CN106519034B

CN106519034B - 抗pd-1抗体及其用途

Info

Publication number: CN106519034B
Application number: CN201611198440.8A
Authority: CN
Inventors: 李强; 孙见宇; 郑云程; 杨璐; 马心鲁; 李媛丽
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: EP3575318A4; KR20190117493A; PH12019501438A1; JP2020504627A; US20190367617A1; CN106519034A; WO2018113258A1; US11161904B2; RU2739610C1; JP6908722B2; KR102340832B1; EP3575318A1; MY197695A

Abstract

本发明提供了以高亲和力与PD‑1特异性结合的抗体，还提供了编码所述抗体的核酸分子，用于表达所述抗体的表达载体和宿主细胞，以及所述抗体的生产方法。此外，本发明还提供了包含所述抗体的免疫缀合物以及药物组合物，以及所述抗体在用于制备治疗多种疾病(包括癌症和感染性疾病、炎性疾病)的药物中的用途。

Description

抗PD-1抗体及其用途

技术领域

本发明属于治疗性单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及一种针对程序性死亡受体(PD-1)的抗体；还涉及所述抗体在治疗多种疾病(包括癌症和感染性疾病、炎性疾病)中的用途。

背景技术

程序性死亡受体-1(Programmed Death-1，PD-1)是CD28家族成员，是在活化T细胞和B细胞表面表达的免疫抑制性受体(Yao Zhu等,Nat Rev Drug Discov,2013；12(2):130-146)，最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中利用削减杂交技术得到的。PD-1主要表达于CD⁴⁺T细胞、CD⁸⁺T细胞、NK-T细胞、B细胞和活化的单核细胞表面，主要受T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)信号的诱导表达，TNFα可增强PD-1在这些细胞表面的表达(Francisco LM等,Immunol Rev,2010；236:219-242)。PD-1分子由胞外区、跨膜区和胞内区构成。胞外区含有一个免疫球蛋白可变区IgV结构域，胞内区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。T细胞被激活后，PD-1主要通过ITSM模体，将酪氨酸磷脂酶SHP2集合，导致包括CD3ζ、PKCθ和ZAP70等效应分子的去磷酸化。PD-1配体有两个：PD-L1和PD-L2。PD-L1又称B7H1或CD274，PD-L2称为B7DC或CD273。PD-L1和PD-L2表达于不同的细胞群体(Shimauchi,Kabashima等,Int J Cancer,2007；121(12):2585-2590)。其中，PD-L2表达比较局限，主要在活化的巨噬细胞、树突状细胞和少数肿瘤细胞上。PD-L1则在活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肿瘤细胞上广泛表达，同时在机体一些免疫屏蔽部位如胎盘、眼及其上皮、肌肉，肝和血管内皮等组织表达。

PD-1能够与配体(Programmed Death-1Ligands,PD-Ls)PD-L1和PD-L2相互作用，通过细胞内信号转导通路显著抑制CD3和CD28介导的T细胞活化以及细胞因子产生，因此是调节T细胞反应的重要免疫哨卡。在正常情况下，PD-1/PD-Ls信号通路可以诱导和维持外周组织的免疫耐受，对防止组织的过度炎症反应以及自身免疫性疾病的发生具有积极作用(Latchman Y等,Nat Immunol,2001；2:261-268)。而在病理情况下，PD-1与配体PD-L1、PD-L2相互作用，下调T细胞免疫刺激性细胞因子如IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌以及存活蛋白的表达，促进免疫抑制性细胞因子IL-10分泌，从而抑制T细胞免疫反应(Hamido等,ExpertOpin Biol Ther,2013；13(6):847-861)。研究表明，PD-1协同抑制信号与人类多种疾病发生密切相关，可作为疾病治疗的靶分子(Okazaki T等,J Immunol.2007；19:813-824)。

PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤发展有着密切关系，在肿瘤患者体内，PD-L1高表达能增强肿瘤的转移能力，导致患者死亡率上升，并且与患者预后不良相关。研究发现在肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌及头颈癌等人类肿瘤组织中都检测到高表达的PD-L1蛋白。此外，肿瘤细胞在多种细胞因子诱导下也高表达PD-L1，这一现象与肿瘤免疫逃逸相关；同时，肿瘤部位浸润性CD⁸⁺T细胞也受到肿瘤微环境的影响，PD-1表达也比外周血中的T细胞要高，它与肿瘤细胞表面PD-L1作用，抑制T细胞的活化与增殖，肿瘤细胞可通过此途径逃避细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)的杀伤作用，减弱机体抗肿瘤免疫应答。用阻断型抗PD-1单抗阻断PD-1/PD-L1信号可以通过上调IFN-γ、IL-2、IL-10分泌，并有效逆转CD⁴⁺和CD⁸⁺T细胞的增殖抑制，同时使T细胞的活化程度和杀伤能力显著增强(Dong HD等,Nat Med,2002；8:793-800)。

多种慢性和急性病毒感染也通过PD-1/PD-Ls信号逃避人体免疫监测。机体外周病毒特异性CD⁴⁺、CD⁸⁺T细胞高表达PD-1，导致功能失调或者无能，不能及时有效地清除感染的病毒(Narasimhan J等,J Virol,2008；376:140-153)。近来，已有大量研究表明，通过特异性单抗阻断PD-1/PD-Ls抑制途径能够有效地使HIV、HBV和HCV等病毒特异性CD⁴⁺、CD⁸⁺T活化增殖，产生IFN-γ、TNF-α以及颗粒酶B等杀伤因子，恢复免疫细胞特异性的抗病毒功能(Barber DL等,Nature,2006；439:682-687)。

因此，可制备特异性抗PD-1单抗，通过特异性阻断PD-1/PD-L1信号对该抑制途径的作用进行封闭，增强CTL杀伤肿瘤细胞的功能，有效抑制肿瘤的形成和生长。目前已经有两种PD-1抑制剂抗肿瘤抗体药上市，分别是Pembrolizumab(商品名Keytruda，默克公司研发)和Nivolumab(商品名Opdivo，小野制药/百时美施贵宝研发)；CureTech公司研发的Pidilizumab处于II期临床研究阶段；MedImmune研发的AMP-224、AMP-514处于I期临床研究阶段。虽然已有多种抗PD-1、PD-L1和CTLA4等免疫哨卡的单克隆抗体应用于临床，但这些抗体作为单药使用的应答率还较低，平均只有15-20％。因此研发新型的抗PD-1单克隆抗体，具有更高的特异性、更低毒副作用、更佳临床药效，也将给癌症或感染性患者提供更多的用药选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对PD-1分子具有高亲和力的抗PD-1单克隆抗体。

在一方面，本发明提供了分离的结合PD-1的单克隆抗体，其包含：

重链可变区，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；和

轻链可变区，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，

其中：

(i)重链可变区包含选自SEQ ID NOs：1和2所示的CDR-H1序列，和选自SEQ IDNOs：3和4所示的CDR-H2序列，和选自SEQ ID NOs：5和6所示的CDR-H3序列；和

(ii)轻链可变区包含选自SEQ ID NOs：7和8所示的CDR-L1序列，和选自SEQ IDNOs：9和10所示的CDR-L2序列，和选自SEQ ID NOs：11和12所示的CDR-L3序列。

本发明的一优选实施例中，所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO：1所示的CDR-H1序列，和SEQ ID NO：3所示的CDR-H2序列，和SEQ ID NO：5所示的CDR-H3序列；且其轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的CDR-L1序列，和SEQ ID NO：9所示的CDR-L2序列，和SEQ IDNO：11所示的CDR-L3序列。

另一优选实施例中，所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO：2所示的CDR-H1序列，和SEQ ID NO：4所示的CDR-H2序列，和SEQ ID NO：6所示的CDR-H3序列；且其轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示的CDR-L1序列，和SEQ ID NO：10所示的CDR-L2序列，和SEQ ID NO：12所示的CDR-L3序列。

进一步地，包含上述CDR序列的抗体为鼠源的、嵌合的或人源化的。

例如，所述抗体为鼠源的或嵌合的，其重链可变区进一步包含鼠IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区；和其轻链可变区包含鼠κ、λ链或其变体的轻链FR区。

较优选地，上述鼠源或嵌合抗体包含：

(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；和

(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

例如，本发明的优选实施例中鼠源抗体AB12N1和嵌合抗体AB12N2，其重链可变区包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

更优选地，上述鼠源或嵌合抗体包含：

(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和

(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。

例如，本发明的优选实施例中鼠源抗体AB12M1和嵌合抗体AB12M2，其重链可变区包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

例如，所述抗体为人源化的。制备人源化抗体的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以通过将本发明的CDR序列转移至人抗体可变区中来制备本发明的人源化抗PD-1抗体。所述人源化抗体不会产生抗抗体反应(AAR)和人抗鼠抗体反应(HAMA)，不会因被抗抗体中和而被快速清除。

本发明的一优选实施例中，将上述鼠源抗体AB12M1通过CDR移植(CDR-grafting)进行人源化改造。由此产生的所述人源化抗体，较优选地，其重链可变区包含选自SEQ IDNOs：17、19、21、23、25、27和29所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含选自SEQ ID NOs：18、20、22、24、26、28和30所示的氨基酸序列。更优选地，由此产生的所述人源化抗体AB12M3、AB12M4、AB12M5、AB12M6、AB12M7、AB12M8和AB12M9，其重链可变区分别包含如SEQID NO：17、19、21、23、25、27和29所示的氨基酸序列；和其轻链可变区分别包含如SEQ IDNO：18、20、22、24、26、28和30所示的氨基酸序列。

本发明的另一优选实施例中，将上述鼠源抗体AB12N1通过CDR移植(CDR-grafting)进行人源化改造。由此产生的所述人源化抗体，较优选地，其重链可变区包含选自SEQ ID NOs：31、33和35所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含选自SEQ ID NOs：32、34和36所示的氨基酸序列。更优选地，由此产生的所述人源化抗体AB12N3、AB12N4和AB12N5，其重链可变区分别包含如SEQ ID NO：31、33和35所示的氨基酸序列；和其轻链可变区分别包含如SEQ ID NO：32、34和36所示的氨基酸序列。

在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明抗体的序列进行替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与其来源序列至少80％同源；更优地，本发明所述变体的序列可以与其来源序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。

本发明的抗体可以为全长抗体，例如，在一些优选的实施方案中，本发明的抗人PD-1抗体还包含人IgG4或IgG1的重链恒定区和人κ轻链恒定区；或者，所述抗体可以仅包含抗原结合片段，诸如Fab或Fab’²片段，或单链抗体ScFv。

在上述任何实施例中，本发明所述抗体能够以约1nM或更低的KD结合PD-1；在较优选的实施例中，所述抗体或其抗原结合能够以约100pM或更低的KD结合PD-1；在更优选的实施例中，所述抗体能够以约10pM或更低的KD结合PD-1；在最优选的实施例中，所述抗体能够以约1pM或更低的KD结合PD-1。

本发明另一方面，提供一种编码如上所述抗体的DNA分子。

例如，编码本发明优选嵌合抗体AB12M2重链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：37所示，且编码其轻链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：38所示。

又如，编码本发明的优选人源化抗体AB12M3重链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：39所示，且编码其轻链可变区序列的DNA分子如SEQ ID NO：40所示。

再如，编码本发明另一优选人源化抗体AB12M4重链可变区的DNA分子如SEQ IDNO：41所示，且编码其轻链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：42所示。

本发明另一方面，提供一种包含如上所述DNA分子的表达载体。

本发明另一方面，提供一种用如上所述表达载体转化的宿主细胞。宿主细胞优选为CHO细胞。

本发明另一方面，提供一种包含与治疗剂缀合的本发明所述抗体的免疫缀合物。所述治疗剂优选为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。

本发明另一方面，还提供了包含本发明所述抗体的任何一种双特异性分子。例如，可以将上述PD-1抗体与具有另一种抗原结合特性的抗体或抗体片段功能性连接组成双特异性抗体。诸如，所述双特异性抗体包括但不限于针对以下分子的抗体：VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体或其它生长因子受体、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-IBB和ICOS。

本发明另一方面，还提供了一种药物组合物，其包含本发明所述抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

本发明又一方面，还提供了制备本发明所述抗体的方法，其包括：(a)在允许产生所述抗体的条件下培养本发明的上述宿主细胞；(b)回收、分离产生的所述抗体。

本发明再一方面，还涉及根据本发明所述结合PD-1的抗体、或包含其的药物组合物、或包含其的免疫缀合物、或包含其的双特异性分子在制备用于治疗PD-1介导的疾病或病症的药物中的用途。

其中，所述的疾病优选为癌症；更优选为高表达PD-L1的癌症；所述的癌症包括但不限于肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、头颈癌；优选为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤；最优选为非小细胞肺癌、黑素瘤和肾癌。

其中，所述疾病优选为感染性疾病；例如，慢性病毒感染、细菌感染或寄生虫感染疾病。所述感染性疾病更优选为HIV、HBV和HCV。

优选地，在制备治疗癌症或感染性疾病的药物中可以使用嵌合的、人源化的抗PD-1抗体；较优选地，使用人源化的。

其中，本发明所提供的抗体可单独使用或与其它治疗剂或治疗方法联合使用：例如，抗肿瘤药或免疫原剂(例如，肿瘤抗原)、抗原呈递细胞(例如，用来源于肿瘤的抗原或核酸刺激的树突细胞)、免疫刺激细胞因子(例如IL-2、IFNa2、GM-CSF)和用编码免疫刺激细胞因子(例如，但不限于GM-CSF)的基因转染的细胞；标准癌症治疗(例如化疗、放疗或手术)；或其它抗体(包括但不限于针对以下分子的抗体：VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体或其它生长因子受体、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-IBB和ICOS)。

本发明制备的抗PD-1人源化抗体相对临床上使用的Keytruda和Opdivo具有更高的结合亲和力，亲和力常数KD值小于1pM，且具有极强的特异性。体内抗肿瘤研究数据显示，本发明所提供的人源化抗体能显著地抑制转基因小鼠移植瘤的生长，甚至部分小鼠的肿瘤完全消失。此外，本发明所述抗体采用CHO细胞表达，具有产量高、活性高、纯化工艺简单以及生产成本低的优势。

发明详述

缩写和定义

hPD-1 人PD-1蛋白

CDR 用Kabat编号系统界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区

EC₅₀ 产生50％功效或结合的浓度

ELISA 酶联免疫吸附测定

FR 抗体构架区：将CDR区排除在外的免疫球蛋白可变区

HRP 辣根过氧化物酶

IL-2 白细胞介素2

IFN 干扰素

IC₅₀ 产生50％抑制的浓度

IgG 免疫球蛋白G

Kabat 由Elvin A Kabat倡导的免疫球蛋白比对及编号系统

mAb 单克隆抗体

PCR 聚合酶链式反应

V区在不同抗体之间序列可变的IgG链区段。其延伸到轻链的109位Kabat残基和重链的第113位残基。

VH 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区

K_D 平衡解离常数

ka 结合速率常数

Kd 解离速率常数

本发明所使用的术语“抗体”涵盖全长抗体(例如，IgG1或IgG4抗体)、其各种功能性片段(例如可仅包含抗原结合部分，如Fab、F(ab’)2或scFv片段)以及经过修饰的抗体(例如人源化、糖基化等)。本发明还包括具有糖基化修饰的抗PD-1抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点，例如在寡糖链上去岩藻糖修饰以增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能；在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。

术语“单克隆抗体或mAb”，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。

“抗体片段”和“抗原结合片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％5、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗体片段实例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(linear antibody)；单链抗体分子，例如ScFv、单抗体(技术来自Genmab)；纳米抗体(技术来自Domantis)；结构域抗体(技术来自Ablynx)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；NatBiotechnol,23:1126-1136中。

“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。

“Fab′片段”含有一条轻链和一条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。

“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。

“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。

“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。对于scFv综述，可参见Pluckthun(1994)The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，New York，第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。

“抗原结合片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。

本文所用术语“超变区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。超变区包含以下氨基酸残基：来自序列比对所界定的“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，例如，轻链可变结构域的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位残基和重链可变结构域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位残基，参见Kabat等，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫目的物的蛋白质序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.；和/或来自根据结构来界定的“超变环”(HVL)的残基，例如，轻链可变结构域的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位残基和重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位残基，参见Chothia和Leskl，1987，J.Mol.Biol.196：901-917。“构架”残基或“FR”残基为除本文定义的超变区残基之外的可变结构域残基。

术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核表达系统或原核表达系统中表达嵌合抗体分子。在本发明的一优选实施方案中，所述的PD-1嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。所述PD-1嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链FR区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。

术语“双特异性分子”，是指本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段可以进行衍生化或连接至另一功能性分子上，例如另一种肽或蛋白质(例如肿瘤相关抗原、细胞因子和细胞表面受体)以生成与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。为创建本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体在功能上连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)至一种或多种其它结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模仿物，从而产生双特异性分子。例如，“双特异性抗体”是指包含两个可变结构域或ScFv单位使得所得抗体识别两种不同抗原。

本文使用的术语“免疫结合”和“免疫结合性质”是指一种非共价相互作用，其发生在免疫球蛋白分子和抗原(对于该抗原而言免疫球蛋白为特异性的)之间。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(K_D)表示，其中K_D值越小，表示亲和力越高。所选多肽的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出。(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。Kd/Ka的比率等于解离常数K_D(通常参见Davies等人,AnnualRev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量K_D、ka和kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法(例如，实施例3.4中所述的ForteBio Octet法)来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。当平衡结合常数(K_D)为≤10μM，优选为≤100nM，更优选为≤10nM，和最优选为≤100pM～约1pM时，本发明的抗体被认为特异性地结合至PD-1表位。

同源抗体

在又一方面，本发明抗体包含的重链和轻链可变区所包含的氨基酸序列与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源，且其中所述抗体保留了本发明抗PD-1抗体的期望的功能特性。

例如，本发明提供了人源化的结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区包含与选自SEQ ID NOs：17、19、21、23、25、27和29的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；更优地，所述重链可变区包含与选自SEQID NOs：17、19、21、23、25、27和29的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列；(b)所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NOs：18、20、22、24、26、28和30的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；更优选地，所述轻链可变区包含与选自SEQID NOs：18、20、22、24、26、28和30的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列。

具有保守修饰的抗体

术语“保守修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。

在某些实施方式中，本发明的抗体包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重链可变区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体(例如AB12M1或AB12N1)的特定氨基酸序列或其保守修饰，且其中所述抗体保留了本发明抗PD-1抗体的期望的功能特性。因此，本发明提供了分离的结合PD-1的抗体或其抗原结合部分，其包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重链可变区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区CDR-H1序列包含选自SEQ ID NOs：1和2所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区CDR-H2序列包含选自SEQ ID NOs：3和4所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区CDR-H3序列包含选自SEQ ID NOs：5和6所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L1序列包含选自SEQ ID NOs：7和8所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L2序列包含选自SEQID NOs:9和10所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L3序列包含选自SEQ ID NOs：11和12所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。

抗PD-L1的抗体的治疗用途

可将本发明的抗体(其包括双特异性、多克隆、单克隆、人源化抗体)用作治疗剂。这些药剂可通常用于在受试者中治疗或预防癌症，增加疫苗功效或提高天然免疫应答。

本发明的特异性结合PD-1蛋白的抗体或其片段可以药物组合物的形式给予，用于癌症或慢性感染的治疗。

本发明抗体的治疗上有效的量通常涉及实现治疗目标所需的量。如上指出，这可以是抗体和它的靶抗原之间的结合相互作用。此外，给予所需量取决于抗体对它的特异性抗原的结合亲和力，并也取决于抗体在受试者体内的药代动力学特性。本发明抗体或抗体片段的治疗上有效的剂量给药的常用范围(以非限制实例的方式)可为约0.1mg/kg体重—约50mg/kg体重。常用给药频率可在例如从每天两次至一周一次的范围内。

在使用抗体片段的情况下，特异性结合至靶蛋白的结合结构域的最小的抑制性片段是优选的。例如，基于抗体的可变区序列，其保持结合靶蛋白序列的能力。这类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术制备。(参见，例如，Marasco等人,Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:7889-7893)。制剂还可根据治疗的特定适应症的需要而含有超过一种活性化合物，优选相互间无不利影响的具有互补活性的那些。备选地或另外，组合物可包含增强它的功能的作用剂，例如，细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。

癌症

本发明抗体或抗原结合片段可用于治疗癌症(即抑制肿瘤细胞的生长或存活)。可用本发明抗体抑制其生长的优选的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如恶性转移性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难控制的前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其它恶性肿瘤。

感染性疾病

本发明抗体或抗体片段还可用于防止或治疗感染和感染性疾病。抗体或抗体片段可单独使用，或与疫苗联合使用，以刺激针对病原体、毒素和自体抗原的免疫应答。抗体或其抗原结合片段可用于刺激对感染人的病原性病毒的免疫应答，这些病毒例如但不限于病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)病毒(hepatitis(A,B,or C))、疱疹病毒(herpes virus)(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、埃巴二氏病毒(Epstein Barrvirus))、腺病毒(adenovirus)、流感病毒(influenza virus)、黄病毒(flaviviruses)、艾柯病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒(cornovirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、腮腺炎病毒(mumpsvirus)、轮状病毒(rotavirus)、麻疹病毒(measles virus)、风疹病毒(rubella virus)、细小病毒(parvovirus)、牛痘病毒/痘苗病毒(vaccinia virus)、HTLV病毒、登革热病毒(dengue virus)、乳头瘤病毒(papillomavirus)、软疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒(rabies virus)、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒(arboviral encephalitis virus)。抗体或其抗原结合片段还可用于刺激对细菌或真菌寄生虫及其它病原体引起的感染的免疫应答。

免疫佐剂

本发明的抗体或抗体片段可与其它重组蛋白和/或肽(例如肿瘤抗原或癌细胞)联合使用，以便提高对这些蛋白的免疫应答(即在接种方案中)。

例如，通过共同给予抗PD-1抗体与目标抗原(例如疫苗)，可将抗PD-1抗体及其抗体片段用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，本发明在另一方面提供了增强受治疗者对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予受治疗者：(i)抗原；和(ii)本发明抗PD-1抗体或其抗原结合部分，以便提高受治疗者对抗原的免疫应答。例如，抗原可为肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。所述抗原的非限制性实例包括但不限于肿瘤抗原或来自病毒、细菌或其它病原体的抗原。

本发明抗体及抗体片段的非治疗性应用

非治疗性应用的抗PD-1抗体商品已经存在，例如，由eBioscience of San Diego，California，USA所售的J116和J105单克隆抗hPD-1抗体，其用于流式细胞术分析、免疫组织化学和体外功能分析；由R&D Systems of Minneapolis，MN，USA所售的Mab1086单克隆抗hPD-1抗体，其用于流式细胞术、蛋白质印迹和ELISA。本发明抗体可用于当前J116、J105和/或Mab1086所提供的任何非治疗目的。

本发明抗体可用作亲和纯化试剂。

所述抗体还可用于诊断测定，例如用于检测PD-1在特定的细胞、组织或血清中的表达。为了诊断应用，通常用可检测的部分标记(直接或间接)抗体。可利用众多标记物，其通常分为以下类别：生物素、荧光染料、放射性核苷酸、酶、碘和生物合成标记物。

本发明抗体可用于任何已知的测定法中，例如竞争性结合测定法，直接和间接夹心测定法和免疫沉淀测定法。Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques(单克隆抗体：技术手册)，第147-158页(CRC Press，Inc.1987)。

抗体还可用于体内诊断测定。通常用放射性核素(例如111In、99Tc、4C、31I、125I、3H、32P、35S或18F)标记抗体，以使可用免疫显像(immunoscintiography)或正电子成像术定位抗原或表达抗体的细胞。

单克隆抗体制备

本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术进行制备，包括常规单克隆抗体方法学，例如Kohler和Milstein,Nature,1975；256:495中所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交规程，但是原则上也可以使用制备单克隆抗体的其它方法，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。

用于制备杂交瘤的优选动物系统为鼠科动物系统。在小鼠中制备杂交瘤是非常完善的规程。分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的。

为表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增或使用表达目标抗体的杂交瘤的cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入到表达载体中，从而使得目的基因与转录和翻译调控序列可操作的连接，转染宿主细胞进行表达，表达宿主优选真核表达载体，更优选哺乳动物细胞，例如CHO及其衍生细胞系。

抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析纯化。随后或备选地，可将特异性抗原或其表位固定在柱上以通过免疫亲和层析而纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化例如由D.Wilkinson论述(The Scientist,由The Scientist,Inc.,Philadelphia PA,Vol.14,No.8(2000年4月17日),25-28页公布)。

本发明的嵌合或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为创造嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠可变区连接至人恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。通过将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可以将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选为IgG1或IgG4恒定区。

为创造人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539及Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。还可以利用转基因动物，例如，HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“KM小鼠^TM”(参见专利WO02/43478)进行抗体人源化改造。其他抗体人源化改造的方法包括噬菌体展示技术。

通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在此将整篇申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。

附图说明

图1、ELISA测定AB12N1和AB12M1与人PD-1的结合。

图2-1、ELISA测定AB12N1和AB12M1与食蟹猴PD-1和人ICOS的交叉反应。

图2-2、ELISA测定AB12N1和AB12M1与人CTLA4的交叉反应。

图2-3、ELISA测定AB12N1和AB12M1与人CD28的交叉反应。

图3、竞争ELISA测定AB12N1和AB12M1阻断人PD-1和PD-L1结合的能力。

图4、SDS-PAGE还原电泳定性分析AB12N1和AB12M1。

图5、ELISA测定AB12M2、AB12M3和AB12M4效价及特异性。

图6、ELISA测定AB12M2、AB12M3和AB12M4与鼠PD-1交叉反应。

图7、竞争ELISA测定AB12M2、AB12M3和AB12M4与Keytruda的相对亲和力。

图8、竞争ELISA测定AB12M2、AB12M3和AB12M4与Opdivo的相对亲和力。

图9、AB12M3和AB12M4与过表达PD-1的CHO细胞的结合。

图10、AB12M3和AB12M4与活化人T细胞的结合。

图11、AB12M3和AB12M4以浓度依赖方式促进T细胞增殖。

图12、AB12M3和AB12M4以浓度依赖方式促进IFN-γ分泌。

图13、AB12M3和AB12M4促进T细胞分泌IL-2。

图14、AB12M4对小鼠肿瘤体积增长的抑制作用。

具体实施方式

实施例1：抗PD-1的鼠源单克隆抗体的制备

将人PD-1胞外段纯化抗原50μg(购自北京义翘神州生物技术有限公司)以完全弗氏佐剂充分乳化后，采用多点免疫方式免疫雄性Balb/C小鼠，免疫周期为三周一次。在第3次免疫后第10天，通过眼窝取血，ELISA测试血浆抗人PD-1抗体滴度以监测小鼠免疫应答程度。然后在融合前3天，对产生抗人PD-1抗体滴度最高的小鼠加强免疫一次。3天后，处死小鼠并取出该小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞株融合。混合2×10⁸Sp2/0细胞与2×10⁸脾细胞在50％聚乙二醇(分子量为1450)和5％二甲基亚砜(DMSO)溶液中融合。用Iscove培养基(含有10％胎牛血清，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μg胸苷)来调整脾脏细胞数至5×10⁵/mL，以0.3ml加入96孔培养板孔内，并置于37℃，5％CO₂培养箱内。培养10天后，采用实施例3.2中ELISA法分别检测上清中抗体与生物素标记的人PD-L1-Fc竞争结合PD-1的能力，筛选并鉴定了8个竞争性较强的阳性杂交瘤细胞株，分别进行亚克隆，再次对上清纯化鼠源抗体进行筛选及鉴定，获得2个阳性杂交瘤单克隆细胞株#22和#32。

实施例2、ELISA法测定抗PD-1鼠源抗体效价

采用ELISA对杂交瘤细胞株#22(所分泌抗体被命名为AB12N1)和#32(该分泌抗体被命名为AB12M1)培养上清中纯化的鼠源单克隆抗体的效价进行测定。用PBS缓冲液将PD-1(购自北京义翘神州生物技术有限公司)稀释至0.1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，4℃放置16-20h。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH 7.4，PBS含0.05％吐温20)缓冲液洗板1次后，加入200μl/孔PBST/1％脱脂奶粉，室温孵育1h封闭。移去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，加入用PBST/1％脱脂奶粉稀释至适合浓度的待测PD-1鼠源抗体，100μl/孔，室温孵育1.5h。移去反应体系，用PBST洗板3次后，50μl/孔加入用PBST/1％脱脂奶粉稀释(稀释比例1：4000)HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(购自The Jackson Laboratory)，室温孵育1h。PBST洗板3次后，加入100μl/孔TMB，室温孵育显色10-30min。加入50μl/孔0.2M硫酸终止反应。酶标仪在双波长450/620nm处检测吸光值(O.D.)，计算EC₅₀值。

从图1可知，杂交瘤克隆#22表达的鼠单抗AB12N1和#32杂交瘤克隆表达的鼠单抗AB12M1均能与PD-1结合。AB12M1与抗原结合活性的EC₅₀值约为0.002μg/ml，而AB12N1的EC₅₀值约为0.1μg/ml。

实施例3、抗PD-1鼠源单克隆抗体的筛选与鉴定

3.1、鼠源抗体的结合特异性测定

为检测PD-1抗体对于PD-1同一家族其他蛋白的特异结合活性，人CTLA4、人CD28及人ICOS被用于进行结合检测。同时，为了检测PD-1抗体对于人以外的不同种属的差异性，对小鼠和食蟹猴的PD-1也进行了结合检测。

用PBS缓冲液将人PD-1/His、人ICOS/Fc，人CTLA4/His、人CD28/Fc、食蟹猴PD-1/Fc及鼠PD-1/His(均购自北京义翘神州生物技术有限公司)，稀释至0.1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，4℃放置16～20h。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，PBST(pH 7.4，PBS含0.05％吐温20)缓冲液洗板1次后，加入200μl/孔PBST/1％脱脂奶粉，室温孵育1h封闭。移去封闭液，PBST缓冲液洗板3次后，加入待测PD-1抗体，100μl/孔，室温孵育1.5h。移去反应体系，PBST洗板3次后，50μl/孔加入1：4000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(购自TheJackson Laboratory)，室温孵育1小时。PBST洗板3次后，加入100μl/孔TMB，室温孵育5-10min。加入50μl/孔0.2M硫酸终止反应。酶标仪在双波长450/620nm处读取吸收值。

如图2-1至图2-3所示，AB12N1和AB12M1对PD-1家族的其他三种蛋白都没有特异的结合能力。同时，AB12N1和AB12M1与鼠源PD-1也没有种属交叉反应，但AB12M1能特异性结合食蟹猴的PD-1，而AB12N1与食蟹猴的PD-1无特异性结合。

3.2、鼠源抗体阻断PD-1结合PD-L1实验

以生物素标记的人PD-L1作为试剂。用PBS缓冲液将PD-1(购自北京义翘神州生物技术有限公司)稀释至2.0μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，室温过夜。弃去包被溶液，加入200μl/孔PBST/1％脱脂奶粉，室温孵育1h封闭。移去封闭液，PBST缓冲液洗板3次后，然后每孔加入50μL稀释好的鼠源单抗AB12N1和AB12M1与50μl生物素标记的人PD-L1混合液，充分孵育后以PBST洗去未结合的抗体及生物素标记的PD-L1，然后加入100μl每孔的HRP标记的亲和素，充分孵育后以PBST洗去未结合的HRP标记的亲和素，加入100μl每孔的TMB显色液，显色30分钟。用0.2M的硫酸终止反应，以酶标仪在双波长450/620nm处读取吸光度值。如图3中所示，鼠源抗体AB12N1和AB12M1都能特异地阻断PD-1与PD-L1的结合。AB12M1阻断PD-L1与PD-1结合能力明显优于AB12N1。

3.3、纯化鼠源抗体SDS-PAGE分析和Western-Blot鉴定

采用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法(Western-Blot)对纯化的鼠单克隆抗体AB12N1和AB12M1进行定性、半定量分析。按胶配置方法配置12％浓度的PAGE胶，各泳道分别加入4μg的抗体AB12N1、AB12M1、Keytruda和Opdivo。电泳至染料抵达分离胶底部，断开电源，以凝胶成像系统观察电泳结果。如图4所示，鼠源抗体AB12N1和AB12M1还原性SDS-PAGE电泳结果均呈现清晰、均一的两条带，分别是约50KD重链和约25KD轻链(其中，各泳道上样如下：1.Marker；2.AB12N1；3.AB12N1；4.AB12M1；5.AB12M1；6.Keytruda；7.Opdivo)。

按胶配置方法配置15％浓度的非还原PAGE胶，人PD-1上样量为5μg，电泳至染料抵达分离胶底部，断开电源。取下凝胶，平放于大小一致的NC膜上，根据凝胶面积按1mA/cm²接通电源，100mA，电转移2～4小时。浸在封闭液中，4℃封闭过夜，用PBST缓冲液洗膜3次，每次10min。再分别加入过量AB12N1和AB12M1抗体孵育1h，PBST缓冲液洗膜3次，每次10min。以1：5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG Fc二抗作为检测抗体，孵育1h，PBST缓冲液洗膜3次。在DAB显色液中避光显色15min，出现条带后立即以水冲洗以终止显色反应，拍照后进行定量和定性分析。

Western-Blot结果显现约34KD大小的PD-1目的条带，说明AB12N1和AB12M1均能特异性结合人PD-1。

3.4、抗PD-1鼠源抗体的亲和力测定以及动力学分析

我们采用生物薄膜干涉技术(BLI)对纯化的鼠单克隆抗体的表征亲和力及结合动力学进行测定。按照Octet分子相互作用仪(ForteBio Octet RED&QK系统，PALL公司)标准操作方法进行测定，对照抗体为Keytruda和Opidivo。多通道平行定量分析浓度梯度设定为：3.125、6.25、12.5、25、50和100nM，将Human PD-1-His(北京义翘神州生物技术有限公司)偶联Ni-NTA传感器。追踪抗原—抗体结合动力学及解离动力学。分析所得数据，以此法测定的ka(kon)、kd(koff)和KD值显示于表1。鼠单克隆抗体AB12M1与人PD-1的平衡解离常数KD值<1×10^-12M，与对照抗体Keytruda和Opidivo的结合亲和力相当。而AB12N1的KD值为3.508×10^-10M，表征亲和力低于对照抗体Keytruda和Opidivo。

表1、鼠单抗AB12M1和AB12N1的亲和力测定结果

实施例4、抗PD-1鼠源单抗的亚型鉴定及可变区扩增

抗体亚型鉴定：取杂交瘤细胞培养上清液，采用IsoStrip^TM小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Santa Cruz Biotechnology，货号sc-24958)鉴定抗体亚型。单抗AB12N1亚型经鉴定为IgG1(Kappa)，单抗AB12M1亚型为IgG2b(Kappa)。

抗体可变区扩增：将候选杂交瘤细胞#22和#32分别培养至总数量10⁷个细胞，1000rpm离心10分钟收集细胞，并以Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，用反转录试剂盒SMARTer RACE合成第一链cDNA，以第一链cDNA为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的抗体可变区DNA序列。根据亚型鉴定结果，获取该抗体亚型的重链和轻链恒定区序列，设计特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补。采用常规PCR方法扩增目的基因，将扩增产物测序后，得到杂交瘤克隆#22分泌抗体AB12N1的重链可变区序列SEQ ID NO：15和轻链可变区序列SEQ ID NO：16；该抗体的重链CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、4和6所示，其轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、10和12所示。杂交瘤克隆#32分泌抗体AB12M1的重链可变区序列SEQ ID NO：13和轻链可变区序列SEQ ID NO：14；该抗体的重链CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、3和5所示，其轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、9和11所示。

实施例5、抗PD-1鼠源抗体的人源化

根据上述获得的AB12N1和AB12M1抗体可变区序列，利用计算机辅助抗体三维建模以及结构分析进行抗体人源化改造。CDR移植(CDR-Grafting)是一种常见的抗体人源化方法，是通过将人源抗体的FR替换鼠源抗体的FR来达到保持活性、降低免疫原性的目的。结合Discovery Studio分析工具进行CDR移植抗体人源化改造的方法主要包括以下步骤：(1)抗体三维结构建模；(2)关键残基分析。利用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式以确定对于保持CDR区构象至关重要的关键残基，主要有三类：1、位于VL和VH结合界面上的残基，对于两个结构域的折叠起到关键作用；2、靠近CDR区并且包埋于蛋白内部的残基；3、与CDR区有直接相互作用的残基，相互作用包括：疏水相互作用/氢键/盐桥；(3)人源模板选择。须同时满足下面两个条件：首先，把各杂交瘤细胞分泌的抗体氨基酸序列与人胚胎系抗体氨基酸序列进行比对，找出同源性高的序列；其次，选择其中与MHC II(HLA-DR)亲和力低的人胚胎系(germline)抗体框架序列，以降低其免疫原性；(4)基于关键残基分析的反向嫁接，获得人源化抗体序列。

其中，鼠源抗体AB12M1以人V_H3-23重链可变区和人V_K3D-11轻链可变区为模板序列，共获得7个人源化抗体，分别是AB12M3、AB12M4、AB12M5、AB12M6、AB12M7、AB12M8和AB12M9。同时，构建了它的一株人鼠嵌合抗体AB12M2，是将鼠源抗体的重链可变区序列嫁接至人IgG1重链恒定区，将鼠源抗体的轻链可变区序列嫁接至人Kappa轻链恒定区而获得。上述人源化抗体的可变区氨基酸序列如表2所示。

鼠源抗体AB12N1以人V_H3-33重链可变区和人V_K3-11轻链可变区为模板序列，共获得3个人源化抗体，分别是AB12N3、AB12N4和AB12N5。同时，构建了它的一株人鼠嵌合抗体AB12N2，是将鼠源抗体的重链可变区序列嫁接至人IgG1重链恒定区，将鼠源抗体的轻链可变区序列嫁接至人Kappa轻链恒定区而获得。上述人源化抗体的可变区氨基酸序列如表2所示。

从表3中各人源化抗体的亲和力常数及动力学参数可知，AB12M3、AB12M4、AB12M5、AB12M6、AB12M7、AB12M8和AB12M9与鼠源抗体AB12M1以及嵌合抗体AB12M2相比人源化程度超过95％，但亲和力没有明显损失，KD值均小于1×10^-12M，保留了亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，大大降低了其免疫原性。

另一组人源化抗体AB12N3、AB12N4和AB12N5与鼠源抗体AB12N1以及嵌合抗体AB12N2相比人源化程度也超过95％，亲和力也未出现明显下降，KD值均在10^-10M数量级。

表2、人源化抗体可变区氨基酸序列

表3、人源化抗体亲和力比较

实施例6、抗PD-1人源化抗体功能鉴定

6.1、间接法ELISA测定人源化抗体的效价及结合特异性

采用间接法ELISA测定人源化抗体AB12M3和AB12M4及嵌合抗体AB12M2与抗原PD-1的结合特性。以Keytruda和Opdivo作为对照抗体，以培养基作为阴性对照。使用HRP标记的羊抗人IgG抗体作为检测抗体(购自The Jackson Laboratory)，具体方法同实施例2所述。同样的方法，被用于检测人源化抗体AB12M3和AB12M4及嵌合抗体AB12M2对小鼠PD-1(购自北京义翘神州生物技术有限公司)有无交叉反应，同样以Keytruda和Opdivo作为对照抗体，以培养基作为阴性对照。

如图5所示，人源化抗体AB12M3和AB12M4及嵌合抗体AB12M2均能特异性地结合人PD-1，且它们与抗原结合活性的EC₅₀值均低于对照抗体Keytruda和Opdivo，约在0.001～0.01μg/ml之间。这表明本发明所构建的抗PD-1人源化抗体AB12M3和AB12M4及嵌合抗体AB12M2与PD-1的结合能力未因人源化改造而消减，仍保留了鼠源亲本抗体的高亲和力。并且，它们与小鼠PD-1均不结合，具有较强的种属特异性(图6)。

6.2、PD-1人源化抗体相对亲和力测定

以辣根过氧化物酶(HRP)标记的Keytruda和Opdivo作为试剂。用PBS缓冲液将PD-1(购自北京义翘神州生物技术有限公司)稀释至0.1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，室温过夜。弃去包被溶液，加入200μl/孔PBST/1％脱脂奶粉，室温孵育1h进行封闭。移去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，然后每孔加入50μL生长培养基(DMEM+5％FBS)与50μLHRP标记的Keytruda或Opdivo抗体的混合液，以PBS洗去未结合的HRP标记的Keytruda或Opdivo抗体。然后分别加入抗体AB12M2、AB12M3和AB12M4；以未标记的Keytruda或Opdivo作为阳性对照。充分孵育后以PBS洗去未结合的HRP标记的Keytruda或Opdivo抗体，然后以酶标仪在双波长450/620nm处读取吸光度值。

结果如图7及图8所示，抗体AB12M2和AB12M3及AB12M4都能显著地竞争性阻断Keytruda或Opdivo与PD-1的结合，且它们与Keytruda-HRP或Opdivo-HRP竞争结合PD-1的EC₅₀值均低于Keytruda及Opdivo，但都在0.1～1μg/ml之间。因此，可以判断抗体AB12M2、AB12M3及AB12M4与Keytruda和Opdivo的亲和力大小相当。

6.3、PD-1人源化抗体体外阻断PD-1与PD-L1结合实验

将带His标签的PD-1蛋白胞外区片段包被96孔酶标板后，封闭、洗板，加入待测PD-1抗体，同时加入生物素标记的PD-L1-Fc，孵育反应。洗板后，检测生物素标记的PD-L1/Fc结合量，计算PD-1抗体对配体PD-L1结合阻断的IC₅₀值。

用pH 7.2PBS缓冲液将PD1/His稀释至2μg/ml，以100μl每孔的体积加入96孔酶标板中，室温振荡孵育1小时。将96孔酶标板中PBS缓冲液吸掉，加入200μl每孔PBST(pH7.2PBS含0.05％吐温-20)/1％脱脂奶粉，室温孵育1小时封闭。PBST洗板3次，加入50μl每孔用封闭液稀释至合适浓度的待测PD-1抗体，同时加入50μl每孔用封闭液稀释至200ng/ml的生物素标记的PD-L1/Fc，室温孵育1小时，PBST洗板3次，加入100μl每孔用封闭液1：250稀释的SA-Avidin-HRP(HRP标记的链霉亲和素)，室温孵育1小时。PBST洗板3次，加入100μl每孔TMB，室温孵育5-10分钟。加入50μl每孔0.2M硫酸终止反应。用酶标仪在450nm处读取吸收值，计算PD-1抗体对配体PD-L1结合阻断的IC₅₀值。

如表4中实验结果所示，AB12M3和AB12M4抗体都能有效阻断PD-L1与PD-1的结合，并且优于Keytruda，与Opdivo结果相似。

表4、AB12M3和AB12M4体外阻断PD-1与PD-L1结合的IC₅₀值

6.4、抗PD-1人源化抗体体外细胞结合实验

FACS(荧光活性细胞分选仪)是一个用于检测蛋白和细胞结合的试验方法。本测试用于检测本发明的PD-1人源化抗体与细胞表面表达的天然PD-1的结合活性。本测试所用的细胞为PD-1过表达的CHO细胞。3×10⁵个CHO细胞与一系列梯度浓度待测的AB12M3或AB12M4(一抗)孵育30分钟，经洗涤后加入FITC标记的羊抗人IgG二抗(购自BD Biosciences公司)结合30分钟，流式细胞仪检测FITC信号。结果显示在图9中，AB12M3和AB12M4可以与过表达于CHO细胞表面的PD-1特异性结合。

6.5、抗PD-1人源化抗体与活化人T细胞特异性结合试验

采用密度梯度离心法(Lymphoprep^TM，人淋巴细胞分离液，STEMCELL公司)从人外周血获得新鲜单个核细胞，使用T细胞分选试剂(STEMCELL公司)获得高纯度T淋巴细胞。经过5μg/ml抗CD3抗体刺激48h，加入250IU/ml的人IL-2培养7天获得大量活化T淋巴细胞。3×10⁵个T淋巴细胞与一系列浓度梯度的AB12M3或AB12M4(一抗)孵育30分钟，经洗涤后加入FITC标记的羊抗人IgG二抗(BD Biosciences公司)，流式细胞仪检测FITC信号。结果显示在图10中，AB12M3和AB12M4可以与表达于活化人T细胞表面的PD-1受体特异性结合。

实施例7、抗人PD-1人源化抗体的生物学活性测定

7.1、抗PD-1人源化抗体在混合淋巴细胞反应中对细胞增殖和细胞因子分泌的影响

利用混合淋巴细胞反应证明阻断PD-1/PD-L1途径对淋巴效应细胞的影响。测定PD-1抗体或者同型IgG对照抗体对混合淋巴细胞反应中T细胞增殖以及IFN-γ分泌的影响。

新鲜分离的人PBMC调整细胞密度为2.0×10⁶个/ml，采用贴壁法获得单核细胞。添加100ng/ml GM-CSF和100ng/ml IL-4培养5天，补加100ng/ml TNF-ɑ诱导DC细胞成熟。使用CD⁴⁺T细胞正选试剂盒(STEMCELL公司)从人新鲜PBMC中分离CD⁴⁺T细胞。96孔板中，每孔250μl培养液含有10⁵个分离的T细胞，10⁴个诱导成熟的DC细胞以及一系列浓度梯度的AB12M3或AB12M4。使用同型IgG对照抗体作为阴性对照。混合淋巴细胞在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养6天，然后从96孔板中每孔取出100μl培养上清进行IFN-γ测定。IFN-γ采用OptEIAELISA试剂盒(BD Biosciences公司)测定。96孔板剩余细胞用Cell Titer Glo试剂盒(Promega公司)测定细胞增殖情况。结果显示，AB12M3和AB12M4以浓度依赖方式促进T细胞增殖(图11)和IFN-γ(图12)分泌。

7.2、抗PD-1人源化抗体对超抗原刺激诱导人PBMC细胞分泌细胞因子的影响

新鲜制备的人PBMC细胞，用含20μg/ml AB12M3、AB12M4或同型IgG对照抗体的RPMI1640培养基(含10％灭活FBS)重悬为10⁶/ml，接种于96孔板，100μl/孔。超抗原SEB的最高浓度为2500ng/ml，10倍稀释4个梯度，加入到96孔板中，设三复孔。培养72小时，取上清使用OptEIA ELISA试剂盒(BD Biosciences公司)测定IL-2浓度。结果显示在图13中，AB12M3和AB12M4可以促进T细胞分泌IL-2。

7.3、体外测定抗PD-1人源化抗体刺激T细胞杀伤肿瘤细胞效应

将PD-L1过表达的人非小细胞肺癌细胞株HCC827(中科院上海细胞库)接种于96孔细胞培养板，加入一系列浓度的AB12M1、AB12M3、AB12M4或huIgG，然后按照10：1的效靶比加入用抗CD3抗体和IL-2活化的T细胞，培养48小时，使用培养基洗板，去除大部分T细胞，用CCK-8细胞增殖试剂盒(Dojindo公司)测定HCC827细胞存活情况，计算杀伤率。结果显示在表5中，表明AB12M3、AB12M4具备增强T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。

表5、人源化抗体AB12M3和AB12M4对肿瘤细胞的杀伤率(％)

7.4、抗PD-1人源化抗体在人源化PD-1小鼠体内皮下移植结肠癌MC38细胞模型中的药效学研究

采用北京百奥赛图生物技术有限公司构建的B-hPD-1人源化小鼠进行抗人PD-1抗体的体内药效评价，该小鼠采用C57BL/6背景，采用基因打靶技术将小鼠PD-1基因的包括IgV结构域部分在内的第二个外显子部分进行人源化改造。改造成功的小鼠带有人鼠嵌合的PD-1，即胞外部分为hPD-1而胞内部分为mPD-1。这类嵌合PD-1结构不影响PD-1正常信号传递，鼠源或人源PD-L1配体与此PD-1受体结合后可抑制T细胞活性。

将MC38鼠结肠癌细胞(购自舜冉上海生物科技有限公司)以5×10⁵个/0.1mL接种于雌性B-hPD-1人源化小鼠右侧前胁肋部皮下，待肿瘤生长到约150mm³时按肿瘤体积随机分组，每组8只，共3组，分别为：(1)溶剂对照组(PBS组)、(2)AB12M4处理组和(3)Keytruda对照组(购自Merck公司，批号：5SNL80505)，组(2)和组(3)的给药剂量为20mg/kg，给药体积10ml/kg。所有组给药途径均为腹腔注射，每3天给药1次，连续给药6次，当实验进行到接种后第28天结束。

使用游标卡尺测量肿瘤长径(L)和短径(W)，通过公式V＝1/2(L×W²)计算肿瘤体积(V)，每周测量3次，同时测量小鼠体重。

如图14所示，实验结束时，溶剂对照组平均肿瘤体积为3405.2mm³。AB12M4处理组的平均肿瘤体积为277.4mm³，Keytruda给药组的平均肿瘤体积为249mm³。表明AB12M4具有显著抑瘤作用，其抑瘤效果与Keytruda相当。另外，整个实验过程中，动物健康状态良好，无动物死亡。实验结束时，各组动物体重均出现增长，AB12M4处理组动物与溶剂对照组动物体重比较无显著性差异(p>0.05)，表明动物对AB12M4耐受良好，未对实验动物产生明显毒性作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 鲁南制药集团股份有限公司

<120> 抗PD-1抗体及其用途

<130> 201612

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

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1 5

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<212> PRT

<213> CDR-H1

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Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly

1 5

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<212> PRT

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<212> PRT

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Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg

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<212> PRT

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<212> PRT

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Glu Ser Val Asp Asp Tyr Gly Ile Ser Phe

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<211> 6

<212> PRT

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<212> PRT

<213> mAb1 CDR-L2

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<212> PRT

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Asp Ala Ser

1

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<211> 9

<212> PRT

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Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr

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<211> 9

<212> PRT

<213> CDR-L3

<400> 12

Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr

1 5

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> 鼠源抗体AB12M1或嵌合抗体AB12M2重链可变区氨基酸序列

<400> 13

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Lys Asp Thr Ser Trp Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 14

<211> 111

<212> PRT

<213> 鼠源抗体AB12M1或嵌合抗体AB12M2轻链可变区氨基酸序列

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 111

<212> PRT

<213> 鼠源抗体AB12N1或嵌合抗体AB12N2重链可变区氨基酸序列

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 鼠源抗体AB12N1或嵌合抗体AB12N2轻链可变区氨基酸序列

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

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<211> 118

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M3重链可变区氨基酸序列

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Lys Asp Thr Ser Trp Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 111

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M3轻链可变区氨基酸序列

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

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<211> 118

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M4重链可变区氨基酸序列

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gln Lys Asp Thr Ser Trp Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 20

<211> 111

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M4轻链可变区氨基酸序列

<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

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Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M5重链可变区氨基酸序列

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M5轻链可变区氨基酸序列

<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Val Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M6重链可变区氨基酸序列

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gln Lys Asp Thr Ser Trp Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M6轻链可变区氨基酸序列

<400> 24

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Val Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M7重链可变区氨基酸序列

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Lys Asp Thr Ser Trp Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M7轻链可变区氨基酸序列

<400> 26

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Val Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 118

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M8重链可变区氨基酸序列

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Lys Asp Thr Ser Trp Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M8轻链可变区氨基酸序列

<400> 28

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Val Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 118

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M9重链可变区氨基酸序列

<400> 29

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Lys Asp Thr Ser Trp Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12M9轻链可变区氨基酸序列

<400> 30

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Val Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 31

<211> 110

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12N3重链可变区氨基酸序列

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12N3轻链可变区氨基酸序列

<400> 32

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 111

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12N4重链可变区氨基酸序列

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12N4轻链可变区氨基酸序列

<400> 34

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 35

<211> 110

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12N5重链可变区氨基酸序列

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB12N5轻链可变区氨基酸序列

<400> 36

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 354

<212> DNA

<213> 嵌合抗体AB12M2重链可变区核苷酸序列

<400> 37

gaggtgaagc tggtggagag cggaggagga ctggtgaagc caggaggatc tctgaagctg 60

agctgtgctg cctctggctt caccttttcc tcttacggca tgagctgggt gagacagaca 120

cccgagaagc gcctggaatg ggtcgctacc atctctggcg gcggcagaga cacatactat 180

cctgattccg tgaagggcag attcaccatc agccgcgata acgccaaaaa taatctgtat 240

ctgcaaatgt cttccctgag gtctgaggac accgctctgt actattgcgc ccggcagaag 300

gatacatctt ggttcgtgca ctggggacag ggcaccctgg tgaccgtgtc cgcc 354

<210> 38

<211> 333

<212> DNA

<213> 嵌合抗体AB12M2轻链可变区核苷酸序列

<400> 38

gacatcgtgc tgacccagtc tccagctagc ctggccgtgt ccctgggaca gagggctacc 60

atcagctgtc gggcctctga gtctgtcgac gattacggca tctctttcat gaattggttc 120

cagcagaaac ctggccagcc ccctaaactg ctgatctatg tcgcttccaa tcagggaagc 180

ggagtgcctg ctagattcag cggatctgga tctggaaccg acttcagcct gaacatccat 240

ccaatggagg aggacgatac cgccatgtac ttctgtcagc agtctaaaga agtcccttgg 300

acctttggcg gcggcacaaa gctggagatc aag 333

<210> 39

<211> 354

<212> DNA

<213> 人源化抗体AB12M3重链可变区核苷酸序列

<400> 39

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc ctggaggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg cttccggctt caccttttcc agctacggca tgtcttgggt gagacaggct 120

cctggcaagg gactggagtg ggtggctacc atctccggag gaggaaggga cacatactat 180

ccagatagcg tgaagggcag gttcacaatc tctcgggaca acgctaagaa caatctgtat 240

ctgcagatga actccctgag agctgaggac accgccctgt actattgcgc ccgccagaag 300

gatacaagct ggtttgtgca ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc ttcc 354

<210> 40

<211> 333

<212> DNA

<213> 人源化抗体AB12M3轻链可变区核苷酸序列

<400> 40

gagatcgtgc tgacccagag ccctgccaca ctgagcctgt ctccaggcga gagggctacc 60

ctgtcttgtc gggcctccga gagcgtggac gattacggca tctccttcat gaactggttt 120

cagcagaagc caggccaggc tcccaagctg ctgatctatg tggccagcaa tcagggctct 180

ggagtgccag ctcgcttctc tggctccgga agcggaaccg acttttctct gacaatcagc 240

tctctggagc cagacgatac agccatgtac ttctgccagc agtccaagga ggtgccatgg 300

acctttggcg gaggaacaaa ggtggagatc aag 333

<210> 41

<211> 354

<212> DNA

<213> 人源化抗体AB12M4重链可变区核苷酸序列

<400> 41

gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgaagc caggaggatc tctgaggctg 60

agctgtgctg cctctggctt caccttttcc tcttacggca tgagctgggt gagacagaca 120

cccgagaagc gcctggaatg ggtcgctacc atctctggcg gcggcagaga cacatactat 180

cctgattccg tgaagggcag attcaccatc agccgcgata acgccaaaaa taatctgtat 240

ctgcaaatgt cttccctgag gtctgaggac accgctctgt actattgcgc ccggcagaag 300

gatacatctt ggttcgtgca ctggggacag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctcc 354

<210> 42

<211> 333

<212> DNA

<213> 人源化抗体AB12M4轻链可变区核苷酸序列

<400> 42

gaaatcgtgc tgacccagtc tccagctaca ctggccgtgt cccctggaga gagggctacc 60

atcagctgtc gggcctctga gtctgtcgac gattacggca tctctttcat gaattggttc 120

cagcagaaac ctggccagcc ccctaaactg ctgatctatg tcgcttccaa tcagggaagc 180

ggagtgcctg ctagattcag cggatctgga tctggaaccg acttcaccct gaacatccat 240

ccaatggagg aggacgatac cgccatgtac ttctgtcagc agtctaaaga agtcccttgg 300

acctttggcg gcggcacaaa gctggagatc aag 333

Claims

1.分离的结合PD-1的单克隆抗体，其包含：

重链可变区，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；和

轻链可变区，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，

其中：

(i) 重链可变区包含SEQ ID NO：1所示的CDR-H1序列，和SEQ ID NO：3所示的CDR-H2序列，和SEQ ID NO：5所示的CDR-H3序列；和

(ii) 轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的CDR-L1序列，和SEQ ID NO：9所示的CDR-L2序列，和SEQ ID NO：11所示的CDR-L3序列。

2.如权利要求1所述抗体，其特征在于，所述抗体为鼠源的或嵌合的，其重链可变区包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链FR区；和其轻链可变区包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。

3.如权利要求2所述抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；和其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

4.如权利要求1所述抗体，其特征在于，所述抗体为人源化的。

5.如权利要求4所述抗体，其特征在于，所述抗体选自下组：

（1）其重链可变区如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，和其轻链可变区如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；

（2）其重链可变区如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，和其轻链可变区如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；

（3）其重链可变区如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，和其轻链可变区如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；

（4）其重链可变区如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，和其轻链可变区如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；

（5）其重链可变区如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，和其轻链可变区如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；

（6）其重链可变区如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，和其轻链可变区如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列；

（7）其重链可变区如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，和其轻链可变区如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5任一项所述抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区包含SEQ IDNO：1所示的CDR-H1序列，和SEQ ID NO：3所示的CDR-H2序列，和SEQ ID NO：5所示的CDR-H3序列；和轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的CDR-L1序列，和SEQ ID NO：9所示的CDR-L2序列，和SEQ ID NO：11所示的CDR-L3序列，所述抗体包含一个或更多个氨基酸的替换、添加和/或缺失，且与其来源序列至少95%、96%、97%、98%或99%同源。

7.如权利要求1-5任一项权利要求所述抗体，其特征在于，所述抗体为包含人IgG4或IgG1的重链恒定区和人κ轻链恒定区的全长抗体；或仅包含Fab或Fab’²或ScFv的抗原结合片段。

8.如权利要求1-5任一项权利要求所述抗体，其特征在于，所述抗体含有糖基化修饰。

9.如权利要求1-5任一项权利要求所述抗体，其特征在于，所述抗体以100 pM或更低的KD结合PD-1。

10.如权利要求9所述抗体，其特征在于，所述抗体以1 pM或更低的KD结合PD-1。

11.编码如权利要求1-5任一项所述抗体的DNA分子。

12.如权利要求11所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子选自下组：

（1）编码所述抗体重链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：37所示，和编码所述抗体轻链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：38所示；

（2）编码所述抗体重链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：39所示，和编码所述抗体轻链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：40所示；

（3）编码所述抗体重链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：41所示，和编码所述抗体轻链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：42所示。

13.包含如权利要求11或12所述DNA分子的表达载体。

14.用如权利要求13所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞为CHO细胞。

15.包含如权利要求1-5任一项所述抗体的双特异性分子，所述双特异性分子还包括针对以下分子的抗体：VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体或其它生长因子受体、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-1-BB和ICOS。

16.包含如权利要求1-5任一项所述抗体的免疫缀合物，所述免疫缀合物还包含治疗剂，其中，治疗剂为放射性同位素或细胞毒剂。

17.药物组合物，其包含如权利要求1-5任一项所述抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

18.制备如权利要求1-5任一项所述抗体的方法，其包括：在允许产生所述抗体的条件下培养包含如权利要求14所述的宿主细胞，以及回收、分离产生的所述抗体。

19.如权利要求1-5任一项所述抗体或如权利要求15所述双特异性分子或如权利要求16所述免疫缀合物或如权利要求17所述的药物组合物在制备用于治疗非小细胞肺癌或结肠癌的药物中的用途。