CN109575139A - 针对表皮生长因子受体和程序性死亡受体的双特异抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了双特异性抗体，其包含结合于EGFR的第一结合结构域和结合于PD‑1的第二结合结构域，其中，所述抗体或其抗原结合片段是选自由单链抗体(scFv)、双抗体和上述形式的寡聚物所组成的组中的形式。本发明还提供了本发明抗体的氨基酸序列、克隆或表达载体、宿主细胞、以及用于表达或分离抗体的方法。还提供了包含本发明抗体的治疗组合物。本发明还提供了用双特异性抗体治疗癌症和其他疾病的方法。

Description

针对表皮生长因子受体和程序性死亡受体的双特异抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月29日提交的PCT专利申请序列号PCT/CN2017/104584的权益和优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及一种双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一结合结构域和结合PD-1的第二结合结构域，其中，所述抗体或其抗原结合片段是选自由单链抗体(scFv)、双抗体和上述形式的寡聚物所组成的组中的形式。此外，本发明提供了一种编码该抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、宿主细胞、生产抗体的方法以及使用双特异性抗体治疗癌症、感染或其他人类疾病的免疫治疗方法。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)在多种人类癌症中均过度表达。EGFR可以由不同的配体激活。在这些配体中，EGF是EGFR的高亲和力配体。EGF与EGFR胞外区结合诱导受体二聚化。EGFR可能还与ErbB受体的另一成员，如HER2，配对形成异源二聚体。EGFR二聚化刺激其内在的激酶活性以及EGFR在几个位点的随后的磷酸化。该磷酸化诱导下游的激活和信号传递，并进一步启动一些信号转导通路，主要是MAPK、Akt和JNK通路，从而导致DNA合成和细胞增殖。整个EGF/EGFR通路诱导细胞分化、迁移、黏附和增殖。由于EGFR在多种人类肿瘤中过度表达，因此EGFR是靶向治疗的重要靶点。
两个EGFR靶向抗体，西妥昔单抗(Erbitux)和帕尼单抗(Vectibix)，已被美国食品药物管理局批准用于治疗结肠癌和头颈部癌。这些抗体阻断配体与EGFR和下游信号的结合，介导抗肿瘤免疫应答。
程序性死亡蛋白1(PD-1，CD279)是表达在活化的T细胞和其他免疫细胞上的CD28家族中的一个成员。PD-1的参与抑制这些免疫细胞的功能。PD-1有两个已知配体，PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)，两者都属于B7家族。PD-L1表达在各种淋巴和外周组织细胞类型中可诱导，而PD-L2更加局限于髓系细胞包括树突状细胞。PD-1通路的主要作用是下调组织和器官中的炎症免疫反应。
研究发现，在肿瘤微环境中，癌细胞能够通过上调PD-1/PD-L1通路而产生免疫逃逸(Boussiotis 2016 N Engl J Med)。这种机制特别见于具有EGFR基因激活突变的肿瘤中。PD-1通路上调可能是免疫逃逸的典型机制。作为证据，高PD-L1表达在EGFR突变的患者的肿瘤中被发现(Azuma 2014 Ann Oncol；Ramalingam 2016 J Thorac Oncol)。
事实上，尽管EGFR过量表达已在肺癌中被发现，但抗EGFR抗体尚未被批准用于肺癌治疗。抗EGFR治疗的初始效果经常受到这种靶向治疗的抵制而减弱，主要是由于EGFR突变所致。目前相比单独靶向EGFR的肿瘤治疗，并不知晓靶向EGFR通路和PD-1/PD-L1通路是否可能提供更有效的治疗。因此，本发明的目标是产生抗EGFR和PD-1双特异性抗体并且证明该抗体在癌症治疗中提供了一些优势。首先，双特异性抗体可用于肺癌治疗，而抗EGFR抗体尚未被批准用于EGFR过量表达的此适应症。第二，双特异性抗体可以逆转EGFR治疗的耐药性。同时与抗PD-1治疗相比，双特异性抗体可以增加PD-L1和EGFR双阳性的肿瘤的反应率。
发明内容
本发明提供了分离的抗体，特别是双特异性抗体。
一方面，本发明提供了一种双特异性抗体或其抗原结合片段，包含结合于人EGFR的第一结合结构域和结合于人PD-1的第二结合结构域，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括选自由单链抗体(scFv)、双抗体、和上述形式的寡聚物所组成的组中的形式。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是选自由单链抗体(scFv)、双抗体、和上述形式的寡聚物所组成的组中的形式。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述第二结合结构域结合于鼠源PD-1。
在一个实施例中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含抗EGFR的单链抗体。
在一个实施例中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含抗PD-1的单链抗体。
在一个实施例中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含抗EGFR的单链抗体和抗PD-1的单链抗体.
如前所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段
a)结合于人EGFR且亲和常数KD为5.49E-10以下；并且
b)结合于人PD-1且亲和常数KD为7.68E-09以下。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有下列性质中的至少一种：
a)结合于人EGFR且KD在5.45E-10至5.49E-10之间，并且
b)结合于人PD-1且KD在1.98E-09至7.68E-09之间。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包括：
包含第一结合结构域的多肽链，所述第一结合结构域包含抗EGFR的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；
包含第二结合结构域的另一多肽链，所述第二结合结构域包含抗PD-1的重链可变区和轻链可变区。
在一个实施例中，如前所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一结合结构域包含：
重链可变区，所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，和轻链可变区，所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，其中
H-CDR3包含SEQ ID NO：8所示的序列及其保守性修饰，H-CDR2包含SEQ ID NO：7所示的序列及其保守性修饰，H-CDR1包含如SEQ ID NO：6所示的序列及其保守性修饰；并且
L-CDR3包含如SEQ ID NO：11所示的序列及其保守性修饰；L-CDR2包含SEQ ID NO：10所示的序列及其保守性修饰；L-CDR1包含如SEQ ID NO：9所示的序列及其保守性修饰。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、或99％的同源性。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列是选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5所组成的组中的序列。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：1、3所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％的同源性；以及
b)第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、4、5所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％的同源性。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：1、3所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：2、4、5所组成的组中的序列。
在各种实施例中，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：1所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：2所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：3所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：2所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：1所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：4所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：1所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：5所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：3所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：4所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：3所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：5所组成的组中的序列；
所述抗体的序列如表1和序列表所示。
表1推导的抗体氨基酸序列
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：19、20、21、22、23所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、或99％的同源性。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列是选自SEQ ID NO：19、20、21、22、23所组成的组中的序列。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域，其具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：19、21所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、或99％的同源性；以及
b)第一结合结构域，其具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：20、22、23所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、或99％的同源性。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：19、21所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：20、22、23所组成的组中的序列。
在各种实施例中，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：19所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：20所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：21所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：20所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：19所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：22所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：19所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：23所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：21所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：22所组成的组中的序列；
或者，如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)第二结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：21所组成的组中的序列；以及
b)第一结合结构域，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：23所组成的组中的序列；
所述抗体的序列如表3和序列表所示。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，包含互补决定区(CDR)，该互补决定区具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：6-18所组成的组中的序列。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，其中第二结合结构域包含：
重链可变区，其包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，以及
轻链可变区，其包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
其中所述H-CDR3包含如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中抗PD-1的L-CDR3包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中抗PD-1的H-CDR2包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中抗PD-1的L-CDR2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中抗PD-1的H-CDR1包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中抗PD-1的L-CDR1包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
在更优选的实施例中，前述抗体或其抗原结合片段，其中第二结合域包含：
包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的重链可变区，；包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的轻链可变区，其中
a)抗PD-1的H-CDR3包含如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列及其保守性修饰；
b)抗PD-1的L-CDR3包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列及其保守性修饰；
c)抗PD-1的H-CDR2包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列及其保守性修饰；
d)抗PD-1的L-CDR2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列及其保守性修饰；
e)抗PD-1的H-CDR1包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性修饰；
f)抗PD-1的L-CDR1包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选的抗体或其抗原结合片段，其中第二结合结构域包含：
a)包含SEQ ID NO：12的H-CDR1；
b)包含SEQ ID NO：13的H-CDR2；
c)包含SEQ ID NO：14的H-CDR3；
d)包含SEQ ID NO：15的L-CDR1；
e)包含SEQ ID NO：16的L-CDR2；
f)包含SEQ ID NO：17的L-CDR3。
优选的抗体或其抗原结合片段，其中第二结合结构域包含：
a)包含SEQ ID NO：12的H-CDR1；
b)包含SEQ ID NO：13的H-CDR2；
c)包含SEQ ID NO：18的H-CDR3；
d)包含SEQ ID NO：15的L-CDR1；
e)包含SEQ ID NO：16的L-CDR2；
f)包含SEQ ID NO：17的L-CDR3。
所述抗体的CDR序列如表2和序列表所示。
表2抗体的CDR序列
在更优选的实施例中，抗体或其抗原结合片段，其中第一结合结构域包含：
a)包含SEQ ID NO：6的H-CDR1；
b)包含SEQ ID NO：7的H-CDR2；
c)包含SEQ ID NO：8的H-CDR3；
d)包含SEQ ID NO：9的L-CDR1；
e)包含SEQ ID NO：10的L-CDR2；
f)包含SEQ ID NO：11的L-CDR3。
本发明中的抗体可以是嵌合抗体。
本发明中的抗体可以是人源化抗体或全人抗体。
本发明中的抗体可以是啮齿类动物的抗体。
在另一方面，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子编码如前所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了一种克隆或表达载体，该克隆或表达载体包含如前所述的核酸分子。
本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含一个以上如前所述的克隆或表达载体。
在另一方面中，本发明提供了一种用于生产如前所述的抗体的方法，包括培养如前所述的宿主细胞，并且分离所述抗体。
在又一方面中，本发明提供了一种药物组合物，包含如前所述的抗体或其抗原结合片段，以及一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明提供了一种免疫偶联物，包含连接至治疗剂的如前所述的抗体或其抗原结合片段。
其中，本发明提供了一种药物组合物，包含如前所述的免疫偶联物和一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明还提供了一种调节受试者的免疫应答的方法，包括向受试者施用如前所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了如前所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防免疫病症或癌症的药物中的应用。
本发明还提供了一种抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用治疗有效量的如前所述的抗体或其抗原结合片段，以抑制肿瘤细胞生长。
其中，所述肿瘤细胞是选自由黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌和直肠癌所组成的组中的癌症的细胞。
发明的有益效果
抗EGFR和PD-1通路的双特异性抗体可提供癌症治疗的几大好处。首先，双特异性抗体可用于肺癌治疗，而抗EGFR抗体尚未被批准用于此适应症，虽然EGFR的过度表达已在肺癌的发现。第二，双特异性抗体可以逆转EGFR治疗的耐药性。同时与抗PD-1治疗相比，双特异性抗体可以增加PD-L1和EGFR双阳性肿瘤的反应率。
附图说明
图1示出测试的双特异性抗体的示意图。
图2示出双特异性抗体靶向EGFR和PD-1的可能机制图。
图3示出纯化的WBP336B(a)和WBP336C(b)的体积排阻色谱图。
图4示出ELISA(a)和FACS(b)中双特异性抗体与人PD-1的结合。
图5示出ELISA(a)和FACS(b)中双特异性抗体与人EGFR的结合。
图6示出ELISA(a)和FACS(b、c、d)中双特异性抗体与人EGFR和PD-1的双重结合。
图7示出ELISA中双特异性抗体与食蟹猴(cynomolgus)PD-1的结合。
图8示出FACS中双特异性抗体与小鼠PD-1的结合。
图9示出FACS中双特异性抗体与食蟹猴EGFR的结合。
图10示出ELISA(a)和FACS(b，c)中，双特异性抗体阻断人或小鼠PD-1与PDL1的结合。
图11示出FACS中双特异性抗体能够阻断人EGF与EGFR的结合。
图12示出人MLR试验中的IL2和IFNγ释放。
图13示出在A431中双特异性抗体抑制EGFR磷酸化。
图14示出双特异性抗体对EGFR+肿瘤细胞的ADCC作用。
图15示出双特异性抗体以及西妥昔单抗的CDC效应。
图16示出双特异性抗体对PD-1阳性细胞的ADCC效应。
图17示出双特异性抗体对PD-1阳性细胞的CDC效应。
图18示出两种双特异性抗体与CD28、CTLA-4或ICOS的结合能力。
图19示出两种双特异性抗体对Her2或Her3的结合能力。
图20示出两种双特异性抗体的熔融曲线。
图21示出双特异性抗体的PD-1结合在血清中14天后没有损失。
图22示出双特异性抗体的EGFR结合在血清中14天后轻微损失。
图23示出由双特异抗体WBP336B、WBP336C、和对照抗体刺激细胞的颗粒酶B(Granzyme B)的分泌。
图24示出WBP336B在动物模型中抑制A431肿瘤的生长。
图25示出双特异性抗体在MC38同基因小鼠模型中的抑制肿瘤生长的作用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。
术语“程序性死亡蛋白1”、“程序性死亡受体1”、“程序性细胞死亡受体1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”，“CD279”和“hPD-F”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、亚型、物种同源物或其他物种的PD-1和具有PD-1的至少一个共同表位的类似物。
如本文中所使用，术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)并通过二硫键相互连接的蛋白质，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成：称为互补决定区(CDR)的高变区，以及穿插分布的称为构架区(FR)的更保守区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。重链中的CDR缩写为H-CDR，例如H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，轻链中的CDR缩写为L-CDR，例如L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。
如本文中所使用，术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或它们的衍生物，并且包括包含抗原结合位点的任何多肽，而不论其是否是在体外或体内产生的。该术语包括但不限于，多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、以及嫁接的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段，例如scFv、dAb和其它保留抗原结合功能(即，与PD-1和EGFR特异性结合的能力)的抗体片段。通常情况下，这样的片段应当包括抗原结合片段。
抗原结合片段通常包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，它不一定必须包括两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH和CH1结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。
本文中所描述的术语“交叉反应性”是指对人类、猴、和/或鼠源(小鼠或大鼠)中相同靶分子的抗原片段的结合。因此，“交叉反应性”应被理解为与在不同物种中表达的相同分子X的种属间反应，而不是除X以外的分子。识别例如人PD-1与猴、和/或鼠(小鼠或大鼠)PD-1的单克隆抗体的交叉反应特异性可通过例如FACS分析确定。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非特别指出，术语“患者”或“受试者”可以互换使用。
术语“治疗”和“治疗方法”是指治疗性治疗和预防性/预防措施。那些需要治疗者包括已具有特定医学病症的个体，以及那些可能最终获得该病症的个体。
术语“保守性修饰”，即，不显著影响或改变由核苷酸序列编码的或包含氨基酸序列的抗体结合特性的核苷酸和氨基酸序列修饰。这类保守性序列修饰包括核苷酸和氨基酸的取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如定点突变和PCR介导的突变将修饰引入序列。保守性氨基酸取代包括这种取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域进行定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，β分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例：
实施例1实验材料准备
1.抗原和基准抗体的产生
1.1产生可溶性抗原
编码人EGFR(Uniport No.：P00533)、人PD-1(Uniport No.：Q15116)、鼠PD-1(Uniport No.：Q02242)、人PD-L1(Uniport No.：Q9NZQ7)、鼠PD-L1(Uniport No.：Q9EP73)的胞外结构域的序列的DNA是在生工生物工程(上海)股份有限公司合成的，然后亚克隆到在C端具有不同标签(例如6×his、人Fc或小鼠Fc)修饰的pcDNA3.3表达载体中。
用纯化的表达载体pcDNA3.3转染Expi293细胞(Invitrogen-A14527)。培养细胞5天，收集上清液，并使用Ni-NTA柱(GE Healthcare，175248)或蛋白A柱(GE Healthcare，175438)或蛋白G柱(GE Healthcare，170618)进行蛋白质纯化。所获得的人EGFR、人PD-1、小鼠PD-1、人PD-L1、小鼠PD-L1通过SDS-PAGE和SEC进行质量控制，然后储存在-80℃。
1.2生成基准(BMK)抗体
在生工生物工程(上海)股份有限公司合成编码抗EGFR抗体西妥昔单抗的可变区的DNA序列(WBP336-BMK1)，然后亚克隆到具有人IgG1或人IgG4恒定区的修饰的pcDNA3.3表达载体(S228P)。在用人PD-1和小鼠PD-1免疫大鼠后，内部产生抗PD-1抗体W3052-R2-2E5-uIgG4k，并转化为IgG4(S228P)形式。
将含有VH和VL基因的质粒共转染入Expi293细胞。然后将细胞培养5天，收集上清液，使用蛋白A柱(GE Healthcare，175438)或蛋白G柱(GE Healthcare，170618)进行蛋白质纯化。使用SDS-PAGE和SEC评估获得的抗体，然后储存在-80℃。
2.细胞池/细胞系的产生
2.1产生靶标表达细胞系
使用Lipofectamine 2000将含有编码全长人PD-1或小鼠PD-1的基因的表达载体转染至CHO-S或293F细胞中。将细胞在含有适当选择标记的培养基中培养。通过有限稀释法获得人PD-1高表达的稳定细胞系(WBP305.CHO-S.hProl.C6)和小鼠PD-1高表达的稳定细胞系(WBP305.293F.mPro1.B4)。
将人EGFR、人EGFRvIII和食蟹猴(macaca fascicularis)EGFR的基因分别插入表达载体pcDNA 3.3中。然后将质粒分别转染到CHO-K1细胞中，如下所述。简言之，在转染前一天，将5×105个CHO-K1细胞接种到6孔组织培养板的一个孔中，并在5％CO2和37℃下温育。向细胞中加入3mL新鲜非选择性培养基(F12-K，10％FBS)。在1.5mL管中制备转染试剂，其中将4μg DNA与10μg Lipofectamine 2000混合，使其在Opti-MEM培养基中的最终体积为200μL。用移液管将管中的溶液逐滴加入细胞中。转染6-8小时后，用PBS洗涤细胞，并加入3mL新鲜的非选择性培养基。转染24-48小时后用胰蛋白酶收获表达细胞，并接种于选择性培养基(F12-K，10％FBS，10μg/mL杀稻瘟菌素)中的T75烧瓶中。经过两三次选择，细胞被用藻红蛋白(PE)和抗PE微珠(Miltenyi-013-048-801)标记的抗EGFR抗体富集。通过有限稀释法分离稳定的单细胞克隆，并使用抗EGFR抗体进行FACS筛选。
2.2获取并培养靶向表达的肿瘤细胞系
A431购自ATCC(ATCC号：CRL-1555)，并在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养。细胞在37℃、5％CO2培养箱中进行常规传代培养。对于长期储存，将细胞在补充有5％(v/v)DMSO的完全生长培养基中冷冻并储存在液氮气相中。
实施例2：双特异性抗体的产生
1.构建表达载体
双特异性抗体的构建：将编码具有C末端人κ轻链的抗EGFR抗体的scFv(VH-(G4S)3-VL)的DNA序列克隆到修饰的pcDNA3.3表达载体中；将编码具有C末端人IgG4(S228P)重链恒定区的抗PD-1抗体4k的scFv(VH-(G4S)3-VL)的DNA序列克隆到修饰的pcDNA3.3表达载体中。
2.优化双特异性抗体(连接或定向等)
在原始构建的基础上，我们优化了双特异性抗体。将编码具有C-端人类κ轻链的抗EGFR抗体的scFv(VL-(G4S)3-VH)DNA序列克隆到修饰的pcDNA3.3表达载体中；将编码具有C端人IgG4(S228P)重链恒定区的抗PD-1抗体的scFv(VL-(G4S)3-VH)的DNA序列克隆到修饰的pcDNA3.3表达载体中。
在抗EGFR抗体西妥昔单抗的可变区上鉴定了两个潜在的糖基化位点：一个位于轻链的FR2上，另一个位于重链的FR3上。为了除去位于抗EGFR抗体西妥昔单抗的可变区上的这些潜在的N-糖基化位点，基于这些位置上的种系序列进行几个突变。LFR2上的RTNGS突变为RTDQS或KPDQS。HFS3上的QSNDT突变为QSEDT或RAEDT。产生的抗体的实例在表1中列出。
3.小规模转染、表达和纯化
根据制造商的说明书，使用ExpiCHO表达系统试剂盒(Thermo Fisher-A29133)将重链和轻链表达质粒共转染到ExpiCHO细胞中。转染10天后，收集上清液，并使用蛋白A柱(GE Healthcare-17543802)和体积排阻色谱(SEC)(GE Healthcare-17104301)进行蛋白质纯化。通过Nano Drop测定抗体浓度。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC评估蛋白质的纯度。表达和纯化后获得两个双特异性抗体，即W336-T1U2.G10-4.uIgG4.SP(dk)和W336-T1U3.G10-4.uIgG4.SP(dk)。
4.产生双特异性抗体用于体内研究(包括内毒素对照和检测)
使用ExpiCHO系统试剂盒(ThermoFisher-A29133)将WBP336B(W336-T1U2.G10-4.uIgG4.SP(dk))或WBP336C(W336-T1U3.G10-4.uIgG4.SP(dk))表达质粒对共转染到ExpiCHO细胞中。转染后10天，收集上清液，并在控制内毒素的条件下使用蛋白A柱(GEHealthcare-17543802)和体积排阻色谱(GE Healthcare-17104301)进行蛋白质纯化。通过使用内毒素检测试剂盒(GenScript-L00350)检测内毒素水平，两种双特异性抗体的内毒素水平均小于10EU/mg。通过SDS-PAGE和HPLC-SE C评估蛋白质的纯度。
5.结果
5.1候选序列
候选抗体序列在表3中列出，CDR在表4中列出。
表3.推导的双特异性抗体氨基酸序列
表4.WBP336B和WBP336C的CDR序列
实施例3：靶向EGFR和PD-1的可能机制
针对EGFR和PD1的双特异性抗体能够改善抗肿瘤作用，我们提出了三种可能的机制(图2)。首先，该抗体能够阻断EGFR途径，抑制肿瘤的增殖、迁移等。其次，该抗体能够阻断PD-1通路，恢复或改善T细胞的抗肿瘤功能。最后，该抗体能够桥接肿瘤细胞和T细胞，易于改善抗肿瘤作用。这也有助于在肿瘤微环境中蓄积抗PD-1抗体。
实施例4：体外表征
1.蛋白质分析
两个候选抗体由ExpiCHO细胞表达，然后使用蛋白A色谱和体积排阻色谱进行纯化。如表5和图3所示，两种抗体具有合理的表达水平和高纯度。
表5.双特异性抗体的纯化
2a.EGFR-或PD-1-结合(ELISA和FACS)
为了鉴定两种候选抗体的特征，我们用ELISA(图4A)和FACS(图4B)方法检测它们与PD-1的结合。在ELISA实验中，将0.5μg/mL人体PD-1蛋白WBP305-hProl.ECD.mFc在4℃下预包被于非组织培养处理的平底96孔板中。2％BSA封闭后，将100μL浓度为25nM至0.0001nM的进行连续3倍稀释抗体吸移到每个孔中，并在室温下孵育1小时。除去未结合的物质后，将HRP标记的山羊抗人IgG加入到孔中并孵育1小时。通过分配100μL的TMB底物显色，然后用100μL 2N HCl终止。使用微孔板分光光度计在450nm处读取吸光度。
对于FACS结合，将工程改造的人PD-1表达细胞WBP305.CHO-S.hProl.C6以1×105个细胞/孔接种在U底96孔板中。向细胞中加入83.3nM至0.001nM的连续3倍稀释抗体。将板在4℃下孵育1小时。洗涤后，将PE标记的山羊抗人抗体加入各孔中，并且将板在4℃下孵育1小时。通过流式细胞仪检测抗体与细胞的结合，并通过FlowJo分析平均荧光强度(MFI)。
我们也通过流式细胞法测定双特异性抗体与EGFR表达细胞的结合。简言之，将1×105个A431(EGFR+)细胞或食蟹猴EGFR过表达的稳定细胞系(WBP562-CHOK1.cProl.H6)在4℃下与EGFR×PD-1双特异性或MgG4同型对照抗体的系列稀释液孵育60分钟。用补充有1％牛血清白蛋白(洗涤缓冲液)的冷PBS洗涤两次后，在4℃下用荧光标记的抗人IgG抗体孵育细胞30分钟，检测细胞表面结合的抗体。细胞在相同的缓冲液中洗涤两次，使用FACS CantoII细胞仪(BD Biosciences)测量染色细胞的平均荧光(MFI)。使用不含抗体或仅含第二抗体的孔建立背景荧光。使用四参数非线性回归分析，使用GraphPad Prism软件获得细胞结合的EC50值。
在ELISA方法中，与其亲本抗体(EC50＝0.031nM)或WBP305-BMK1(EC50＝0.024nM)相比，WBP336B(EC50＝0.032nM)和WBP336C(EC50＝0.024nM)与PD-1结合的能力相当。FACS方法用于测试结合细胞表面PD-1与这些抗体的结合。WBP336B和WBP336C以分别为1.29nM和1.05nM的EC50结合于PD-1阳性细胞，略高于其亲本抗体(0.78nM)和BMK1(0.87nM)的EC50。
使用相似的测定法来测试与EGFR的抗体结合(图5A和5B)。将96孔ELISA板(NuncMaxiSorp，ThermoFisher)在4℃下用含有0.5μg/mL抗原(EGFR-ECD，W562-hProl.ECD.his(sino))的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包被过夜。在用含有2％(w/v)牛血清白蛋白(Pierce)的PBS封闭1小时后，使用含有2％牛血清白蛋白的PBS对不同EGFR×PD-1双特异性抗体进行不同稀释度的系列稀释，在室温下在板上孵育2小时。孵育后，将板每孔用300μL含有0.5％(v/v)吐温20的PBS洗涤三次。加入100ng/mL山羊抗人IgG Fc-HRP(Bethyl，#A80-304P)并在室温下孵育1小时。每孔用300μL含有0.5％(v/v)吐温20的PBS洗涤6次后，加入四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma-860336-5G)进行检测。经大约8分钟后，每孔加入100μL的2M HCl，反应终止。使用多孔板读数器(M5e)在450nm处测量孔的吸光度。
在ELISA中，WBP336B和WBP336C结合于人EGFR的EC50分别为0.035nM和0.029nM，与西妥昔单抗结合于EGFR的EC50＝0.023nM相近。在细胞表面EGFR的结合中，WBP336B/C和西妥昔单抗之间的差异略大。使用A431细胞作为靶细胞，WBP336B和WBP336C与A431结合的EC50分别为2.6nM和1.4nM，而西妥昔单抗结合于EGFR的EC50＝0.5nM。
2b.EGFR-和PD-1-双重结合(ELISA和FACS)
为了测试双特异性抗体是否可以同时结合PD-1和EGFR，开发了如下ELISA测定。在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，在4℃下，用0.5μg/mL抗原-1(EGFR-ECD，W562-hProl.ECD.his(sino))包被96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher)过夜。用溶解2％(w/v)牛血清白蛋白(Pierce)的PBS封闭1小时后，将含有2％牛血清白蛋白的PBS对不同的EGFR×PD-1双特异性抗体进行不同稀释度的系列稀释，在室温下在板上孵育1小时。孵育后，平板每孔用300μL含有0.5％(v/v)吐温20的PBS洗涤三次。将0.1μg/mL抗原-2(PD-1-ECD，WBP305-hProl.ECD.hFc.Biotin)加入板中并孵育1小时。洗涤板三次后，加入Streptavidin-HRP(Invitrogen，#SNN1004)(1∶25000稀释)，并在室温下孵育1小时。每孔用300μL含有0.5％(v/v)吐温20的PBS洗涤6次后，加入四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma-860336-5G)进行检测。大约10分钟后，通过加入每孔100μL的2M HCl终止反应。使用多孔板读数器(M5e)在450nm处测量孔的吸光度。
如图6a所示，两个抗体能够结合两个靶标，EC50分别为0.035nM和0.028nM。
通过流式细胞术检测EGFR×PD-1双特异性抗体桥接两个靶细胞的能力。用50nM钙黄绿素-AM(Invitrogen-C3099)或20nM FarRed(Invitrogen-C34572)分别在37℃下标记1×106/mL EGFR+A431细胞或PD-1+CHOK-S细胞30分钟，并用1％胎牛血清洗涤两次。每种类型的细胞重新悬浮，然后以1∶1的比例混合至1×106/mL的终浓度。将抗体加入到细胞中，然后缓慢混合并孵育1小时。桥接百分比通过同时标记的钙黄绿素AM和FarRed的百分比计算。
如图6b、c和d所示，与两种单特异性抗体的联合或同型对照抗体相比，双特异性抗体可以使Far-Red和CAlcein-AM染色细胞群体显著增加，证明双特异性抗体确实将两种细胞桥接在一起。
3.交叉物种结合(ELISA/FACS)
由于亲本抗PD-1抗体能够结合食蟹猴和鼠源靶点，因此研究了两种双特异性抗体的交叉物种结合。在FACS测定中，检测了抗体与小鼠PD-1结合。简言之，将工程化的表达小鼠PD-1的细胞WBP305.293F.mProl.B4以1×105个细胞/孔接种在U底96孔板中。向细胞中加入133.3nM至0.06nM的3倍滴定抗体。4℃下孵育1小时。洗涤后，将PE标记的山羊抗人抗体加入各孔中，并且在4℃下孵育1小时。通过流式细胞仪检测抗体与细胞的结合，并通过FlowJo分析平均荧光强度(MFI)。
ELISA方法用于检测抗体与食蟹猴PD-1结合的能力。简言之，将96孔板用0.5μg/mL内部制造的食蟹猴PD-1蛋白WBP305-cProl.ECD.his在4℃包被过夜。2％BSA封闭后，将100μL从25nM至0.0001nM的3倍滴定的抗体吸移到每个孔中，并在室温下孵育1小时。除去未结合的物质后，将HRP标记的山羊抗人IgG加入到孔中并孵育1小时。通过分配100μL的TMB底物显色，然后用100μL2N HCl终止。使用微孔板分光光度计在450nm处读取吸光度。
如图7所示，与其亲本抗体(EC50＝0.295nM)相比，WBP336C(EC50＝0.275nM)相似地结合于食蟹猴PD-1，而WBP336B具有降低的结合活性(EC50＝0.874nM)。相比之下，WBP305-BMK1具有EC50＝0.132nM的结合活性。
FACS用于测定双特异性抗体与鼠PD-1的结合。如图8所示，WBP336B和WBP336C分别具有EC50为7.11nM和4.47nM的鼠PD-1结合能力，类似于其亲本抗体的5.01nM。相比之下，WBP305-BMK1完全不与鼠PD-1结合。
据报道，西妥昔单抗与食蟹猴EGFR结合，但不结合鼠源EGFR。因此，我们只测试结合食蟹猴EGFR的双特异性抗体。如图9所示，WBP336B和WBP336C结合EGFR，EC50为0.75nM和0.59nM，而西妥昔单抗结合EGFR的EC50为0.29nM。
4.双特异性抗体的亲和力
表面等离子共振(SPR)技术用于测定抗体对EGFR或PD-1的ECD的结合速率(on-rate constant)(ka)和解离速率(kd)，并由此确定亲和常数(KD)。
Biacore T200系列S传感器芯片CM5，胺耦合试剂盒和10×HBS-EP缓冲液购自GEHealthcare。山羊抗人IgG Fc抗体购自Jackson ImmunoResearch Lab(目录号109-005-098)。在固定步骤中，通过在注射前即刻混合400mM EDC和100mM NHS来制备活化缓冲液。CM5传感器芯片通过活化缓冲液活化420秒。然后将10μg NaAc(pH4.5)中的30μg/mL山羊抗人IgGFcγ抗体以5μL/min的流速注射到Fc1-Fc4通道中200秒。该芯片由1M乙醇胺-HCl(GE)去活化。然后将抗体捕获在芯片上。简言之，将运行缓冲液(HBS-EP+)中的4μg/mL抗体以10μL/分钟的流速分别注射到Fc3通道30秒。将EGFR或PD-1的分析物ECD和空白运行缓冲液的八种不同浓度(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.15625nM)以30μL/分钟的流速顺序注射到Fcl-Fc4通道，相关阶段为120秒，然后为2400秒的解离阶段。在每个解离阶段之后，以10μL/分钟的速度注入再生缓冲液(10mM甘氨酸，pH 1.5)30秒。
如表6所示，WBP336B和WBP336C均以高亲和力结合于PD-1和EGFR。它们与hPD-1结合的KD分别为8nM和2nM，高于其亲本抗体的0.65nM。高KD主要由快kd的贡献，而ka没有显著变化。与它们的亲本抗体西妥昔单抗相比，它们与EGFR的结合没有变化。
表6
5.基于竞争的功能测定(例如配体竞争测定)
我们使用了不同的测定法研究了双特异性抗体的功能。
首先，这些抗体能够在基于ELISA的竞争实验中阻断PD-1与PD-L1的结合，如图10a所示。WBP336B和WBP336C的IC50分别为0.454nM和0.352nM，与其亲本抗体305B(IC50＝0.524nM)相近。双特异性抗体的增加的效力可能是由于其比常规IgG更大的尺寸，通过空间阻碍提高了阻断作用。
还基于FACS的竞争测定用于评估细胞表面PD-1上的双特异性抗体。简单地说，1×105个A431(EGFR+)细胞在4℃下与系列稀释的EGFR×PD-1双特异性或hIgG4同型对照抗体以及0.1μg/mL生物素标记的EGF(Life Technology，#E3477，W562-hL1-生物素)进行孵育60分钟。用补充有1％牛血清白蛋白的冷PBS(洗涤缓冲液)洗涤两次后，通过在4℃下将细胞与链霉亲和素PE(Affymetrix，#12-4317-87)孵育30分钟来检测细胞表面结合的抗体。细胞在相同的缓冲液中洗涤两次，使用FACS Canto II细胞仪(BD Biosciences)测量染色细胞的平均荧光(MFI)。使用不含抗体或仅含第二抗体的孔建立背景荧光。使用四参数非线性回归分析，使用GraphPad Prism软件获得细胞结合的IC50值。
如图10b所示，双特异性抗体在阻断PD-1与PDL1结合上具有与其亲本抗体305B以及WBP305-BMK1相似的作用。WBP336B、WBP336C、305B和WBP305-BMK1的IC50分别为1.12nM、0.79nM、0.68nM和0.90nM。双特异性抗体及其亲本抗体也可以阻断鼠PD-1/PDL1的相互作用，如图10c所示。WBP336B、WBP336C、305B的IC50分别为31.77nM、18.73nM和16.78nM。抗体阻断鼠PD-1比阻断人PD-1的效力低，可能是由于它们对小鼠PD-1的亲和力低于对人PD-1的亲和力。
双特异性抗体也可以阻断EGF/EGFR相互作用。如图11所示，WBP336B、WBP336C和WBP336-BMK1分别阻断EGF与EGFR的结合，IC50分别为1.62nM、1.44nM和1.01nM，表明双特异性抗体保持其针对EGFR的效力。
6.基于细胞的功能测定
几种基于细胞的测定用以评估双特异性抗体的功能。同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)用于测定评估抗PD-1的功能。简言之，将纯化的CD4+T细胞与未成熟或成熟的同种异体DC(iDC或mDC)共同培养。使用完整的RPMI-1640培养基在96孔圆底板中建立MLR。将CD4+T细胞、各种浓度的抗体和突触状细胞加入板中。将板在37℃、5％CO2下孵育。分别在第3天和第5天测定IL-2和IFN-γ的产生。细胞在第5天收获以通过3H-TDR测量CD4+T细胞的增殖。
如图12a和12b所示，WBP336B和WBP336C以与抗PD-1抗体相似的剂量依赖性方式改善IL2和INFγ释放。
我们还测试了抗体在A431细胞中阻断EGFR磷酸化的能力。简言之，将A431细胞进行胰蛋白酶消化，并稀释至5×105个细胞/mL。然后将100μL细胞悬浮液加入96孔透明的平底微孔板(Coming-3599)的每个孔中，得到5×104个细胞/孔的最终密度。使A431细胞附着约18小时，然后将培养基更换为不含胎牛血清的饥饿培养基。将所有的板在37℃下孵育过夜，然后用适当浓度的EGFR×PD-1双特异性抗体、EGFR单克隆抗体或具有200ng/mL EGF(Sino Biological-10605-HNAE)的hIgG对照抗体在37℃下培养2小时。缓慢吸出所有培养基，用冰冷的DPBS(GE-Healthcare-SH30028)洗涤细胞。通过加入110μL/孔的补充有10μg/mL抑肽酶(Thermo-Prod78432)和亮肽素半硫酸盐(Santa Cruz Biotechnology-SC-295358)的冰冷裂解缓冲液(R&D System-DYC002)将细胞裂解，并在冰上孵育15分钟。将所有裂解物储存在-80℃。
使用ELISA测定法检测磷酸化的EGFR。在室温下将96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher)用8μg/mL人EGFR捕获抗体(R&D Systems-DYC1095B)包被过夜。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，并在室温下用溶解1％(w/v)牛血清白蛋白(Pierce)的PBS封闭1小时。然后收集细胞裂解物，并在4℃下以2000g旋转5分钟以除去细胞碎片。将100μL上清液加入每个孔中，并将板在室温下孵育2小时。孵育后，每孔用300μL含有0.5％(v/v)吐温20的PBS洗涤三次。抗磷酸酪氨酸-HRP(R&D Systems-DYC1095B)用来检测磷酸化的EGFR。每孔用洗涤缓冲液洗涤三次。每孔加入100μL的底物混合物(R&D Systems-DY999)进行检测。大约10分钟后，每孔通过加入250μL的2M HCl来终止反应。使用多孔板读数器(M5e)在450nm测量孔的吸光度。使用四参数非线性回归分析，使用GraphPad Prism软件获得EGFR磷酸化抑制的IC50值。
如图13所示，抗体也可以以剂量依赖的方式抑制A431细胞中EGFR的磷酸化。然而，双特异性抗体在抑制EGFR磷酸化中显示了比其亲本抗体西妥昔单抗低的有效性，包括较低的最大抑制率和较高IC50(WBP336B，WBP336C和西妥昔单抗分别为21.8nM、21.9nM和8.1nM)。双特异性抗体的这种性质可以降低西妥昔单抗的皮肤毒性(Liporini C 2013，JPharmacol Pharmacother)。
7.对EGFR+细胞和PD-1+细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体介导的细胞 毒作用(CDC)测定
测试双特异性抗体WBP336B和WBP336C对于EGFR+A431和HCC827细胞介导ADCC作用。还在EGFR+细胞上测试抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性。通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，#17-1440-03)密度离心，从肝素化静脉血中新鲜分离人外周血单核细胞(PBMC)，然后在完全培养基中培养过夜(RPMI1640，补充有10％FBS，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)。简言之，在ADCC测定当天，将EGFR表达的靶细胞A431和HCC827(2×104/孔)与效应细胞(PBMC/靶细胞比例为20∶1)和系列稀释的抗体或hIgG同型对照在37℃下完全培养4小时。孵育后，将板离心，将上清液转移至透明底部的96孔板(Corning，#3599)，并向每个孔中加入反应混合物(Roche，#116447930，细胞毒性反应试剂盒)并孵育15分钟。加入终止溶液后，用M5e读板，测定样品在492nm和600nm处的吸光度。
使用以下等式计算细胞毒性百分比：％细胞毒性＝(样品-效应细胞对照-靶细胞对照)/(靶细胞裂解-靶细胞对照)×100％
对于CDC测定，将EGFR表达的靶细胞A431和HCC827(2×104细胞/孔)用100μL人正常血清(最终1∶50稀释)(Quidel，#A113)和系列稀释的抗体或hIgG同型对照在37℃完全培养2小时。孵育后，将板离心，将上清液转移至透明底部的96孔板(Corning，#3599)，并向每个孔中加入反应混合物(Roche，#116447930，细胞毒性反应试剂盒)并孵育15分钟。加入终止溶液后，用M5e读板，测定样品在492nm和600nm处的吸光度。
使用以下等式计算细胞毒性百分比：％细胞毒性＝(样品-靶细胞对照)/(靶细胞裂解-靶细胞对照)×100％
使用GraphPad Prism软件测定细胞杀伤的IC50值，其中使用四参数非线性回归分析计算值。
如图14所示，IgG4同型中的双特异性抗体对两种肿瘤细胞系不诱导ADCC作用。双特异性抗体的这种性质可以减少或避免西妥昔单抗的皮肤毒性(Liporini C 2013，JPharmacol Pharmacother)。两种肿瘤细胞系也用于测试两种抗体的CDC效应。如图15所示，双特异性抗体以及西妥昔单抗没有观察到CDC的作用。
同样，我们也测试了PD-1阳性细胞上的ADCC和CDC。为了测试ADCC效应，将活化的人CD4+T细胞或工程改造的人PD-1表达细胞WBP305.CHO-S.hProl.C6和各种浓度的PD-1抗体在96孔板中预培养30分钟，然后以20∶1的效应物/靶标比例加入新鲜分离的PBMC。将板在5％CO2培养箱中在37℃下保持4小时。通过基于LDH的细胞毒性检测试剂盒测定靶细胞裂解。使用微孔板分光光度计在492nm下读取吸光度。
对于PD-1阳性细胞的CDC，将活化的人CD4+T细胞或工程化的人PD-1表达细胞WBP305.CHO-S.hProl.C6和各种浓度的PD-1抗体在96孔板中混合。以1∶50的稀释比加入人补体。将板在5％CO2培养箱中在37℃下保持2小时。靶细胞裂解由CellTiter-Glo试剂测定。
活化的人CD4+细胞和工程化的PD-1+细胞均用作靶细胞。如图16和17所示，两种双特异性抗体对PD-l+细胞没有诱导显著的ADCC或CDC作用。
8.与PD-1和EGFR的旁系同源物的结合
为了测试两种双特异性抗体的特异性，测试了它们与PD-1和EGFR的旁系同源物结合。在4℃下，将96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher)在含有0.5-1μg/mL CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、HER2-ECD或HER3-ECD的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中用包被过夜。在用含有2％(w/v)牛血清白蛋白(Pierce)的PBS封闭1小时后，使用含有2％牛血清白蛋白的PBS系列稀释EGFR×PD-1双特异性抗体或阳性对照抗体，并在室温下在板上孵育2小时。孵育后，将平板每孔用300μL含有0.5％(v/v)吐温20的PBS洗涤三次。加入浓度为100ng/mL的山羊抗人IgG Fc-HRP(Bethyl，#A80-304P)，并在室温下孵育1小时。每孔用300μL含有0.5％(v/v)吐温20的PBS洗涤6次后，加入四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma-860336-5G)进行检测。大约8分钟后，每孔加入100μL的2M HCl，终止反应。使用多孔板读数器(M5e)在450nm测量孔的吸光度。用内部制备的1.0μg/mL的人CD28ECD.mFc(20368)、人CTLA4ECD.his、人ICOS ECD.mFc(20374)和人PD-1预包被非组织培养处理的平底96孔板，4℃过夜。2％BSA封闭后，将100μL从20nM开始进行10倍连续稀释的抗体吸移到每个孔中，并在室温下孵育1小时。除去未结合的抗体后，将HRP标记的山羊抗人IgG加入到孔中并孵育1小时。通过分配100μL的TMB底物显色，然后用100μL 2N HCl终止。使用微孔板分光光度计在450nm处读取吸光度。
如图18所示，两种抗体不结合CD28、CTLA-4或ICOS、PD-1的旁系同源物。抗体也不结合Her2或Her3、EGFR的旁系同源物(图19)。
9.非特异性结合(ELISA/FACS)
测试抗体与无关蛋白(ELISA)或不同细胞系(FACS)的结合。FACS和ELISA检测均用于检测抗体是否结合其他靶标。在ELISA测定中，测试了测试抗体、同型对照抗体与不同蛋白质(包括因子VIII、FGFR-ECD、PD-1、CTLA-4.ECD、HER3.ECD、OX40.ECD、4-1BB.ECD、CD22.ECD、CD3e.ECD、Ag1.E和XAg.ECD)的结合。Ag1.E和XAg是未公开的蛋白质。在4℃下，将几个96孔板(Nunc-Immuno Plate，Thermo Scientific)用个别抗原(2μg/mL)包被过夜。用含有2％BSA的PBS封闭1小时后，用300μL的PBST洗涤3次。将测试抗体以及同型对照抗体在含有2％BSA的PBS中稀释至10μg/mL，然后加入板中并在室温下孵育2小时。用300μL的PBST洗涤3次后，将HRP耦合的山羊抗人IgG抗体(2％BSA中1∶5000稀释)加入板中，室温孵育1小时。最后，将板用300μL的PBST洗涤6次。通过分配100μL的TMB底物12分钟显色，然后用100μL的2M HCl终止。使用微板分光光度计测量450nm的吸光度。
在FACS测定中，不同的细胞系(Ramos、Raji、MDA-MB-453、BT474、Jurkat、Hut78、A431、A204、CaLu-6、A375、HepG2、BxPC-3、HT29、FaDu、293F、CHO-K1)被调整为每孔1×105个细胞。将测试抗体和同型对照抗体在含有1％BSA的PBS中稀释至10μg/mL，并与细胞在4℃孵育1小时。细胞用180μL的含有1％BSA的PBS洗涤两次。将PE耦合的山羊抗人IgG Fc片段(Jackson，目录号109-115-098)在含有1％BSA的PBS中稀释至5μg/mL的终浓度，然后加入以再悬浮细胞，并在4℃避光孵育30分钟。用180μL含有1％BSA的PBS进行另外的洗涤步骤，然后在4℃下以1500rpm离心4分钟。最后，将细胞重新悬浮于100μL含有1％BSA的PBS中，并通过流式细胞术(BD Canto II)测量荧光值，并通过FlowJo进行分析。
如表7所示，如预期的那样，在所测试的蛋白质中，WBP336B和WBP336C仅与PD-1结合。它们不与其他蛋白质结合，包括PD-1的接近的家族成员CTLA-4。
在FACS测定中，测试了WBP336B和WBP336C在不同细胞系上的结合。如表8所示，两种抗体结合于具有高水平EGFR表达的细胞系A431、CaLu-6、BxPC-3、HT29和FaDu。它们也弱结合到具有中等EGFR表达的细胞系BT474、A375、HepG2和293F。它们不结合Ramos、Raji、MDA-MB-453、Jurkat、Hut78和CHO-K1。
总体而言，非特异性结合试验表明WBP336B和WBP336C特异性结合EGFR和PD-1。
表7.在ELISA中双特异性抗体结合于不同蛋白
表8.在FACS中双特异性抗体结合于不同蛋白(MFI值)
10.热稳定性
差式扫描荧光法(DSF)用于测量双特异性抗体的热稳定性。使用7500 Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)进行DSF测定。简言之，将19μL的双特异性抗体溶液与1μL 62.5倍SYPRO橙色溶液(TheromFisher-S6650)混合并加入到96孔板中。以2℃/分钟的速度将板从26℃加热至95℃，并收集所得的荧光数据。通过其操作软件自动分析数据，并通过采用所得荧光数据的相对于温度的负导数的最大值来计算Th。Ton可以粗略地确定为负导数图从转变前的基线开始减少的温度。
如表9和图20所示，两种抗体在57℃具有相似的Th1。
表9.双特异性抗体的DSF数据
11.血清稳定性
将双特异性抗体与人血清孵育长达14天，并且不时测试它们与PD-1和EGFR的结合。将新鲜收集的人血液在不含抗凝血剂的聚苯乙烯管中在室温下静置孵育30分钟。在4000rpm离心血液10分钟后收集血清。重复离心和收集步骤直到血清澄清。将抗体在37℃下与血清缓慢混合14天，并在指定的时间点抽取等分测试样品：0天、1天、4天、7天和14天，将等分测试样品在液氮中快速冷冻，并在-80℃储存直到使用。样品用于通过FACS评估其对EGFR+A431和工程化的PD-1+CHO细胞的结合能力。如图21和22所示，它们与PD-1和EGFR的结合随时间没有显著变化，表明双特异性抗体在人血清中稳定至少14天。
12.压力测试
使用Micro Float-A-透析装置(8-10kD，光谱/孔)将WBP336B(W336-T1U2.G10-4.uIgG4.SP(dK))、WBP336C(W336-T1U3.G10-4.uIgG.4SP(dK))、抗EGFR抗体(WBP336-hBMKl.IgG1)和抗-PD-1抗体交换到20mM Tris，150mM NaCl，pH8.5缓冲液中，并使用超滤过滤器(Amicon超离心过滤器，30K截留分子量(MWCO)，0.5mL，Merck MilliporeCrop)进一步浓缩至1mg/mL。使用Uv-Vis分光光度计(NanoDrop 2000 Spectrophotometer，Thermo Scientific Inc.)进行抗体的定量。将抗体在37℃下孵育，并在孵育5天后取出，以通过表面等离子体共振(SPR)分析靶结合。通过SPR(ProteOn XPR36，Bio-RadLaboratories，Inc)测量抗体与两种抗原(PD1.ECD.his和EGFR.ECD.his)之间的相互作用。将每种抗体捕获到固定在GLM生物传感器芯片(Bio-Rad Laboratories，Inc)上的抗人FcIgG(Jackson，目录号：109-005-098)表面上。测定在25℃下用1×PBST作为运行和稀释缓冲液进行。对于120秒的缔合相，以100μL/分钟的流速注射1∶5系列稀释的W305-hProl.ECD.His溶液(20、10、5、2.5和1.25nM)和运行缓冲液，随后进行400秒的解离。通过18s注射10mM甘氨酸(pH1.5)达到芯片表面的再生。再生后，对于120秒的缔合相，以100μL/分钟的流速注射1∶5系列稀释的W562-hProl.ECD.his溶液(20、10、5、2.5和1.25nM)和运行缓冲液，然后进行1200秒的解离。通过18s注射10mM甘氨酸(pH1.5)达到芯片表面的再生。
由于在WBP336B和WBP336C上存在潜在的PTM位点(表3)，所以测试这些抗体对高pH和高温条件的抗性。将这些抗体在pH 8.0和37℃下孵育5天，并使用SPR测定其与PD-1和EGFR的结合。
如表10和11所示，它们在高pH和高温条件下对PD-1或EGFR的结合没有变化，表明没有显著的PTM或PTM没有改变其与靶标的结合活性。
表10.PD-1的抗体结合
表11.EGFR的抗体结合
13.颗粒酶B测定
体外颗粒酶B测定试验中，表达EGFR的A431靶细胞(5×103细胞/孔，50μL)与PBMC或CD8+T细胞(1×105细胞/孔，50μL，被25ng/mL PMA和50ng/mL离子霉素Ionomycin激活)混合在一起培养7天，并且在100μL完全培养基中用抗体或hIgG同种型对照在37℃下培养24小时。孵育后，将板离心并将上清液转移至透明底96孔板(Coming，#3799)。将细胞重悬于含有10μg/mL抑肽酶和10μg/mL亮肽素的100μL的裂解缓冲液(R&D，Cat：DYC002)中，并置于冰上20分钟。在检测颗粒酶B之前，将样品以约10000g离心5分钟并收集细胞裂解物。将来自8000pg/mL至15.36pg/mL的双倍滴定标准品，稀释的上清液和稀释的细胞裂解物以100μL/孔加入ELISA板中。在37℃温育1.5小时后，每孔加入100μL生物素化的抗人粒酶B抗体，并在37℃温育1小时。将板洗涤3次并制备100μL抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物工作溶液到每个孔中。在37℃温育30分钟后进行另外5次洗涤步骤。在停止TMB显色后30分钟内使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
双特异性抗体WBP336B/WBP336C增加颗粒酶B分泌的结果显示在图23中。与抗EGFR抗体、抗PD-1抗体和同种型对照相比，双特异性抗体WBP336B或WBP336C可促进颗粒酶B的分泌。
实施例5：体内表征
1.A431异种移植小鼠模型的疗效
在补充有15％热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基中，将A431肿瘤细胞(ATCC，Manassas，VA，cat#CRL-1555)在5％CO2空气环境下37℃体外培养为单层培养物。肿瘤细胞每周常规传代培养两次。收获以指数生长期生长的细胞并计数后进行肿瘤接种。
从健康供体的全血中收集PBMC，并使用分离血液层的亲水性多糖1.077 Ficoll(GE Healthcare公司，GE Healthcare)提取。梯度离心将血液分离成血浆的顶层，随后是PBMC层，以及多形核细胞和红细胞的底部部分。接种之前，将新鲜分离的PBMC与用丝裂霉素(mytomycin)处理的A431共培养72小时，然后与E∶T比为1∶3的未处理的A431混合。
将每只小鼠在右侧腹部皮下接种含有A431肿瘤细胞(5×106)的0.2mL PBS，该A431肿瘤细胞使用或不使用PBMC(1.67×106)共培养3-4天，以促进肿瘤发生。当肿瘤接种后第3天平均肿瘤大小达到约60mm3时开始治疗。根据实验设计表中所示的预定方案，确定每组的小鼠数量和施用测试品的小鼠数量。
关于动物处理、护理和研究相关的所有程序均按照实验动物护理评估与认证协会(AAALAC)的指导和按照药明康德(WuXi AppTec)机构动物保护使用委员会(IACUC)批准的指导原则进行。在日常监测时，每天根据协议中所述检查动物对肿瘤生长和治疗对正常行为(如移动性、食物和水消耗(仅通过查看)、体重增益/损失(体重每周测量两次)、眼睛/头发缠结(matting))的任何影响以及任何其他异常效果。基于每个子集中的动物数量，记录死亡和观察到的临床症状。
主要终点是观察肿瘤生长是否可以延迟或小鼠是否可以治愈。使用卡尺在两个维度中每周测量两次肿瘤大小，并且体积以mm3表示，使用下式：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。T/C值(百分比)表示抗肿瘤效果。
对于每组使用下式计算TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中Ti是治疗组在给定日的平均肿瘤体积，T0是治疗开始当天治疗组的平均肿瘤体积，Vi是与Ti相同天的载体对照组的平均肿瘤体积，V0是治疗开始当天的载体组的平均肿瘤体积。
统计分析
在每个时间点为每组的肿瘤体积提供总结统计，包括平均值和标准误差(SEM)。对最终剂量后(药物开始后第28天)最佳治疗时间点获得的数据进行组间肿瘤体积差异的统计分析和药物相互作用分析。
进行单因素方差分析，以比较各组之间的肿瘤体积，然后进行Dunnett t检验的post-hoc多重比较(均与IgG组比较)。所有数据使用SPSS 17.0进行分析。认为p＜0.05具有统计学显著意义。
表12.肿瘤牛长抑制
注：
a.平均值±SEM.
b.肿瘤生长抑制通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积来计算(T/C和TGI)。对于被认为具有抗肿瘤活性的测试样品，T/C必须在50％以下。
c.基于肿瘤大小计算p值。
每周两次向不同组的小鼠注射WBP336B或对照抗体。每周测量肿瘤三次，结果显示在图24中。基于第28天的肿瘤体积测量计算携带A431异种移植物的MiXeno人源化小鼠中的肿瘤生长抑制。与同种型对照(hIgG4)组相比，抗PD-1抗体组略微抑制肿瘤生长(p＝0.163)。相反，如表12中所分析的，抗EGFR(西妥昔单抗)组和WBP336B组完全诱导肿瘤消退(p＝0.000)。结果表明WBP336B的抗EGFR活性完全抑制肿瘤生长。
2.MC38同系小鼠模型的疗效
为了在体内测试双特异性抗体的抗PD-1活性，由于双特异性抗体与鼠PD-1的交叉反应性，我们使用了同系小鼠模型。
在37℃、5％CO2空气的环境中，MC38细胞作为单层培养物培养在补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中。通过胰蛋白酶-EDTA处理将肿瘤细胞每周常规地传代培养两次。收获生长在指数生长期的细胞并计数后进行肿瘤接种。
将每只小鼠右侧腋下(外侧)皮下接种0.1mL含有MC38肿瘤细胞(3×105)的PBS用于肿瘤发生。当平均肿瘤体积达到79mm3时，对动物随机分组，然后开始疗效研究。
关于动物处理、护理和研究相关的所有程序均按照实验动物护理评估与认证协会(AAALAC)的指导和按照药明康德(WuXi AppTec)机构动物保护使用委员会(IACUC)批准的指导原则进行。在日常监测时，每天根据协议中所述检查动物对肿瘤生长和治疗对正常行为(如移动性、食物和水消耗(仅通过查看)、体重增益/损失(体重每周测量两次)、眼睛/头发缠结(matting))的任何影响，以及任何其他异常效果。基于每个子集中的动物数量，记录死亡和观察到的临床症状。
主要终点是观察肿瘤生长是否可以延迟或小鼠是否可以治愈。使用卡尺在两个维度中每周测量两次肿瘤大小，并且体积以mm3表示，使用下式：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。肿瘤大小用于计算T/C(％)值。T/C值(百分比)表示抗肿瘤效果，T和C分别是治疗组和对照组在给定日的平均体积。
对于每组使用下式计算TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中Ti是治疗组在给定日的平均肿瘤体积，T0是治疗开始当天治疗组的平均肿瘤体积，Vi是与Ti相同天的载体对照组的平均肿瘤体积，V0是治疗开始当天的载体组的平均肿瘤体积。
在每个时间点为每组的肿瘤体积提供总结统计，包括平均值和标准误差(SEM)。对最终剂量后(药物开始后第14天)最佳治疗时间点获得的数据进行组间肿瘤体积差异的统计分析和药物相互作用分析。
进行单因素方差分析以比较各组之间的肿瘤体积，并且当获得显着的F-统计学(治疗方差与误差方差的比率)时，通过Games-Howell检验进行组间比较。对于两组之间的比较，使用Mann-Whitney检验。所有数据均采用SPSS 17.0和prism 5进行分析，p＜0.05被认为具有统计学显著意义。
结果如图25所示。WBP336B和WBP336C均显著抑制肿瘤生长(p＜0.05)，WBP336B诱导肿瘤消退。由于抗人EGFR抗体不与小鼠EGFR结合，所以抗人EGFR抗体在该模型中没有显示出任何抗肿瘤作用，这表明双特异性抗体的抗肿瘤作用主要由抗PD-1部位所提供。
3.A431/hPBMC小鼠模型中的抗体生物分布
3.1细胞培养
将A431肿瘤细胞(ATCC，货号#CRL-1555)作为单层培养物在体外维持在1640培养基中，其中补充有15％热灭活的胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，温度为37℃。空气中5％CO2的气氛。每周两次对肿瘤细胞进行常规传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数肿瘤接种。
3.2外周血单核细胞(PBMC)提取
从健康供体捐赠的全血中收集PBMC，并使用分离血液层的亲水性多糖1.077Ficoll(GE Healthcare公司，GE Healthcare)提取。梯度离心将血液分离成顶层血浆，然后是一层PBMC和多形核细胞和红细胞的底部部分。
3.3 MiXeno皮下移植物模型的肿瘤和PBMC接种
在第0天，每只小鼠在右侧皮下接种A431肿瘤细胞(5×106)。当平均肿瘤大小达到约50mm3时，PBMC(3×106)在0.2mL PBS中静脉注射注入每只老鼠。当平均肿瘤大小达到约600mm3时开始治疗。根据预定方案将每组和测试物品的小鼠数量给予小鼠，如下面的实验设计表所示。
3.4实验设计表
表13.实验设计
3.5观察
所有与动物处理，护理和研究中的治疗相关的程序均按照Wuxi AppTec动物护理和使用委员会(IACUC)批准的指南进行，并遵循实验动物管理评估和认证协会的指导(AAALAC)。在常规监测时，每天检查动物肿瘤生长和治疗对正常行为的影响，例如活动性、食物和水消耗(仅通过观察)、体重增加/减少(体重每周测量两次)、眼/毛发垫和协议中规定的任何其他异常效果。根据每个子集内的动物数量记录死亡和观察到的临床症状。
3.6样品在不同时间点收集和准备
在抗体注射后，在48小时、72小时、和6天的时间点收集血液和组织样品。收集肿瘤和肝脏样品以通过IHC测试抗体。在收集组织样本之前，使用PBS灌注去除组织中的血液。将大约60-90mg肿瘤和肝脏样品包埋在OCT中用于IHC染色。
3.7结果
如表14所示，同型对照、抗PD-1抗体在肝脏和肿瘤组织中具有相似的IHC评分。而抗EGFR抗体和双特异性抗体WBP336B/C在肿瘤中的IHC评分高于肝组织。结果表明，双特异性抗体优先分布于肿瘤组织中。
表14
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司（WuXi Biologics (Shanghai) Co., Ltd.）
<120> 针对表皮生长因子受体和程序性死亡受体的双特异抗体
<130> AJ3297PI1801
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85 90 95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
130 135 140
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Leu Gly
165 170 175
Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Ile Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 2
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
210 215 220
Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala
<210> 3
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85 90 95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
130 135 140
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Leu Gly
165 170 175
Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Ile Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 4
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
210 215 220
Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala
<210> 5
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Arg
195 200 205
Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
210 215 220
Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His
1 5 10
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser
1 5 10 15
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Ile Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Gln Leu Thr His Trp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 19
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85 90 95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
130 135 140
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Leu Gly
165 170 175
Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Ile Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
245 250 255
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
260 265 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
325 330 335
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
340 345 350
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
405 410 415
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
420 425 430
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
435 440 445
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
450 455 460
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
465 470 475 480
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
485 490 495
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
500 505 510
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
515 520 525
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
530 535 540
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
545 550 555 560
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
565
<210> 20
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
210 215 220
Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
245 250 255
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
260 265 270
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
275 280 285
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
290 295 300
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
305 310 315 320
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
325 330 335
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345
<210> 21
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85 90 95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
130 135 140
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Leu Gly
165 170 175
Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Ile Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
245 250 255
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
260 265 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
325 330 335
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
340 345 350
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
405 410 415
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
420 425 430
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
435 440 445
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
450 455 460
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
465 470 475 480
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
485 490 495
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
500 505 510
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
515 520 525
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
530 535 540
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
545 550 555 560
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
565
<210> 22
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
210 215 220
Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
245 250 255
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
260 265 270
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
275 280 285
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
290 295 300
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
305 310 315 320
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
325 330 335
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345
<210> 23
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Arg
195 200 205
Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
210 215 220
Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
245 250 255
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
260 265 270
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
275 280 285
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
290 295 300
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
305 310 315 320
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
325 330 335
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345

Claims (32)

1.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，包含结合于人EGFR的第一结合结构域和结合于人PD-1的第二结合结构域，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括选自由单链抗体(scFv)、双抗体(diabody)和上述形式的寡聚物所组成的组中的形式。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述第二结合结构域结合于鼠源PD-1。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含抗EGFR的单链抗体。
4.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含抗PD-1的单链抗体。
5.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含抗EGFR的单链抗体和抗PD-1的单链抗体。
6.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段
a)结合于人EGFR且KD为5.49E-10以下；并且
b)结合于人PD-1且KD为7.68E-09以下。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有下列性质中的至少一种：
a)结合于人EGFR且KD在5.45E-10至5.49E-10之间，并且
b)结合于人PD-1且KD在1.98E-09至7.68E-09之间。
8.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括两种多肽链：
包含第一结合结构域的多肽链，所述第一结合结构域包含抗EGFR的重链可变区和轻链可变区；
包含第二结合结构域的另一多肽链，所述第二结合结构域包含抗PD-1的重链可变区和轻链可变区。
9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一结合结构域包含
重链可变区，所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，和轻链可变区，所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，其中
所述H-CDR3包含SEQ ID NO：8所示的序列及其保守性修饰，所述H-CDR2包含SEQ IDNO：7所示的序列及其保守性修饰，所述H-CDR1包含如SEQ ID NO：6所示的序列及其保守性修饰；并且
所述L-CDR3包含如SEQ ID NO：11所示的序列及其保守性修饰；所述L-CDR2包含SEQ IDNO：10所示的序列及其保守性修饰；所述L-CDR1包含如SEQ ID NO：9所示的序列及其保守性修饰。
10.如权利要求8或9所述的抗体或其抗原结合片段，包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、或99％的同源性。
11.如权利要求8或9所述的抗体或其抗原结合片段，包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列是选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5所组成的组中的序列。
12.如权利要求8或9所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)所述第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：1、3所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、或99％的同源性；以及
b)所述第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、4、5所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、或99％的同源性。
13.如权利要求8或9所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)所述第二结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：1、3所组成的组中的序列；以及
b)所述第一结合结构域的可变区，其具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：2、4、5所组成的组中的序列。
14.如权利要求8或9所述的抗体或其抗原结合片段，包含互补决定区(CDR)，所述互补决定区具有的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：6-18所组成的组中的序列。
15.如权利要求8或9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二结合结构域包含
重链可变区，所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
其中所述H-CDR3包含如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
16.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗PD-1的所述L-CDR3包含如SEQID NO：17所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
17.如权利要求15或16所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗PD-1的所述H-CDR2包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
18.如权利要求15至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗PD-1的所述L-CDR2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
19.如权利要求15至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗PD-1的所述H-CDR1包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
20.如权利要求15至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗PD-1的所述L-CDR1包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列及其保守性修饰。
21.如权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或啮齿类动物的抗体。
22.一种核酸分子，其编码如权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
23.一种克隆或表达载体，其包含如权利要求22所述的核酸分子。
24.一种宿主细胞，其包含一个以上如权利要求23所述的克隆或表达载体。
25.一种用于生产如权利要求1至20中任一项所述的抗体的方法，包括培养如权利要求24所述的宿主细胞，并且分离所述抗体。
26.一种药物组合物，其包含如权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
27.一种免疫偶联物，其包含连接至治疗剂的如权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
28.一种药物组合物，其包含如权利要求27所述的免疫偶联物和一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
29.一种调节受试者的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用如权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
30.如权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防免疫病症或癌症的药物中的应用。
31.一种抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以抑制肿瘤细胞生长。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述肿瘤细胞是选自由黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌和直肠癌所组成的组中的癌症的细胞。
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