗涤2次后，按100μl/孔加入1×PBS重悬细胞，采用流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)进行检测。
抗人PD-L1人源化抗体与PD-1结合阻断活性如图9和图10所示，结果显示：13株抗人PD-L1人源化抗体均能阻断PD-1与PD-L1的结合。
2、抗人PD-L1人源化抗体与CD80结合阻断活性
肿瘤细胞或抗原递呈细胞表达的PD-L1蛋白通过与淋巴细胞表面表达的CD80蛋白结合，抑制淋巴细胞的刺激活性。本实施例对抗人PD-L1人源化抗体阻断CD80与PD-L1结合的阻断活性进行评价，并设置avelumab-hIgG1阳性对照抗体、hIgG1同型对照抗体和PE抗鼠IgG对照抗体，实验方法如下：
用1×FCM缓冲液3倍倍比稀释抗人PD-L1人源化抗体，起始浓度为200μg/ml。用1×FCM缓冲液稀释自产的携带mFc的重组人CD80蛋白至浓度为24μg/ml。用1×FCM缓冲液重悬CHO-hPD-L1细胞至2×10E6/ml细胞密度，按100μl/孔均分于96孔V底板中。按50μl/孔将抗体加入到CHO-hPD-L1细胞中，冰上孵育30min后，按50μl/孔加入重组人CD80-mFc蛋白，冰上孵育30min。250×g离心5min后，吸弃上清，用1×FCM洗涤1次后，按100μl/孔加入用1×FCM缓冲液稀释的PE抗鼠IgG荧光二抗(稀释倍数为1:500)(Biolegend，Cat.405307)，冰上孵育30min。250×g离心5min后，吸弃上清，加入1×FCM洗涤2次后，按100μl/孔加入1×PBS重悬细胞，采用流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)进行检测。
抗人PD-L1人源化抗体与CD80结合阻断活性如图11和图12所示，结果显示：13株抗人PD-L1人源化抗体均能阻断PD-L1与CD80的结合。
实施例4抗人PD-L1人源化抗体的体外活性表征
1、Jurkat-GL4.30-hPD-1和CHO-hPD-L1-OKT3共孵育下荧光素酶报告基因体系的检测
为利用荧光素酶报告基因体系检测抗人PD-L1人源化抗体的体外功能活性，通过慢病毒包装体系构建稳定表达hPD-1和荧光素酶基因的Jurkat-GL4.30-hPD-1效应细胞株。同时构建PD-L1递呈细胞CHO-hPD-L1-OKT3，即采用中国仓鼠CHO细胞稳定表达hPD-L1和抗原非依赖的TCR细胞表面驱动蛋白。实验当天，用含1％FBS的RPMI1640完全培养基重悬CHO-hPD-L1-OKT3细胞和Jurkat-GL4.30-hPD-1细胞，活细胞密度分别为1.6×10E6/ml和8.0×10E6/ml，分别按25μl/孔分于96孔荧光酶标板中。用含1％FBS的RPMI1640完全培养基稀释抗人PD-L1人源化抗体，起始浓度为20μg/ml，按50μl/孔吸取抗体至Jurkat-GL4.30-hPD-1和CHO-hPD-L1-OKT3混合细胞中，混匀后，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养6h。按100μl/孔加入提前解冻的Bright-LumiTM溶液(碧云天，Cat.RG051M)，避光静止5min后，使用多功能酶标仪(Molecular Device，SpectraMax i3x多功能酶标仪)在Lumi模式下进行检测。并设置hIgG1同型对照抗体。
荧光素酶报告基因法分析抗人PD-L1人源化抗体的体外活性如图13和图14所示，结果显示：抗人PD-L1人源化抗体能介导荧光素酶报告基因信号的回调，并呈抗体剂量依赖性。
2、T-DC异体混合淋巴反应体系中刺激IL-2和IFN gamma的产生
通过异体T-DC MLR实验，评价抗人PD-L1人源化抗体刺激细胞因子IL-2和IFNgamma的活性。实验流程如下：
采用人淋巴细胞分离液LymphoprepTM(Axis-Shield，Cat.07851)从健康人外周血中分离得到外周血淋巴细胞PBMC。其中，供体1的PBMC经人CD14 Microbeads(Miltenyi，Cat.130-050-201)筛选获得CD14+单核细胞。将单核细胞按照5×10E5/ml接种于T75培养瓶中，补加细胞因子人GM-CSF和IL-4至终浓度为50ng/ml，连续刺激6天后，补加人TNF alpha至终浓度为50ng/ml，继续诱导分化3天获得成熟的DC细胞。供体2的PBMC经EasySepTMHuman T Cell Enrichment Kit(Stemcell，Cat.19051)负筛选获得CD3+T细胞。按照DC:T细胞比例为1:5，DC细胞量为2×10E4/孔，将DC和T细胞混合均匀后分于96孔U型板中，共150μl/孔体系。用X-VIVO 15完全培养基稀释抗人PD-L1人源化抗体，起始浓度为20μg/ml，4倍倍比稀释，按50μl/孔加入到细胞中。混合淋巴实验反应3-5天后，检测细胞上清中IL-2和IFNgamma的表达。并设置hIgG1同型对照抗体。
抗人PD-L1人源化抗体介导的混合淋巴细胞反应中IL-2的分泌结果如图15、图16和图17所示，抗人PD-L1人源化抗体介导的混合淋巴细胞反应中IFNγ的分泌结果如图18、图19和图20所示，结果显示：在T-DC异体混合淋巴反应实验中，抗人PD-L1人源化抗体能介导细胞因子IL-2和IFNγ的上调，并与抗体用量正相关。
实施例5抗人PD-L1人源化抗体的结合特异性分析
PD-L1蛋白属于B7家族蛋白，其同家族蛋白包括PD-L2(B7-DC)、ICOSL(B7-H2)、B7-H3、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)等。为检测抗人PD-L1人源化抗体的结合特异性，设置avelumab-hIgG1阳性对照抗体、hIgG1同型对照抗体和HRP抗体人IgG Fab对照抗体，实验流程如下：
用50mM CB缓冲液稀释携带hFc标签的重组人PD-L1蛋白，重组人PD-L2蛋白(Acrobiosystem，Cat.PD2-H5251)，重组人PD-1蛋白(自产)，重组人ICOS蛋白(Acrobiosystem，Cat.ICS-H5250)，重组人ICOSLG蛋白(Acrobiosystem，Cat.B72-H5254)，重组人CD276蛋白(Acrobiosystem，Cat.B73-H5253)，重组人CD86蛋白(Acrobiosystem，Cat.CD6-H5257)，重组人CD28蛋白(Acrobiosystem，Cat.CD8-H525a)和重组人CTLA-4蛋白(Acrobiosystem，Cat.CT4-H5255)至1μg/ml，按100μl/孔加入96孔ELISA检测板中，2-4℃包被过夜。弃上清，按200μl/孔加入封闭液(1xPBS+1％BSA)，37℃封闭1h。用含1％BSA的PBS稀释抗人PD-L1人源化抗体抗至10μg/ml，及阳性对照抗体anti-hPD-1商业化抗体(Opdivo)，anti-ICOS-hIgG4和anti-hCD28-mIgG2a至10μg/ml，按100μl/孔加入，37℃静置孵育30min。用1×PBS洗涤3次。按100μl/孔加入HRP标记的羊抗人IgG Fab(Sigma A0293-1ML)或HRP标记的羊抗鼠IgG(Sigma，AP113P)，37℃静置孵育30min，用1×PBS洗涤3次后，进行显色反应。
抗人PD-L1人源化抗体与重组人PD-L1蛋白、重组人PD-L2蛋白、重组人PD-1蛋白、重组人ICOS蛋白、重组人ICOSLG蛋白、重组人CD276蛋白、重组人CD86蛋白、重组人CD28蛋白和重组人CTLA-4蛋白的结合活性如图21-图29所示，结果显示：13株抗人PD-L1人源化抗体的特异性高，其均不与除PD-L1外的其他B7家族蛋白及其他相关性蛋白结合。
实施例6抗人PD-L1人源化抗体的体内抗肿瘤活性
由于本发明的鼠单抗与鼠源PD-L1不交叉，故采用hPD-L1 knock in转基因小鼠测定抗人PD-L1人源化抗体176L6H5、176L5H2和176L4H1的体内抗肿瘤效果，并设置hIgG1同型对照抗体、阳性对照抗体avelumab-hIgG1和Tecentriq(罗氏)，具体方法如下：
hPD-L1 knock in转基因小鼠：
雌性C57BL/6背景的hPD-L1 knock in转基因小鼠(6-8周龄)，购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，合格证编号为NO.320726210100112386。
培养细胞和接种小鼠：
通过CRISPR CAS 9技术利用sgRNA敲除MC38结直肠癌细胞(国家实验细胞共享资源平台，资源编号：3111C0001CCC000523)内源性小鼠PD-L1基因后，筛选获得小鼠PD-L1完全敲除的MC38细胞。然后将携带多克隆位点MCS的人PD-L1 cDNA通过慢病毒转导的方式整合到MC38 mPD-L1敲除后的MC38细胞系中，经筛选获得稳定表达人PD-L1的MC38细胞(MC38-hPD-L1细胞)。经MC38-hPD-L1细胞进行常规传代培养，以用于后续的小鼠体内实验。
收集对数生长期的MC38-hPD-L1细胞，用DPBS(Hyclone，Cat.SH30028.02)洗涤两次，用DPBS(Hyclone，Cat.SH30028.02)调节细胞浓度为1×10E7个/ml。取雌性hPD-L1knock in转基因小鼠，右侧皮下接种MC38-hPDP-L1细胞，接种体积为0.1ml/小鼠，即1×10E6个细胞/小鼠。MC38-hPD-L1细胞接种当天定义为研究第0天。
荷瘤小鼠的分组和给药：
当平均肿瘤体积达到60～80mm3，即可对小鼠按肿瘤体积随机分组，本研究在第7天(D7)对小鼠按肿瘤体积随机分为7组，每组8只小鼠，开始进行腹腔给药(i.p.)。MC38-hPD-L1肿瘤模型给药剂量、方式及频率如表3所示，其中Q3Dx3表示每3天给药一次，一共给药3次。
表3
组别 剂量(mg/kg) 给药体积(μl/g) 给药途径 给药频率
hIgG1同型对照 10 10 i.p. Q3Dx3
176L4H1 10 10 i.p. Q3Dx3
176L5H2 10 10 i.p. Q3Dx3
176L6H5 10 10 i.p. Q3Dx3
avelumab-hIgG1 10 10 i.p. Q3Dx3
Tecentriq 10 10 i.p. Q3Dx3
PBS - 10 i.p. Q3Dx3
从第7天开始测量肿瘤体积并进行记录，在研究持续期间内每周2次监测小鼠瘤体积和小鼠体重。用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。按照(1/2)×长径×(短径)2计算肿瘤体积。当小鼠体积下降20％或者肿瘤体积超过2000mm3时，达到仁慈终点，用CO2窒息法处死小鼠。
两组之间比较可用独立样本T检验。3组以上比较应用One-Way ANOV A。如果F值显示显著性差异，可进行多组间的时候分析。数据使用GraphPad Prism处理，当p<0.05表示统计学显著性差异。肿瘤生长抑制率TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，Ti为第i天治疗组的平均肿瘤体积，T0为治疗开始时治疗组的平均肿瘤体积，Vi为第i天溶剂对照组的平均肿瘤体积，V0为治疗开始时溶剂对照组的平均肿瘤体积。
抗人PD-L1人源化抗体对小鼠肿瘤体积的影响如表4所示，抗人PD-L1人源化抗体的体内抗肿瘤活性结果如图30所示，其中，(a)图是抗人PD-L1人源化抗体对小鼠肿瘤体积的影响结果；(b)图是抗人PD-L1人源化抗体对小鼠生存率的影响结果；(c)图是抗人PD-L1人源化抗体对小鼠体重的影响结果；结果显示：本实施例中的抗人PD-L1人源化抗体的抗肿瘤作用显著，第32天的TGI分别为104.86％、102.16％和85.08％。8只小鼠中肿瘤全消(CR)小鼠分别为8只、5只和5只(即CR分别为8/8、5/8和5/8)。阳性对照抗体Avelumab-hIgG1和Tecentriq(罗氏)的TGI分别为100.42％和75.22％，CR分别为7/8和4/8。抗人PD-L1人源化抗体显著延长小鼠生存期，并且各给药组对小鼠体重无显著影响。
表4
Figure BDA0003860215860000111
注：表中肿瘤体积单位为mm3；“N/A”代表因小鼠肿瘤体积超过2000mm3，达到仁慈终点，用CO2窒息法处死小鼠。

Claims (13)

1.一种抗人PD-L1人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含重链CDR区和轻链CDR区，重链CDR区由HCDR1、HCDR2、HCDR3组成，轻链CDR区由LCDR1、LCDR2、LCDR3组成，HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:14～16，LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:17～19，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3～7任一所示。
2.根据权利要求1所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8～13任一所示。
3.根据权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如下表任一项所示：
抗人PD-L1人源化抗体 重链可变区 轻链可变区 176L1H1 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.8 176L1H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.8 176L1H3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.8 176L2H1 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.9 176L2H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.9 176L2H3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.9 176L3H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.10 176L4H1 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.11 176L4H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.11 176L4H3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.11 176L4H4 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.11 176L5H2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.12 176L6H5 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.13
4.根据权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3～6任一所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
5.根据权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
6.根据权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD中的任一种的恒定区序列；
所述轻链恒定区为κ或λ链；
所述重链恒定区和轻链恒定区的种属来源选自牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人中的任一种。
7.根据权利要求1或2任一项所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为双特异性抗体、CDR移植抗体或多聚体抗体中的任一种或几种；所述抗原结合片段为scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv中的任一种或几种。
8.核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段。
9.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求8所述核酸。
10.细胞，其特征在于，所述细胞携带权利要求8所述核酸、含有权利要求8所述载体或表达权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段。
11.一种生产权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在培养基中培养权利要求10所述细胞；以及从培养基中或从所培养的细胞中回收如此产生的抗体或其抗原结合片段。
12.药物组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段、或权利要求8所述核酸、或权利要求9所述载体或权利要求10所述细胞。
13.权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段、权利要求8所述核酸、权利要求9所述载体、权利要求10所述细胞、权利要求12所述药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病的药物中的应用。
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