CN110734493B

CN110734493B - 抗pd-1抗体及其用途

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Publication number: CN110734493B
Application number: CN201910654839.XA
Authority: CN
Inventors: 黄承浩; 熊丹; 林超龙; 游敏; 罗文新; 张军; 夏宁邵
Original assignee: Yang Sheng Tang Co Ltd; Xiamen University
Current assignee: Yang Sheng Tang Co Ltd; Xiamen University
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2021-12-17
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: CN110734493A; CN113861295A

Abstract

本发明涉及疾病治疗及免疫学领域，具体而言，本发明涉及抗PD‑1的抗体或其抗原结合片段，编码它们的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物。本发明进一步涉及所述抗体(特别是人源化抗体)或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于提高免疫细胞活性、增强免疫应答，或者用于预防和/或治疗肿瘤或感染。

Description

抗PD-1抗体及其用途

技术领域

本发明涉及疾病治疗及免疫学领域，具体而言，本发明涉及抗PD-1的抗体或其抗原结合片段，编码它们的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物。本发明进一步涉及所述抗体(特别是人源化抗体)或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于提高免疫细胞活性、增强免疫应答，或者用于预防和/或治疗肿瘤或感染。

背景技术

T细胞的激活过程需要两个信号：一是由抗原递呈细胞APCs呈递的主要组织相容性复合体MHC结合的抗原肽与T细胞表面的细胞受体交联产生第一刺激信号，这种信号具有抗原特异性；二是由APCs表面分子(如B7家族)与T细胞表面相应分子(如CD28)结合所提供的第二刺激信号，主要包括激活T细胞的共刺激因子以及调节T细胞不被过度刺激的共抑制因子两种，该信号是非抗原特异性的，但是T细胞抗原特异性激活所必须的，它决定抗原刺激的T细胞是进入增殖、分化过程称为效应T细胞，还是进入抑制状态或凋亡。

程序化死亡分子(Programmed death gene 1，PD-1；又称CD279)，是CD28家族成员中的免疫抑制分子，对维持机体的免疫耐受有重要作用，其功能是使机体免受自身免疫系统的攻击。PD-1基因是由Ishida等人于1992年通过削减杂交技术从小鼠凋亡期的T细胞杂交瘤2B4.11中克隆出来的(Ishida Y,Agata Y,et al.Induced expression of PD-1,anovel member of the immunoglobulin gene superfamily,upon programmed celldeath[J].EMBO J,1992,11(11):3887-3895)。PD-1由288个氨基酸组成，分子量在50-55kDa，属I型跨膜蛋白，CD28家族成员之一，其基因Pdcd1定位于小鼠1号染色体和人2号染色体上。由于缺乏近膜端的半胱氨酸残基，PD-1以单体的形式存在于细胞膜表面。PD-1胞外含一个IgV样区，胞质区含有2个酪氨酸残基，分别连接着免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)和免疫受体酪氨酸转化基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM)，点突变结果显示ITSM基序对于PD-1信号传递起着重要作用(Keir M E,Butte M J,et al.PD-1and its ligands intolerance and immunity[J].Annu Rev Immunol,2008,26:677-704)。

PD-1主要表达于活化的T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞和树突状细胞表面。静息的T细胞表面不表达PD-1，但被激活后可诱导表达。T细胞被激活后，细胞表面的PD-1表达可在24h之内检测到，与其配体结合后，在几个小时之内就可发挥功能效应(Riley JL.PD-1signaling in primary T cells[J].Immunol Rev,2009,229(1):114-125)。PD-1有两个配体，分别是PD-L1(又称B7-H1，CD274)和PD-L2(又称B7-DC，CD273)，分别于1999年和2001年被发现，均属B7家族I型跨膜蛋白，胞外段都有IgV和IgC结构域。PD-L1由基因CD274编码表达，共290个氨基酸，该基因定位于小鼠19号染色体和人9号染色体。PD-L2由基因Pdcd1lg2编码表达，共247个氨基酸，其基因与PD-L1编码基因定位于相同染色体。

PD-L1在造血和非造血细胞中均有表达。在T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞和髓系肥大细胞中，PD-L1呈高水平组成性表达，且在细胞活化后继续上调表达。在部分非造血细胞中，主要是实体瘤如肾脏，卵巢癌和非小细胞肺癌等，由于肿瘤信号通路的异常或肿瘤细胞受外界信号诱导，PD-L1也呈现高水平表达的特征。研究还发现，I型和II型干扰素也能使免疫细胞上调PD-L1的表达(Francisco L M,Sage P T.,et al.ThePD-1pathway in tolerance and autoimmunity[J].Immunol Rev,2010,236:219-242)。与PD-L1相比，PD-L2的表达谱相对较窄，通常不表达在静息的细胞表面，主要诱导性表达于骨髓状DC细胞，巨噬细胞髓源性肥大细胞及部分B细胞系，在外周组织及其他类型细胞中表达受限。研究还发现PD-L2抑制T细胞活性的作用低于PD-L1(Latchman Y,et al.PD-L2is asecond ligand for PD-1and inhibits T cell activation[J].Nat Immunol,2001,2(3):261-268)。

PD-1抑制T细胞活性的分子机制主要是通过PI3K/Akt信号通路。T细胞表面PD-1与PD-L1/PD-L2结合后，PD-1膜内区ITIM和ITSM的酪氨酸被磷酸化，招募含有SH2同源域的去磷酸化酶SHP-2，SHP-2去磷酸化TCR复合体，抑制CD3ζ、ZAP70、PKCθ的磷酸化，进而抑制PI3K的磷酸化，从而抑制Akt的磷酸化，导致细胞因子IL-2、IFN-γ的下调表达，抑制T细胞的活性、增殖及细胞因子的表达(Chemnitz J M,Parry R V,et al.SHP-1and SHP-2associatewith immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1uponprimary human T cell stimulation,but only receptor ligation prevents T cellactivation[J].J Immunol,2004,173(2):945-954)。

PD-1/PD-L1信号除了调节并维持自身免疫耐受,在一些慢性传染性疾病患者,如人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)等感染者中，病毒入侵细胞后会诱导细胞表面高表达PD-L1，引起T细胞凋亡或衰竭。在肿瘤患者体内，PD-L1的高表达能够增强肿瘤的生长和转移能力，因此可以作为肿瘤患者预后的指标(Ceeraz S,Nowak E C,etal.B7family checkpoint regulators in immune regulation and disease[J].TrendsImmunol,2013,34(11):556-563)。研究发现，多种肿瘤细胞高表达PD-L1，如黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾细胞癌、淋巴瘤、胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、食道癌、膀胱癌和肝癌等(Chen L,Han,X.Anti-PD-1/PD-L1therapy of human cancer:past,present,and future[J].J Clin Invest,2015,125(9):3384-3391)。此外，肿瘤部位浸润性CD8⁺T细胞表面也高表达PD-1，它们与肿瘤细胞表面的PD-L1相互作用，从而抑制T细胞的活化与增殖，使得T细胞丧失对肿瘤细胞的杀伤作用，引起免疫逃逸。因此，有针对性地阻断PD-1/PD-L1信号通路,能够增强T细胞对传染病病原体和肿瘤细胞的杀伤。目前,已经有多个抗PD-1和PD-L1单克隆抗体药物被FDA批准用于癌症的治疗，具有不错的临床治疗效果(Sunshine J,Taube JM.PD-1/PD-L1inhibitors[J].Curr Opin Pharmacol,2015,23:32-38)。截止到2018年2月，默克公司Pembrolizumab派姆单抗和百时施贵宝公司Nivolumab纳武单抗已经被美国FDA批准用于包括非小细胞肺癌、头颈癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、霍奇森淋巴瘤、尿路上皮癌和胃癌在内的近十种恶性肿瘤的临床治疗。

尽管PD-1抗体肿瘤免疫疗法在近些年取得一定的成绩，但是对已进入国内肿瘤治疗临床研究的PD-1抗体进行分析后发现，由于不同PD-1抗体氨基酸序列，尤其是CDR区序列存在异质性，因而它们的特点及功能及治疗肿瘤的效果也不尽相同。总的来说，现有的PD-1抗体均存在一定毒副作用及对在部分人群中其治疗剂量明显受限等缺陷，这大大削弱了PD-1抗体的临床治疗效果及普适性，并且导致了一定的安全性隐患(Michot J M,Bigenwald C,et al.Immune-related adverse events with immune checkpointblockade:a comprehensive review[J].Eur J Cancer,2016,54:139-48)。

因此，发展具有更高的特异性、更低的毒副作用、更优的临床药效的抗PD-1抗体是迫切而必要的，这将给癌症、感染等疾病患者提供更多的用药选择。

发明内容

在本申请中，发明人首先开发了具有优良性质的鼠源抗体，其能够特异性识别/结合人PD-1，阻断PD-1与其配体PD-L1的结合，并且能够在体外/体内增强免疫细胞活性，刺激免疫应答。因此，该鼠源抗体具有用于预防和/或治疗肿瘤或感染的潜力。

在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，对该鼠源抗体进行了深入的研究和改造，从而开发了该鼠源抗体的人源化抗体：本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度，而且具有与鼠源抗体基本上相同的生物学功能。

因此，本发明的抗体(特别是人源化抗体)是极为有利的，其不仅保留了亲本鼠源抗体的功能和性质，从而具有用于预防和治疗肿瘤或感染的潜力；而且具有较高的人源化程度，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。本发明的抗体具有重大的临床价值。

本发明的抗体

因此，在一个方面，本发明提供了一种能够特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)下述3个重链可变区(VH)互补决定区(CDR)：

(i)VH CDR1，其具有如SEQ ID NOs:1、9、17、25任一项所示的VH中含有的CDR1的序列，或者与所述VH中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(ii)VH CDR2，其具有如SEQ ID NOs:1、9、17、25任一项所示的VH中含有的CDR2的序列，或者与所述VH中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和

(iii)VH CDR3，其具有如SEQ ID NOs:1、9、17、25任一项所示的VH中含有的CDR3的序列，或者与所述VH中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

和/或

(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：

(iv)VL CDR1，其具有如SEQ ID NOs:2、10、18、26任一项所示的VL中含有的CDR1的序列，或者与所述VL中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(v)VL CDR2，其具有如SEQ ID NOs:2、10、18、26任一项所示的VL中含有的CDR2的序列，或者与所述VL中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和

(vi)VL CDR3，其具有如SEQ ID NOs:2、10、18、26任一项所示的VL中含有的CDR3的序列，或者与所述VL中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。

在某些优选的实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的CDR1、CDR2及CDR3，和/或所述轻链可变区(VL)中含有的CDR1、CDR2及CDR3由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。

在某些示例性实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的CDR1、CDR2及CDR3，和/或所述轻链可变区(VL)中含有的CDR1、CDR2及CDR3由Kabat编号系统定义。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：

(a)下述3个重链可变区(VH)互补决定区(CDR)：

(i)VH CDR1，其具有如SEQ ID NO:1所示的VH中含有的CDR1的序列，或者与所述VH中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个或4个氨基酸的置换)的序列；

(ii)VH CDR2，其具有如SEQ ID NO:1所示的VH中含有的CDR2的序列，或者与所述VH中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸的置换)的序列；和

(iii)VH CDR3，其具有如SEQ ID NO:1所示的VH中含有的CDR3的序列，或者与所述VH中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个或7个氨基酸的置换)的序列；

和/或

(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：

(iv)VL CDR1，其具有如SEQ ID NO:2所示的VL中含有的CDR1的序列，或者与所述VL中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个或7个氨基酸的置换)的序列；

(v)VL CDR2，其具有如SEQ ID NO:2所示的VL中含有的CDR2的序列，或者与所述VL中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个或2个氨基酸的置换)的序列；和

(vi)VL CDR3，其具有如SEQ ID NO:2所示的VL中含有的CDR3的序列，或者与所述VL中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸的置换)的序列。

在某些优选的实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的CDR1、CDR2及CDR3，和/或所述轻链可变区(VL)中含有的CDR1、CDR2及CDR3由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。在某些示例性实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的CDR1、CDR2及CDR3，和/或所述轻链可变区(VL)中含有的CDR1、CDR2及CDR3由Kabat编号系统定义。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：

(a)如SEQ ID NO:1所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；

和/或，

(b)如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。

在某些优选的实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个CDR和/或所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。在某些示例性实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个CDR和/或所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR由Kabat编号系统定义。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:1所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR；

其中，所述重链可变区(VH)中含有的3个CDR和所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR通过Kabat编号系统确定。

在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)下述3个重链可变区(VH)CDR：

(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个或4个氨基酸的置换)的序列，

(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:4，或与SEQ ID NO:4相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸的置换)的序列，和

(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个或7个氨基酸的置换)的序列；

和/或

(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：

(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:6，或与SEQ ID NO:6相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个或7个氨基酸的置换)的序列，

(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，或与SEQ ID NO:7相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个或2个氨基酸的置换)的序列，和

(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，或与SEQ ID NO:8相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸的置换)的序列；

其中，所述重链可变区(VH)CDR和所述轻链可变区(VL)CDR由Kabat编号系统定义。

在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的一项或多项：

(i)VH CDR1具有如X₁X₂AFX₃RFX₄(SEQ ID NO:49)所示的序列；

(ii)VH CDR2具有如X₅X₆GGX₇X₈X₉X₁₀(SEQ ID NO:50)所示的序列；

(iii)VH CDR3具有如ARHX₁₁X₁₂X₁₃TX₁₄AX₁₅X₁₆X₁₇(SEQ ID NO:51)所示的序列；

(iv)VL CDR1具有如X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂YX₂₃YX₂₄F(SEQ ID NO:52)所示的序列；

(v)VL CDR2具有如RX₂₅A(SEQ ID NO:53)所示的序列；和

(vi)VL CDR3具有如QX₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀PX₃₁(SEQ ID NO:54)所示的序列；

其中，X₁至X₃₁彼此独立地是任意氨基酸。

在某些优选的实施方案中，X₁至X₃₁彼此独立地选自丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、甘氨酸(G)、天冬氨酸(N)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、辅氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。

在某些优选的实施方案中，X₁选自G或A，X₂选自F或A，X₃选自S或A，X₄选自D或A，X₅选自I或A，X₆至X₈彼此独立地选自G或A，X₉选自R或A，X₁₀选自T或A，X₁₁选自G或A，X₁₂选自T或A，X₁₃至X₁₄彼此独立地选自G或A，X₁₅选自M或A，X₁₆选自D或A，X₁₇选自Y或A，X₁₈选自K或A，X₁₉选自S或A，X₂₀选自V或A，X₂₁选自D或A，X₂₂选自N或A，X₂₃选自G或A，X₂₄选自S或A，X₂₅选自S或A，X₂₆选自Q或A，X₂₇选自S或A，X₂₈选自N或A，X₂₉选自E或A，X₃₀选自D或A，X₃₁选自T或A。

在某些优选的实施方案中，X₆是G，X₇是G，X₁₀是T，X₁₁是G，X₁₃是G，X₁₄是G，X₁₅是M，X₂₃是G，X₂₄是S，X₂₆是Q，X₃₁是T。

(1)X₁至X₄中的至多一个为A；

(2)X₅至X₁₀中的至多一个为A；

(3)X₁₁至X₁₇中的至多一个为A；

(4)X₁₈至X₂₄中的至多一个为A；

(5)X₂₆至X₃₁中的至多一个为A。

在某些优选的实施方案中，X₁至X₁₇中的至多一个为A。

在某些优选的实施方案中，X₁₈至X₃₁中的至多一个为A。

在某些优选的实施方案中，X₁至X₃₁中的至多一个为A。

(1)如SEQ ID NOs:3、55-58任一项所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VHCDR2；以及，如SEQ ID NO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；

(2)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NOs:4、59-61任一项所示的VHCDR2；以及，如SEQ ID NO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；

(3)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQID NOs:5、62-64任一项所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；

(4)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQID NO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NOs:6、65-69任一项所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；

(5)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQID NO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7或70所示的VLCDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；或

(6)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQID NO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NOs:71-74任一项所示的VL CDR3。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQ ID NO:5所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3。

在另一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：

(a)下述3个重链可变区(VH)互补决定区(CDR)：

(i)VH CDR1，其具有如SEQ ID NO:9所示的VH中含有的CDR1的序列，或者与所述VH中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(ii)VH CDR2，其具有如SEQ ID NO:9所示的VH中含有的CDR2的序列，或者与所述VH中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和

(iii)VH CDR3，其具有如SEQ ID NO:9所示的VH中含有的CDR3的序列，或者与所述VH中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

和/或

(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：

(iv)VL CDR1，其具有如SEQ ID NO:10所示的VL中含有的CDR1的序列，或者与所述VL中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(v)VL CDR2，其具有如SEQ ID NO:10所示的VL中含有的CDR2的序列，或者与所述VL中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和

(vi)VL CDR3，其具有如SEQ ID NO:10所示的VL中含有的CDR3的序列，或者与所述VL中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

(a)如SEQ ID NO:9所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；

和/或，

(b)如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:9所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR；

(a)下述3个重链可变区(VH)CDR：

(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，或与SEQ ID NO:11相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12，或与SEQ ID NO:12相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13，或与SEQ ID NO:13相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

和/或

(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：

(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:14，或与SEQ ID NO:14相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或与SEQ ID NO:15相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或与SEQ ID NO:16相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:11所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:12所示的VH CDR2；以及，如SEQ ID NO:13所示的VHCDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:14所示的VL CDR1；如SEQID NO:15所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:16所示的VL CDR3。

(a)下述3个重链可变区(VH)互补决定区(CDR)：

(i)VH CDR1，其具有如SEQ ID NO:17所示的VH中含有的CDR1的序列，或者与所述VH中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(ii)VH CDR2，其具有如SEQ ID NO:17所示的VH中含有的CDR2的序列，或者与所述VH中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和

(iii)VH CDR3，其具有如SEQ ID NO:17所示的VH中含有的CDR3的序列，或者与所述VH中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

和/或

(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：

(iv)VL CDR1，其具有如SEQ ID NO:18所示的VL中含有的CDR1的序列，或者与所述VL中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(v)VL CDR2，其具有如SEQ ID NO:18所示的VL中含有的CDR2的序列，或者与所述VL中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和

(vi)VL CDR3，其具有如SEQ ID NO:18所示的VL中含有的CDR3的序列，或者与所述VL中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

(a)如SEQ ID NO:17所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；

和/或，

(b)如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:17所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR；

(a)下述3个重链可变区(VH)CDR：

(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或与SEQ ID NO:19相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:20，或与SEQ ID NO:20相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:21，或与SEQ ID NO:21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

和/或

(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：

(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:22，或与SEQ ID NO:22相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:23，或与SEQ ID NO:23相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:24，或与SEQ ID NO:24相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:19所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:20所示的VH CDR2；以及，如SEQ ID NO:21所示的VHCDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:22所示的VL CDR1；如SEQID NO:23所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:24所示的VL CDR3。

(a)下述3个重链可变区(VH)互补决定区(CDR)：

(i)VH CDR1，其具有如SEQ ID NO:25所示的VH中含有的CDR1的序列，或者与所述VH中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(ii)VH CDR2，其具有如SEQ ID NO:25所示的VH中含有的CDR2的序列，或者与所述VH中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和

(iii)VH CDR3，其具有如SEQ ID NO:25所示的VH中含有的CDR3的序列，或者与所述VH中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

和/或

(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：

(iv)VL CDR1，其具有如SEQ ID NO:26所示的VL中含有的CDR1的序列，或者与所述VL中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(v)VL CDR2，其具有如SEQ ID NO:26所示的VL中含有的CDR2的序列，或者与所述VL中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和

(vi)VL CDR3，其具有如SEQ ID NO:26所示的VL中含有的CDR3的序列，或者与所述VL中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

(a)如SEQ ID NO:25所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；

和/或，

(b)如SEQ ID NO:26所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:25所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:26所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR；

(a)下述3个重链可变区(VH)CDR：

(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:27，或与SEQ ID NO:27相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:28，或与SEQ ID NO:28相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:29，或与SEQ ID NO:29相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

和/或

(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：

(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:30，或与SEQ ID NO:30相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:31，或与SEQ ID NO:31相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:32，或与SEQ ID NO:32相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:27所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:28所示的VH CDR2；以及，如SEQ ID NO:29所示的VHCDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:30所示的VL CDR1；如SEQID NO:31所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:32所示的VL CDR3。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的构架区(FR)。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含来源于鼠免疫球蛋白的重链可变区(VH)构架区(FR)，和/或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含来源于鼠免疫球蛋白的轻链可变区(VL)构架区(FR)。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含来源于人免疫球蛋白的重链可变区(VH)构架区(FR)，和/或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含来源于人免疫球蛋白的轻链可变区(VL)构架区(FR)。在此类实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区FR和/或轻链可变区FR可以包含一个或多个非人源(例如，鼠源)氨基酸残基，例如所述重链构架区FR和/或轻链构架区FR可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的鼠源氨基酸残基。

(a)人免疫球蛋白的重链构架区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；和/或

(b)人免疫球蛋白的轻链构架区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人免疫球蛋白的框架区，例如人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区。在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和/或人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区。

在此类实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的框架区(重链框架区和/或轻链框架区)可以包含一个或多个非人源(例如，鼠源)氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，所述框架区(重链框架区和/或轻链框架区)包含一或多个氨基酸残基，其被回复突变至相应的鼠源残基或相应鼠源残基的保守氨基酸置换(此类突变称为回复突变(backmutation))。

因此，在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人免疫球蛋白的框架区(例如，人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区)，所述框架区任选地包含一个或多个从人源残基至鼠源残基的回复突变。

在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：IGVH3-23*04所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和IGKV3-11*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区，所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至鼠源残基的回复突变。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少95％。

在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：IGVH1-2*02所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和IGKV1-16*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区，所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至鼠源残基的回复突变。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少84％。

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NOs：1、9、17、25、33、35、37、39任一项所示的序列；

(ii)与SEQ ID NOs：1、9、17、25、33、35、37、39任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NOs：1、9、17、25、33、35、37、39任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和/或

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NOs：2、10、18、26、34、36、38、40任一项所示的序列；

(v)与SEQ ID NOs：2、10、18、26、34、36、38、40任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NOs：2、10、18、26、34、36、38、40任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：1所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：2所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：9所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：10所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：10所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：17所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：17所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：17所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：18所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：18所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：18所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：25所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：25所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：25所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：26所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：26所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：26所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：33所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：33所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：33所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：34所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：34所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：34所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：35所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：35所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：35所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：36所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：36所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：36所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：37所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：37所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：37所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：38所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：38所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：38所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：39所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：39所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：39所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：40所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：40所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：40所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

(1)具有如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:2所示的序列的VL；

(2)具有如SEQ ID NO:9所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:10所示的序列的VL；

(3)具有如SEQ ID NO:17所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:18所示的序列的VL；

(4)具有如SEQ ID NO:25所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:26所示的序列的VL；

(5)具有如SEQ ID NO:33所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:34所示的序列的VL；

(6)具有如SEQ ID NO:35所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:36所示的序列的VL；

(7)具有如SEQ ID NO:37所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:38所示的序列的VL；或

(8)具有如SEQ ID NO:39所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:40所示的序列的VL。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。在某些优选的实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的保守置换。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，

本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。

在某些优选的实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在某些优选的实施方案中，所述重链恒定区是鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在某些优选的实施方案中，所述重链恒定区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在某些实施方案中，优选地所述重链恒定区是人IgG1或IgG4重链恒定区。

在某些优选的实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。在某些优选的实施方案中，所述轻链恒定区是鼠κ轻链恒定区。在某些优选的实施方案中，所述轻链恒定区是人κ轻链恒定区。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。在某些优选的实施方案中，本发明的抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv片段、双抗体(diabody)。

本发明的抗体或其抗原结合片段对PD-1(特别是人PD-1)具有高特异性和高亲和力。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够以约1×10^-10M或更低的K_D结合PD-1(特别是人PD-1)；优选地，以约5×10^-11M或更低的K_D结合PD-1(特别是人PD-1)，或者，以约1×10^-11M或更低的K_D结合PD-1(特别是人PD-1)。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段具备以下生物学功能中的至少一项：

(1)特异性识别/结合PD-1(特别是人PD-1)；

(2)阻断PD-1与PD-L1的结合，或者抑制和/或阻断由PD-1结合PD-L1介导的细胞内信号传导；

(3)在体外及受试者体内提高免疫细胞(特别是T细胞，例如抗原特异性T细胞)活性；

(4)在体外及受试者体内提高免疫细胞(特别是T细胞，例如抗原特异性T细胞)的效应细胞因子(例如，IL-2、IFN-γ等)的分泌水平、增殖活性、活化标记(例如，CD25、CD69等)的表达水平、和/或细胞杀伤活性；

(5)在体外及受试者体内增强免疫应答(特别是T细胞介导的免疫应答)；

(6)在受试者中预防和/治疗肿瘤(例如，具有微卫星高度不稳定性(MSI-H)或者错配修复缺陷(dMMR)的肿瘤)或感染。

在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。

衍生的抗体

本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对PD-1(特别是人PD-1)的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。

因此，在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有标记。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，

)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。如上所述的可检测的标记可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

在另一个方面，本发明还提供了一种缀合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂。

在某些优选的实施方案中，所述缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)。在某些优选的实施方案中，所述治疗剂选自细胞毒素或放射性同位素。在本发明中，合适的治疗剂的非限制性实例包括，抗代谢物、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰基酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素及抗有丝分裂剂。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段任选地通过接头与所述治疗剂缀合。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段通过可裂解的接头(例如肽接头、二硫化物或腙接头)与所述治疗剂缀合。

抗体的制备

本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。

本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)₂片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)₂片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHO DG44)。

在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

治疗方法和药物组合物

本发明的抗体或其抗原结合片段可用于体外或在受试者体内抑制和/或阻断由PD-1结合PD-L1介导的细胞内信号传导，提高免疫细胞活性，增强免疫应答，以及用于预防和/或治疗肿瘤或感染，或者用作免疫佐剂。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。

在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒、化学治疗剂、抗血管生成药物、抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂等。

在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是用于治疗感染的药物，例如抗病毒剂、抗真菌剂、抗细菌剂、免疫刺激剂等。

在某些优选的实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段或者缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段或者缀合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。

在某些示例性实施方案中，所述药物包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段或者缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于：

(1)在体外或受试者(例如人)体内提高免疫细胞(例如T细胞)活性；

(2)在受试者(例如人)中增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)；

(3)在受试者(例如人)中治疗肿瘤；或

(4)在受试者(例如人)中治疗感染。

在某些优选的实施方案中，所述肿瘤是具有微卫星高度不稳定性(MSI-H)和/或错配修复缺陷(dMMR)的肿瘤。

在另一个方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其含有本发明的抗体或其抗原结合片段，以及免疫原。

在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段作为佐剂。

在某些优选的实施方案中，所述免疫原选自与肿瘤相关的抗原(例如蛋白、多肽或糖类分子)、肿瘤细胞、由所述抗原致敏的树突状细胞，及其任意组合。

在某些优选的实施方案中，所述免疫原选自与病原体(例如，病毒)相关的抗原(例如蛋白、多肽或糖类分子)、灭活或减毒的病原体、由所述抗原致敏的树突状细胞，及其任意组合。

在某些优选的实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述免疫原性组合物包含稳定剂。

某些优选的实施方案中，在所述免疫原性组合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述免疫原作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述免疫原可以同时、分开或相继施用。

在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用作佐剂的用途，或者，在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于在受试者中增强免疫应答(例如，T细胞介导的免疫应答)；其中，所述免疫原性组合物包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及免疫原。

在某些优选的实施方案中，所述免疫原选自与肿瘤相关的抗原(例如蛋白、多肽或糖类分子)、肿瘤细胞、由所述抗原致敏的树突状细胞，及其任意组合。在此类实施方案中，所述免疫原性组合物用于在受试者中预防和/或治疗肿瘤。

在某些优选的实施方案中，所述免疫原选自与病原体(例如，病毒)相关的抗原(例如蛋白、多肽或糖类分子)、灭活或减毒的病原体、由所述抗原致敏的树突状细胞，及其任意组合。在此类实施方案中，所述免疫原性组合物用于在受试者中预防和/或治疗感染。

在另一个方面，本发明提供了一种在体外提高免疫细胞(例如T细胞)活性的方法，所述方法包括将所述免疫细胞与本发明的抗体或其抗原结合片段接触的步骤。此类方法可以用于治疗目的，或非治疗目的。

在某些优选的实施方案中，可使用任何适宜的指示物来测量免疫细胞的活性。此类适宜的指示物的非限制性实例包括：在本发明的抗体或其抗原结合片段存在的条件下，免疫细胞(例如T细胞)的细胞因子(例如，IL-2、IFN-γ等)分泌水平、增殖活性、和/或活化标记(例如，CD25、CD69等)表达水平增加。

在某些优选的实施方案中，所述方法用于治疗肿瘤。在此类实施方案中，通过上述方法获得的免疫细胞可以过继转移到受试者中以治疗肿瘤。在本发明的抗体或其抗原结合片段存在下进行体外活化可预期提高过继转移的免疫细胞的活性，从而有利于这些过继转移的免疫细胞在受试者体内的肿瘤杀伤作用。在某些优选的实施方案中，所述免疫细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(例如，肿瘤浸润性T细胞)。

在某些优选的实施方案中，所述方法还包括将所述免疫细胞与另外的药学活性剂接触的步骤，所述另外的药学活性剂可以选自免疫刺激性细胞因子。在某些示例性实施方案中，所述另外的药学活性剂选自例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF，及其任意组合。

在某些优选的实施方案中，所述免疫细胞为T细胞，例如细胞毒性T细胞(CTL)、抗原特异性T细胞或肿瘤浸润性T细胞(TIL-T)。在某些示例性实施方案中，所述免疫细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(例如，肿瘤浸润性T细胞)。

在另一个方面，本发明提供了一种在受试者中提高免疫细胞活性和/或增强免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体(或其抗原结合片段)、本发明的缀合物、本发明的药物组合物或本发明的免疫原性组合物。

在某些优选的实施方案中，所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。

在某些优选的实施方案中，所述方法用于预防和/或治疗肿瘤。在此类实施方案中，所述受试者患有肿瘤。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤是具有微卫星高度不稳定性(MSI-H)和/或错配修复缺陷(dMMR)的肿瘤。

在某些优选的实施方案中，所述方法用于预防和/或治疗感染。在此类实施方案中，所述受试者患有感染。在某些优选的实施方案中，所述感染是病毒感染，例如慢性病毒感染。

在某些优选的实施方案中，所述免疫细胞为T细胞，例如细胞毒性T细胞(CTL)、抗原特异性T细胞或肿瘤浸润性T细胞(TIL-T)。在某些示例性实施方案中，所述免疫细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞，例如肿瘤浸润性T细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体(或其抗原结合片段)、本发明的缀合物、本发明的药物组合物或本发明的免疫原性组合物。

在某些优选的实施方案中，将本发明的抗体(或其抗原结合片段)或缀合物与另外的具有抗肿瘤活性的药物联合使用。这种另外的具有抗肿瘤活性的药物可以在施用抗体(或其抗原结合片段)或缀合物之前、同时或之后施用。

在某些优选的实施方案中，将本发明的抗体(或其抗原结合片段)、缀合物、药物组合物或免疫原性组合物与额外的疗法组合施用。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗。这种额外的疗法可以在施用本发明的抗体(或其抗原结合片段)、缀合物、药物组合物或免疫原性组合物之前、同时或之后施用。

在另一个方面，本发明提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗感染的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体(或其抗原结合片段)、本发明的缀合物、本发明的药物组合物或本发明的免疫原性组合物。

在某些优选的实施方案中，将本发明的抗体(或其抗原结合片段)或缀合物与另外的用于治疗感染的药物联合使用。这种另外的用于治疗感染的药物可以在施用抗体(或其抗原结合片段)或缀合物之前、同时或之后施用。

在某些优选的实施方案中，将本发明的抗体(或其抗原结合片段)与疫苗联合使用。在某些优选的实施方案中，所述疫苗可以是与病原体相关的抗原(例如蛋白、多肽或糖类分子)、灭活或减毒的病原体、由所述抗原致敏的树突状细胞，或其任意组合。在某些优选的实施方案中，所述病原体可以是病毒(例如，甲、乙、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头状瘤病毒或疱疹病毒)、真菌、细菌或寄生虫。

在本发明中，所述肿瘤的非限制性实例包括黑色素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、乳腺癌、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、结肠癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤及血液学恶性肿瘤(例如，淋巴瘤、白血病)等。

之前已报道，微卫星不稳定性(Microsatellite Instability,MSI)是一种与DNA错配修复(Mismatch Repair,MMR)基因的失活性改变相关的肿瘤表型，其存在于多达24种类型的肿瘤中。MSI通常表现为与正常组织相比，肿瘤组织中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失造成该微卫星的长度发生任何改变。越来越多的证据表明免疫检查点抑制对于微卫星不稳定性或错配修复缺陷患者群体是有益的。目前，FDA已批准PD-1抗体(药品名：pembrolizumab，商品名：Keytruda)用于确定具有微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)的不可切除或转移性实体瘤患者，而与该肿瘤起源的身体部位及组织类型无关。

根据美国国家癌症研究所(NCI)制定的MSI检测分类标准(Boland CR,etal.Cancer Res.1998Nov 15；58(22):5248-57.)，对于5个微卫星标准位点，BAT26、BAT25、D2S123、D5S346、D17S250，与正常组织比较，如果肿瘤组织包含2个及以上位点不稳定，则判定为微卫星高不稳定(MSI-H)，即错配修复功能缺陷(dMMR)；如果小于2个位点不稳定或无位点不稳定，则判定为微卫星低不稳定(MSI-L)或微卫星稳定(MSS)，即错配修复功能完整(pMMR)。

用于检测微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)的方法是本领域技术人员已知的，例如通过PCR或二代测序来检测肿瘤组织中上述5个标准微卫星位点的长度改变，如有2个或以上位点不稳定，则判定为MSI-H。另外，也可通过免疫组化(ICH)检测肿瘤组织中MLH1、MSH2、MSH6、PSM2的表达情况，如果四个蛋白均表达阳性，则判定为pMMR，任一蛋白阴性表达，则判定为dMMR。

因此，在某些优选的实施方案中，本发明所述的肿瘤是具有微卫星高度不稳定性(MSI-H)和/或错配修复缺陷(dMMR)的肿瘤。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自结肠腺癌、食管癌、直肠腺癌、胃腺癌、子宫体及子宫内膜癌等。

在本发明中，所述感染是指病毒、细菌、真菌、寄生虫等任何病原微生物所导致的任何感染。所述病毒的非限制性实例包括甲、乙、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头状瘤病毒或疱疹病毒等；所述细菌的非限制性实例包括衣原体、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌等；所述真菌的非限制性实例包括毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子癣菌属、白假丝酵母菌、新生隐球菌等；所述寄生虫的非限制性实例包括疟原虫、血吸虫、杜氏利什曼原虫、丝虫、钩虫等。

本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的缀合物、本发明的药物组合物或者本发明的免疫原性组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的重组蛋白，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

此外，本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的缀合物可以以单位剂量形式存在于药物组合物或免疫原性组合物中，以便于施用。

本发明的抗体或其抗原结合片段、缀合物、药物组合物或免疫原性组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、缀合物、药物组合物或免疫原性组合物通过静脉注射或推注给予。

本发明的药物组合物或免疫原性组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段或缀合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。

本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.01～100mg/kg，例如0.1～100mg/kg，0.1～50mg/kg，或1～50mg/kg。应注意的是，剂量可随需要治疗的症状的类型和严重性不同而发生变化。此外，本领域技术人员理解，对于任一特定患者，特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整；此处给出的剂量范围只用于举例说明目的，而不限定本发明药物组合物或免疫原性组合物的使用或范围。

在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。

检测方法和试剂盒

本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合PD-1，从而可用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。

在本发明中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，

)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

在另一个方面，本发明提供了检测PD-1在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。在某些优选的实施方案中，所述PD-1是人PD-1。

在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。在某些优选的实施方案中，所述PD-1是人PD-1。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。

在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat编号系统确定。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、结构域抗体(技术来自Ablynx)、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。

如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)₂片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。

如本文中所使用的，术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。

如本文中所使用的，术语“Fc片段”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。

如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。如本文中所使用的，术语“di-scFv”是指，由两个scFv连接形成的抗体片段。

如本文中所使用的，术语“双抗体”意指，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure2:1121-1123(1994))。

如本文中所使用的，术语“probody”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指一种经掩蔽的抗体，其在健康组织中保持惰性，但在疾病环境中特异性活化(例如，经由疾病环境中富集或特有的蛋白酶的蛋白酶裂解)。其详细教导可参见，例如Desnoyers等人,Sci.Transl.Med.,5:207ra144,2013。可对本文所描述的任何抗体或其抗原结合部分使用类似掩蔽技术。

上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用可互换，其是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外，修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。

本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，例如杂交瘤技术(参见，例如Kohler等人.Nature,256:495,1975)，重组DNA技术(参见，例如美国专利申请4,816,567)，或噬菌体抗体库技术(参见，例如Clackson等.Nature352：624-628,1991，或Marks等.J.Mol.Biol.222：581-597,1991)。

抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析进行纯化。随后或作为替代，可将特异性抗原(该抗体识别的靶分子)或其抗原表位固定在柱上，并通过免疫亲合层析法来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化可参考例如D.Wilkinson(TheScientist,publi shed by The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.,Vol.14,No.8(Apr.17,2000),pp.25-28)。

如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链可变区来自第二抗体(例如人抗体)。

如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。

人源化抗体既能够保留非人源供体抗体(例如鼠源抗体)的预期性质，又能够有效降低非人源供体抗体(例如鼠源抗体)在人受试者中的免疫原性，因此，是特别有利的。然而，由于供体抗体的CDR与受体抗体的FR之间的匹配问题，人源化抗体的预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)通常低于非人源供体抗体(例如鼠源抗体)。

在本发明中，为了使人源化抗体尽可能保留供体抗体的性质(包括例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)，本发明的人源化抗体中构架区(FR)可以既包含人源受体抗体的氨基酸残基，也包含相应的非人源供体抗体的氨基酸残基。

在本申请中，本发明抗体的预期性质包括：(1)特异性识别/结合PD-1(特别是人PD-1)；(2)阻断PD-1与PD-L1的结合的能力；(3)抑制和/或阻断由PD-1结合PD-L1介导的细胞内信号传导的能力；(4)提高免疫细胞(特别是T细胞，例如抗原特异性T细胞)活性的能力；(5)增强免疫应答(特别是T细胞介导的免疫应答)的能力；(6)预防和/治疗肿瘤的能力；(7)预防和/治疗感染的能力。本发明的人源化抗体保留了亲本抗体(鼠源抗体或鼠-人嵌合抗体)的上述预期性质中的一项或多项。

本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。

为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。例如，将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。例如，将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。

为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in Antibody Engineering:Methodsand Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。或者，还可以利用转基因动物，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库。例如，已有报道在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失可以完全抑制了内源性抗体产生，然后将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠中将导致该小鼠在遇到抗原刺激时产生人抗体(参见例如，Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551；Jakobovits等，1993，Nature362：255-258；Bruggermann等，1993，Year inImmunology 7：33；和Duchosal等，1992，Nature 355：258)。上述转基因动物的非限制性实例包括，HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)，其含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“KM小鼠^TM”(参见专利申请WO02/43478)。其他抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术(Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks等，J.Mol.Biol.1991，222：581-597；Vaughan等，1996，Nature Biotech 14：309)。

如本文中所使用的，术语“人源化程度”是用于评价人源化抗体中非人源氨基酸残基的数量的指标。人源化抗体的人源化程度例如可通过下述来进行计算：人源化程度＝(FR区氨基酸个数-FR区保留的非人源氨基酸个数)/FR区氨基酸个数×100％。

如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因(germline antibody gene)”或“胚系抗体基因片段(germline antibody gene segment)”是指，存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列，其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。在本发明中，表述“重链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、D基因(diversity)、J基因(joining)和C基因(constant)；类似地，表述“轻链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、J基因(joining)和C基因(constant)。在本发明中，由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germlinesequence)”。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，IMGT、UNSWIg、NCBI或VBASE2)获得或查询。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(K_D)表示。在本发明中，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于约10^-9M，例如小于约10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤或感染)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。

如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤或感染，或者，具有患有上述疾病的风险。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，肿瘤或感染)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤或感染)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

如本文中所使用的，术语“免疫细胞”包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞，例如淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。在某些优选的实施方案中，所述免疫细胞是T细胞，例如细胞毒性T细胞(CTL)、抗原特异性T细胞或肿瘤浸润性T细胞(TIL-T)。

如本文中所使用的，术语“免疫应答”是指，免疫细胞(例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞或粒细胞)以及由免疫细胞或肝脏所产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子、以及补体)的作用，该作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞、或者在自身免疫或病理炎症情况下的正常人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体中清除。在某些优选的实施方案中，所述免疫应答是指T细胞介导的免疫应答，该应答产生于当该T细胞特异的抗原对该T细胞的刺激之时。由T细胞在抗原特异性刺激时产生的反应的非限制性实例包括T细胞的增殖以及细胞因子(例如IL-2)的产生。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)本发明的抗体不仅能够特异性识别/结合PD-1，阻断PD-1与PD-L1的结合，并且能够在体外/体内增强免疫细胞活性，刺激免疫应答。因此，本发明的抗体具有用于预防和/或治疗肿瘤或感染的潜力。

(2)本发明的抗体(特别是人源化抗体)不仅保留了亲本鼠源抗体的功能和性质，从而具有用于预防和治疗肿瘤或感染的潜力；而且具有较高的人源化程度，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。尤其令人意外的是，本发明的抗体相比于商业化抗PD-1抗体具有明显提高的阻断活性及诱导T细胞活化的能力。因此，本发明的抗体(特别是人源化抗体)具有重大的临床价值。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。

附图说明

图1A示意性地示出了ELISA法检测抗体与PD-1/His之间结合活性的原理。

图1B示意性地示出了FACS法检测抗体与细胞表面所表达的人PD-1之间结合活性的原理。

图1C示意性地示出了ELISA法检测抗体阻断人PD-1/His与PD-L1/Fc结合的能力的原理。

图2显示了实施例1中通过ELISA法检测鼠源抗体(16F2、10D6、48G7和17D5)与人PD-1及鼠PD-1的结合活性的检测结果。

图3显示了实施例2中通过FACS法检测鼠源抗体(16F2、10D6、48G7和17D5)与细胞表面表达的人PD-1的结合活性的检测结果。

图4显示了实施例2中通过CLEIA法检测鼠源抗体(16F2、10D6、48G7和17D5)阻断人PD-1/His和PD-L1/Biotin之间结合能力的检测结果。Control是指以PBS代替抗PD-1单抗的阳性对照组。

图5显示了实施例2中鼠源抗体(16F2、10D6、48G7和17D5)对人PD-1/His和PD-L1/Biotin之间结合的抑制率曲线。Control是指以PBS代替抗PD-1单抗的阳性对照组。

图6显示了实施例4中鼠源抗体(16F2、10D6、48G7和17D5)诱导IL-2分泌水平的检测结果，其中control是指未加入抗PD-1抗体的阴性对照组。

图7显示了实施例5中通过ELISA法检测嵌合抗体17D5-cAb和48G7-cAb的抗原结合活性的检测结果。

图8显示了实施例6中通过CLEIA法检测人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2的结合活性的检测结果。其中，PEM是指Pembrolizumab，NIV是指Nivolumab。

图9显示了实施例6中通过CLEIA法检测人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2的阻断活性的检测结果。其中，PEM是指Pembrolizumab，NIV是指Nivolumab。

图10显示了实施例6中人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2诱导IL-2分泌水平的检测结果。其中，PEM是指Pembrolizumab，NIV是指Nivolumab，control是指未加入抗PD-1抗体的阴性对照组。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley & Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：鼠源抗PD-1单克隆抗体的产生

在本实施例中，通过常规杂交瘤融合技术获得抗人PD-1单克隆抗体；利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)及流式分选法(FACS)筛选具有高结合活性的单克隆抗体；利用化学发光酶联免疫测定法(CLEIA)筛选能高阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的单克隆抗体。

1.1 PD-1表达质粒的构建

通过PCR、使用表2所示的引物扩增人全长PD-1序列(genbank：NM_005018.2)，并将其连接入plv载体(Addgene公司)中，构建成表达PD-1的质粒，命名为plv-PD-1。

另外，通过相同的方法获得表达人全长PD-L1的质粒(命名为plv-PD-L1)，该人全长PD-L1的序列参见genbank：NM_014143.3。

表2：引物序列

1.2稳定表达PD-1的细胞系的构建

利用lipofectamine 2000转染试剂将plv-PD-1质粒和包装质粒psPAX2(Addgene公司，货号12260)和pMD2.G(Addgene公司，货号12259)共转染入293T细胞(购买于美国ATCC公司，货号CRL-3216^TM)。48小时后，收集病毒上清过滤收集，将病毒上清感染U-2OS(购买于美国ATCC公司，货号HTB-96)，用含有1μg/mL嘌呤霉素(Invitrogen公司，货号A11138-03)的培养基加压筛选稳定表达人PD-1的细胞系。藉由有限稀释法获得单个克隆。最后利用抗PD-1抗体(eBioscience公司，货号16-9989-82)筛选高表达PD-1的U-2OS细胞克隆株(以下简称为U-2OS/PD-1)用于后续试验。

另外，通过相同的方法将plv-PD-L1质粒和包装质粒共转染入293T细胞，然后将病毒上清感染293T细胞，并通过相同的方法获得单个克隆，最后利用抗PD-L1抗体(BD公司，货号558017)筛选高表达PD-L1的293T细胞克隆株(以下简称为293T/PD-L1)用于后续试验。

1.3抗原免疫及细胞融合

对6周龄的BALB/c小鼠(获得自北京维通利华实验动物技术有限公司)采用脾脏免疫注射100μg上述1.1中获得的plv-PD-1质粒，进行初次免疫。第2周将1×10⁶U-2OS/PD-1细胞经腹腔注射给初次免疫后的BALB/c小鼠。第3周、第4周、第5周和第6周再以相同剂量进行免疫加强，第6周采集血清利用ELISPOT法在U-2OS/PD-1细胞上检测多抗血清效价，然后选择效价高的小鼠进行脾脏免疫，注射1×10⁶U-2OS/PD-1细胞。三天后，使用标准技术(Gefter M L,Margulies D H,et al.A simple method for polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells[J].Somatic Cell Genet,1977,3:231-236)进行细胞融合及筛选。

1.4阳性克隆的检测

将人PD-1/His蛋白(Sino Biological Inc.,货号10377-H08H)用CB缓冲液稀释，以100ng/孔包被于辐照过的聚苯乙烯96孔板中，封闭液进行封闭后，抽干并于4℃保存备用。将稀释后的融合的杂交骨髓瘤细胞培养液上清加入已包被的板中，37℃反应1h，洗板5次，甩干，加入HRP标记的GAM二抗(NOVUS，货号NBP1-73693)，37℃反应0.5h，洗板5次，甩干。加入化学发光显色底物，立即置于酶标仪(安图实验仪器公司，PHOMO)中进行数据读取。以细胞培养基为阴性对照，凡OD值大于阴性对照2倍以上者，初步判定为阳性克隆。

1.5单克隆化及抗体表达纯化

阳性细胞株可以通过(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,pp.59-103,Academic Press,1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。取出抗体阳性孔细胞，用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔，培养7-14天后选择只有一个集落生长的孔，检测培养液抗体与U-2OS/PD-1细胞的结合活性。将抗体阳性孔细胞扩大培养并建成克隆株。

另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。从产生腹水瘤小鼠中收集腹水，3000rpm离心20min去除细胞碎片，上清以0.22μm的一次性滤器去除颗粒物后进行亲和层析纯化，IgG抗体用Protein A层析介质(GE Healthcare，货号17-1279-03)纯化，均严格按照产品说明书的指引在

explorer液相色谱纯化系统上完成。纯化后抗体纯度均在95％以上，抗体浓度藉由Bradford法测定。

1.6鼠源抗PD-1单抗的序列分析

按照上述方法共制备获得了4株特异性结合PD-1的鼠源抗体，分别命名为16F2、10D6、48G7和17D5。四株抗体的VH和VL序列如下表3所示。进一步，还使用Kabat等人描述的方法(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，PublicHealth Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了四株鼠源单抗的CDR序列(表4)。

表3:鼠源抗体轻重链可变区氨基酸序列

表4:鼠源抗体CDR的序列

1.7 ELISA法检测PD-1抗体与PD-1/His蛋白的反应性

ELISA法检测PD-1抗体结合活性的原理如图1A所示。

将人PD-1/His蛋白(Sino Biological Inc.,货号10377-H08H)或鼠PD-1/His蛋白(Sino Biological Inc.,货号50124-M03H)用CB缓冲液稀释，以100ng/孔包被于辐照过的聚苯乙烯96孔板中，封闭液进行封闭后，抽干并于4℃保存备用。将经PBS稀释至0.1μg/mL的鼠源抗体(16F2、10D6、48G7和17D5)分别加入已包被的板中，37℃反应1h，洗板5次，甩干，加入HRP标记的二抗，37℃反应0.5h，洗板5次，甩干。加入化学发光显色底物，立即置于酶标仪(安图实验仪器公司，PHOMO)中进行数据读取。以PBS为阴性对照。

结果如图2所示，四株抗人PD-1鼠源抗体(16F2、10D6、48G7和17D5)均能结合人PD-1蛋白，而不与鼠PD-1蛋白结合。

实施例2：鼠源抗PD-1单克隆抗体的性质鉴定

2.1 FACS法检测PD-1抗体结合活性

FACS法检测PD-1抗体结合活性的原理如图1B所示。

将待检测的U-2OS/PD-1细胞消化，并吹散制成单细胞悬液，离心后用含3％胎牛血清的PBS重悬。细胞悬液经200目的筛网过滤供检测使用，每份细胞样品收集约1×10⁵个细胞。将待检抗体稀释成1μg/mL与上述细胞进行孵育，用FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma公司，货号F9006)及利用流式细胞术在流式细胞仪(BD公司，FACS Aria II)检测PD-1抗体的结合活性。横坐标表示检测细胞的荧光值。

结果如图3所示，四株鼠源的抗人PD-1抗体均与表达PD-1蛋白的U-2OS细胞100％结合。阳性对照为商业化抗人PD-1抗体(eBioscience公司，货号16-9989-82)，FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体为二抗，阴性对照为PBS。

2.2 CLEIA法检测PD-1抗体的阻断活性

CLEIA法检测抗体阻断人PD-1/His和PD-L1/Biotin之间结合能力的作用原理图分别如图1C所示。

将PD-1/Fc蛋白(BPS bioscience公司，货号71106)用CB缓冲液稀释，以100ng/孔包被于辐照过的、不透光的聚苯乙烯96孔板中，封闭液进行封闭后，抽干并于4℃保存备用。将抗PD-1单抗进行梯度稀释，起始浓度60μg/mL，连续3倍稀释七个梯度，即20μg/mL、6.67μg/mL、2.22μg/mL、0.74μg/mL、0.25μg/mL、0.082μg/mL、0.027μg/mL。将稀释成不同梯度的抗PD-1单抗或PBS与100ng/孔生物素化的PD-L1蛋白PD-L1/Biotin(BPS bioscience公司，货号71105)加入已包被的板中，待其充分反应后，将未结合的游离蛋白或抗体洗去，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素streptavidin-HRP(GE公司，货号RPN4401)作为二抗进行反应，将未结合的酶标亲和素洗去后，最终加入化学发光显色底物，通过化学发光仪(Berthod公司，OrionII)读取发光值(RLU,Relative Chemiluminescence Value)。阳性对照为未加抗PD-1单抗，而以PBS代替的检测组。化学发光仪读取的值表示PD-1抗体阻断PD-1与PD-L1之间相互作用的强弱。其中，以RLU值为纵坐标，以抗体浓度的log₁₀为横坐标，绘制反应曲线。同时，通过公式可计算出相应的抗体阻断率，阻断率＝(log₁₀阳性对照-log₁₀反应值)/(log₁₀阳性对照-log₁₀空白对照)。利用PRISM 6软件(GraphPad公司)计算半抑制浓度(或称半抑制率)，即IC₅₀。

结果分别如图4及图5所示。图4显示了鼠单抗阻断人PD-1/His和PD-L1/Biotin之间结合能力的剂量依赖型反应曲线，结果显示，鼠源抗体10D6、48G7、16F2和17D5均能在体外有效阻断PD-1和PD-L1蛋白间的相互结合。图5显示了抗体阻断PD-1和PD-L1蛋白之间相互作用的半抑制率(IC₅₀)，17D5、48G7、16F2、10D6的IC₅₀分别为5.019μg/mL、7.99μg/mL、11.23μg/mL、7.412μg/mL，表明其对PD-1和PD-L1蛋白间的相互结合均具备良好的抑制活性。

实施例3：表面等离子共振法(SPR)检测抗体的抗原亲和活性

利用BIAcoreTM仪器(GE Healthcare公司，型号BIACORE3000)进行抗体的抗原亲和力测定。使用标准伯胺偶联规程产生抗鼠Fc CM5生物传感器芯片(GE Healthcare公司)。以10μl每分钟的流速在抗鼠Fc表面捕捉鼠源抗体1分钟。以30μl每分钟的流速在抗体结合表面注射自3.3nM连续稀释至120nM的PD-1/Fc达3分钟，然后经历10分钟解离阶段。使用EIA评估软件(GE Healthcare公司)一对一郎缪(Langmuir)结合模型计算结合速率(K_a或K_on)及解离速率(K_d或K_off)。以比率K_off/K_on来计算平衡常数(K_D)。结果如下表所示。结果显示，17D5、48G7、16F2、10D6均以高亲和力结合至人PD-1蛋白。

表5：SPR测定结果

抗体	K<sub>D</sub>
		10D6	6.01×10<sup>-11</sup>
48G7	4.00×10<sup>-11</sup>
		16F2	8.00×10<sup>-11</sup>
17D5	5.91×10<sup>-12</sup>

实施例4：鼠源抗PD-1单抗诱导T细胞激活能力的评价

在96孔板中包被100ng每孔的anti-CD3抗体(Biolegend,货号317302)和100ng每孔的CD28抗体(Biolegend,货号302902)，利用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，货号17-1440-02)密度梯度离心法从健康人全血中分离外周血单核PBMC细胞，将10⁴个细胞加入微孔中，刺激2天后，加入5×10⁴的实施例1获得的293T/PD-L1细胞及不同浓度PD-1抗体(即10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.001μg/mL)刺激2-4天，同时，以不加入PD-1抗体的微孔作为control。收集上清液利用人IL-2ELISA检测试剂盒(R&D Systems公司，货号D2050)检定IL-2的分泌水平。

结果如表6及图6所示，与control组相比，10D6、48G7、16F2和17D5处理后IL-2分泌水平均显著增加。这一结果表明10D6、48G7、16F2和17D5均能够明显诱导T细胞活化，增强T细胞免疫应答，从而能够杀伤肿瘤细胞，其中17D5诱导T细胞活化的活性最高(IL-2分泌基线平均值为26.2ng/mL，峰值为1504.9ng/mL)。由此可见，本发明的抗体能够增强免疫细胞活性，刺激免疫应答，从而特别适用于治疗肿瘤或感染。

表6：IL-2的分泌水平测定结果

抗体浓度	Control	10D6	48G7	16F2	17D5
						0.001μg/mL	20.6	22.1	21.5	38.4	11.2
0.01μg/mL	27.1	302.8	182.8	145.6	312.4
						0.1μg/mL	13.7	757.1	708.4	729.0	821.2
1μg/mL	32.4	1225.3	1240.6	1097.4	1494.9
						10μg/mL	37.1	1317.1	1209.9	1144.9	1504.9

实施例5：鼠源抗PD-1单克隆抗体的人源化

将编码小鼠单克隆抗体17D5和48G7的重链和轻链可变区的基因序列分别与编码人抗体的重链和轻链恒定区的基因序列相连接，并在CHO细胞中进行重组表达，从而获得嵌合抗体17D5-cAb和48G7-cAb。并通过1.7中所描述的ELISA法检测不同浓度的嵌合抗体与人PD-1的结合活性，结果如图7所示。结果显示，嵌合抗体17D5-cAb和48G7-cAb保持了良好的针对人PD-1的结合活性。

进一步，为了减少异源抗体施用给人受试者时引起的免疫原性，需要通过CDR移植的方法对小鼠单克隆抗体17D5和48G7进行人源化。在大量的分析和实验的基础上，本发明人以人胚系基因序列IGVH3-23*04(SEQ ID NO：45)及IGKV3-11*01(SEQ ID NO：46)作为接受小鼠单克隆抗体17D5的CDR的人抗体模板，其能够与17D5的重链和轻链CDR良好地匹配，能够最大程度地保留17D5结合抗原的亲和力；以人胚系基因序列IGVH1-2*02(SEQ ID NO：47)及IGKV1-16*01(SEQ ID NO：48)作为接受小鼠单克隆抗体48G7的CDR的人抗体模板，其能够与48G7的重链和轻链CDR良好地匹配，能够最大程度地保留48G7结合抗原的亲和力。上述人胚系基因序列SEQ ID NOs：45-48的具体序列还可见于NCBI，Kabat和GenBank等公共数据库。

将小鼠单克隆抗体17D5和48G7的重链和轻链CDR区分别移植到人源化模板(即，人胚系基因序列IGVH3-23*04(SEQ ID NO：45)及IGKV3-11*01(SEQ ID NO：46)及IGVH1-2*02(SEQ ID NO：47)及IGKV1-16*01(SEQ ID NO：48))的FR框架上。进一步，还结合对序列的分析及以往的人源化经验，对上述人源化模板的FR区氨基酸残基进行了一系列的回复突变，以使人源化抗体尽可能保留鼠源抗体的抗原结合能力。共制备获得2株人源化17D5抗体(分别命名为17D5H1、17D5H2)和2株人源化48G7抗体(分别命名为48G7H1、48G7H2)。

人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2的氨基酸序列示于下表。另外，还通过公式：人源化程度＝(FR区氨基酸个数-FR区保留的鼠源氨基酸个数)/FR区氨基酸个数×100％，计算了17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2的人源化程度，结果显示上述4株人源化抗体的人源化程度分别为96.2％，95.6％，85.0％，84.3％。

表7：人源化抗体的轻重链可变区氨基酸序列

实施例6：人源化PD-1单抗的活性评价

本实施例以商业化抗体为参比抗体，评价人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2的抗原亲和活性、阻断活性及诱导T细胞活化能力。

商业化抗体使用Pembrolizumab和Nivolumab。Pembrolizumab(商品名KEYTRUDA，默克公司)，公开于例如Hamid，O等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2)：134-44，WO2009/114335和US 8,354,509。Pembrolizumab具有例如SEQ ID NO：41所示的重链序列和SEQ ID NO：42所示的轻链序列。Nivolumab(商品名Opdivo，百世施贵宝公司)，公开于例如US8,008,449和WO2006/121168中。Nivolumab具有例如SEQ ID NO：43所示的重链序列和SEQ ID NO：44所示的轻链序列。

6.1 CLEIA法比较人源化抗体与商业化抗体的结合活性

将PD-1/His蛋白(Sino Biological Inc.,货号10377-H08H)用CB缓冲液稀释，以100ng/孔包被于辐照过的、不透光的聚苯乙烯96孔板中，封闭液进行封闭后，抽干并于4℃保存备用。将人源化抗体及参比抗体进行梯度稀释，起始浓度为1μg/mL，连续5倍稀释七个梯度，即0.2μg/mL、0.04μg/mL、0.008μg/mL、0.0016μg/mL、0.00032μg/mL、0.000064μg/mL、0.0000128μg/mL。将稀释成不同梯度的抗PD-1单抗加入已包被的板中，待其充分反应后，将未结合的游离蛋白或抗体洗去，加入HRP标记的GAH二抗，将未结合的酶标抗体洗去后，最终加入化学发光显色底物(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，通过化学发光仪(Berthod公司，OrionII)读取发光值(RLU，Relative Chemiluminescence Value)。利用PRISM 6软件(GraphPad公司)计算半最大效应浓度，即EC₅₀。

结果如图8所示，人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2均能较好的和PD-1蛋白相互结合，相应的ED₅₀值如下表所示。结果显示，与Pembrolizumab相比，人源化抗体17D5H1、17D5H2具有更强的PD-1结合活性，人源化抗体48G7H1、48G7H2的PD-1结合活性与Pembrolizumab相当；与Nivolumab相比，人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2均具有更强的PD-1结合活性。这表明，本发明的人源化抗体可以更低剂量用于抗肿瘤治疗，具有更高的安全性。

表8：人源化抗体的结合活性测定结果

6.2 CLEIA法比较人源化抗体与商业化抗体的阻断活性

通过实施例2中描述的CLEIA法检测四株人源化抗体以及商业化抗体的阻断活性。反应曲线如图9所示，相应的IC₅₀值如下表所示。结果显示，人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2均能显著阻断PD-1和PD-L1蛋白间的相互结合，并且明显优于商业化抗体Pembrolizumab和Nivolumab。这表明，本发明的人源化抗体用于抗肿瘤治疗具有更高的活性。

表9：阻断活性测定结果

6.3 SPR法比较人源化抗体与商业化抗体的抗原亲和活性

通过实施例3中描述的SPR法检测四株人源化抗体以及商业化抗体的抗原亲和活性。结果如下表所示，与默克公司Pembrolizumab相比，人源化抗体17D5H1、17D5H2与PD-1蛋白间的亲和力更强，人源化抗体48G7H1、48G7H2与Pembrolizumab相当；与百世施贵宝公司的Nivolumab相比，人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2与PD-1蛋白间的亲和力更强。这表明，本发明的人源化抗体可以更低剂量用于抗肿瘤治疗，具有更高的安全性。

表10：SPR测定结果

抗体	K<sub>D</sub>
		Pembrolizumab	2.89×10<sup>-11</sup>
Nivolumab	3.55×10<sup>-9</sup>
		17D5H1	5.71×10<sup>-12</sup>
17D5H2	1.34×10<sup>-12</sup>
		48G7H1	3.25×10<sup>-11</sup>
48G7H2	2.91×10<sup>-11</sup>

6.4 IL-2释放检测法比较人源化抗体和商业化抗体的诱导T细胞激活能力

通过实施例4中描述的方法检测四株人源化抗体以及商业化抗体的诱导T细胞激活能力。结果如图10所示，IL-2分泌基线平均值为22.2ng/mL，17D5H1峰值为1515.1ng/mL，17D5H2峰值为1495.5ng/mL，48G7H1峰值为1250.1ng/mL，48G7H2峰值为1296.2ng/mL，Pembrolizumab峰值为1255.8ng/mL，Nivolumab峰值为1163.5ng/mL。由此可见，与默克公司Pembrolizumab相比，人源化抗体17D5H1、17D5H2激活T细胞和促进T细胞增殖能力更强，人源化抗体48G7H1、48G7H2与Pembrolizumab相当；与百世施贵宝公司的Nivolumab相比，人源化抗体17D5H1、17D5H2、48G7H1、48G7H2激活T细胞和促进T细胞增殖能力均更强。这表明，本发明的人源化抗体具有明显优于Pembrolizumab、Nivolumab的活化T细胞的能力，同等剂量下具有更高的抗肿瘤治疗效果。另外，与各自的亲本鼠源抗体17D5、48G7比较可以看出，本发明的人源化抗体基本上保留了亲本抗体的T细胞激活能力。

以上结果表明，本发明的人源化抗体不仅具有较高的人源化程度，能够减少免疫排斥反应的可能性，而且展示出与鼠源抗体相当且优于商业化抗体的抗肿瘤活性。这样的技术效果是显著的和出人意料的。

实施例7：17D5抗体与抗原结合关键氨基酸的确定

为了确定抗体抗原相互作用的关键氨基酸位点，对17D5的6个CDR区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3进行丙氨酸扫描，将各位氨基酸分别点突变为丙氨酸(A)。关键氨基酸往往具有一定的保守性，比如维持抗体构象的氨基酸残基和被包埋的氨基酸残基，这些氨基酸突变成丙氨酸以后会导致抗体失去活性。通过实施例1.7所述的方法检测突变后的抗体与PD-1的结合活性并计算突变后抗体的rEC50(原始抗体测定值/突变抗体测定值，原始抗体EC50相对值为1，完全失去结合活性的用0标示)，并按照rEC50＜0.2(活性下降5倍)，0.2≤rEC50＜0.5(活性下降2～5倍)，0.5≤rEC50＜0.8(活性下降1.25～2倍)，rEC50≥0.8(活性不变)进行分类，结果如表11-12所示。

表11：17D5重链可变区丙氨酸点突变抗体的rEC50

表12：17D5轻链可变区丙氨酸点突变抗体的rEC50

上述结果显示，重链可变区氨基酸G26,F27,S30,D33,I51,G56,R57,T101,D107,Y108点突变为丙氨酸后结合活性基本不变；G52,G55,T58,G100,G102,G104,M106点突变为丙氨酸后结合活性稍有下降；F29,R31,R32点突变为丙氨酸后结合活性下降2～5倍；G53,G54,R98,H99,T103点突变为丙氨酸后结合活性下降程度较大，为5倍以上，认为是不可变位点。轻链可变区氨基酸K27,S28,V29,D30,N31,S55,S95,N96,E97,D98,点突变为丙氨酸后结合活性基本不变；G33,S35,Q94,T100点突变为丙氨酸后结合活性稍有下降；Y32,Y34,R54点突变为丙氨酸后结合活性下降2～5倍；F36,Q93,P99点突变为丙氨酸后结合活性下降程度较大，为5倍以上，认为是不可变位点。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 厦门大学

养生堂有限公司

<120> 抗PD-1抗体及其用途

<130> IDC190229

<150> CN201810801294.6

<151> 2018-07-20

<160> 78

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5重链可变区

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Glu Glu Ile Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5轻链可变区

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ala Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR1

<400> 3

Gly Phe Ala Phe Ser Arg Phe Asp

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR2

<400> 4

Ile Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr

1 5

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR3

<400> 5

Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR1

<400> 6

Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR2

<400> 7

Arg Ser Ala

1

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR3

<400> 8

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr

1 5

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7重链可变区

<400> 9

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Ala Pro Asp Asn Gly Ala Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Val Tyr Tyr Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7轻链可变区

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Thr Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7 HCDR1

<400> 11

Gly Phe Asn Phe Lys Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7 HCDR2

<400> 12

Ile Ala Pro Asp Asn Gly Ala Thr

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7 HCDR3

<400> 13

Asn Ala Val Tyr Tyr Asp Arg Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7 LCDR1

<400> 14

Gln Asn Val Gly Ser Asn

1 5

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7 LCDR2

<400> 15

Ser Ala Ser

1

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7 LCDR3

<400> 16

Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16F2重链可变区

<400> 17

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ile Tyr

20 25 30

Gly Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Asp Tyr Asn Ser Val

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Glu Gly Tyr Gly Tyr Asp Gly Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16F2轻链可变区

<400> 18

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Asn Ser Arg Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ala Pro Lys Arg Trp Ile Ser

35 40 45

Asp Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16F2 HCDR1

<400> 19

Gly Phe Ser Leu Ser Ile Tyr Gly Ile Gly

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16F2 HCDR2

<400> 20

Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys

1 5

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16F2 HCDR3

<400> 21

Ala Arg Ile Glu Gly Tyr Gly Tyr Asp Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16F2 LCDR1

<400> 22

Ser Arg Val Ser Tyr

1 5

<210> 23

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16F2 LCDR2

<400> 23

Asp Thr Ser

1

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16F2 LCDR3

<400> 24

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 25

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10D6重链可变区

<400> 25

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Ser Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Phe Ala Trp Glu Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Cys

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Gly Tyr Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp His Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10D6轻链可变区

<400> 26

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Phe Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Phe Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ile

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Phe

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Met Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Phe Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10D6 HCDR1

<400> 27

Gly Ser Ser Ile Thr Ser Asp Phe Ala

1 5

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10D6 HCDR2

<400> 28

Ile Gly Tyr Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10D6 HCDR3

<400> 29

Ala Arg Trp His Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10D6 LCDR1

<400> 30

Gln Asn Ile Val His Ile Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10D6 LCDR2

<400> 31

Lys Val Ser

1

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10D6 LCDR3

<400> 32

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 33

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5H1重链可变区

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr His Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5H1轻链可变区

<400> 34

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ala Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5H2重链可变区

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr His Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5H2轻链可变区

<400> 36

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ala Asn Leu Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 37

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7H1重链可变区

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Met Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ala Pro Asp Asn Gly Ala Thr Glu Tyr Ala Pro Arg Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Met Thr Pro Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Val Tyr Tyr Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7H1轻链可变区

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 39

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7H2重链可变区

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Met Lys Gln Pro Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ala Pro Asp Asn Gly Ala Thr Glu Tyr Ala Pro Arg Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Val Tyr Tyr Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 48G7H2轻链可变区

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Pembrolizumab重链

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 42

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Pembrolizumab轻链

<400> 42

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 43

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Nivolumab重链

<400> 43

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 44

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Nivolumab轻链

<400> 44

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 45

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人胚系基因序列IGVH3-23*04

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys

<210> 46

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人胚系基因序列IGKV3-11*01

<400> 46

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85

<210> 47

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人胚系基因序列IGVH1-2*02

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 48

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人胚系基因序列IGKV1-16*01

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

85

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR1通式

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> X为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X为任意氨基酸

<400> 49

Xaa Xaa Ala Phe Xaa Arg Phe Xaa

1 5

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR2通式

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> X为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(8)

<223> X为任意氨基酸

<400> 50

Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR3通式

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(6)

<223> X为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(12)

<223> X为任意氨基酸

<400> 51

Ala Arg His Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Ala Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR1通式

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> X为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> X为任意氨基酸

<400> 52

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Tyr Xaa Phe

1 5 10

<210> 53

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR2通式

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X为任意氨基酸

<400> 53

Arg Xaa Ala

1

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR3通式

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(6)

<223> X为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X为任意氨基酸

<400> 54

Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa

1 5

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR1-G26A

<400> 55

Ala Phe Ala Phe Ser Arg Phe Asp

1 5

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR1-F27A

<400> 56

Gly Ala Ala Phe Ser Arg Phe Asp

1 5

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR1-S30A

<400> 57

Gly Phe Ala Phe Ala Arg Phe Asp

1 5

<210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR1-D33A

<400> 58

Gly Phe Ala Phe Ser Arg Phe Ala

1 5

<210> 59

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR2-I51A

<400> 59

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr

1 5

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR2-G56A

<400> 60

Ile Gly Gly Gly Gly Ala Arg Thr

1 5

<210> 61

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR2-R57A

<400> 61

Ile Gly Gly Gly Gly Gly Ala Thr

1 5

<210> 62

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR3-T101A

<400> 62

Ala Arg His Gly Ala Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 63

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR3-D107A

<400> 63

Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Ala Tyr

1 5 10

<210> 64

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 HCDR3-Y108A

<400> 64

Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Asp Ala

1 5 10

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR1-K27A

<400> 65

Ala Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR1-S28A

<400> 66

Lys Ala Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR1-V29A

<400> 67

Lys Ser Ala Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 68

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR1-D30A

<400> 68

Lys Ser Val Ala Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR1-N31A

<400> 69

Lys Ser Val Asp Ala Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 70

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR2-S55A

<400> 70

Arg Ala Ala

1

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR3-S95A

<400> 71

Gln Gln Ala Asn Glu Asp Pro Thr

1 5

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR3-N96A

<400> 72

Gln Gln Ser Ala Glu Asp Pro Thr

1 5

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR3-E97A

<400> 73

Gln Gln Ser Asn Ala Asp Pro Thr

1 5

<210> 74

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 17D5 LCDR3-D98A

<400> 74

Gln Gln Ser Asn Glu Ala Pro Thr

1 5

<210> 75

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 75

accggtatgc agatcccaca ggcgccctgg ccagt 35

<210> 76

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 76

tctagatcag aggggccaag agcagtgtcc atcctcaggc ctc 43

<210> 77

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 77

tagagaattc ggatccatga ggatatttgc tgtctttata ttcatgacct actggc 56

<210> 78

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 78

ccatggctcg agcccgggtt acgtctcctc caaatgtgta tcactttgct tctttg 56

Claims

1.能够特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，其包含：

(1)如SEQ ID NOs:3、55-58任一项所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQ ID NO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；

(2)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NOs:4、59-61任一项所示的VH CDR2；以及，如SEQ ID NO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；

(3)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQ IDNOs:5、62-64任一项所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；

(4)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQ IDNO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NOs:6、65-69任一项所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；

(5)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQ IDNO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7或70所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3；或

(6)如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQ IDNO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NOs:8、71-74任一项所示的VL CDR3。

2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：如SEQ ID NOs:3所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2；以及，如SEQ ID NO:5所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2；以及，如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3。

3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。

4.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含人免疫球蛋白的框架区，所述框架区任选地包含一个或多个从人源残基至鼠源残基的回复突变。

5.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和/或人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区。

6.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：IGVH3-23*04所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和IGKV3-11*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区，所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至鼠源残基的回复突变。

7.权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少95％。

8.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NOs：1、33、35任一项所示的VH，以及SEQ ID NOs：2、34、36任一项所示的VL。

9.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(1)如SEQ ID NO:1所示的VH和如SEQ ID NO:2所示的VL；

(2)如SEQ ID NO:33所示的VH和如SEQ ID NO:34所示的VL；或

(3)如SEQ ID NO:35所示的VH和如SEQ ID NO:36所示的VL。

10.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv片段和双抗体(diabody)；和/或，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。

11.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为IgG抗体。

12.权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述IgG抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。

13.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有标记。

14.权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。

15.权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述可检测的标记是酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素。

16.权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述酶是辣根过氧化物酶。

17.权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述发光物质是化学发光物质。

18.分离的核酸分子，其编码权利要求1-17任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

19.载体，其包含权利要求18所述的核酸分子。

20.权利要求19所述的载体，其中，所述载体为克隆载体或表达载体。

21.宿主细胞，其包含权利要求18所述的核酸分子或权利要求19或20所述的载体。

22.制备权利要求1-17任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求21所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

23.缀合物，其包含权利要求1-17任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂。

24.权利要求23所述的缀合物，其中，所述治疗剂选自细胞毒素或放射性同位素。

25.药物组合物，其含有权利要求1-17任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者权利要求23或24所述的缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

26.权利要求25所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂。

27.权利要求26所述的药物组合物，其中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物。

28.权利要求27所述的药物组合物，其中，所述具有抗肿瘤活性的药物是免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒、化学治疗剂、抗血管生成药物、抗代谢药物、靶向肿瘤药物或免疫刺激剂。

29.权利要求26所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段或所述缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。

30.免疫原性组合物，其含有权利要求1-17任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及免疫原。

31.权利要求30所述的免疫原性组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段用作佐剂。

32.权利要求30所述的免疫原性组合物，其中，所述免疫原选自与肿瘤相关的抗原、肿瘤细胞、由所述抗原致敏的树突状细胞，及其任意组合。

33.权利要求30所述的免疫原性组合物，其中，所述免疫原选自与病原体相关的抗原、灭活或减毒的病原体、由所述抗原致敏的树突状细胞，及其任意组合。

34.权利要求30所述的免疫原性组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段与所述免疫原作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。

35.权利要求1-17任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求23或24所述的缀合物，或权利要求25-29任一项所述的药物组合物，在制备药物中的用途，所述药物用于：

(1)在体外或受试者体内提高免疫细胞活性；

(2)在受试者中增强免疫应答；

(3)在受试者中治疗肿瘤，所述肿瘤选自黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、宫颈癌、甲状腺癌及淋巴瘤；或

(4)在受试者中治疗肿瘤，所述肿瘤是具有微卫星高度不稳定性(MSI-H)和/或错配修复缺陷(dMMR)的肿瘤。

36.权利要求35所述的用途，其中，所述免疫细胞是T细胞；和/或，所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。

37.权利要求35所述的用途，其中，所述受试者为人。

38.权利要求1-17任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于在受试者中增强免疫应答；其中，所述免疫原性组合物包含所述抗体或其抗原结合片段以及免疫原。

39.权利要求38所述的用途，其中，所述受试者为人。