CN113365660A - 对受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)具特异性的抗体及嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)结合分子，特别是对ROR1具特异性的人类抗体，包括抗体片段。本发明进一步关于含有此类抗体或片段的重组受体，包括嵌合抗原受体(CAR)，以及编码对ROR1具特异性的抗体、抗原结合片段或受体的聚核苷酸。本发明进一步关于含有此类ROR1结合蛋白及受体的经基因工程改造的细胞，以及相关方法及其在过继细胞疗法中的用途。

Description

对受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)具特异性的抗体及嵌 合抗原受体
相关申请案的交叉引用
本申请案主张2019年1月29日提交的题为“对受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)具特异性的抗体及嵌合抗原受体(ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORSSPECIFIC FOR RECEPTOR TYROSINE KINASE LIKE ORPHAN RECEPTOR 1(ROR1))”的美国临时申请案第62/798,456号的优先权，该案内容以全文引用的方式并入。
序列表以引用的方式并入
本申请案与电子格式的序列表一起提交。序列表以2020年1月28日创建的名为735042017740SeqList.txt的文件提供，其大小225千字节。呈电子格式的序列表中的信息以全文引用的方式并入。
【技术领域】
在一些方面中，本发明关于受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)结合分子，特别是对ROR1具特异性的人类抗体，包括抗体片段。本发明进一步关于含有此类抗体或片段的重组受体，包括嵌合抗原受体(CAR)，以及编码对ROR1具特异性的抗体、抗原结合片段或受体的聚核苷酸。本发明进一步关于含有此类ROR1结合蛋白及受体的经基因工程改造的细胞，以及相关方法及其在过继细胞疗法中的用途。
【背景技术】
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)在胚胎发生期间表达，但通常不在正常成体细胞上表达的跨膜受体。然而，ROR1在多种不同癌症环境中表达，且在一些情况下，其参与促进肿瘤细胞存活的细胞信号传导。基于ROR1的表达，其可作为疗法的肿瘤特异性及/或肿瘤相关性靶点。ROR1结合分子、受体及表达此类分子的细胞是可获得的。需要的是改良的ROR1结合分子及经工程改造的表达ROR1结合受体的细胞。本发明提供满足此类需求的实施方案。
【发明内容】
本文中提供一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其含有：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：(i)该VH区包括含SEQ ID NO:67、82或52中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、含SEQ ID NO:71、86、56或97中所示的序列的重链互补决定区2(CDR-H2)及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含SEQID NO:75、90或60中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；或(ii)该VH区包括含SEQ ID NO:65、80或50中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:69、84、54或95中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的CDR-L1、含SEQID NO:77、92或62中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3；或(iii)该VH区包括含SEQ ID NO:66、81或51中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:70、85、55或96中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的CDR-L2；及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3；或(iv)该VH区包括含SEQ ID NO:68、83或53中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:72、87、57或98中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:74、89、59或100中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQID NO:76、91或61中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:78、93或63中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3。
本文中还提供一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其含有：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：(i)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、56及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、97及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(ii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:65、69及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:80、84及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:50、54及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:50、95及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(iii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:66、70及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:81、85及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:51、55及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:51、96及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(iv)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:68、72及74中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:76、78及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:83、87及89中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:91、93及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:53、57及59中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、63及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:53、98及100中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:61、63及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在任何此类实施方案中的一些中：(i)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(ii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:65、69及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(iii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:66、70及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或(iv)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:68、72及74中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:76、78及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在任何此类实施方案中的一些中：(i)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(ii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:80、84及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(iii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:81、85及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或(iv)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:83、87及89中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:91、93及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3.
在任何实施方案中的一些中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何实施方案中的一些中，该VH区包括含分别如SEQ IDNO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ IDNO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、56及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、97及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
本文中还提供一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其含有：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：该VH区含有SEQ ID NO:112、121、103或130内所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区含有SEQ IDNO:115、124或106内所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)。
本文中还提供一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其含有：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：该VH区含有SEQ ID NO:112内所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区含有SEQ ID NO:115内所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；该VH区含有SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区含有SEQ ID NO:103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区含有SEQID NO:130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区含有SEQ ID NO:112内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO 115内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区含有SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何实施方案中的一些中，该VH区包含SEQ ID NO:103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何实施方案中的一些中，该VH区包含SEQ IDNO:130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:112、121、103或130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115、124或106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或含有与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或含有与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或该VH区为或含有与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何实施方案中的一些中，该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何实施方案中的一些中，该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
本文中还提供一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其含有：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：该VH区为或含有与SEQ ID NO:112、121、103或130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115、124或106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
本文中还提供一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其含有：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：该VH区为或含有与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或含有与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或含有与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或该VH区为或含有与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中：该VH区为或含有SEQ ID NO:112、121、103或130中所示的序列，且该VL区为或含有SEQ ID NO:115、124或106中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中：该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ IDNO:130及106中所示的序列。
本文中还提供一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其含有：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：该VH区为或含有SEQ ID NO:112、121、103或130中所示的序列，且该VL区为或含有SEQ ID NO:115、124或106中所示的序列。
本文中还提供一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其含有：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ IDNO:130及106中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区及该VL区为或含有分别如SEQID NO:121及124中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:110、119、101或128，或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:113、122或104，或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:111、120、102或129编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:114、123、105或131编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:110或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:113或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:111编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQID NO:114编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ IDNO:119或与SEQ ID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:122或与SEQ ID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:120编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:123编码的氨基酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该抗体为全长抗体。在任何实施方案中的一些中，该抗体为抗原结合片段。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段为经分离的。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段为重组的。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区及该VL区的至少一部分为人类的或来自人类蛋白质。在任何此类实施方案中的一些中，该其抗原结合片段为或含有单链片段。在任何此类实施方案中的一些中，该其抗原结合片段为或含有单链Fv(scFv)。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区在该VL区的氨基末端。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区在该VL区的羧基末端。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区与该VL区通过可挠性接头接合。在任何此类实施方案中的一些中，该可挠性接头含有SEQ IDNO:41中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有SEQ ID NO:118、127、109或134中所示的序列，或与SEQ ID NO:118、127、109或134具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有SEQ ID NO:118中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有SEQ ID NO:127中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该scFv为或包含SEQ ID NO:109中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该scFv为或包含SEQ ID NO:134中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:116、125、107或132，或与SEQ ID NO:116、125、107或132具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:117、126、108或133编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:116或与SEQ ID NO:116具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:117编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:125或与SEQ ID NO:125具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:126编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或片段进一步含有免疫球蛋白恒定区或其变体的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，免疫球蛋白恒定区的该部分含有铰链区或其变体的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，免疫球蛋白恒定区或其变体的该至少一部分含有CH2区或其变体的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，免疫球蛋白恒定区或其变体的该至少一部分含有CH3区或其变体的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，免疫球蛋白恒定区或其变体的该至少一部分含有CH2区及/或CH3区或其变体的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，免疫球蛋白恒定区或其变体的该至少一部分为人类的或来自人类蛋白质或其变体。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段特异性结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白质。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段特异性结合至人类ROR1蛋白质。在任何此类实施方案中的一些中，该人类ROR1蛋白质含有SEQ ID NO:144、145或146中所示的氨基酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段特异性结合至由SEQ ID NO:199中所示的序列组成的抗原决定基或SEQ ID NO:199中所示的序列内存在的抗原决定基。在任何实施方案中的一些中，该抗体或其抗原结合片段进一步结合至由选自SEQ ID NO:200-214中的任一个的序列组成的一或多个抗原决定基或选自SEQ ID NO:200-214中的任一个的序列内存在的抗原决定基。在任何实施方案中的一些中，该一或多个抗原决定基包含构形抗原决定基。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段不结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质，不与其交叉反应，或以较低水平或程度或亲和力与其结合。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段不结合至人类ROR2蛋白质，不与其交叉反应，或以较低水平或程度或亲和力与其结合。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段与人类ROR2的结合的范围、水平或程度或亲和力比与人类ROR1蛋白质的结合的范围、水平或程度或亲和力低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。
在任何实施方案中的一些中，该抗体或其抗原结合片段以约1×10-11M至约1×10- 7M的平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质。在任何实施方案中的一些中，该抗体或其抗原结合片段以约1×10-8M至约1×10-7M的平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质。在任何实施方案中的一些中，该抗体或其抗原结合片段以约5×10-11M至约1×10-10M的平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质。
在任何实施方案中的一些中，该抗体或其抗原结合片段以约1×10-5 1/s至约1×10-2 1/s的解离速率常数(kd或koff)结合至人类ROR1蛋白质。在任何实施方案中的一些中，该抗体或其抗原结合片段以约1×10-3 1/s至约1×10-2 1/s的解离速率常数(kd或koff)结合至人类ROR1蛋白质。在任何实施方案中的一些中，该抗体或其抗原结合片段以约1×10-5 1/s至约1×10-4 1/s的解离速率常数(kd或koff)结合至人类ROR1蛋白质。
本文还提供一种单链细胞表面蛋白质，其含有本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段。
本文还提供一种偶联物，其含有本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段及异源分子或部分。在任何此类实施方案中的一些中，该异源分子或部分为治疗部分。
本文还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包括含本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段的细胞外抗原结合结构域及细胞内信号传导区。
本文还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包括含本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段的细胞外抗原结合结构域、跨膜区及细胞内信号传导区。
本文还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其含有：含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：(i)该VH区包括含SEQ IDNO:67、82或52中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、含SEQ ID NO:71、86、56或97中所示的序列的重链互补决定区2(CDR-H2)及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；或(ii)该VH区包括含SEQ ID NO:65、80或50中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:69、84、54或95中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ IDNO:75、90或60中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3；或(iii)该VH区包括含SEQ ID NO:66、81或51中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:70、85、55或96中所示的序列的CDR-H2及含SEQID NO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3；或(iv)该VH区包括含SEQ ID NO:68、83或53中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:72、87、57或98中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:74、89、59或100中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:76、91或61中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:78、93或63中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3。
本文中还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其含有：含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：(i)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、56及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、97及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(ii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:65、69及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:80、84及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:50、54及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:50、95及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(iii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:66、70及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQID NO:81、85及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ IDNO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:51、55及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:51、96及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(iv)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:68、72及74中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:76、78及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:83、87及89中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:91、93及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:53、57及59中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、63及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:53、98及100中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:61、63及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在任何此类实施方案中的一些中：(i)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(ii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:65、69及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(iii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:66、70及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或(iv)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:68、72及74中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:76、78及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在任何此类实施方案中的一些中：(i)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(ii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:80、84及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(iii)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:81、85及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或(iv)该VH区包括含分别如SEQ ID NO:83、87及89中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:91、93及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
本文中还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其含有：含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：该VH区含有SEQ ID NO:112、121、103或130内所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区含有SEQ ID NO:115、124或106内所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)。
本文中还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其含有：含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：该VH区含有SEQ ID NO:112内所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区含有SEQ ID NO:115内所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；该VH区含有SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区含有SEQ ID NO:103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区含有SEQ ID NO:130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区含有SEQ ID NO:112内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO 115内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区含有SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区含有SEQ ID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在任何此类实施方案中的一些中：该VH区为或含有与SEQ ID NO:112、121、103或130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115、124或106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中：该VH区为或含有与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或含有与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或含有与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或该VH区为或含有与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
本文中还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其含有：含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：该VH区为或含有与SEQID NO:112、121、103或130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115、124或106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
本文中还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其含有：含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：该VH区为或含有与SEQID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或含有与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或含有与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或该VH区为或含有与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或含有与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中：该VH区为或含有SEQ ID NO:112、121、103或130中所示的序列，且该VL区为或含有SEQ ID NO:115、124或106中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中：该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
本文中还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其含有：含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：该VH区为或含有SEQ IDNO:112、121、103或130中所示的序列，且该VL区为或含有SEQ ID NO:115、124或106中所示的序列。
本文中还提供一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其含有：含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区及该VL区为或含有分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区及该VL区为或含有分别如SEQID NO:121及124中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:110、119、101或128，或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:113、122或104，或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:111、120、102或129编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:114、123、105或131编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:110或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:113或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:111编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQID NO:114编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ IDNO:119或与SEQ ID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:122或与SEQ ID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区为或含有由SEQ ID NO:120编码的氨基酸序列，且该VL区为或含有由SEQ ID NO:123编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段为经分离的。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段为重组的。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区及该VL区的至少一部分为人类的或来自人类蛋白质。
在任何此类实施方案中的一些中，该其抗原结合片段为或含有单链片段。在任何此类实施方案中的一些中，该其抗原结合片段为或含有单链Fv(scFv)。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区在该VL区的氨基末端。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区在该VL区的羧基末端。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区与该VL区通过可挠性接头接合。在任何此类实施方案中的一些中，该可挠性接头含有SEQ IDNO:41中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有SEQ ID NO:118、127、109或134中所示的序列，或与SEQ ID NO:118、127、109或134具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有SEQ ID NO:118中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有SEQ ID NO:127中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:116、125、107或132，或与SEQ IDNO:116、125、107或132具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:117、126、108或133编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQID NO:116或与SEQ ID NO:116具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:117编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:125或与SEQ ID NO:125具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该scFv为或含有由SEQ ID NO:126编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体进一步在细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间含有间隔子。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子含有免疫球蛋白或其变体的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子含有免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子的长度小于或小于约15个氨基酸。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有与SEQID NO:1、26、27、29、31、32、33或135具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，铰链区的至少一部分含有IgG4铰链区的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，铰链区的至少一部分含有人类IgG4铰链区或其变体的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，铰链区的至少一部分含有IgG2铰链区的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，铰链区的至少一部分含有人类IgG2铰链区或其变体的全部或一部分。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ ID NO:1中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:2或30，或与SEQ ID NO:2或30具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:30编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ ID NO:135中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:192或136，或与SEQID NO:192或136具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:136编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子含有免疫球蛋白或其变体的CH3区的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，CH3区的至少一部分含有IgG4 CH3的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，CH3区的至少一部分含有IgG2 CH3的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，CH3区的至少一部分含有IgG4 CH3及/或IgG2 CH3的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，该IgG4 CH3为人类IgG4 CH3且该IgG2 CH3为人类IgG2 CH3。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子含有免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分及CH3区的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子的长度为或为约111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个氨基酸，或其长度在前述任何值之间。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子的长度或约120个氨基酸。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有与SEQ ID NO:138具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ IDNO:138中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:193或139，或与SEQ ID NO:193或139具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQID NO:139编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子的长度为或为约120个氨基酸。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有与SEQ ID NO:3具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ ID NO:3中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:4或137，或与SEQID NO:4或137具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:137编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子含有免疫球蛋白或其变体的CH2的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，CH2区的至少一部分含有IgG4 CH2的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，CH2区的至少一部分含有IgG2 CH2的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，CH2区的至少一部分含有IgG4 CH2及/或IgG2 CH2的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，该IgG4 CH2为人类IgG4 CH2且该IgG2CH2为人类IgG2 CH2。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子含有免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分、CH2的至少一部分及CH3区的至少一部分。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子的长度为或为约130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229或230个氨基酸，或其长度在前述任何值之间。在任何此类实施方案中的一些中，该铰链区、该CH2区及该CH3区中的一或多个含有来自人类IgG4的CH2区的全部或一部分及CH3区的全部或一部分。在任何此类实施方案中的一些中，该铰链区、该CH2区及该CH3区中的一或多个为嵌合的且含有来自人类IgG4及人类IgG2的铰链、CH2区及CH3区。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子含有IgG4/2嵌合铰链区或相较于人类IgG4铰链含有至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链区；IgG2/4嵌合CH2区；以及IgG4CH3区。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有与SEQ ID NO:194具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ IDNO:194中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:195或196，或与SEQ ID NO:195或196具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQID NO:196编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有与SEQ ID NO:37具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ IDNO:37中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:38或140，或与SEQ ID NO:38或140具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQID NO:140编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该细胞内信号传导区含有细胞内信号传导结构域。在任何此类实施方案中的一些中，该细胞内信号传导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，为T细胞受体(TCR)组分或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在任何此类实施方案中的一些中，该细胞内信号传导结构域为或含有CD3-ζ(CD3ζ)链或其功能变体或信号传导部分的细胞质信号传导结构域。在任何此类实施方案中的一些中，该细胞内信号传导结构域为人类的或来自人类蛋白质。在任何此类实施方案中的一些中，该细胞内信号传导结构域为或含有SEQ ID NO:13、14或15中所示的序列，或与SEQ ID NO:13、14或15具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该细胞内信号传导结构域为或含有SEQ ID NO:13中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该细胞内信号传导区进一步含有共刺激信号传导区。在任何此类实施方案中的一些中，共刺激信号传导区含有T细胞共刺激分子或其信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在任何此类实施方案中的一些中，共刺激信号传导区含有CD28、4-1BB或ICOS或其信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在任何此类实施方案中的一些中，共刺激信号传导区为人类的或来自人类蛋白质。在任何此类实施方案中的一些中，共刺激信号传导区含有CD28的细胞内信号传导结构域。在任何此类实施方案中的一些中，共刺激信号传导区为或含有SEQ ID NO:10中所示的序列或与SEQ ID NO:10具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，共刺激信号传导区含有4-1BB的细胞内信号传导结构域。在任何此类实施方案中的一些中，共刺激信号传导区为或含有SEQ ID NO:12中所示的序列或与SEQ ID NO:12具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体进一步含有跨膜区。在任何此类实施方案中的一些中，共刺激信号传导区在跨膜区与细胞内信号传导结构域之间。在任何此类实施方案中的一些中，跨膜区为或含有来自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域。在任何此类实施方案中的一些中，跨膜区为或含有来自CD28的跨膜结构域。在任何此类实施方案中的一些中，跨膜区为人类的或来自人类蛋白质。
在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有SEQ ID NO:8或与SEQID NO:8具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有SEQ IDNO:8中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有由SEQ IDNO:197或198，或与SEQ ID NO:197或198具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有由SEQ ID NO:198编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有SEQ ID NO:149或与SEQID NO:149具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有SEQ IDNO:149中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有由SEQ IDNO:147或148，或与SEQ ID NO:147或148具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有由SEQ ID NO:148编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序含有：细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜区及细胞内信号传导区。在任何此类实施方案中的一些中，编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序含有：含scFv的细胞外抗原结合结构域；含修饰的IgG4铰链的间隔子；跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。在任何此类实施方案中的一些中，编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序含有：含scFv的细胞外抗原结合结构域；含修饰的IgG4铰链的间隔子，该IgG4铰链含有SEQ ID NO:135中所示的序列；来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区，该共刺激信号传导区含有4-1BB的细胞内信号传导结构域。在任何此类实施方案中的一些中，编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序含有：含scFv的细胞外抗原结合结构域；含经修饰的IgG4铰链CH3的间隔子；跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。在任何此类实施方案中的一些中，编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序含有：含scFv的细胞外抗原结合结构域；含经修饰的IgG4铰链-CH3的间隔子，该IgG4铰链-CH3含有SEQ ID NO:138中所示的序列；来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区，该共刺激信号传导区含有4-1BB的细胞内信号传导结构域。在任何此类实施方案中的一些中，该细胞外抗原结合结构域为scFv。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或含有SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列，或与SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或含有SEQ ID NO:184中所示的序列或与SEQ ID NO:184中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或含有SEQ ID NO:184中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或含有SEQ ID NO:185中所示的序列或与SEQ ID NO:185中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或含有SEQ ID NO:185中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:186中所示的序列或与SEQ IDNO:186中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:186中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:187中所示的序列或与SEQ ID NO:187中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQID NO:187中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:188中所示的序列或与SEQ ID NO:188中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:188中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:189中所示的序列或与SEQ ID NO:189中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:189中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列或与SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列编码。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:156中所示的序列或与SEQ ID NO:156中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列编码。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:156中所示的序列编码。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:157中所示的序列或与SEQ IDNO:157中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列编码。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:157中所示的序列编码。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体特异性结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白质。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体特异性结合至人类ROR1蛋白质。在任何此类实施方案中的一些中，该人类ROR1蛋白质含有SEQ ID NO:144、145或146中所示的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体不结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质，不与其交叉反应或以较低水平或程度或亲和力与其结合。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体不结合至人类ROR2，不与其交叉反应或以较低水平或程度或亲和力与其结合。
在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体与人类ROR2的结合的范围、水平或程度或亲和力比与人类ROR1的结合的范围、水平或程度或亲和力低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。在任何此类实施方案中的一些中，结合是在相同或实质上相同的条件或分析下比较。在任何此类实施方案中的一些中，相较于在ROR1蛋白质存在下信号传导或活性的水平或程度，该抗ROR1嵌合抗原受体在ROR2蛋白质存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。在任何此类实施方案中的一些中，相较于在人类ROR1蛋白质存在下信号传导或活性的水平或程度，该抗ROR1嵌合抗原受体在人类ROR2蛋白质存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。在任何此类实施方案中的一些中，活性是在相同或实质上相同的条件或分析下比较。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体在人类ROR2存在下展现的信号传导或活性的水平或程度比在人类ROR1存在下信号传导或活性的水平或程度低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。在任何此类实施方案中的一些中，活性在相同或实质上相同的条件或分析下比较。
在任何此类实施方案中的一些中，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体，该抗ROR1嵌合抗原受体在ROR2蛋白质存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。在任何此类实施方案中的一些中，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体，该抗ROR1嵌合抗原受体在人类ROR2存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。在任何实施方案中的一些中，活性在相同或实质上相同的条件或分析下比较。
在任何此类实施方案中的一些中，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体，该抗ROR1嵌合抗原受体在ROR2蛋白质存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。在任何此类实施方案中的一些中，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体，该抗ROR1嵌合抗原受体在人类ROR2蛋白质存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。在任何此类实施方案中的一些中，活性是在相同或实质上相同的条件或分析下比较。在任何此类实施方案中的一些中，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体，该抗ROR1嵌合抗原受体展现相同、实质上相同或较高的抗原特异性信号传导或抗原依赖性活性或信号传导。在任何此类实施方案中的一些中，活性是在相同或实质上相同的条件或分析下比较。在任何此类实施方案中的一些中，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体，该抗ROR1嵌合抗原受体展现相同、实质上相同或较低的信号传导或非抗原依赖性活性或信号传导。在任何此类实施方案中的一些中，活性是在相同或实质上相同的条件或分析下比较。在任何此类实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体展现的持续性(tonic)信号传导或非抗原依赖性活性或信号传导的水平或程度比参考ROR1特异性嵌合抗原受体的持续性信号传导或非抗原依赖性活性的水平或程度低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。在任何此类实施方案中的一些中，活性在相同或实质上相同的条件或分析下比较。
在任何此类实施方案中的一些中，该参考ROR1特异性嵌合抗原受体含有抗ROR1抗体R12或抗ROR1抗体2A2或其抗原结合片段。在任何此类实施方案中的一些中，该参考ROR1特异性嵌合抗原受体含有来自R12或2A2的scFv。在任何此类实施方案中的一些中，该参考ROR1特异性嵌合抗原受体含有抗ROR1抗体R12或来自R12或2A2的scFv。
本文还提供一种聚核苷酸，其含有编码本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合结构域的全部或一部分、本文所提供的任何实施方案的单链细胞表面蛋白质、本文所提供的任何实施方案的偶联物或本文所提供的任何实施方案的抗ROR1嵌合抗原受体的核酸。
在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其含有SEQ IDNO:110、119、101或128中所示的序列或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其含有SEQ ID NO:113、122或104中所示的序列或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其含有SEQ ID NO:110中所示的序列或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其含有SEQ ID NO:113中所示的序列或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其含有SEQ IDNO:119中所示的序列或与SEQ ID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其含有SEQ ID NO:122中所示的序列或与SEQ ID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其含有SEQID NO:116、125、107或132中所示的序列或与SEQ ID NO:116、125、107或132具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其含有SEQ ID NO:116中所示的序列或与SEQ ID NO:116具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其含有SEQ ID NO:125中所示的序列或与SEQID NO:125具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码间隔子的核酸，其含有SEQID NO:192中所示的序列或与SEQ ID NO:192具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码间隔子的核酸，其含有SEQ ID NO:193中所示的序列或与SEQ ID NO:193具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码间隔子的核酸，其含有SEQ ID NO:195中所示的序列或与SEQ ID NO:195具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，编码该抗ROR1抗体或其抗原结合结构域、该单链细胞表面蛋白质、该偶联物或该抗ROR1嵌合抗原受体的核酸含有至少一个经修饰的剪接供体或剪接受体位点或两者，该经修饰的剪接供体及/或受体位点含有对应于参考剪接供体位点及/或参考剪接受体位点的一或多个核苷酸修饰。在任何此类实施方案中的一些中，该一或多个核苷酸修饰含有核酸取代。在任何此类实施方案中的一些中，该参考剪接供体及/或参考剪接受体位点为典型、非典型或隐蔽的剪接位点。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸通过剪接位点消除进行优化。
在任何此类实施方案中的一些中：参考剪接供体或参考剪接受体位点或两者的剪接位点预测得分至少或至少约0.4、0.5、0.6、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.99或1.0分；或参考剪接供体或参考剪接受体位点或两者参与剪接事件的机率预测为至少或至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
在任何此类实施方案中的一些中：参考剪接供体或参考剪接受体位点或两者的剪接位点预测得分至少或至少约0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.99或1.0分；及/或参考剪接供体或参考剪接受体位点或两者参与剪接事件的机率预测为至少或至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
在任何此类实施方案中的一些中，该一或多个核苷酸修饰中的至少一个在参考剪接受体及/或参考剪接供体位点的剪接位点接合处(junction)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基内。在任何此类实施方案中的一些中，该一或多个核苷酸修饰是沉默的，或产生简并密码子，或不改变所编码蛋白质的氨基酸序列，或前述一或多个或全部。
在任何此类实施方案中的一些中，当在细胞中表达聚核苷酸时，自该聚核苷酸转录的RNA展现至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的RNA同质性。在任何此类实施方案中的一些中，当在细胞中表达时，自该聚核苷酸转录的RNA展现相较于自参考聚核苷酸转录的mRNA的异质性减小的异质性，该参考聚核苷酸编码与该聚核苷酸相同的氨基酸序列，其中该参考聚核苷酸相较于该聚核苷酸的不同之处在于，在编码间隔子的核酸中存在一或多个剪接供体位点、或一或多个剪接受体位点、或两者，或含有一或多个核苷酸修饰。在任何此类实施方案中的一些中，RNA异质性减小大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％或更高百分比。在任何此类实施方案中的一些中，自该参考聚核苷酸转录的RNA展现大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％或更高百分比的RNA异质性。在任何此类实施方案中的一些中，转录的RNA为信使RNA(mRNA)。在任何此类实施方案中的一些中，RNA同质性或异质性或两者通过琼脂糖凝胶电泳、基于芯片的毛细电泳、分析型超速离心、场流动分级分离或液相层析测定。
在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸针对在人类细胞中表达进行密码子优化。
在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其含有SEQ IDNO:111、120、102或129中所示的序列；及编码VL的核酸，其含有SEQ ID NO:114、123、105或131中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其含有SEQ ID NO:111中所示的序列；及编码VL的核酸，其含有SEQ ID NO:114中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其含有SEQ ID NO:120中所示的序列；及编码VL的核酸，其含有SEQ ID NO:123中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其含有SEQID NO:117、126、108或133中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其含有SEQ ID NO:117中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其含有SEQ ID NO:126中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码的间隔子核酸，其含有SEQID NO:136中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码间隔子的核酸，其含有SEQ ID NO:139中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码间隔子的核酸，其含有SEQ ID NO:196中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，所述聚核苷酸含有SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列，或与SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:156中所示的序列或与SEQ ID NO:156中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:156中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:157中所示的序列或与SEQ ID NO:157中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ IDNO:157中所示的序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸进一步含有CD33信号序列、GM-CSF信号序列、CD8信号序列或Igκ信号序列。在任何此类实施方案中的一些中，该聚核苷酸进一步含有CD33信号序列。在任何此类实施方案中的一些中，该CD33信号序列如SEQ ID NO:190中所示或与SEQ ID NO:190具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
本文还提供一种载体，其含有本文所提供的任何实施方案的聚核苷酸。在一些实施方案中，该载体为病毒载体。在一些实施方案中，该病毒载体为反转录病毒载体或慢病毒载体。
本文还提供一种细胞，其含有本文所提供的任何实施方案的抗ROR1嵌合抗原受体。本文还提供一种细胞，其含有本文所提供的任何实施方案的聚核苷酸或本文所提供的任何实施方案的载体。本文还提供一种细胞，其含有本文所提供的实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、本文所提供的任何实施方案的偶联物、本文所提供的任何实施方案的单链细胞表面蛋白质、本文所提供的任何实施方案的抗ROR1嵌合抗原受体、本文所提供的任何实施方案的聚核苷酸或本文所提供的任何实施方案的载体。
在一些实施方案中，该细胞为淋巴细胞。在一些实施方案中，该细胞为NK细胞或T细胞。在任何此类实施方案中的一些中，该细胞为T细胞且该T细胞为CD4+或CD8+T细胞。在任何此类实施方案中的一些中，该细胞为获自受试者的初代细胞。
在任何此类实施方案中的一些中，在复数个细胞中，该复数个中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％、或小于或小于约1％的细胞含有展现持续性信号传导或非抗原依赖性活性或信号传导的抗ROR1嵌合抗原受体。
本文还提供一种组合物，其含有本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、本文所提供的任何实施方案的偶联物、本文所提供的任何实施方案的单链细胞表面蛋白质或本文所提供的任何实施方案的抗ROR1嵌合抗原受体。
本文还提供一种组合物，其含有本文所提供的任何实施方案的细胞。在任何此类实施方案中的一些中，该组合物进一步含有医药学上可接受的赋形剂。在任何此类实施方案中的一些中，该组合物含有CD4+及CD8+T细胞且CD4+与CD8+T细胞的比率为从或从约1:3至3:1。在任何此类实施方案中的一些中，该组合物含有CD4+及CD8+T细胞且CD4+与CD8+T细胞的比率为或约为1:2至2:1。在任何此类实施方案中的一些中，该组合物含有CD4+及CD8+T细胞且CD4+与CD8+T细胞的比率为或约为1:1。
在任何此类实施方案中的一些中，在该组合物中的复数个细胞中，该复数个中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％、或小于或小于约1％的细胞含有展现持续性信号传导或非抗原依赖性活性或信号传导的抗ROR1嵌合抗原受体。
本文还提供一种治疗方法，其含有向患有与ROR1相关的疾病或病症的受试者给予本文所提供的任何实施方案的组合物。
本文还提供一种治疗方法，其含有向患有与ROR1相关的疾病或病症的受试者给予本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、本文所提供的任何实施方案的偶联物、本文所提供的任何实施方案的单链细胞表面蛋白质、本文所提供的任何实施方案的抗ROR1嵌合抗原受体、本文所提供的任何实施方案的聚核苷酸、本文所提供的任何实施方案的载体或本文所提供的任何实施方案的细胞。本文还提供本文所提供的任何实施方案的组合物，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。本文还提供本文所提供的任何实施方案的组合物的用途，其用于制造供治疗与ROR1相关的疾病或病症用的药物。本文还提供本文所提供的任何实施方案的组合物的用途，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。本文还提供一种治疗方法，其含有向患有与ROR1相关的疾病或病症的受试者给予本文所提供的任何实施方案的细胞。
本文还提供一种治疗方法，其含有向患有与ROR1相关的疾病或病症的受试者给予本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、本文所提供的任何实施方案的偶联物、本文所提供的任何实施方案的单链细胞表面蛋白质、本文所提供的任何实施方案的抗ROR1嵌合抗原受体、本文所提供的任何实施方案的聚核苷酸、本文所提供的任何实施方案的载体或本文所提供的任何实施方案的细胞。本文还提供本文所提供的任何实施方案的细胞，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。本文还提供本文所提供的任何实施方案的细胞的用途，其用于制造供治疗与ROR1相关的疾病或病症用的药物。本文还提供本文所提供的任何实施方案的细胞的用途，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该与ROR1相关的疾病或病症为癌症。在任何所提供的实施方案中的一些中，该癌症为表达ROR1的癌症。在任何所提供的实施方案中的一些中，该癌症与表达ROR1的实体肿瘤或表达ROR-1的恶性血液病相关。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该癌症与表达ROR1的实体肿瘤相关。在任何所提供的实施方案中的一些中，该与实体肿瘤相关的癌症选自由以下组成的组：神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。在任何所提供的实施方案中的一些中，该肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌瘤及非典型性类癌。在任何所提供的实施方案中的一些中，该肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。在任何所提供的实施方案中的一些中，该乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该癌症与表达ROR1的恶性血液病相关。在任何所提供的实施方案中的一些中，该恶性血液病选自由以下组成的组：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's Lymphoma)或套细胞淋巴瘤(MCL)。
在本文所提供的方法的一些实施方案中，该与ROR1相关的疾病或病症为癌症。在本文所提供的方法的一些实施方案中，该癌症为表达ROR1的癌症。在本文所提供的方法的一些实施方案中，该癌症与表达ROR1的实体肿瘤或表达ROR-1的恶性血液病相关。
在本文所提供的方法的一些实施方案中，该癌症与表达ROR1的实体肿瘤相关。在本文所提供的方法的一些实施方案中，该与实体肿瘤相关的癌症选自由以下组成的组：神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。在本文所提供的方法的一些实施方案中，该肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌瘤及非典型性类癌。在本文所提供的方法的一些实施方案中，该肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。在本文所提供的方法的一些实施方案中，该乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。
在本文所提供的方法的一些实施方案中，该癌症与表达ROR1的恶性血液病相关。在本文所提供的方法的一些实施方案中，该恶性血液病选自由以下组成的组：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤或套细胞淋巴瘤(MCL)。
在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该与ROR1相关的疾病或病症为癌症。在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该癌症为表达ROR1的癌症。在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该癌症与表达ROR1的实体肿瘤或表达ROR-1的恶性血液病相关。
在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该癌症与表达ROR1的实体肿瘤相关。在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该与实体肿瘤相关的癌症选自由以下组成的组：神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌瘤及非典型性类癌。在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。
在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该癌症与表达ROR1的恶性血液病相关。在本文所提供的供使用的细胞或组合物的一些实施方案中，该恶性血液病选自由以下组成的组：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤或套细胞淋巴瘤(MCL)。
在本文所提供的用途的一些实施方案中，该与ROR1相关的疾病或病症为癌症。在本文所提供的用途的一些实施方案中，该癌症为表达ROR1的癌症。在本文所提供的用途的一些实施方案中，该癌症与表达ROR1的实体肿瘤或表达ROR-1的恶性血液病相关。
在本文所提供的用途的一些实施方案中，该癌症与表达ROR1的实体肿瘤相关。在本文所提供的用途的一些实施方案中，该与实体肿瘤相关的癌症选自由以下组成的组：神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。在本文所提供的用途的一些实施方案中，该肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。在本文所提供的用途的一些实施方案中，该乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。
在本文所提供的用途的一些实施方案中，该癌症与表达ROR1的恶性血液病相关。在本文所提供的用途的一些实施方案中，该恶性血液病选自由以下组成的组：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤或套细胞淋巴瘤(MCL)。
在任何此类实施方案中的一些中，该与ROR1相关的疾病或病症与ROR1表达相关。在任何此类实施方案中的一些中，该与ROR1相关的疾病或病症为B细胞相关病症。在任何此类实施方案中的一些中，该与ROR1相关的疾病或病症为癌症。在任何此类实施方案中的一些中，该癌症为表达ROR1的癌症。在任何此类实施方案中的一些中，该表达ROR1的癌症选自由以下组成的组：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。
本文还提供一种试剂盒，其含有本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、本文所提供的任何实施方案的单链细胞表面蛋白质、本文所提供的任何实施方案的偶联物、本文所提供的任何实施方案的抗ROR1嵌合抗原受体、本文所提供的任何实施方案的细胞或本文所提供的任何实施方案的组合物，及使用说明书。在任何此类实施方案中的一些中，说明书为关于给予该抗ROR1抗体或其抗原结合片段、该单链细胞表面蛋白质、该偶联物、该抗ROR1嵌合抗原受体、该细胞或该组合物。在任何此类实施方案中的一些中，这些说明书与本文所提供的任何实施方案的供使用的方法、组合物或用途一致。
本文还提供一种制品，其含有本文所提供的任何实施方案的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、本文所提供的任何实施方案的单链细胞表面蛋白质、本文所提供的任何实施方案的偶联物、本文所提供的任何实施方案的抗ROR1嵌合抗原受体、本文所提供的任何实施方案的细胞、本文所提供的任何实施方案的组合物或本文所提供的任何实施方案的试剂盒。
【附图简单说明】
图1描绘在如实施例1中所描述由筛选得到的表达所选候选抗ROR1 CAR的初代T细胞中用盘结合的重组ROR1-Fc刺激24小时之后，相较于表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞中各细胞因子的表达水平，通过ICS测定的GFP+CD4+T细胞中的相对细胞内IFN-γ、TNF-α或IL-2表达水平。
图2显示在与表达ROR1的MDA-MB-231靶点细胞共培养24-70小时之后，相较于表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞中各细胞因子的表达水平，通过ICS测定的如实施例1中所描述由筛选得到的表达所选候选抗ROR1 CAR的初代T细胞中的相对细胞内IFN-γ、TNF-α或IL-2表达水平。
图3A-图3B描绘如通过测量在0与70小时之间的时间段内红色荧光信号的损失所评估的在将NucLight红(NLR)标记的H1975靶点细胞与表达6种所选候选抗ROR1 CAR中的一种的初代T细胞共培养之后，由活体外细胞毒性分析得到的结果。作为对照，评估仅含靶细胞的培养物以及模拟细胞(不表达CAR)与靶细胞的共培养物。
图4A-图4C显示来自两名独立供体的表达6种所选候选抗ROR1CAR种的一种的初代T细胞在与H1975(图4A及图4B)共培养70小时之后IFN-γ、TNF-α或IL-2的产生情况，或在与MDA-MB-231、A549或BT-549(图4C)靶细胞共培养之后IL-2的产生情况。作为对照，评估仅含靶细胞的培养物以及模拟细胞(不表达CAR)与靶细胞的共培养物。
图5A-图5D显示在H1975非小细胞肺癌(NSCLC)小鼠模型中，如通过给予表达6种所选候选抗ROR1 CAR中的一种或表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞之后平均或个别肿瘤体积的变化所评估的抗肿瘤活性。图5A(低剂量)及图5B(高剂量)描绘所有经治疗小鼠的平均肿瘤体积；在此描绘中，肿瘤曲线在一组第一只小鼠死于疾病之后结束。由所有个别小鼠得到的结果显示于图5C(低剂量)或图5D(高剂量)中。作为对照，向小鼠给予不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。
图6A-图6B描绘在H1975非小细胞肺癌(NSCLC)小鼠模型中，在给予低剂量(图6A)或高剂量(图6B)的表达6种所选候选抗ROR1 CAR中的一种或表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞之后的卡普兰-迈耶存活曲线(Kaplan-Meier survival curves)。
图7A-图7D显示在给予低剂量(图7A及图7B)或高剂量(图7C及图7D)的表达6种所选候选抗ROR1 CAR中的一种或表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞之后第10天及第24天测定的每只小鼠的血液中表达CD4+及CD8+CAR的细胞的平均数量。图7E-图7F显示在给予低剂量(图7E)或高剂量(图7F)的表达6种所选候选抗ROR1 CAR中的一种或表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞之后第10天及第24天测定的每只小鼠的血液中表达CD3+CAR的细胞的平均数量。数据以个别值以及组平均值±标准偏差显示。
图8A-图8C描绘给予低剂量(平均值：图8A；个别值：图8C)或高剂量(平均值：图8B；个别值：图8C)的表达抗ROR1 CAR-F、CAR-A或R12参考CAR的细胞的H1975非小细胞肺癌(NSCLC)小鼠中平均及个别肿瘤体积的变化。作为对照，向小鼠给予不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。
图9A-图9B描绘在向小鼠给予低剂量(图9A)或高剂量(图9B)的表达抗ROR1 CAR-F、CAR-A或R12参考CAR的细胞之后的卡普兰-迈耶存活曲线。作为对照，向小鼠给予不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。
图10A-图10D描绘在给予低剂量(图10A及图10B)或高剂量(图10C及图10D)的表达抗ROR1 CAR-F、CAR-A或R12参考CAR的细胞之后第7天、第14天及第21天，每微升血液中的平均CD4+(图10A及图10C)及CD8+(图10B及图10D)CAR+T细胞计数。
图11A-图11B描绘在给予表达抗ROR1 CAR-F、CAR-A或R12参考CAR的细胞之后14天，肿瘤中存在的CD4+(图11A)及CD8+(图11B)CAR+T细胞的数量。
图12A-图12C描绘在MDA-MB-231三阴性乳腺癌小鼠模型中，在给予低剂量(图12B)或高剂量(图12C)的表达抗ROR1 CAR-F、CAR-A或R12参考CAR的细胞后直至约第49天评估的生物发光影像。作为对照，向小鼠给予不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗(图12A)。
图13A-图13C描绘在MDA-MB-231三阴性乳腺癌小鼠模型中，在给予低剂量(图13A)或高剂量(图13B)的表达抗ROR1 CAR-F、CAR-A或R12参考CAR的细胞后直至约第49天评估的由生物发光成像得到的平均总通测量量值(p/s)，以组平均值±标准误差显示。图13C描绘个别小鼠的总通量测量值(p/s)。作为对照，向小鼠给予不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。
图14A-图14E描绘在给予低剂量(平均值：图14A)或高剂量(平均值：图14B)的表达抗ROR1 CAR-F、CAR-A或R12参考CAR的细胞的MDA-MB-231三阴性乳腺癌小鼠模型中平均及个别肿瘤体积的变化。在该研究中描绘在给予高剂量(图14C)及低剂量(图14D)的表达抗ROR1 CAR F及参考CAR R12的T细胞之后直至另一时间点时的平均肿瘤体积变化。对于每一治疗条件，在高剂量或低剂量下个别经治疗小鼠的肿瘤体积结果显示于图14E中。平均肿瘤体积以直至治疗组中所有小鼠存活的最后一天的组平均值±标准误差描绘。作为对照，向小鼠给予不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。
图15A及图15B描绘给予低剂量(图15B)该高剂量(图15A)的表达抗ROR1 CAR-F或R12参考CAR的细胞的MDA-MB-231三阴性乳腺癌小鼠模型的卡普兰-迈耶存活曲线。作为对照，向小鼠给予不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。
图16A-图16D显示在给予低剂量(图16A及图16B)或高剂量(图16C及图16D)的表达抗ROR1 CAR-F、CAR-A或R12参考CAR的细胞之后第7天、第14天、第21天及第30天时测定的动物血液中表达CD4+(图16A及图16C)及CD8+(图16B及图16D)CAR的细胞的平均数量。还在第7天、第14天、第21天及第30天时测定给予表达抗ROR1 CAR-F或R12参考CAR的细胞的每只小鼠的血液中表达CD3+CAR的细胞(CD45+CD3+CAR+)的平均数量，显示于图16E中。如所示，当给予高剂量及低剂量时，表达抗ROR1 CAR-F的细胞在MDA-MB-231小鼠模型中展现较高扩增。
图17描绘以两种E:T比率与由两名原发性CLL供体产生的表达抗ROR1 CAR-F、抗CD19 CAR或R12参考CAR的经工程改造的细胞共培养约6天的Rapid Red标记的靶细胞(CD4/CD8 T细胞耗竭的白血球清除术样品)的损失。
图18A显示通过流动式细胞测量术进行细胞毒性分析的结果，显示了以两种E:T比率与由两名原发性CLL供体产生的表达抗ROR1 CAR-F、抗CD19 CAR或R12参考CAR的经工程改造的细胞共培养约4天的CD19+靶细胞或CD19+ROR1+靶细胞(CD4/CD8 T细胞耗竭的白血球清除术样品)的损失。图18B描绘用CellTraceTM紫(CTV)细胞增殖试剂标记且与来自患有CLL的受试者的靶细胞以2.5:1及0.25:1的E:T比率共培养的表达CAR的细胞(抗ROR1 CAR-F、抗CD19 CAR或R12参考CAR)的增殖情况。图18C显示如由共培养第4天的上清液所评估的IFN-γ、TNF-α及IL-2的产生情况。比较仿真处理的细胞或仅靶细胞作为对照。
图19A-图19D描绘在给予高剂量(平均值：图19A；个别值：图19C)或低剂量(平均值：图19B；个别值：图19D)的表达抗ROR1 CAR-F、抗CD19或R12参考CAR的细胞的植入表达萤火虫荧光素酶及绿色荧光蛋白(FfLuc-GFP)的人类套细胞淋巴瘤(MCL)JeKo-1细胞的套细胞淋巴瘤(MCL)小鼠模型中平均及个别肿瘤体积的变化。作为对照，向小鼠给予不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。
图20A-图20B描绘给予高剂量(图20A)或低剂量(图20B)的表达抗ROR1 CAR-F、抗CD19或R12参考CAR的细胞的MCL小鼠模型的卡普兰-迈耶存活曲线。作为对照，向小鼠给予不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。
图21显示在给予低剂量或高剂量的表达抗ROR1 CAR-F、抗CD19或R12参考CAR的经工程改造的细胞之后第7天、第14天、第21天及第28天测定的MCL小鼠模型的血液中表达CD3+CAR的细胞的平均数量。
图22A-图22E描绘如通过表面等离子体共振(SPR)，使用通过随后注射183、61.0、20.33、6.78及2.26nM浓度的重组人类ROR1实施多循环动力学所评估的各种重组产生的抗ROR1 scFv-mFc的结合，这些抗ROR1scFv-mFc包括抗ROR1 scFv ROR1-1(SEQ ID NO:118；图22A)、ROR1-2(SEQ ID NO:127；图22B)、ROR1-3(SEQ ID NO:109；图22C)及ROR1-4(SEQ IDNO:134；图22D)；CAR-A、CAR-F、CAR-G、CAR-I、CAR-R及CAR-B1的scFv结合结构域；以及参考CAR R12的scFv抗原结合结构域(SEQ ID NO:142；图22E)，其具有C末端6×His标签(ROR1ECD 6×His)。
图23描绘K562-ROR1-TetOn细胞株响应于自512ng/mL至0ng/mL的2倍递增稀释系列的多西环素的ROR1表达。使用ROR1亲本K562细胞，即两个内源性表达ROR1+细胞株MCL细胞株JeKo-1及TNBC细胞株MDA-MB-231作为对照。
图24描绘在添加递增浓度的多西环素下，由表达抗ROR1CAR-F或参考CAR R12的经工程改造的细胞与K562-ROR1-TetOn以4:1的E:T比率共培养72小时得到的共培养物上清液评估的有关IFNγ、IL-2及TNFα产生情况的剂量反应曲线。不表达CAR的细胞(模拟)用作对照。
图25A-图25B描绘细胞毒性分析的结果，其通过在各种浓度(2ng/mL-512ng/mL)多西环素及表达抗ROR1 CAR-F或参考CAR R12的经工程改造的细胞存在下以4:1E:T比率培养约72小时的NucLight红标记的K562-ROR1-TetOn细胞的红色荧光信号损失所测定的。DMSO、无多西环素及未处理的细胞用作对照。
图26显示关于与经工程改造成表达人类ROR1(hROR1)或鼠类ROR1(mROR1)的CT26细胞共培养的表达ROR1 CAR-F或ROR1 R12 CAR的Jurkat Nur77报告分子细胞中的ROR1物种交叉反应性的评估。K562细胞及未修饰的CT26细胞用作非特异性对照。
【发明】
“”提供受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)结合分子，例如抗体(包括抗原结合抗体片段，例如单链片段，包括单链Fv片段(scFv))；及重组受体，包括含有此类抗体或片段的嵌合受体；以及编码此类抗体、片段或重组受体的核酸。在一些方面中，提供靶向或针对ROR1及表达ROR1的细胞及疾病的抗体、片段及嵌合抗原受体(CAR)。据观察，ROR1在与某些疾病及病况，例如恶性病相关的细胞或组织中，例如在例如来自复发性或新诊断的骨髓瘤患者的恶性浆细胞上表达，而例如在正常组织上表达极少。在所提供的实施方案中有可用于治疗疾病及病况及/或用于靶向此类细胞类型的方法，包括编码ROR1结合抗体、片段或受体的核酸分子，以及所编码的抗体或抗原结合片段及受体。还提供包含其的组合物及制品。这些受体一般可含有对ROR1具特异性的抗体(包括抗原结合抗体片段，例如重链可变(VH)区、单结构域抗体片段及单链片段，包括scFv)，例如呈抗原结合结构域形式。还提供表达此类ROR1结合受体，例如抗ROR1 CAR及/或含有编码此类受体的核酸的细胞，例如经工程改造或重组的细胞，以及含有此类细胞的组合物及制品及治疗剂。还提供制备及使用这些抗体及片段的方法，以及表达或含有这些抗体及片段的细胞，例如用于产生这些抗体或其片段。还提供含有此类抗体、抗原结合片段、受体或细胞的组合物，包括医药组合物，以及包含此类抗体或片段的偶联物。在一些方面中，所提供的组合物、抗体、抗原结合片段、受体或细胞可与疗法或治疗方法结合使用。
靶向ROR1的疗法，例如利用抗ROR1抗体的疗法或过继细胞疗法(包括涉及给予表达对ROR1具特异性的嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)及/或其他重组抗原受体的细胞的疗法，以及其他过继免疫细胞及过继T细胞疗法)可有效治疗癌症以及其他疾病及病症，例如ROR1。在某些情况下，过继细胞疗法的可用方法可能并不总是完全令人满意的。在一些方面中，给予的细胞能够识别并结合至靶点，例如靶抗原，例如ROR1，以运输、定位于并成功地进入受试者、其肿瘤及环境内的适当位点；变得活化、扩增；发挥各种效应功能，包括细胞毒性杀灭及例如细胞因子的各种因子的分泌；保持(包括长期保持)分化成、转化成或参与重编程成某些表型状态以在清除及再暴露于靶配体或抗原之后提供有效且稳固的回忆反应；以及避免或减少耗竭、无反应、终末分化及/或分化成抑制性状态。
在一些情况下，这些抗体或含有抗原结合结构域的重组受体特异性结合、识别或靶向的特定靶点抗原的特性可影响受体的活性。在一些情况下，ROR1由某些癌症表达且为细胞疗法的引人注目的治疗靶点。为获得对抗体或细胞疗法，特别是特异性结合、识别或靶向ROR1的重组受体的最佳反应，需要改良的策略。本发明提供满足此类需求的实施方案。
在一些方面中，所提供的实施方案基于观察到，给予表达所提供的ROR1结合分子，例如嵌合抗原受体(CAR)的经工程改造的细胞展现改善的抗原特异性活性、信号传导及功能、高抗肿瘤活性、一致的抗原依赖性活性或信号传导、较多或长期的活体内扩增以及当给予时改善的存留性，同时针对不同抗原展现出最少的非抗原依赖性活性或信号传导或交叉反应。此类抗体及重组受体可用于促进特定疾病及病症，例如与ROR1表达相关的疾病及病症的安全且有效的治疗。
在一些情况下，针对疗法的最佳反应可取决于抗体或抗原结合片段、或含有此类抗体或抗原结合片段作为抗原结合结构域的重组受体识别靶点抗原的能力。在一些方面中，本文中观察到，某些所提供的抗体或抗原结合片段，例如当作为重组受体(例如CAR)的抗原结合结构域存在时与ROR1的结合的结合亲和力、特异性或动力学可与针对疗法的改善或较大的反应相关联。在一些方面中，所提供的实施方案基于观察到，所提供的结合分子相较于可用抗体展现针对ROR1的较低结合亲和力及/或较快解离速率常数(koff或kd；较快解离速率)，且还展现改善的抗肿瘤活性、较多或长期的活体内扩增、改善的存留性及/或减少的非抗原依赖性活性或信号传导。在一些方面中，具有较低结合亲和力(例如较高平衡解离常数)的表达含有抗原结合结构域(例如抗体或其抗原结合片段)的重组受体的经工程改造的细胞(例如T细胞)可展现实质上改善的活体内扩增、增加的存留性、较高或改善的抗原特异性抗肿瘤活性及延长的存活期，包括针对各种不同类型的肿瘤。
在一些方面中，具有较快解离速率常数(koff或kd；较快解离速率)的表达含有抗原结合结构域(例如抗体或其抗原结合片段)的重组受体的经工程改造的细胞(例如T细胞)可展现实质上改善的活体内扩增、增加的存留性、较高或改善的抗原特异性抗肿瘤活性及延长的存活期，包括针对各种不同类型的肿瘤。在一些方面中，具有较低结合亲和力(例如较高平衡解离常数)及较快解离速率常数(koff或kd；较快解离速率)的表达含有抗原结合结构域(例如抗体或其抗原结合片段)的重组受体的经工程改造的细胞(例如T细胞)可展现实质上改善的活体内扩增、增加的存留性、较高或改善的抗原特异性抗肿瘤活性及延长的存活期，包括针对各种不同类型的肿瘤。不希望受理论所束缚，在一些方面中，本文中观察到，增加例示性抗ROR1CAR的结合结构域对ROR1结合的抗原结合解离速率潜在地促使CAR对较低抗原水平的敏感性增加。
在一些情况下，针对疗法，例如细胞疗法的最佳反应可取决于经工程改造的重组受体例如CAR在细胞表面上一致地且可靠地表达及/或结合靶点抗原的能力。举例而言，在一些情况下，由引入的转殖基因(例如编码重组受体)转录的RNA的异质性在一些情况下，当在细胞疗法中使用的细胞，例如人类T细胞中表达时可影响重组受体的表达及/或活性。
在一些情况下，重组受体，例如CAR中的间隔子的长度及类型可影响该受体的表达、活性及/或功能。
另外，在一些情况下，某些重组受体可展现非抗原依赖性活性或信号传导(又称为“持续性(tonic)信号传导”)，此可例如由于表达该重组受体的T细胞的分化及/或耗竭增加而导致不合需要的影响。在一些方面中，此类活性可能限制T细胞的活性、作用或效力。在一些情况下，在工程改造并离体扩增细胞以进行重组受体表达期间，细胞可能因重组受体引起的持续性信号传导而展现指示耗竭的表型。
本申请案中所提及的所有出版物，包括专利文件、科学论文及数据库，均以全文引用的方式并入本文中用于所有目的，其引用程度就如同每一个别出版物以引用的方式个别地并入一般。若本文所阐述的定义与以引用方式并入本文中的专利、申请案、公开的申请案及其他出版物中所述的定义相反或另外不一致，则以本文所阐述的定义为准，而非以引用方式并入本文中的定义为准。
本文使用的各部分标题仅出于组织目的，而不应理解为限制所描述的主题。
I.ROR1结合分子
在一些方面中，提供ROR1结合分子，例如ROR1结合多肽。此类结合分子包括特异性结合至ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的抗体(包括抗原结合片段)。在这些结合分子中还有含有此类抗体的多肽，包括含有此类抗体的单链细胞表面蛋白质，例如重组受体，例如嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面中，提供结合ROR1的细胞表面蛋白质，例如结合ROR1分子的重组受体或嵌合抗原受体(CAR)，及编码结合ROR1的细胞表面蛋白质，例如重组受体(例如CAR)的聚核苷酸，以及表达此类受体的细胞。还提供含有编码此类抗体、抗原结合片段及结合分子，例如I.A或I.D部分中描述者的全部或一部分的核酸序列。此类聚核苷酸的实施例包括I.E部分中描述的内容。在一些方面中，这些聚核苷酸可引入细胞中以产生含有或表达所提供的结合分子，例如ROR1结合抗体、抗原结合结构域及受体(例如CAR)的经工程改造的细胞。
A.ROR1靶向抗体
提供抗ROR1多肽，包括抗体及功能性抗原结合片段。在这些ROR1结合多肽中有抗体，例如单链抗体(例如抗原结合抗体片段)，例如含有重链可变(VH)区及/或轻链可变(VL)区或其部分者。在一些实施方案中，这些抗体或抗原结合片段包括VH及VL，例如单链Fv片段(scFv)。这些抗体包括特异性结合至ROR1，例如人类ROR1的抗体。在所提供的抗ROR1抗体中有人类抗体，或由人类抗体修饰的抗体或人类抗体的变体。这些抗体包括经分离抗体。还提供含有此类抗体的ROR1结合分子，例如单链蛋白质、融合蛋白、偶联物及/或重组受体，例如嵌合受体，包括抗原受体。在一些方面中，这些ROR1结合分子包括经分离分子。
还提供结合ROR1的细胞表面蛋白质，例如结合ROR1的重组受体。这些结合ROR1的细胞表面蛋白质可含有所提供的特异性结合至ROR1，例如ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的抗体(例如抗原结合抗体片段)。在一些方面中，所提供的结合分子结合至ROR1的细胞外部分。在一些实施例中，这些重组受体为嵌合抗原受体，例如含有抗ROR1抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体。
还提供聚核苷酸，其含有编码此类抗体、抗原结合片段及结合分子的全部或一部分的核酸序列。所提供的聚核苷酸可并入构建体，例如脱氧核糖核酸(DNA)或RNA构建体中，例如可引入细胞中以表达所编码的ROR1结合抗体、抗原结合片段、偶联物或受体，例如抗ROR1 CAR的构建体。在一些方面中，还提供所编码的抗体、抗原结合片段、偶联物及受体，例如含有ROR1结合多肽的抗体、抗原结合片段、共轭物偶联物及受体，以及其组合物及制品及用途。
术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用且包括多克隆及单克隆抗体，包括完整抗体及功能性(抗原结合)抗体片段，包括抗原结合片段(Fab)、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的重链可变(VH)区、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)及单结构域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖免疫球蛋白的经基因工程改造及/或以其他方式修饰的形式，例如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人类抗体、人源化抗体，及异型偶联抗体、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、双功能抗体、三功能抗体及四功能抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另外陈述，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段，在本文中又称为“抗原结合片段”。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或子类的抗体，包括IgG及其子类、IgM、IgE、IgA及IgD。
术语“互补决定区”及“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，已知其意思指抗体可变区内的不相邻氨基酸序列，其赋予抗原特异性及/或结合亲和力。一般而言，各重链可变区中存在三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)且各轻链可变区中存在三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“构架区”及“FR”为已知的，意思指重链及轻链的可变区的非CDR部分。一般而言，各全长重链可变区中存在四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4)，且各全长轻链可变区中存在四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4)。
给定CDR或FR的确切氨基酸序列边界可使用多种熟知方案中的任一种容易地测定，包括以下文献中所描述的方案：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography”,J.Mol.Biol.262,732-745.(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains”,Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A及Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool”,JMol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70,(“Aho”编号方案)；Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm”,PNAS,1989,86(23):9268-9272,(“AbM”编号方案)；及Ye等人,“IgBLAST:an immunoglobulin variable domainsequence analysis tool”,Nucleic Acids Res.2013年7月；41(Web Server issue):W34-40,(“IgBLAST”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可根据用于标识的方案而变化。举例而言，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。Kabat与Chothia方案的编号均基于最常见的抗体区序列长度，其中在一些抗体中出现由插入字母(例如“30a”)表示的插入以及缺失。这两个方案将某些插入及缺失(“插入缺失”)放于不同位置，产生不同编号。接触方案基于对复杂晶体结构的分析，且在多个方面与Chothia编号方案类似。AbM方案基于Oxford Molecular的AbM抗体模型化软件使用的方案的在Kabat与Chothia定义之间的折衷。IgBLAST方案基于与生殖V、D及J基因的匹配，且可使用美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)的IgBLAST工具确定。
下表1列出如分别通过Kabat、Chothia、AbM及接触方案标识的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的例示性位置边界。CDR-H1的残基编号使用Kabat与Chothia编号方案列出。FR位于各CDR之间，例如，其中FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间等等。应注意，由于所示Kabat编号方案将插入序列放于H35A及H35B处，故取决于环长度，Chothia CDR-H1环的末端在使用所示Kabat编号惯例编号时在H32与H34之间变化。
Figure BDA0003187625950000501
Figure BDA0003187625950000511
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD
2-Al-Lazikani等人(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另外说明，否则给定抗体或其区域，例如其可变区的“CDR”或“互补决定区”或个别指定的CDR(例如CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应理解为涵盖如通过任一前述方案或其他已知方案定义的互补决定区(或特定互补决定区)。举例而言，在陈述特定CDR(例如CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，此类CDR具有如通过任一前述方案或其他已知方案定义的可变区内相应CDR(例如CDR-H3)的序列。在一些实施方案中，指定具体CDR序列。所提供的抗体的例示性CDR序列使用各种编号方案描述(参见例如表2)，但应理解，所提供的抗体可包括如根据任一其他前述编号方案或其他已知的编号方案所描述的CDR。
同样，除非另外说明，否则给定抗体或其区域，例如其可变区的FR或个别指定的FR(例如FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如通过任一已知方案定义的构架区(或特定构架区)。在一些情况下，指定用于标识特定CDR、FR或多个FR或CDR的方案，例如通过Kabat、Chothia、AbM、IgBLAST、IMGT或Contact方法、或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链及轻链(分别为VH及VL)的可变区一般具有类似结构，且各结构域包含四个保守性构架区(FR)及三个CDR。(参见例如Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体以分别筛选互补VL或VH结构域的集合库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
在所提供的抗体中有抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”指包含完整抗体中结合该完整抗体所结合的抗原的一部分的除完整抗体以外的分子。抗体片段的实施例包括(但不限于)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子，例如scFv及仅包含VH区的单结构域抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，该抗体或包括含可变重链(VH)及可变轻链(VL)区的抗体片段。在特定实施方案中，该抗体包含重链可变(VH)区及/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段，例如scFv。
单结构域抗体(sdAb)包含抗体的重链可变区的全部或一部分或轻链可变区的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体为人类单结构域抗体。
抗体片段可通过各种技术制备，包括(但不限于)完整抗体的蛋白质水解消化以及由重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体为重组产生的片段，例如包含呈非天然存在的布置的片段，例如两个或两个以上抗体区域或链通过合成接头，例如肽接头接合的片段，及/或通过酶消化天然存在的完整抗体不能产生的片段。在一些方面中，抗体片段为scFvs。
“人源化”抗体为全部或实质上全部CDR氨基酸残基均来源于非人类CDR且全部或实质上全部FR氨基酸残基均来源于人类FR的抗体。人源化抗体视情况可包括来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人类抗体的“人源化形式”指已经历人源化，通常用以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人类抗体的特异性及亲和力的非人类抗体变体。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如作为CDR残基来源的抗体)的相应残基取代，例如用以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
在所提供的抗ROR1抗体中有人类抗体。“人类抗体”为氨基酸序列对应于人类或人类细胞所产生的抗体的氨基酸序列或利用人类抗体谱或其他人类抗体编码序列(包括人类抗体集合库)的非人类来源的抗体。该术语不包括含非人类抗原结合区的非人类抗体的人源化形式，例如全部或实质上全部CDR为非人类CDR者。该术语包括人类抗体的抗原结合片段。
人类抗体可通过将免疫原给予转基因动物来制备，该转基因动物经修饰以响应于抗原攻击而产生完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体。此类动物通常含有人类免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合至动物染色体中。在此类转基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座一般未活化。人类抗体还可来源于人类抗体集合库，包括噬菌体展示集合库及无细胞集合库，其含有来源于人类谱系的抗体编码序列。
在所提供的抗体中有单克隆抗体，包括单克隆抗体片段。如本文所使用，术语“单克隆抗体”指自实质上均质的抗体群获得或在实质上均质的抗体群内的抗体，还即，构成该群体的个别抗体除含有天然存在的突变或在制备单克隆抗体制剂期间产生的可能变体以外，其余为一致的，这些变体一般以微量存在。与通常包括针对不同抗原决定基的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂中的每一单克隆抗体针对抗原上的单一抗原决定基。该术语不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。单克隆抗体可通过多种技术制备，包括(但不限于)自融合瘤产生、重组DNA方法、噬菌体展示及其他抗体展示方法。
术语“多肽”与“蛋白质”可互换使用，意思指氨基酸残基的聚合物，且不限于最小长度。多肽，包括所提供的抗体及抗体链及其他肽，例如接头及ROR1结合肽，可包括氨基酸残基，包括天然及/或非天然氨基酸残基在内。这些术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化及类似修饰。在一些方面中，多肽相对于原初或天然序列可含有修饰，只要蛋白质维持所希望的活性。这些修饰可为有意的，如经由定点诱变法进行；或可为偶然的，例如经由产生蛋白质的宿主的突变或由PCR扩增所引起的错误引起。
1.例示性抗体
在一些实施方案中，抗体，例如抗ROR1抗体，或抗原结合片段，含有如所描述的重链及/或轻链可变(VH或VL)区序列或其足够抗原结合部分。在一些实施方案中，抗体，例如抗ROR1抗体，例如抗原结合抗体片段，含有如所描述的重链可变区(VH)序列及/或轻链可变区(VL)序列，或其足够抗原结合部分。在一些实施方案中，抗体，例如抗ROR1抗体，例如抗原结合抗体片段为单链片段，例如单链Fv(scFv)片段。在一些方面中，scFv包含VH区及VL区。在一些实施方案中，抗体，例如抗ROR1抗体，例如抗原结合抗体片段为单结构域抗体(sdAb)，例如仅含VH区的抗体。
在一些实施方案中，抗ROR1抗体，例如抗原结合抗体片段，包括含如所描述的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及/或重链互补决定区3(CDR-H3)的VH区序列或其足够抗原结合部分。在一些实施方案中，抗ROR1抗体，例如抗原结合抗体片段，包括含如所描述的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的VH区序列或其足够抗原结合部分。在一些实施方案中，抗ROR1抗体，例如抗原结合抗体片段包括含如所描述的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及/或轻链互补决定区3(CDR-L3)的VL区序列或其足够抗原结合部分。在一些实施方案中，抗ROR1抗体，例如抗原结合片段，包括含如所描述的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的VL区序列或其足够抗原结合部分。
在一些实施方案中，抗ROR1抗体，例如抗原结合片段，包括含如所描述的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3的VH区序列，且包括含如所描述的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3的VL区序列。在一些实施方案中，抗ROR1抗体，例如抗原结合片段，包括含如所描述的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的VH区序列，且包括含如所描述的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的VL区序列。另外，在所提供的抗体及其片段中有具有与此类序列，例如本文所描述的抗体或其片段的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、VH、VL、scFv序列或其他序列中的任一个至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约85％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约86％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约87％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约88％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约89％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约90％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约91％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约92％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约93％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约94％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约95％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约96％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约97％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约98％序列一致性的序列的抗体及其片段。在一些方面中，在所提供的抗体及其片段中有具有与任何此类序列具至少或至少约99％序列一致性的序列的抗体及其片段。
在一些实施方案中，该抗体仅含VH区序列或其足够抗原结合部分，例如本文所描述的VH序列中的任一个(例如CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3及/或CDR-H4)的sdAb。在一些实施方案中，这些抗体或抗原结合片段包括含有VH区且作为单结构域抗体的抗体或抗原结合片段，其在不与VL区配对及/或无任何额外抗体结构域或结合位点情况下能够特异性结合至ROR1。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Kabat编号的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Chothia编号的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据AbM编号的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据IgBLAST编号的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Kabat、Chothia、AbM、IMGT或IgBLAST编号、或其他编号方案的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:112、121、103或130中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:112、121、103或130中所示的VH区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的重链可变(VH)区，或含有此类VH序列中存在的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及/或重链互补决定区3(CDR-H3)，例如含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3者。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:112或121中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:112或121中所示的VH区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的VH区，或含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，例如含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3者。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:112中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:112中所示的VH区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的VH区，或含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，例如含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3者。在一些实施方案中，该抗体，例如其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:121中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:121中所示的VH区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的VH区，或含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，例如含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3者。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:103中所示的VH区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的VH区，或含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，例如含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3者。在一些实施方案中，该抗体，例如其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:130中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:130中所示的VH区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的VH区，或含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，例如含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3者。
在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ ID NO:67、82或52中所示的序列的CDR-H1。在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ ID NO:71、86、56或97中所示的序列的CDR-H2。在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ IDNO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3。
在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ ID NO:65、80或50中所示的序列的CDR-H1。在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ ID NO:69、84、54或95中所示的序列的CDR-H2。在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ IDNO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3。
在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ ID NO:66、81或51中所示的序列的CDR-H1。在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ ID NO:70、85、55或96中所示的序列的CDR-H2。在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ IDNO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3。
在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ ID NO:68、83或53中所示的序列的CDR-H1。在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ ID NO:72、87、57或98中所示的序列的CDR-H2。在任何所提供的实施方案中的一些中，VH区包括含SEQ IDNO:74、89、59或100中所示的序列的CDR-H3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:67、82或52中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:71、86、56或97中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:65、80或50中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:69、84、54或95中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:66、81或51中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:70、85、55或96中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:68、83或53中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:72、87、57或98中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:74、89、59或100中所示的序列的CDR-H3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:67或82中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:71或86中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73或88中所示的序列的CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:65或80中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:69或84中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73或88中所示的序列的CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:66或81中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:70或85中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73或88中所示的序列的CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:68或83中所示的序列的CDR-H1、含SEQ IDNO:72或87中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:74或89中所示的序列的CDR-H3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含以下中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3：分别地，SEQ IDNO:67、71及73；SEQ ID NO:82、86及88；分别地，SEQ ID NO:52、56及58；或分别地，SEQ IDNO:52、97及99。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含以下中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3：分别地，SEQID NO:65、69及73；分别地，SEQ ID NO:80、84及88；分别地，SEQ ID NO:50、54及58；或分别地，SEQ ID NO:50、95及99。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含以下中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3：分别地，SEQ ID NO:66、70及73；分别地，SEQ ID NO:81、85及88；分别地，SEQ ID NO:51、55及58；或SEQ ID NO:51、96及99。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含以下中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3：分别地，SEQ ID NO:68、72及74；分别地，SEQ ID NO:83、87及89；分别地，SEQ IDNO:53、57及59；或分别地，SEQ ID NO:53、98及100。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:65、69及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:66、70及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:68、72及74中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:80、84及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:81、85及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:83、87及89中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，VH区包括分别含SEQ ID NO:112、121、103或130中的任一个中所示的VH区氨基酸序列内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，VH区包含SEQ ID NO:112或121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包含SEQ ID NO:112内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包含SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包含SEQ ID NO:103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包含SEQ ID NO:130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包含如所描述的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中的任一个且包含分别与SEQID NO:112、121、103或130中的任一个中所示的VH区氨基酸序列内所含的构架区1(FR1)、FR2、FR3及/或FR4具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的FR1、FR2、FR3及/或FR4。在任何实施方案中的一些中，该VH区包含分别与SEQ ID NO:112中所示的VH区氨基酸序列内所含的FR1、FR2、FR3及/或FR4具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的FR1、FR2、FR3及/或FR4。在任何实施方案中的一些中，该VH区包含分别与SEQ ID NO:121中所示的VH区氨基酸序列内所含的FR1、FR2、FR3及/或FR4具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的FR1、FR2、FR3及/或FR4。在任何实施方案中的一些中，该VH区包含分别与SEQ ID NO:103中所示的VH区氨基酸序列内所含的FR1、FR2、FR3及/或FR4具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的FR1、FR2、FR3及/或FR4。在任何实施方案中的一些中，该VH区包含分别与SEQ ID NO:130中所示的VH区氨基酸序列内所含的FR1、FR2、FR3及/或FR4具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的FR1、FR2、FR3及/或FR4。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含SEQ ID NO:112、121、103或130中的任一个中所示的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含SEQ ID NO:112中所示的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含SEQ IDNO:121中所示的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含SEQ ID NO:130中所示的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:110、119、101或128，或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:111、120、102或129编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:110或119，或与SEQ ID NO:110或119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:111或120编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:110或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:111编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:119或与SEQ ID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:120编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:101或与SEQ ID NO:101具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:102编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:128或与SEQ ID NO:128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:129编码的氨基酸序列。还提供含有本文所描述的核苷酸序列中的任一个，例如编码所提供的结合分子的全部或一部分的核苷酸序列的聚核苷酸。
在一些实施方案中，所提供的CAR(例如抗ROR1 CAR)中的抗体或抗体片段包含轻链或其足够抗原结合部分。举例而言，在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段含有可变轻链(VL)区或VL区的足够抗原结合部分。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段含有VH区及可变轻链(VL)区、或VH及VL区的足够抗原结合部分。在任何此类实施方案中，VH区序列可为本文所描述的VH区序列中的任一个。在任何此类实施方案中，VL区序列可为本文所描述的VL区序列中的任一个。在任何此类实施方案中，本文所描述的VH区序列中的任一个及VL区序列中的任一个可组合使用。在任何此类实施方案中的一些中，本文所描述的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3序列中的任一个或多个与本文所描述的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3序列中的任一个或多个可组合使用。在一些此类实施方案中，抗体抗原结合片段，例如Fab或scFv。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区或其变体的至少一部分。在一些此类实施方案中，抗体还含有恒定区的全长抗体。
在一些实施方案中，本文所提供的结合分子，例如受体，例如CAR包括含VL区或其足够抗原结合部分中的任一个的抗体，例如抗ROR1抗体或其抗原结合片段。举例而言，在一些实施方案中，CAR包括含VH区及VL区、或VH及VL区的足够抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段。在任何此类实施方案中，VH区序列可为本文所描述的VH区序列中的任一个。在任何此类实施方案中，VL区序列可为本文所描述的VL区序列中的任一个。在任何此类实施方案中，本文所描述的VH区序列中的任一个及VL区序列中的任一个可组合使用。在任何此类实施方案中的一些中，本文所描述的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3序列中的任一个或多个与本文所描述的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3序列中的任一个或多个可组合使用。在一些此类实施方案中，所提供的重组受体中所含抗体为抗原结合片段，例如Fab或scFv。在一些此类实施方案中，受体，例如CAR进一步含有间隔子，例如免疫球蛋白恒定区或其变体的一部分，例如以下I.B部分中所述。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Kabat编号的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Chothia编号的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据AbM编号的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据IMGT编号的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据IgBLAST编号的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Kabat、Chothia、AbM、IMGT或IgBLAST编号、或其他编号方案的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:115、124或106中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:115、124或106中所示的VL区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的轻链可变(VL)区，或含有此类VL序列中存在的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及/或轻链互补决定区3(CDR-L3)，例如含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3者。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:115或124中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:115或124中所示的VL区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的VL区，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3，例如含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3者。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:115中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:115中所示的VL区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的VL区，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3，例如含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3者。在一些实施方案中，抗体，例如其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:124中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:124中所示的VL区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的VL区，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3，例如含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3者。在一些实施方案中，抗体，例如其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:106中所示的VL区氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的VL区，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3，例如含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3者。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的CDR-L1。在任何所提供的实施方案中的一些中，该VL区包括含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的CDR-L2。在任何所提供的实施方案中的一些中，该VL区包括含SEQ IDNO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该VL区包括含SEQ ID NO:76、91或61中所示的序列的CDR-L1。在任何所提供的实施方案中的一些中，该VL区包括含SEQ ID NO:78、93或63中所示的序列的CDR-L2。在任何所提供的实施方案中的一些中，该VL区包括含SEQ IDNO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3.
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含SEQ ID NO:76、91或61中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:78、93或63中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含SEQ ID NO:75或90中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77或92中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79或94中所示的序列的CDR-L3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含SEQ ID NO:76或91中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:78或93中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79或94中所示的序列的CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含以下中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3：分别地，SEQ IDNO:75、77及79；SEQ ID NO:90、92及94；分别地，SEQ ID NO:60、62及64；或分别地，SEQ IDNO:60、62及64。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含以下中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3：分别地，SEQID NO:76、78及79；分别地，SEQ ID NO:91、93及94；分别地，SEQ ID NO:60、63及64；或分别地，SEQ ID NO:61、63及64。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含分别如SEQ ID NO:76、78及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括含分别如SEQ ID NO:91、93及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包括分别含SEQ ID NO:115、124或106中的任一个中所示的VL区氨基酸序列内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包含SEQ ID NO:115或124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包含SEQ ID NO:115内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包含SEQ ID NO:124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包含SEQ ID NO:106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区包含如所描述的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中的任一个，且包含分别与SEQ ID NO:115、124或106中的任一个中所示的VL区氨基酸序列内所含的构架区1(FR1)、FR2、FR3及/或FR4具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的FR1、FR2、FR3及/或FR4。在任何实施方案中的一些中，该VL区包含分别与SEQ ID NO:115中所示的VL区氨基酸序列内所含的FR1、FR2、FR3及/或FR4具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的FR1、FR2、FR3及/或FR4。在任何实施方案中的一些中，该VL区包含分别与SEQ ID NO:124中所示的VL区氨基酸序列内所含的FR1、FR2、FR3及/或FR4具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的FR1、FR2、FR3及/或FR4。在任何实施方案中的一些中，该VL区包含分别与SEQ ID NO:106中所示的VL区氨基酸序列内所含的FR1、FR2、FR3及/或FR4具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的FR1、FR2、FR3及/或FR4。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含SEQ ID NO:115、124或106中的任一个中所示的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含SEQ ID NO:115中所示的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含SEQ ID NO:124中所示的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:113、122或104，或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:114、123、105或131编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:113或122，或与SEQ ID NO:113或122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:114或123编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:113或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:114编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:122或与SEQ ID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:123编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:104或与SEQ ID NO:104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:105编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VL区为或包含由SEQ ID NO:131编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的scFv。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含与SEQ ID NO:112、121、103或130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115、124或106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含与SEQ ID NO:112或121具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115或124具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段的VH区包括分别含选自SEQ ID NO:112、121、103或130中任一个的VH区氨基酸序列内所含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；且包括分别含选自SEQ ID NO:115、124或106中任一个的VL区氨基酸序列内分别包含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区包含SEQ ID NO:112或121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID NO:115或124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在任何此类实施方案中的一些中，该VH区包含SEQ ID NO:112内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID NO:115内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区包含SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区包含SEQ ID NO:103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在任何此类实施方案中的一些中，该VH区包含SEQ ID NO:130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:67、82或52中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、含SEQ ID NO:71、86、56或97中所示的序列的重链互补决定区2(CDR-H2)及含SEQ IDNO:73、88、58或99中所示的序列的重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:65、80或50中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:69、84、54或95中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:66、81或51中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:70、85、55或96中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:68、83或53中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:72、87、57或98中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:74、89、59或100中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:76、91或61中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:78、93或63中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:67或82中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:71或86中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73或88中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:75或90中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77或92中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79或94中所示的序列的CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:65或80中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:69或84中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73或88中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:75或90中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77或92中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79或94中所示的序列的CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:66或81中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:70或85中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:73或88中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:75或90中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:77或92中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79或94中所示的序列的CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含SEQ ID NO:68或83中所示的序列的CDR-H1、含SEQ ID NO:72或87中所示的序列的CDR-H2及含SEQ ID NO:74或89中所示的序列的CDR-H3，且该VL区包括含SEQ ID NO:76或91中所示的序列的CDR-L1、含SEQ ID NO:78或93中所示的序列的CDR-L2及含SEQ ID NO:79或94中所示的序列的CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、56及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、97及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:65、69及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:80、84及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:50、54及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:50、95及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:66、70及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:81、85及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:51、55及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:51、96及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:68、72及74中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:76、78及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:83、87及89中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:91、93及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；该VH区包括含分别如SEQ ID NO:53、57及59中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、63及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或该VH区包括含分别如SEQ ID NO:53、98及100中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:61、63及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:65、69及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:66、70及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:68、72及74中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:76、78及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:80、84及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:81、85及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:83、87及89中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:91、93及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、56及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:50、54及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:51、55及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:53、57及59中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、63及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、97及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:50、95及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:51、96及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区包括含分别如SEQ ID NO:53、98及100中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:61、63及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的VH区包含SEQ ID NO:112、121、103或130的氨基酸序列且该抗体或抗原结合片段的VL区包含氨基酸序列115、124或106。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的VH及VL区包含以下氨基酸序列：分别地，SEQ ID NO:112及115；分别地，SEQ ID NO:121及124；分别地，SEQ ID NO:103及106；或分别地，SEQ ID NO:130及106，或与以上VH及VL中的任一个具有至少或至少约90％序列一致性，例如与其具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的任何抗体或其抗原结合片段。举例而言，其中提供的抗体或其抗原结合片段的VH及VL区包含分别选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:112及115；SEQ ID NO:121及124；SEQ ID NO:103及106；或SEQ ID NO:130及106。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:110、119、101或128，或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:113、122或104，或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:111、120、102或129编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQID NO:114、123、105或131编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:110或119，或与SEQ ID NO:110或119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:113或122，或与SEQ ID NO:113或122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:111或120编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:114或123编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:110或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:113或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:111编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:114编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:119或与SEQ ID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:122或与SEQ ID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:120编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:123编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:101或与SEQ ID NO:101具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:104或与SEQ ID NO:104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:102编码的氨基酸序列且该VL区为或包含由SEQ ID NO:105编码的氨基酸序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:128或与SEQ ID NO:128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:104或与SEQ ID NO:104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该VH区为或包含由SEQ ID NO:129编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:131编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段为单链抗体片段，例如单链可变片段(scFv)、或双功能抗体、或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段为多结构域抗体，例如包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的scFv。在一些实施方案中，单链抗体片段(例如scFv)包括接合两个抗体结构域或区域，例如重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的一或多个接头。接头通常为肽接头，例如可挠性及/或可溶性肽接头。在这些接头中有富含甘氨酸及丝氨酸及/或在一些情况下富含苏氨酸的接头。在一些实施方案中，接头进一步包括能够改善溶解度的带电残基，例如赖氨酸及/或谷氨酸。在一些实施方案中，接头进一步包括一或多个脯氨酸。
因此，所提供的CAR含有抗ROR1抗体，其包括单链抗体片段，例如scFv及双功能抗体，尤其是人类单链抗体片段，通常包含接合两个抗体结构域或区域，即这些VH及VL区的接头。接头通常为肽接头，例如可挠性及/或可溶性肽接头，例如富含甘氨酸及丝氨酸的肽接头。
在一些方面中，富含甘氨酸及丝氨酸(及/或苏氨酸)的接头包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的此类氨基酸。在一些实施方案中，其包括至少或约50％、55％、60％、70％或75％甘氨酸、丝氨酸及/或苏氨酸。在一些实施方案中，接头实质上完全由甘氨酸、丝氨酸及/或苏氨酸构成。接头的长度一般在约5个与约50个氨基酸之间，通常在或在约10个与或与约30个之间，例如为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，且在一些实施例中，长度在10个与25个氨基酸之间。例示性接头包括具有各种数量的序列GGGGS(4GS；SEQ ID NO:39)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:40)的重复(例如在2、3、4与5个之间的此类序列的重复)的接头。例示性接头包括具有SEQ ID NO:41中所示的序列(GGGGSGGGGSGGGGS)或由其组成的接头。例示性接头进一步包括具有SEQ ID NO:24中所示的序列(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或由其组成的接头。例示性接头进一步包括具有SEQ ID NO:162中所示的序列(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)或由其组成的接头。例示性接头包括具有SEQ ID NO:163中所示的序列(GSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)或由其组成的接头。
因此，在一些实施方案中，所提供的实施方案包括含前述接头中的一或多个的单链抗体片段，例如scFv，这些接头为例如富含甘氨酸/丝氨酸的接头，包括具有GGGS(SEQ IDNO:40)或GGGGS(SEQ ID NO:39)的重复的接头，例如SEQ ID NO:41、162或163中所示的接头。
在一些实施方案中，VH区可在VL区的氨基末端。在一些实施方案中，VH区可在VL区的羧基末端。在特定实施方案中，片段，例如scFv，可包括VH区或其部分，后接接头，后接VL区或其部分。在其他实施方案中，片段，例如scFv，可包括VL区或其部分，后接接头，后接VH区或其部分。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该scFv为或包含SEQ ID NO:118、127、109或134中所示的序列，或与SEQ IDNO:118、127、109或134具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该scFv为或包含SEQID NO:118或127中所示的序列，或与SEQ ID NO:118或127具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，该scFv为或包含SEQ ID NO:118中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，该scFv为或包含SEQ ID NO:127中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，该scFv为或包含SEQ ID NO:109中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，该scFv为或包含SEQ ID NO:134中所示的序列。
在本文所提供的抗体、抗原结合片段、受体(例如CAR)、偶联物或结合分子的一些实施方案中，该scFv为或包含由SEQ ID NO:116、125、107或132，或与SEQ ID NO:116、125、107或132具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，该scFv为或包含由SEQ ID NO:117、126、108或133编码的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该scFv为或包含由SEQ ID NO:116或125，或与SEQ ID NO:116或125具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，该scFv为或包含由SEQ ID NO:117或126编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，该scFv为或包含由SEQ ID NO:117编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，该scFv为或包含由SEQ ID NO:126编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，该scFv为或包含由SEQ ID NO:108编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，该scFv为或包含由SEQ ID NO:133编码的氨基酸序列。
表2提供所提供的例示性抗体片段(例如scFv)的SEQ ID NO:。在一些方面中，所提供的例示性抗体片段可包含在所提供的ROR1结合受体，例如抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)中。在一些实施方案中，ROR1结合抗体或其片段，例如scFv，包括含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列的VH区以及含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列的VL区，该CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列以及CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列如以下表2中每一列中所列SEQ ID NO:所阐述(根据Kabat、Chothia、AbM及IgBLAST编号方案)。在一些实施方案中，ROR1结合抗体或其片段，例如scFv，包含以下表2的每一列中所列SEQ ID NO:阐述的VH区序列及VL区序列，或抗体包含与以下表2的每一列中所列SEQ ID NO:阐述的VH区序列及VL区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的VH区及VL区氨基酸序列。在一些实施方案中，ROR1结合抗体或其片段，例如scFv，包含以下表2的每一列中所列SEQ ID NO:阐述的VH区序列及VL区序列。在一些实施方案中，ROR1结合抗体或其片段包含以下表2的每一列中所列SEQ ID NO:阐述的scFv序列，或抗体包含与以下表2的每一列中所列SEQ ID NO:阐述的scFv序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的scFv氨基酸序列。在一些实施方案中，ROR1结合抗体或其片段包含以下表2的每一列中所列SEQ ID NO:阐述的scFv序列。在一些实施方案中，表2的每一列中所列抗体或其抗原结合片段(例如scFv)中的任一个可例如作为细胞外抗原结合结构域包含在受体，例如嵌合抗原受体(CAR)中。
在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段包含VH区及VL区，其中该抗体或其抗原结合片段的VH区可含有表2中所示CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3氨基酸序列中的任一个的组合，且该抗体或其抗原结合片段的VL区可含有表2中所示CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3氨基酸序列中的任一个的组合。在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段包含呈任何组合、取向或含有不同接头的表2中所示的VH区及/或VL区。在一些方面中，该抗体或其抗原结合片段包含表2中所示的VH区。在一些方面中，该抗体或其抗原结合片段包含表2中所示的VL区。在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段包含表2中所示的VH区或表2中所示的VL区的单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段单结构域抗体(sdAb)，其包括含表2中所示的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3的VH区，或含表2中所示的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3的VL区。
Figure BDA0003187625950000841
在所提供的抗体，例如抗原结合片段中有人类抗体。在所提供的人类抗ROR1抗体，例如抗原结合片段的一些实施方案中，人类抗体含有VH区，其包含与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分、与由生殖系核苷酸人类重链D区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分、及/或与由生殖系核苷酸人类重链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分；及/或含有VL区，其包含与由生殖系核苷酸人类κ或λ链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分及/或与由生殖核苷酸人类κ或λ链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分。
在所提供的抗体，例如抗原结合片段中有人类抗体。在所提供的人类抗ROR1抗体，例如抗原结合片段的一些实施方案中，人类抗体含有VH区，其包含与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分、与由生殖系核苷酸人类重链D区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分、及/或与由生殖系核苷酸人类重链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分；且含有VL区，其包含与由生殖系核苷酸人类κ或λ链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分及/或与由生殖系核苷酸人类κ或λ链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分。在一些实施方案中，VH区的该部分对应于CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。在一些实施方案中，VH区的该部分对应于CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在一些实施方案中，VH区的部分对应于构架区1(FR1)、FR2、FR3及/或FR4。在一些实施方案中，VL区的该部分对应于CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3。在一些实施方案中，VL区的该部分对应于CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在一些实施方案中，VL区的该部分对应于FR1、FR2、FR3及/或FR4。
在一些实施方案中，人类抗体或其抗原结合片段含有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内相应CDR-H1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-H1。举例而言，在一些实施方案中，人类抗体含有的CDR-H1具有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H1区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方案中，人类抗体或其抗原结合片段含有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内相应CDR-H2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-H2。举例而言，在一些实施方案中，人类抗体含有的CDR-H2具有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H2区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方案中，人类抗体或其抗原结合片段含有与由生殖系核苷酸人类重链V区段、D区段及J区段编码的序列内相应CDR-H3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-H3。举例而言，在一些实施方案中，人类抗体含有的CDR-H3具有与由生殖系核苷酸人类重链V区段、D区段及J区段编码的序列内的相应CDR-H3区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方案中，人类抗体或其抗原结合片段含有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段编码的序列内相应CDR-L1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-L1。举例而言，在一些实施方案中，人类抗体含有的CDR-L1具有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段所编码的序列内的相应CDR-L1区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方案中，人类抗体或其抗原结合片段含有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段编码的序列内相应CDR-L2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-L2。举例而言，在一些实施方案中，人类抗体含有的CDR-L2具有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L2区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方案中，人类抗体或其抗原结合片段含有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段及J区段编码的序列内相应CDR-L3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-L3。举例而言，在一些实施方案中，人类抗体含有的CDR-L3具有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段及J区段编码的序列内的相应CDR-L3区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方案中，人类抗体或其抗原结合片段包括含人类生殖系基因区段序列的构架区。举例而言，在一些实施方案中，人类抗体含有VH区，其中构架区，例如FR1、FR2、FR3及FR4与由人类生殖系抗体区段，例如V区段及/或J区段编码的构架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在一些实施方案中，人类抗体含有VL区，其中构架区，例如FR1、FR2、FR3及FR4与由人类生殖系抗体区段，例如V区段及/或J区段编码的构架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。举例而言，在一些此类实施方案中，VH区及/或VL区内所含有的构架区序列与由人类生殖系抗体区段编码的构架区序列有不超过10个氨基酸，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异。
该抗体或其抗原结合片段可含有免疫球蛋白恒定区，例如一或多个恒定区结构域的至少一部分。在一些实施方案中，这些恒定区包括轻链恒定区及/或重链恒定区1(CH1)。在一些实施方案中，该抗体包括铰链区或其变体的至少一部分。在一些实施方案中，抗体包括CH2及/或CH3结构域，例如Fc区。在一些实施方案中，Fc区为人类IgG，例如IgG1或IgG4的Fc区。
2.例示性特征
在一些方面中，所提供的抗体具有一或多个指定功能特征，例如结合特性，包括结合至特定抗原决定基或与相关但非特异性抗原展现较低或减少的结合。在一些方面中，所提供的抗体可结合至与其他抗体，例如参考抗体类似或重叠的抗原决定基的抗原决定基，及/或展现特定结合亲和力。在一些方面中，所提供的抗体可结合至不同于其他抗体的抗原决定基的抗原决定基，例如结合构形抗原决定基。
在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段特异性结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白质。在任何本文所提供的实施方案的一些中，ROR1指人类ROR1。抗体或其他结合分子结合至ROR1或特异性结合至ROR1的观察结果未必意谓其结合至来自每一物种的ROR1。举例而言，在一些实施方案中，结合至ROR1的特征，例如与ROR1特异性结合及/或与参考抗体竞争结合至ROR1，及/或在一些实施方案中以特定亲和力结合或在特定程度上竞争的能力指针对人类ROR1蛋白质的能力，且该抗体针对另一个物种，例如小鼠的ROR1可能不具有此特征。在一些实施方案中，抗体结合至人类ROR1且结合至另一个物种，例如恒河猕猴或食蟹猕猴的ROR1。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合至人类ROR1且不结合至另一个物种，例如小鼠的ROR1。在一些实施方案中，抗体结合至人类ROR1且结合至另一个物种，例如小鼠的ROR1。
在一些实施方案中，抗体，例如抗ROR1抗体，例如人类抗体特异性结合至ROR1的特定抗原决定基或区域，例如一般为细胞外抗原决定基或区域。ROR1为I型膜蛋白质，其包括含免疫球蛋白(Ig)结构域、卷曲(Fz)结构域及三环(Kr)结构域的胞外区，后接跨膜结构域。根据SEQ ID NO:144中所示的人类ROR1(GenBank编号AAA60275.1；SEQ ID NO:215中所示的包括信号肽的序列，Uniprot编号Q01973)，胞外区对应于氨基酸1-377，氨基酸13-118对应于Ig结构域，氨基酸136-270对应于Fz结构域且氨基酸283-362对应于Kr结构域(根据SEQID NO:215中所示的氨基酸序列，Ig结构域对应于氨基酸42-147、Fz结构域对应于氨基酸165-299及Kr结构域对应于氨基酸312-391)。在一些实施方案中，抗体，例如人类抗体结合至包含Ig结构域、Fz结构域及/或Kr结构域内的残基的抗原决定基。在一些实施方案中，抗体，例如人类抗体结合至包含Ig结构域及/或Fz结构域内的残基的抗原决定基。在一些实施方案中，抗体，例如人类抗体结合至包含Ig及Fz结构域两者内的残基的抗原决定基。
在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合至，例如特异性结合至人类ROR1，例如人类ROR1，例如SEQ ID NO:144中所示的人类ROR1(GenBank编号AAA60275.1；SEQID NO:215中所示的包括信号肽的序列，Uniprot编号Q01973)，或其等位基因变体或剪接变体的一或多个抗原决定基或区域。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段特异性结合至人类ROR1蛋白质内的一或多个抗原决定基。在一个实施方案中，人类ROR1具有SEQID NO:145或146中所示的氨基酸序列的转录物变体或同功异型物。在一些实施方案中，人类ROR1蛋白质包含SEQ ID NO:144、145、146或215中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段结合至ROR1的胞外区，例如人类ROR1的胞外区内存在的一或多个细胞外抗原决定基，例如对应于SEQ ID NO:144中所示的人类ROR1序列的残基1-377(对应于包括信号肽在内的SEQ ID NO:215中所示的人类ROR1序列的残基30-406)。
在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段结合ROR1，例如人类ROR1的一或多个抗原决定基。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段结合ROR1，例如人类ROR1的线性抗原决定基。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段结合ROR1，例如人类ROR1的一或多个构形抗原决定基。
在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段结合人类ROR1的一或多个抗原决定基，例如包含选自SEQ ID NO:199-214中的任一个的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的一或多个抗原决定基，或选自SEQ ID NO:199-214中的任一个的氨基酸序列内存在的一或多个抗原决定基。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段结合人类ROR1的一或多个抗原决定基，例如包括序列FRSTIYGSRLRIRNL(如SEQ ID NO:199中所示)的一或多个抗原决定基。在一些实施方案中，该抗ROR1抗体或其抗原结合片段特异性结合至由SEQ IDNO:199中所示的序列组成的抗原决定基或SEQ ID NO:199中所示的序列内存在的抗原决定基。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合额外抗原决定基，例如一或多个构形抗原决定基。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段除结合序列FRSTIYGSRLRIRNL(如SEQ ID NO:199中所示)外，还结合额外抗原决定基。一或多个额外抗原决定基的实施例包括(但不限于)SEQ ID NO:200-214中所示序列中的一或多个或选自SEQ ID NO:200-214中的任一个的氨基酸序列内存在的一或多个抗原决定基。
在一些实施方案中，该抗体结合至非人类ROR1，例如恒河猕猴(Macaca mulatta)ROR1(如SEQ ID NO:216中所示，Uniprot编号F6RUP2)或食蟹猕猴(Macaca fasicularis)ROR1(如SEQ ID NO:217中所示，Uniprot编号A0A2K5WTX7；或如SEQ ID NO:218中所示，Uniprot编号A0A2K5WTX4)。在一些方面中，非人类ROR1的细胞外结构域与人类ROR1序列至少99％一致。
在一些实施方案中，该抗体结合至非人类ROR1，例如猴、兔、大鼠、小鼠或其他物种的ROR1。在一些实施方案中，该抗体结合至小鼠(小家鼠(Mus musculus))ROR1，例如小鼠ROR1，例如SEQ ID NO:171中所示的小鼠ROR1(GenBank编号NP_038873；SEQ ID NO:219中所示的包括信号肽的序列，Uniprot编号Q9Z139)的抗原决定基或区域。在一些实施方案中，该抗体结合至人类ROR1且结合至小鼠ROR1。在一些实施方案中，一些所提供的抗ROR1抗体或其片段与非人类ROR1，例如小鼠ROR1的结合的范围为该抗体与人类ROR1的结合的至少或至少约75％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或更高百分比。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该抗体或其抗原结合片段不结合至非人类ROR1，视情况小鼠ROR1，不与其交叉反应，或以较低范围、水平或程度或亲和力与其结合。在一些实施方案中，抗ROR1抗体与不相关、非ROR1蛋白质或与非人类ROR1蛋白质，例如小鼠ROR1蛋白质，或其他非ROR1蛋白质的结合的范围为所测量的该抗体与人类ROR1的结合的小于或小于约50％、40％、30％、20％或10％。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段不结合至小鼠ROR1，例如SEQ ID NO:171或219中所示的小鼠ROR1。在一些实施方案中，这些抗体或抗原结合片段不结合至小鼠ROR1，不与其交叉反应，或以较低水平或程度或亲和力与其结合。在一些实施方案中，所提供的抗ROR1抗体或其抗原结合片段与小鼠ROR1的结合的范围、水平或程度或亲和力比与人类ROR1的结合的范围、水平或程度或亲和力低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该抗体或其抗原结合片段不结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质，视情况为人类ROR2蛋白质；不与其交叉反应；或以较低范围、水平或程度或亲和力与其结合。在一些实施方案中，一些所提供的抗ROR1抗体或其片段与非ROR1蛋白质，例如ROR2蛋白质的结合的范围比该抗体与人类ROR1的结合低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段不结合至ROR2蛋白质，视情况为人类ROR2蛋白质，不与其交叉反应，或以较低水平或程度或亲和力与其结合。在一些实施方案中，所提供的抗体中，有与小鼠ROR1的结合小于或等于或约为该抗体与人类ROR1的结合的30％、20％或10％，例如小于或小于约10％。在一些实施方案中，所提供的抗体中，与ROR2，例如人类ROR2的结合小于或等于或约为该抗体与人类ROR1的结合的30％、20％或10％，例如小于或小于约10％的抗体。
在一些实施方案中，如通过多种已知方法中的任一种所测量，所提供的抗体能够以至少一定亲和力结合ROR1，例如人类ROR1。在一些实施方案中，亲和力由平衡解离常数(KD)表示。在一些实施方案中，亲和力由EC50表示。
已知多种分析可用于评估结合亲和力、平衡解离常数(KD)、平衡缔合常数(KA)、EC50、缔合速率(缔合速率常数；Kon或Ka；单位为1/Ms或M-1s-1)和解离速率(解离速率常数；Koff或Ka；单位为1/s或s-1)及/或确定结合分子(例如抗体或其片段)是否特异性结合至特定配体(例如抗原，例如ROR1蛋白质)。可例如通过使用多种熟知的结合分析中的任一种测定结合分子，例如抗体或其抗原结合片段对抗原，例如对ROR1，例如对人类ROR1或食蟹猕猴ROR1或小鼠ROR1的结合亲和力。举例而言，在一些实施方案中，可使用
Figure BDA0003187625950000911
仪器，使用表面等离子共振(SPR)分析测定两种蛋白质(例如抗体或其片段与抗原，例如ROR1蛋白质)之间的复合物的结合动力学及常数(参见例如Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949；Wilson,Science 295:2103,2002；Wolff等人,Cancer Res.53:2560,1993；及美国专利第5,283,173号、第5,468,614号或等效物)。
SPR测量分子结合至传感器表面或自该表面解离时该表面处分子浓度的变化。SPR信号的变化与接近表面的质量浓度的变化成正比，由此允许测量两个分子之间的结合动力学。复合物的解离速率常数(Koff或Kd)、缔合速率常数(Kon或Ka)和/或平衡解离常数(KD)和/或平衡缔合常数(KA)可通过监测缓冲液越过芯片时折射率随时间的变化来测定。其他适合的用于测量一种蛋白质与另一种蛋白质的结合的分析包括例如免疫分析，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)，或通过经荧光、UV吸收、圆二色谱或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱或光学特性的变化来测定结合。其他例示性分析包括(但不限于)西方墨点法(Western blot)、ELISA、分析型超速离心法、光谱法、流动式细胞测量术、测序、基因报告分子分析、流动式细胞测量术及用于检测所表达的核酸或蛋白质的结合的其他方法。
在一些实施方案中，结合分子，例如抗体或其片段结合至，例如特异性结合至抗原，例如ROR1蛋白质或其中的抗原决定基，其亲和力或KA(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M或M-1；假设双分子相互作用，等于此缔合反应的缔合速率[kon或ka]与解离速率[koff或kd]的比率)等于或大于105M-1。在一些实施方案中，肽结合分子结合至，例如特异性结合至抗原，例如人类ROR1的抗原决定基，其亲和力或KA(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M或M-1)等于或大于105M-1(等于此缔合反应的缔合速率[kon]与解离速率[koff]的比率)。在一些实施方案中，结合分子，例如抗体或其抗原结合片段对T细胞靶点多肽的抗原决定基展现结合亲和力，且其亲和力或KA范围自或自约106M-1至或至约1010M-1，例如自或自约106M-1至或至约109M-1，或自或自约106M-1至或至约108M-1。在一些实施方案中，结合亲和力可分类为高亲和力或低亲和力。举例而言，与特定抗原决定基展现高亲和力结合的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段与此类抗原决定基相互作用，其KA至少或至少约107M-1、至少或至少约108M-1、至少或至少约109M-1、至少或至少约1010M-1、至少或至少约1011M-1、至少或至少约1012M-1、或至少或至少约1013M-1。在一些情况下，展现低亲和力结合的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段展现的KA为至多107M-1、至多106M-1、至多105M-1。
或者，亲和力可定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(KD)，单位为M(例如10- 5M至10-13M)。在一些实施方案中，该抗体或其片段对抗原决定基展现结合亲和力，其KD(即，特定结合相互作用的平衡解离常数，其单位为M；假设双分子相互作用，等于此缔合反应的解离速率[koff或kd]与缔合速率[kon或ka]的比率)等于或小于10-5M。举例而言，平衡解离常数KD范围可自10-5M至10-13M，例如10-7M至10-11M、10-7M至10-10M、10-7M至10-9M、10-8M至10-10M或10-9M至10-10M。
缔合速率(缔合速率常数；kon或ka；以1/Ms或M-1s-1为单位)及解离速率(解离速率常数；koff或kd；以1/s或s-1为单位)可使用本领域中已知的分析方法中的任一种，例如表面等离子共振(SPR)来测定。
在一些实施方案中，抗体与ROR1，例如人类ROR1的结合亲和力(EC50)及/或平衡解离常数(KD)自或自约0.1nM至或至约500nM、自或自约0.1nM至或至约100nM、自或自约0.1nM至或至约50nM、自或自约0.1nM至或至约10nM、自或自约0.1nM至或至约1nM、自或自约1nM至或至约500nM、自或自约1nM至或至约100nM、自或自约1nM至或至约50nM、自或自约1nM至或至约10nM、自或自约10nM至或至约500nM、自或自约10nM至或至约100nM、自或自约10nM至或至约50nM、自或自约50nM至或至约500nM、自或自约50nM至或至约100nM、或自或自约100nM至或至约500nM。在某些实施方案中，该抗体与ROR1，例如人类ROR1的结合亲和力(EC50)及/或平衡解离常数(KD)为或为约或小于或小于约100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM，或由前述任何值所界定的范围。在一些实施方案中，这些抗体以低于毫微摩尔浓度的结合亲和力，例如以小于或小于约1nM，例如小于或小于约0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的结合亲和力结合至ROR1，例如人类ROR1。在一些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1抗体或其片段与ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的结合亲和力(EC50)及/或平衡解离常数KD自或自约0.01nM至约1μM、0.1nM至1μM、1nM至1μM、1nM至500nM、1nM至100nM、1nM至50nM、1nM至10nM、10nM至500nM、10nM至100nM、10nM至50nM、50nM至500nM、50nM至100nM或100nM至500nM。在某些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1抗体或其片段与ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的结合亲和力(EC50)及/或平衡解离常数KD为或为约或小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM，或更低，或由前述任何值所界定的范围。
在一些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1抗体或其片段与ROR1蛋白质的EC50及/或KD在或在约10nM与或与约90nM之间、在或在约20nM与或与约80nM之间、在或在约30nM与或与约70nM之间、在或在约40nM与或与约60nM之间、或在或在约40nM与或与约50nM之间。在某些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1抗体或其片段与ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的EC50及/或KD为或为约10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM或100nM，或由前述任何值所界定的范围。在某些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1抗体或其片段与ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的EC50及/或KD为或为约10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM或100nM，或由前述任何值所界定的范围。在某些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1抗体或其片段与ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的EC50及/或KD为或为约40nM、41nM、42nM、43nM、44nM或45nM，或由前述任何值所界定的范围。
在一些实施方案中，所提供的结合分子的VH区包括含在SEQ ID NO:112内的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3且所提供的结合分子的VL区包括含在SEQ ID NO:115内的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且人类ROR1平衡解离常数在或在约30nM与或与约50nM之间。在一些实施方案中，所提供的结合分子的VH区和VL区分别为或包含如SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:115所示的序列，并且人类ROR1的解离速率(koff或kd)在或在约40nM。
在一些实施方案中，所提供的结合分子，例如抗ROR1抗体或其抗原结合片段或含有此类抗体或抗原结合片段的受体具有较快解离速率(解离速率常数；koff或kd；单位为1/s或s-1)。在一些实施方案中，所提供的结合分子的解离速率(koff或kd)在或在约1×10-5s-1与或与约1×10-2s-1之间，例如在或在约5×10-5s-1与或与约9×10-3s-1之间、在或在约1×10- 4s-1与或与约8×10-3s-1之间、在或在约5×10-4s-1与或与约7×10-3s-1之间、在或在约1×10- 3s-1与或与约6×10-3s-1之间、以及在或在约4×10-3s-1与或与约6×10-3s-1之间。在一些实施方案中，所提供的结合分子的解离速率(koff或kd)至少或至少约1×10-5s-1、5×10-5s-1、1×10-4s-1、5×10-4s-1、1×10-3s-1、5×10-3s-1或1×10-2s-1。在一些实施方案中，所提供的结合分子的解离速率(koff或kd)至少或至少约6×10-4s-1、7×10-4s-1、8×10-4s-1、9×10-4s-1、1×10-3s-1、2×10-3s-1、3×10-3s-1、4×10-3s-1、5×10-3s-1、6×10-3s-1、7×10-3s-1、8×10-3s-1、9×10-3s-1或1×10-2s-1。在一些实施方案中，所提供的结合分子的解离速率(koff或kd)至少或至少约4×10-3s-1、5×10-3s-1或6×10-3s-1，或由前述任何值所界定的范围。在一些实施方案中，所提供的结合分子，例如抗ROR1抗体或其抗原结合片段或含有此类抗体或抗原结合片段的受体的解离速率比参考抗ROR1抗体或其抗原结合片段、或含有此类抗体或抗原结合片段(例如抗ROR1抗体R12)的受体的解离速率快至少或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在一些实施方案中，所提供的结合分子的VH区包括含在SEQ ID NO:112内的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3且所提供的结合分子的VL区包括含在SEQ ID NO:115内的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且人类ROR1的解离常速率在或在约4×10-3s-1与或与约6×10-3s-1之间。在一些实施方案中，所提供的结合分子的VH区和VL区分别为或包含如SEQ ID NO:112和SEQ IDNO:115所示的序列，并且人类ROR1的解离速率(koff或kd)在或在约5×10-3s-1。
在一些实施方案中，可比较结合分子，例如抗ROR1抗体对不同抗原，例如来自不同物种的ROR1蛋白质的结合亲和力以确定物种交叉反应性。举例而言，物种交叉反应性可分类为高交叉反应性或低交叉反应性。在一些实施方案中，可比较针对不同抗原，例如来自不同物种，例如来自人类、食蟹猕猴或小鼠的ROR1蛋白质的平衡解离常数KD以确定物种交叉反应性。在一些实施方案中，抗ROR1抗体的物种交叉反应性可较高，例如抗ROR1抗体与人类ROR1及与物种变体ROR1以类似程度结合，例如针对人类ROR1的KD与针对物种变体ROR1的KD的比率为或为约1。在一些实施方案中，抗ROR1抗体的物种交叉反应性可较低，例如抗ROR1抗体对人类ROR1具有高亲和力，但对物种变体ROR1具有低亲和力，或反之亦然。举例而言，针对物种变体ROR1的KD与针对人类ROR1的KD的比率超过10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或更高，且该抗ROR1抗体具有低物种交叉反应性。物种交叉反应性的程度可与已知抗体，例如参考抗体的物种交叉反应性相比较。
在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段与人类ROR1蛋白质的结合程度类似于与非人类ROR1蛋白质的结合程度。举例而言，在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段以特定平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质、或其等位基因变体或剪接变体，且以与之类似、或大致相同、或低2倍、或低5倍的KD结合至非人类ROR1，例如食蟹猕猴ROR1。
举例而言，在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段结合至人类ROR1的KD为约或小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM或更低，且结合至食蟹猕猴ROR1的KD为约或小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM或更低。在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段结合至小鼠ROR1蛋白质的KD为约或小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM或更低。在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合至人类ROR1、食蟹猕猴ROR1及小鼠ROR1。在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合至人类ROR1及食蟹猕猴ROR1，且以低亲和力结合至小鼠ROR1。在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合至人类ROR1及来自其他物种的ROR1，或该ROR1蛋白质的其他变体。
在一些实施方案中，使用通过用特定表面等离子共振(SPR)条件测量的总结合容量(Rmax)来确定所提供的抗体或其抗原结合片段与抗原，例如ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的结合的能力或容量。对于SPR分析，“配体”为固定于传感器的表面上的靶点分子，例如ROR1蛋白质，且“分析物”为用于结合至“配体”的测试分子，例如抗体。举例而言，“分析物”可为结合至ROR1蛋白质的所提供的抗体或其抗原结合片段中的任一种。对于SPR中的特定配体与分析物对，Rmax可在假定1:1结合化学计量模型的情况下，在特定条件下测定。在一些实施方案中，结合容量(Rmax)可使用下式测定：Rmax(RU)＝(分析物分子量)/(配体分子量)×固定的配体的水平(RU)。在SPR条件的特定方面中，任何所提供的抗体或其抗原结合片段与ROR1蛋白质，例如人类ROR1或食蟹猕猴ROR1之间的结合的Rmax为至少或至少约50个共振单位(RU)，例如为约25RU、20RU、15RU、10RU、5RU或1RU。
在一些实施方案中，所提供的抗体的特性或特征相对于所观察到的另一种抗体，例如参考抗体的特性描述。在一些实施方案中，参考抗体为非人类抗ROR1抗体，例如兔或嵌合或人源化抗ROR1抗体。在一些方面中，参考抗体为命名为R12的嵌合兔/人类IgG1抗体(参见例如Yang等人(2011)PloS ONE,6:e21018；美国专利申请案第US 2013/0251642号)及/或由其得到的片段，例如其scFv片段，及/或含有此类抗体的VH及VL序列及/或此类抗体的重链及轻链CDR的抗体。经展示，含有R12的抗原结合scFv片段的嵌合抗原受体(CAR)在CAR疗法中有效促进抗肿瘤反应性(Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；国际公开PCT申请案第WO2014031687号)。在一些实施方案中，参考抗体为包含SEQ ID NO:142中所示的氨基酸序列的scFv。
在一些实施方案中，参考抗体命名为2A2的小鼠抗人类ROR1抗体，及/或由其得到的片段，例如其scFv片段，及/或含有此类抗体的VH及VL序列及/或此类抗体的重链及轻链CDR的抗体(参见例如Baskar等人(2012)MAbs,4:349-361；公开的美国专利申请案第US2012/20058051号)。举例而言，在一些实施方案中，参考抗体具有含SEQ ID NO:172中所示的序列的VH区及含SEQ ID NO:173中所示的序列的VL。在一些实施方案中，参考抗体为抗体2A2的scFv形式。
在一些实施方案中，参考抗体为人类或人源化抗ROR1抗体。例示性人源化抗ROR1抗体描述于国际PCT申请案第WO2014/031174号中。在一些实施方案中，参考抗体为命名为99961的抗体的人源化变体。在一些实施方案中，参考抗体具有含SEQ ID NO:174、175、176或177中所示的序列的VH区及含SEQ ID NO:178、179、180或181中所示的序列的VL。
在一些实施方案中，所提供的抗体含有与一或多种参考抗体中存在的CDR不同的重链及轻链CDR。在所提供的抗体中有竞争结合至及/或结合至ROR1中与一或多种参考抗体(例如R12)所结合的抗原决定基相同或重叠的抗原决定基，但含有独特CDR(例如独特重链及/或轻链CDR1、CDR2及CDR3)的抗体。
在一些实施方案中，抗体的亲和力大致等于或小于相应形式的参考抗体的亲和力，例如其EC50或KD比相应形式的参考抗体的EC50或KD要高不超过或不超过约1.5倍、或不超过或不超过约2倍、不超过或不超过约3倍及/或不超过或不超过约10倍。在一些实施方案中，抗体的亲和力大致等于或小于相应形式的参考抗体的亲和力，例如其EC50或KD比相应形式的参考抗体的EC50或KD要高至少或至少约1.5倍、至少或至少约2倍、至少或至少约3倍、至少或至少约5倍、至少或至少约10倍、至少或至少约20倍、至少或至少约25倍、至少或至少约30倍、至少或至少约40倍、至少或至少约50倍、或至少或至少约100倍。在一些实施方案中，该抗体的亲和力大致等于或小于相应形式的参考抗体的亲和力，即，其亲和力比参考抗体的亲和力低或低约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或100倍。
在一些实施方案中，该抗体的亲和力高于相应形式的参考抗体的亲和力，例如其EC50或KD比相应形式的参考抗体的EC50或KD低或低约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍或更低。
在一些实施方案中，相较于ROR1阴性细胞，例如已知及/或本文所描述的表达ROR1及已知不表达ROR1，或表达相关但不同抗原，例如ROR2的特定细胞，这些抗体对表达ROR1的细胞展示优先结合。在一些实施方案中，在所测量的与表达ROR1的细胞的结合程度明显大于与非表达性细胞或表达相关但不同抗原的细胞的结合程度时，观察到优先结合。在一些实施方案中，如通过例如基于流动式细胞测量术的分析中的平均荧光强度及/或解离常数或EC50所测量，所检测的与表达ROR1的细胞的结合程度相较于不表达ROR1的细胞或表达相关但不同抗原的细胞的倍数变化至少或至少约1.5、2、3、4、5、6或更高，及/或与关于相应形式的参考抗体所观察到的倍数变化大致同样大、大致相同、至少同样大或至少大致同样大，或大于关于相应形式的参考抗体所观察到的倍数变化。在一些情况下，所观察到的与ROR1或与表达ROR1的细胞的结合的总程度与关于相应形式的参考抗体所观察到的结合总程度大致相同、至少同样大或大于关于相应形式的参考抗体所观察到的结合总程度。
在一些方面中，该亲和力相较于相应形式的参考抗体，例如兔ROR1抗体的亲和力为或为大致相同的程度或实质上相同程度的亲和力。在一些方面中，该亲和力为相应形式的参考抗体的亲和力的至少或至少约80％、85％、90％、95％或99％、或与其相同。
在一些实施方案中，抗体特异性结合至与参考抗体所结合的ROR1抗原决定基重叠的抗原决定基。在一些方面中，此类抗体中有与参考抗体结合至相同或类似的抗原决定基的抗体。在一些实施方案中，抗体与参考抗体，例如抗ROR1抗体R12或其scFv片段(如SEQ IDNO:142中所示；参见例如Yang等人(2011)PloS ONE,6:e21018)结合至相同或类似抗原决定基或在ROR1的相同区域内或含有ROR1相同区域内的残基的抗原决定基。在一些实施方案中，该抗体抑制参考抗体与ROR1，例如人类ROR1的结合及/或与参考抗体竞争结合至ROR1。
竞争性抑制分析为已知的且包括基于ELISA的分析、基于流动式细胞测量术的分析及基于RIA的分析。在一些方面中，竞争性抑制分析通过以下方式进行：并入过量的一种抗体的未标记形式并评估其阻断经可检测标记物标记的另一种抗体的结合的能力，由此可通过检测标记或标记物来评估结合程度及其减小。在一些实施方案中，相较于参考抗体的量或浓度，所提供的抗体的过量，例如1倍、2倍、5倍、10倍、50倍或100倍过量添加将抑制参考抗体与抗原的结合(或反之亦然)。在一些实施方案中，结合被抑制至少50％，且在一些实施方案中，被抑制至少75％、90％或99％。在一些方面中，竞争性抑制如在竞争性结合分析中所测量(参见例如Junghans等人,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。竞争分析可用于鉴别与任何本文所描述的抗体竞争的抗体。用定位抗体及参考抗体所结合的抗原决定基的分析还可使用且已知的。
在一些实施方案中，在参考抗体以或以约2nM的浓度存在的情况下，所提供的抗体以小于或小于约200nM、150nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM或10nM、或小于或小于约9nM、8nM、7nM、6nM或5nM的IC50抑制参考抗体的结合。在一些实施方案中，在所提供的抗体以或以约2nM的浓度存在的情况下，参考抗体以小于或小于约200nM、150nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM或10nM、或小于或小于约9nM、8nM、7nM、6nM或5nM的IC50抑制所提供的抗体的结合。在一些实施方案中，所提供的抗体对参考抗体的结合的竞争性抑制(或反之亦然)与参考抗体自身，例如未标记的参考抗体对参考抗体的结合的竞争性抑制程度相同或大致相同、或至少相同或至少大致相同。在一些实施方案中，所提供的抗体使参考抗体与人类ROR1的结合(例如R12 scFv与人类ROR1的结合)抑制至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
本文所提供的抗ROR1抗体可通过各种已知分析法针对其物理/化学特性及/或生物学活性进行鉴别、筛选或特征分析。在一个方面中，测试抗体的抗原结合活性，例如：采用已知方法，例如ELISA、西方墨点法及/或流动式细胞测量术分析法，包括基于细胞的结合分析法，例如评估抗体(例如：与荧光标记物偶联或加标签的抗体)与表达靶点抗原，例如ROR1的细胞的结合，在一些情况下，与使用不表达该靶点抗原，例如ROR1的细胞，或表达不同抗原，例如ROR2的细胞的结果进行比较。可由KD、KA或EC50测量结合亲和力。
3.变体
在某些实施方案中，相较于本文所描述的抗体的序列，抗体包括一或多个氨基酸变化，例如取代、缺失、插入及/或突变。例示性变体包括经设计以改善抗体的结合亲和力及/或其他生物特性的变体。抗体的氨基酸序列变体可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成法来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失及/或插入及/或取代。可进行缺失、插入及取代的任何组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有所需特征，例如抗原结合性即可。
在某些实施方案中，例如相较于本文所述的抗体序列及/或相较于天然谱系(例如人类谱系)的序列，这些抗体包括一或多个氨基酸取代。所关注的取代型诱变位点包括CDR及FR。可将氨基酸取代引入所关注抗体中，并针对所需活性，例如：保持/改善的抗原结合性、降低的免疫原性、改善的半衰期及/或改善的效应功能，例如促进抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力，来筛选产物。
在一些实施方案中，亲本抗体(例如人源化抗体或人类抗体)的CDR内的一或多个残基经取代。在一些实施方案中，进行取代以使序列或序列中的位置恢复为生殖系序列，例如在生殖系(例如人类生殖系)中所发现的抗体序列，以例如降低免疫原性的可能性，例如在向人类受试者给予时降低免疫原性的可能性。
在一些实施方案中，在由体细胞成熟过程期间经历高频率突变的密码子编码的CDR“热点”残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))及/或接触抗原的残基中进行改变，并测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构筑二级集合库及自二级集合库再选择来达成亲和力成熟已描述于Hoogenboom等人的Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸引导的诱变法)中的任一种将多样性引入选用于成熟的可变基因中。接着产生二级集合库。接着，筛选该集合库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法包括CDR定向方法，在这些方法中，使若干CDR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，特异性鉴别出参与抗原结合的CDR残基。特定而言，通常以CDR-H3及CDR-L3作为靶点。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可在一或多个CDR内发生，只要这些改变不会实质上减弱抗体结合抗原的能力即可。举例而言，不会实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如本文所提供的保守性取代)可在CDR中进行。此类改变可以在例如CDR中接触抗原的残基外部。在上文所提供的变体VH及VL序列的某些实施方案中，各CDR未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个或更多残基的多肽范围内的氨基及/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实施例包括具有N末端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入型变体包括抗体N末端或C末端与延长抗体血清半衰期的酶或多肽的融合物。
4.修饰
在某些实施方案中，改变抗体以增加或降低抗体糖基化的范围，例如通过改变氨基酸序列及/或通过修饰附接至糖基化位点的寡醣(例如使用某些细胞株)移除或插入一或多个糖基化位点来改变抗体。
在一些实施方案中，移除或插入N连接的糖基化，N连接的糖基化为在共同序列-Asn-Xaa-Ser/Thr中天冬酰胺处出现的糖基化位点。在一些实施方案中，一或多个氨基酸经另一个氨基酸置换以移除糖基化位点。
例示性修饰、变体及细胞株描述于例如以下中：专利公开案第US 2003/0157108号、第US 2004/0093621号、第US 2003/0157108号、第WO 2000/61739号、第WO 2001/29246号、第US 2003/0115614号、第US 2002/0164328号、第US 2004/0093621号、第US 2004/0132140号、第US 2004/0110704号、第US 2004/0110282号、第US 2004/0109865号、第WO2003/085119号、第WO 2003/084570号、第WO 2005/035586号、第WO 2005/035778号、第WO2005/053742号、第WO2002/031140号；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请案第US 2003/0157108 A1号(Presta,L)；及WO 2004/056312 A1；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)；WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利第6,602,684号(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)；WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)。
经修饰的抗体中有在Fc区中具有一或多个氨基酸修饰的抗体，例如人类Fc区序列或恒定区的其他部分(例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的抗体。
可进行此类修饰以例如改善半衰期，改变与一或多种类型Fc受体的结合，及/或改变效应功能。
变体中还有经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“thioMAbs”，及其他经半胱氨酸工程改造的变体，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基取代，以便在可及位点处产生反应性硫醇基，例如用于药剂与连接剂的偶练以产生免疫偶联物。经半胱氨酸工程改造的抗体描述于例如美国专利第7,855,275号及第7,521,541号中。
在一些实施方案中，抗体经修饰以含有其他非蛋白部分，包括水溶性聚合物。例示性聚合物包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性而可能在制造中具有优势。聚合物可具有任何分子量，且可为分支链或非分支链的。附接至抗体的聚合物的数量可变化，且若连接多于一个聚合物，则聚合物可为相同或不同分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数量及/或类型可基于包括(但不限于)待改善的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将在限定条件下用于疗法中等考虑因素来确定。
B.免疫偶联物
在一些实施方案中，抗体为免疫偶联物或为免疫偶联物的一部分，其中该抗体与一或多个异源分子，如但不限于细胞毒性剂或显影剂偶练。细胞毒性剂包括(但不限于)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素)；化学治疗剂(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、阿霉素(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道诺霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，例如核分解酶；抗生素；毒素，例如小分子毒素或酶活性毒素。在一些实施方案中，抗体与一或多种细胞毒性剂偶练，该一或多种细胞毒性剂例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素；细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。
免疫偶联物中有抗体-药物偶联物(ADC)，其中抗体与一或多种药物共轭，该一或多种药物包括(但不限于)类美登素(maytansinoid)(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号及欧洲专利EP 0 425 235B1)；奥瑞他汀(auristatin)，例如单甲基奥瑞他汀药物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利第5,635,483号及第5,780,588号及第7,498,298号)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号及第5,877,296号；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；及Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环霉素(anthracycline)，例如道诺霉素或阿霉素(参见Kratz等人,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；以及美国专利第6,630,579号)；甲胺喋呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷，例如多西他赛(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)及奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯族毒素(trichothecene)；及CC1065。
免疫偶联物中还有抗体与酶活性毒素或其片段共轭的免疫偶联物，该酶活性毒素或其片段包括(但不限于)白喉A链(diphtheria A chain)、白喉毒素(diphtheria toxin)的非结合活性片段、外毒素A链(得自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链(ricin A chain)、相思子毒素A链(abrin A chain)、莫迪素A链(modeccin A chain)、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、康乃馨(dianthin)蛋白质、洋商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)及单端孢霉烯族毒素。
免疫偶联物中还有抗体与放射性原子共轭形成放射性偶联物的免疫偶联物。例示性放射性同位素包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。
抗体与细胞毒性剂的偶联物可使用多种已知蛋白质偶合剂中的任一种，例如接头来制备(参见Vitetta等人,Science 238:1098(1987))，WO94/11026。接头可为促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”，例如酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头及含二硫基的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。
C.多特异性抗体
在某些实施方案中，ROR1结合分子，例如抗体或含有其的多肽，例如嵌合受体，为多特异性的。多特异性结合分子中有多特异性抗体，包括双特异性抗体。多特异性结合搭配物，例如抗体，针对至少两个不同位点具有结合特异性，该至少两个不同位点可在相同或不同抗原中。在某些实施方案中，结合特异性的一个针对ROR1且另一个针对另一抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至ROR1的两个不同抗原决定基。双特异性抗体还可用于使细胞毒素剂定位于表达ROR1的细胞。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段形式。多特异性抗体中有多特异性单链抗体，例如双功能抗体、三功能抗体及四功能抗体、串联二-scFv及串联三-scFv。还提供含有抗体的多特异性嵌合受体，例如多特异性CAR。还提供含有抗体或包括这些抗体的多肽的多特异性细胞，例如含有包括抗ROR1抗体的细胞表面蛋白质及额外细胞表面蛋白质(例如额外嵌合受体)的细胞，该额外细胞表面蛋白质结合至ROR1上的不同抗原或不同抗原决定基。
例示性额外抗原包括B细胞特异性抗原、其他肿瘤特异性抗原，例如在以下疾病上特异性表达或与其相关的抗原：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及/或头颈癌；以及在T细胞上表达的抗原。例示性抗原包括CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CD138、B7、MUC-1、Ia、HM1.24、HLA-DR、肌腱蛋白(tenascin)、血管生成因子、VEGF、PIGF、ED-B纤维结合蛋白、癌基因、癌基因产物、CD66a-d、坏死抗原、Ii、IL-2、T101、TAC、IL-6、TRAIL-R1(DR4)及TRAIL-R2(DR5)。
D.重组受体
所提供的结合分子，例如ROR1结合分子中有细胞表面蛋白质，例如重组受体，例如包括所提供的抗体或抗原结合片段的一的结合分子。还提供编码此类细胞表面蛋白质，例如受体的全部或一部分的聚核苷酸。受体包括抗原受体及特异性结合至ROR1的其他嵌合受体，例如含有所提供的抗ROR1抗体，例如抗原结合片段的受体。抗原受体中有功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)。ROR1结合受体一般含有抗体(例如抗原结合片段)及/或其他特异性结合至ROR1，例如特异性结合至ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的结合肽。还提供表达重组受体的细胞、含有此类细胞的组合物及其在过继细胞疗法，例如与ROR1表达相关的疾病及病症的治疗中的用途、其组合物及制品及用途。
所提供的聚核苷酸中有编码特异性结合ROR1的重组受体，例如抗原受体的聚核苷酸。在一些方面中，还提供所编码的受体，例如含有ROR1结合多肽的受体，以及其组合物及制品及用途。所提供的聚核苷酸可并入构建体中，例如脱氧核糖核酸(DNA)或RNA构建体中，例如可引入用于表达所编码的重组ROR1结合受体的细胞中的构建体中。
1.例示性受体
所提供的结合ROR1的细胞表面蛋白质，例如受体，一般含有细胞外抗原结合结构域及细胞内信号传导区。所提供的受体，例如重组受体中有含有所提供的抗体或其抗原结合片段，例如所提供的抗ROR1抗体或其片段中的一或多种的多肽。在一些实施方案中，所提供的细胞表面蛋白质特异性结合至ROR1，例如人类ROR1。
抗原受体中有嵌合及/或功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)。嵌合受体，例如CAR一般包括细胞外抗原结合结构域，其包括、为或包含抗ROR1抗体，例如本文所描述的抗ROR1抗体或其片段。在一些实施方案中，嵌合受体，例如CAR，包括细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体还包括间隔子及/或跨膜结构域。在一些实施方案中，间隔子位于细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间。在一些实施方案中，CAR含有细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜区及细胞内信号传导区。本文所提供的例示性CAR包括含抗原结合结构域的CAR，该抗原结合结构域包含本文中，例如I.A部分中及/或表2中所描述的抗体或其抗原结合片段；或本文I.D部分中、表3中及/或表E1中所描述的CAR。还提供由本文I.E部分中、表3中及/或表E1中所描述的聚核苷酸编码的CAR。
在一些情况下，CAR称为第一代、第二代及/或第三代CAR。在一些方面中，第一代CAR在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面中，第二代CAR提供此类信号及共刺激信号的CAR，例如包括来自例如CD28或CD137之类共刺激受体的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面中，第三代CAR在一些方面中包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，CAR含有细胞外抗原结合结构域，其在一些情况下包含结合ROR1的抗体，例如抗体片段；跨膜结构域，其为或含有CD28或其功能变体的跨膜部分；及含有CD28或其功能变体的信号传导部分及CD3ζ或其功能变体的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有细胞外抗原结合结构域，其在一些情况下包含结合ROR1的抗体，例如抗体片段；跨膜结构域，其为或含有CD28或其功能变体的跨膜部分；及含有4-1BB或其功能变体的信号传导部分及CD3ζ或其功能变体的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体进一步包括含有Ig分子(例如人类Ig分子)的一部分的间隔子，例如Ig铰链，例如IgG4铰链，例如仅铰链之间隔子。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含本文所描述的抗体或其片段的细胞外部分。在一些方面中，嵌合抗原受体包括含本文所描述的抗体或其片段的细胞外部分及细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或其片段包括scFv且细胞内信号传导区含有ITAM。在一些方面中，细胞内信号传导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域与细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
其他例示性抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造此类受体并将其引入细胞中的方法包括描述于例如以下中者：WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061；美国专利申请公开案第US2002131960号、第US2013287748号、第US20130149337号；美国专利第6,451,995号、第7,446,190号、第8,252,592号、第8,339,645号、第8,398,282号、第7,446,179号、第6,410,319号、第7,070,995号、第7,265,209号、第7,354,762号、第7,446,191号、第8,324,353号及第8,479,118号；以及欧洲专利申请案第EP2537416号，及/或以下描述者：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月；18(2):160-75。在一些方面中，抗原受体包括如美国专利第7,446,190号中所描述的CAR，这些WO/2014055668A1中所描述者。例示性CAR包括如任何前述公开案，例如WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利第7,446,190号、美国专利第8,389,282号中所揭示的CAR，例如其中抗原结合部分，例如scFv，经例如本文所提供的抗体置换。
其他靶向ROR1的CAR描述于例如Hudecek等人,Clin Cancer Res,19(12),3153-3164(2013)及Baskar等人,MAbs.4(3):349-361(2012)中。还参见WO2014031687；US2012/20058051。
a.细胞外抗原结合结构域
嵌合受体中有嵌合抗原受体(CAR)。嵌合受体，例如CAR一般包括细胞外抗原结合结构域，其包括一或多种所提供的抗ROR1抗体或抗原结合片段、为一或多种所提供的抗ROR1抗体或抗原结合片段、或被包含在一或多种所提供的抗ROR1抗体或抗原结合片段内。因此，嵌合受体，例如CAR，通常在其细胞外部分中包括一或多个ROR1结合分子，例如一或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一或多个抗体可变结构域，及/或抗体分子，例如本文所描述的抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一或多个ROR1结合部分，例如抗体的重链可变(VH)区及/或轻链可变(VL)区，例如scFv。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一或多个ROR1结合部分，例如抗体的重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，例如scFv。在一些方面中，CAR包括任何本文(例如I.A部分)中所描述的ROR1结合抗体或其抗原结合片段中的一种或多种。
在一些实施方案中，表2提供可包含在所提供的ROR1结合受体，例如抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)中的例示性抗原结合结构域，例如抗体或抗原结合片段的SEQ ID NO:。在一些方面中，CAR包含表2中所描述的scFv，例如作为细胞外抗原结合结构域的一部分。在一些方面中，CAR包含表2中所描述的VH区，例如作为细胞外抗原结合结构域的一部分。在一些方面中，CAR包含表2中所描述的VL区，例如作为细胞外抗原结合结构域的一部分。在一些实施方案中，ROR1结合受体含有ROR1结合抗体或其片段，其包括含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列的VH区及含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列的VL区，该CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列以及CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列为以表2每一列中所列SEQ ID NO:所示。在一些实施方案中，ROR1结合受体含有ROR1结合抗体或其片段，其包含以表2的每一列中所列SEQ ID NO:所示的VH区序列及VL区序列；或包含与以表2的每一列中所列SEQ ID NO:所示的VH区序列及VL区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的VH及VL区氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中，ROR1结合受体含有ROR1结合抗体或其片段，其包含以表2的每一列中所列SEQ ID NO:所示的VH区序列及VL区序列。在一些实施方案中，ROR1结合受体包括含以表2的每一列中所列SEQ ID NO所示的scFv序列的ROR1结合抗体或其片段，或包含与以表2的每一列中所列SEQ ID NO所示的scFv序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的scFv氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中，ROR1结合受体含有ROR1结合抗体或其片段，其包含以表2的每一列中所列SEQ ID NO:所示的scFv序列。
在一些实施方案中，所提供的CAR可包括含抗体的全部或一部分的细胞外抗原结合结构域，该抗体包括多克隆及单克隆抗体，包括完整抗体及功能性(抗原结合)抗体片段，包括抗原结合片段(Fab)、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的重链可变(VH)区、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)及单结构域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。在一些方面中，CAR中所含抗体或其片段包括免疫球蛋白的经基因工程改造及/或以其他方式修饰的形式，例如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人类抗体、人源化抗体，及异型共轭抗体、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、双功能抗体、三功能抗体及四功能抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。
b.间隔子
在一些实施方案中，重组受体，例如CAR，例如其抗体部分，进一步包括间隔子(在一些情况下又称为间隔子区)，其可为或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰形式的至少一部分，例如铰链区，例如IgG4铰链区、及/或CH1/CL、CH2及/或CH3及/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分属于人类IgG，例如IgG4、IgG2或IgG1。在一些方面中，恒定区的部分充当抗原识别组分(例如scFv)与跨膜结构域之间的间隔子。
在一些实施方案中，间隔子的长度经调整以使表达CAR的细胞(例如表达CAR的细胞)与CAR靶点(例如表达ROR1的肿瘤细胞)之间的生物物理学突触距离优化。在一些实施方案中，CAR由T细胞表达，且间隔子的长度调整成与T细胞活化兼容的长度或经调整以使CART细胞效能优化。
在一些实施方案中，间隔子的长度可使抗原结合之后细胞的反应性相较于在无间隔子存在下的情形或相较于长度不同(例如较长的长度)的替代间隔子增加。在一些实施例中，间隔子的长度为或为约12个氨基酸，或其长度不超过或不超过约12个氨基酸。在一些实施例中，间隔子的长度为或为约15个氨基酸，或其长度不超过或不超过约15个氨基酸。
例示性间隔子包括长度为至少或至少约10至或至约300个氨基酸、至少或至少约10至或至约229个氨基酸、至少或至少约10至或至约200个氨基酸、至少或至少约10至或至约175个氨基酸、至少或至少约10至或至约150个氨基酸、至少或至少约10至或至约125个氨基酸、至少或至少约10至或至约100个氨基酸、至少或至少约10至或至约75个氨基酸、至少或至少约10至或至约50个氨基酸、至少或至少约10至或至约40个氨基酸、至少或至少约10至或至约30个氨基酸、至少或至少约10至或至约20个氨基酸、或至少或至少约10至或至约15个氨基酸且包括在任何所列范围的两个端点之间的任何整数的间隔子。例示性间隔子包括具有至少或至少约50至或至约175个氨基酸、至少或至少约50至或至约150个氨基酸、至少或至少约10至或至约125个氨基酸、至少或至少约50至或至约100个氨基酸、至少或至少约100至或至约300个氨基酸、至少或至少约100至或至约250个氨基酸、至少或至少约125至或至约250个氨基酸、或至少或至少约200至或至约250个氨基酸且包括在任何所列范围的两个端点之间的任何整数的间隔子。在一些实施方案中，间隔子的长度至少或至少约12个氨基酸、至少或至少约119个氨基酸、至少或至少约125个氨基酸、至少或至少约200个氨基酸、或至少或至少约220个氨基酸、或至少或至少约225个氨基酸。在一些实施方案中，间隔子的长度至少或至少约13个氨基酸、至少或至少约120个氨基酸、至少或至少约125个氨基酸、至少或至少约200个氨基酸、或至少或至少约220个氨基酸、或至少或至少约229个氨基酸。在一些实施方案中，间隔子的长度为或为约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个氨基酸或更少。在一些实施方案中，间隔子的长度至少或至少约100个氨基酸，例如其长度至少或至少约110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个氨基酸。
在一些实施方案中，间隔子的长度至少或至少约125至或至约300个氨基酸、至少或至少约125至或至约250个氨基酸、至少或至少约125至或至约230个氨基酸、至少或至少约125至或至约200个氨基酸、至少或至少约125至或至约180个氨基酸、至少或至少约125至或至约150个氨基酸、至少或至少约150至或至约300个氨基酸、至少或至少约150至或至约250个氨基酸、至少或至少约150至或至约230个氨基酸、至少或至少约150至或至约200个氨基酸、至少或至少约150至或至约180个氨基酸、至少或至少约180至或至约300个氨基酸、至少或至少约180至或至约250个氨基酸、至少或至少约180至或至约230个氨基酸、至少或至少约180至或至约200个氨基酸、至少或至少约200至或至约300个氨基酸、至少或至少约200至或至约250个氨基酸、至少或至少约200至或至约230个氨基酸、至少或至少约230至或至约300个氨基酸、至少或至少约230至或至约250个氨基酸、或250至或至约300个氨基酸。在一些实施方案中，间隔子的长度至少或至少约129、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229或230个氨基酸，或任何前述值之间的长度。
例示性间隔子包括单独IgG铰链、连接至CH2及CH3结构域中的一或多个的IgG铰链、或连接至CH3结构域的IgG铰链。在一些实施方案中，间隔子包括单独IgG铰链。在一些实施方案中，IgG铰链、CH2及/或CH3可全部或部分地来源于IgG4或IgG2，例如来自人类IgG4或人类IgG2的全部或一部分。在一些实施方案中，间隔子可为含有来源于IgG4、IgG2及/或IgG2及IgG4的铰链、CH2及/或CH3序列中的一或多个的嵌合多肽。在一些实施方案中，铰链区包含IgG4铰链区的全部或一部分。在一些实施方案中，铰链区包含IgG4铰链区及/或IgG2铰链区的全部或一部分，其中该IgG4铰链区视情况为人类IgG4铰链区且该IgG2铰链区视情况为人类IgG2铰链区；CH2区含有IgG4 CH2区及/或IgG2 CH2区的全部或一部分，其中该IgG4 CH2区视情况为人类IgG4 CH2区且该IgG2 CH2区视情况为人类IgG2 CH2区；及/或CH3区含有IgG4CH3区及/或IgG2 CH3区的全部或一部分，其中该IgG4 CH3区视情况为人类IgG4 CH3区且该IgG2 CH3区视情况为人类IgG2 CH3区。在一些实施方案中，铰链、CH2及CH3包含来自IgG4的铰链区、CH2及CH3中的每一个的全部或一部分。在一些实施方案中，铰链区为嵌合的且包含来自人类IgG4及人类IgG2的铰链区；CH2区为嵌合的且包含来自人类IgG4及人类IgG2的CH2区；及/或CH3区为嵌合的且包含来自人类IgG4及人类IgG2的CH3区。在一些实施方案中，间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或相较于人类IgG4铰链区包含至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链；人类IgG2/4嵌合CH2区；及人类IgG4 CH3区。
在一些实施方案中，间隔子包含免疫球蛋白铰链或其经修饰形式的全部或一部分，或由其组成。在一些实施方案中，间隔子的长度为或为约15个氨基酸或更少。在一些实施方案中，间隔子包含免疫球蛋白铰链，视情况IgG4铰链，或其经修饰形式的全部或一部分，或由其组成，及/或包含约15个或更少氨基酸。在一些实施方案中，间隔子为或为约13个氨基酸长度及/或包含免疫球蛋白铰链，视情况IgG4或其经修饰形式的全部或一部分，或由其组成。在一些实施方案中，间隔子为或为约12个氨基酸长度及/或包含免疫球蛋白铰链，视情况IgG4或其经修饰形式的全部或一部分，或由其组成。在一些实施方案中，间隔子包含SEQ ID NO:1、26、27、28、29、31、32、33或135的序列、或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的前述任一个的变体。在一些实施方案中，间隔子包含式X1PPX2P(SEQ ID NO:25)，其中X1为甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸且X2为半胱氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，间隔子不包含CD28胞外区或CD8胞外区。在某些情况下，间隔子在C末端处具有甲硫氨酸残基。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ ID NO:1中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:2或30，或与SEQ ID NO:2或30具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:30编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ ID NO:135中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:192或136，或与SEQID NO:192或136具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:136编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，间隔子为或包含连接至例如人类免疫球蛋白，例如IgG4及/或IgG2的CH3结构域的IgG铰链。在一些方面中，间隔子的长度为或为约111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个氨基酸，或其长度在任何前述值之间。在一些方面中，间隔子的长度为或为约119或120个氨基酸。在一些实施方案中，间隔子包含SEQ ID NO:3或138的序列、或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的前述任一个的变体，或由其组成。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有与SEQ ID NO:138具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ IDNO:138中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:193或139，或与SEQ ID NO:193或139具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQID NO:139编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，间隔子的长度为或为约120个氨基酸。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有与SEQ ID NO:3具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ ID NO:3中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:4或137，或与SEQ IDNO:4或137具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:137编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，间隔子可全部或部分地来自IgG4及/或IgG2，且可含有突变，例如在一或多个结构域中含有一或多个单氨基酸突变。在一些实施例中，氨基酸修饰在IgG4的铰链区中脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在一些实施方案中，氨基酸修饰为谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)以减小糖基化异质性，例如在SEQ ID NO:48中所示的全长IgG4 Fc序列的CH2区中177位处的N177Q突变或在SEQ ID NO:49中所示的全长IgG2 Fc序列的CH2区中176位处的N176Q突变。在一些实施方案中，间隔子为或包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；以及IgG4 CH3区，且视情况为约228或229个氨基酸长度；或SEQ IDNO:37或194中所示之间隔子。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有与SEQ ID NO:194具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ IDNO:194中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:195或196，或与SEQ ID NO:195或196具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQID NO:196编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有与SEQ ID NO:37具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有SEQ IDNO:37中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQ ID NO:38或140，或与SEQ ID NO:38或140具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该间隔子为或含有由SEQID NO:140编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，间隔子为由经优化以进行密码子表达及/或消除剪接位点(例如隐蔽剪接位点)的聚核苷酸编码。在一些实施方案中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:30中所示的核酸序列。在一些实施方案中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:136中所示的核酸序列。在一些实施方案中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:137中所示的核酸序列。在一些实施方案中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:139中所示的核酸序列。在一些实施方案中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:140中所示的核酸序列。在一些实施方案中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:196中所示的核酸序列。
额外例示性间隔子包括(但不限于)以下中描述之间隔子：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol.Res.,3(2):125-135；或WO2014031687。在一些实施方案中，间隔子的核苷酸序列经优化以在表达时减小RNA异质性。在一些实施方案中，间隔子的核苷酸序列经优化以减少隐蔽剪接位点或降低在剪接位点处发生剪接事件的可能性。
在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，且由SEQ IDNO:2中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:135中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:192中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:4中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:138中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:193中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:38中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQID NO:194中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:195中所示的聚核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，该间隔子由视情况针对密码子使用优化及/或通过例如移除隐蔽剪接位点优化以降低RNA异质性的聚核苷酸编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQID NO:1中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:30中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:135中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:136中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:137中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:138中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:139中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:140中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，且由SEQID NO:196中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有与SEQ ID NO:1、3或37展现至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列且由视情况针对密码子使用优化及/或经优化以降低RNA异质性的聚核苷酸编码。在一些实施方案中，间隔子具有与SEQ ID NO:135、138或194展现至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列且由视情况针对密码子使用优化及/或经优化以降低RNA异质性的聚核苷酸编码。
c.跨膜结构域
抗原识别组分一般连接至一或多种细胞内信号传导组分，例如模拟经由抗原受体复合物(例如在CAR的情况下，TCR复合物)实现的活化及/或经由另一种细胞表面受体进行信号传导的信号传导组分。因此，在一些实施方案中，ROR1结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)连接至一或多个跨膜结构域(例如本文所描述的跨膜结构域)及包含一或多种细胞内组分(例如本文所描述的组分)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用与受体，例如CAR中的一个结构域天然地缔合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域经选择或由氨基酸取代修饰以避免此类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白质的跨膜结构域，由此使与受体复合物的其他成员的相互作用减到最少。
在一些实施方案中，跨膜结构域来源于天然或合成来源。在来源天然的情况下，在一些方面中，结构域来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域包括来源于以下的跨膜结构域(即，至少包含以下的跨膜结构域)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及/或CD154。举例而言，跨膜结构域可为包含SEQ ID NO:149中所示的氨基酸序列且由SEQ ID NO:147或148中所示的核酸序列编码的CD28跨膜结构域。举例而言，跨膜结构域可为包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列且由SEQ ID NO:197或198中所示的核酸序列编码的CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，受体，例如CAR的跨膜结构域为人类CD28或其变体的跨膜结构域，例如人类CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域、或28个氨基酸的序列，或包含SEQ IDNO:8或149中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8或149展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域由视情况针对密码子使用优化及/或通过例如移除隐蔽剪接位点优化以降低RNA异质性的聚核苷酸编码。在一些实施方案中，跨膜结构域具有SEQ ID NO:8或149中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:147、148、197或198中所示的聚核苷酸序列或与其具有至少90％序列一致性的聚核苷酸序列编码。在某些情况下，跨膜结构域在N末端处具有甲硫氨酸残基。
在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有SEQ ID NO:8或与SEQID NO:8具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有SEQ IDNO:8中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有由SEQ IDNO:197或198，或与SEQ ID NO:197或198具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有由SEQ ID NO:198编码的氨基酸序列。
在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有SEQ ID NO:149或与SEQID NO:149具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有SEQ IDNO:149中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有由SEQ IDNO:147或148，或与SEQ ID NO:147或148具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，该跨膜结构域为或含有由SEQ ID NO:148编码的氨基酸序列。
或者，在一些实施方案中，跨膜结构域为合成的。在一些方面中，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸及缬氨酸。在一些方面中，将在合成跨膜结构域的两端处发现苯丙氨酸、色氨酸及缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接通过接头、间隔子及/或跨膜结构域进行。
d.细胞内信号传导组分
细胞内信号传导结构域中有仿真或近似经由天然抗原受体产生的信号、经由此类受体与共刺激受体的组合产生的信号及/或经由单独共刺激受体产生的信号的结构域。在一些实施方案中，存在短寡核苷酸或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头，例如含有甘氨酸及丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸二联体，且其形成CAR的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间的连接。
受体，例如CAR，一般包括含至少一种或多种细胞内信号传导组分的细胞内信号传导区。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分或信号传导结构域，例如介导T细胞活化及细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ(CD3-ζ)链。因此，在一些方面中，ROR1结合抗体连接至一或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域及/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体，例如CAR，进一步包括例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16之类一或多个额外分子的一部分。举例而言，在一些方面中，CAR包括CD3-ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，当连接CAR时，CAR的细胞质结构域或细胞内信号传导区刺激及/或活化免疫细胞，例如经工程改造成表达CAR的T细胞的正常效应功能或反应中的至少一种。举例而言，在一些情形下，CAR诱导T细胞功能，例如细胞溶解活性或T辅助细胞活性，例如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分例如若转导效应功能信号，则被用于替代完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，该或这些细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列，且在一些方面中，还包括在天然环境中与此类受体协同作用以在抗原受体接合之后起始信号转导的辅受体的细胞质序列，及/或此类分子的任何衍生物或变体，及/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情形下，完全活化一般不仅需要经由TCR传导信号，而且需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全活化，CAR中还包括用于产生二级或共刺激信号的组分。在其他实施方案中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面中，额外CAR在相同细胞中表达且提供产生二级或共刺激信号的组分。
T细胞活化在一些方面中描述为由两类细胞质信号传导序列介导：经由TCR起始抗原依赖性初级活化的细胞质信号传导序列(初级细胞质信号传导序列)，及以非抗原依赖性方式起作用以提供二级或共刺激信号的细胞质信号传导序列(二级细胞质信号传导序列)。在一些方面中，CAR包括此类细胞质信号传导序列中的一种或两种。
在一些方面中，CAR包括调控TCR复合物的初级刺激及/或活化的初级细胞质信号传导序列。以刺激方式发挥作用的初级细胞质信号传导序列可含有信号传导基序，称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实施例包括来源于以下的初级细胞质信号传导序列：TCR或CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ及CD3ε。在一些实施方案中，CAR中的细胞内信号传导区含有来源于CD3ζ的细胞质信号传导结构域、其部分或序列。在一些实施方案中，CD3ζ包含SEQ ID NO:13、14或15中所示的氨基酸序列且由SEQ ID NO:150或182中所示的核酸序列编码。在一些实施方案中，CD3ζ由视情况针对密码子使用优化及/或通过例如移除隐蔽剪接位点优化以降低RNA异质性的聚核苷酸编码。在一些实施方案中，CD3ζ具有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:150中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人类CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，例如人类CD3ζ的同功异型物3(登录号：P20963.2)的112个AA的细胞质结构域，或如美国专利第7,446,190号或美国专利第8,911,993号中所描述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13、14或15展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激分子，例如T细胞共刺激分子的信号传导结构域(例如细胞内或细胞质信号传导结构域)及/或跨膜部分。例示性共刺激分子包括CD28、4-1BB、OX40、DAP10及ICOS。举例而言，共刺激分子可来源于4-1BB，且可包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO:154或155中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，来自4-1BB的共刺激分子由视情况针对密码子使用优化及/或通过例如移除隐蔽剪接位点优化以降低RNA异质性的聚核苷酸编码。在一些实施方案中，来自4-1BB的共刺激分子具有SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:155中所示的聚核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB或其功能变体或部分的细胞内共刺激信号传导结构域，例如人类4-1BB(登录号Q07011.1)或其功能变体或部分的42个氨基酸的细胞质结构域，例如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激分子可来源于CD28且可包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO:183中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人类CD28或其功能变体或其部分的细胞内共刺激信号传导结构域，例如其41个氨基酸的结构域，及/或在原初CD28蛋白质的位置186-187处具有LL经GG取代的此类结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域可包含SEQ ID NO:10或11中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10或11展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些方面中，该CAR包括刺激或活化组分(例如细胞质信号传导序列)及共刺激组分。
在一些方面中，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域与跨膜结构域可直接地或间接地连接。在一些实施方案中，细胞外结构域与跨膜结构域由间隔子，例如本文所描述的任何间隔子连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，例如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间的细胞内结构域。在一些方面中，T细胞共刺激分子为CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，刺激或活化组分被包括在一个CAR内，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括在相同细胞上表达的活化或刺激CAR及共刺激CAR(参见WO2014/055668)。在一些方面中，靶向ROR1的CAR刺激或活化CAR；在其他方面中，其为共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月))，例如识别除ROR1之外的抗原的CAR，其中通过抑制性CAR与其配体的结合来减弱或抑制经由靶向ROR1的CAR递送的活化信号，以例如减少脱靶效应。
在一些实施方案中，两种受体分别将活化及抑制信号诱导至细胞，使得一种受体连接至其抗原将活化细胞或诱导反应，但第二种抑制性受体连接至其抗原将诱导抑制或减弱该反应的信号。实施例为活化性CAR及抑制性CAR(iCAR)的组合。此类策略可用于例如在活化性CAR结合在疾病或病况中表达且还在正常细胞上表达的抗原且抑制性受体结合至在正常细胞上表达但不在疾病或病况细胞上表达的独立抗原的情形下降低脱靶效应的可能性。
在一些方面中，嵌合受体为或包括抑制性CAR(例如iCAR)且包括减弱或抑制细胞中的免疫反应，例如ITAM及/或共刺激促进的反应的细胞内组分。例示性此类细胞内信号传导组分在免疫检查点分子，包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、包括A2AR在内的EP2/4腺苷受体上发现的细胞内信号传导组分。在一些方面中，经工程改造的细胞包括抑制性CAR，其包括此类抑制性分子的信号传导结构域或来源于此类抑制性分子的信号传导结构域，使得其用以减弱细胞的反应，例如由活化及/或共刺激CAR诱导的反应。
在某些实施方案中，细胞内信号传导区包含连接至CD3(例如CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜结构域及信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28及4-1BB(CD137；TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR在细胞质部分中包含一或多个，例如两个或两个以上共刺激结构域及一个刺激或活化结构域，例如初级活化结构域。例示性CAR包括CD3-ζ、CD28及4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，所提供的抗ROR1 CAR的实施方案包括含任何本文中，例如I.A.1部分及/或表2中所描述的抗ROR1抗体或抗原结合片段的细胞外抗原结合结构域；含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链的间隔子，例如长度为约12个氨基酸的间隔子，或SEQID NO:1中所示的间隔子，例如由SEQ ID NO:2或30中所示的核苷酸序列编码的间隔子；跨膜结构域，例如来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导区。在一些实施方案中，所提供的抗ROR1 CAR的实施方案包括含任何本文中，例如I.A.1部分及/或表2中所描述的抗ROR1抗体或抗原结合片段的细胞外抗原结合结构域；含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链的间隔子，例如长度为约13个氨基酸的间隔子，或SEQ ID NO:135中所示的间隔子，例如由SEQ ID NO:136或192中所示的核苷酸序列编码的间隔子；跨膜结构域，例如来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导区。
在一些实施方案中，所提供的抗ROR1 CAR的实施方案包括含任何本文中，例如I.A.1部分及/或表2中所描述的抗ROR1抗体或抗原结合片段的细胞外抗原结合结构域；含经修饰的IgG4铰链-CH3的间隔子，例如长度为约119个氨基酸的间隔子，或SEQ ID NO:3中所示的间隔子，例如由SEQ ID NO:4或137中所示的核苷酸序列编码的间隔子；跨膜结构域，例如来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导区。在一些实施方案中，所提供的抗ROR1 CAR的实施方案包括含任何本文中，例如I.A.1部分及/或表2中所描述的抗ROR1抗体或抗原结合片段的细胞外抗原结合结构域；含经修饰的IgG4铰链-CH3的间隔子，例如长度为约120个氨基酸的间隔子，或SEQ ID NO:138中所示的间隔子，例如由SEQ ID NO:193或139中所示的核苷酸序列编码的间隔子；跨膜结构域，例如来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导区。
在任何此类实施方案中的一些中，跨膜结构域为或包含SEQ ID NO:8中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，跨膜结构域为或包含SEQ ID NO:149中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，共刺激信号传导区为人类CD28、人类4-1BB或人类ICOS或其信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域为人类4-1BB的细胞内信号传导结构域。在任何此类实施方案中的一些中，细胞内信号传导结构域为或包含SEQ ID NO:12中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，细胞质信号传导结构域人类CD3-ζ细胞质信号传导结构域，例如SEQ ID NO:13中所示。在任何此类实施方案中的一些中，细胞内信号传导区包含SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:12中所示的序列。在任何此类实施方案中的一些中，本文I.D部分、表3中及/或表E1中描述者。还提供由本文I.E部分中、表3中及/或表E1中所描述的聚核苷酸编码的CAR。还提供含有任何本文所描述的核苷酸序列的聚核苷酸，其例如编码所提供的结合分子的全部或一部分。在某些情况下，跨膜结构域在N末端处具有甲硫氨酸残基。在某些情况下，间隔子在C末端处具有甲硫氨酸残基。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ IDNO:184、185、186、187、188或189中所示的序列，或与SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR具有SEQ ID NO:184中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:184中所示的氨基酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR具有SEQ ID NO:185中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:185中所示的氨基酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR具有SEQ ID NO:186中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:186中所示的氨基酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR具有SEQ ID NO:187中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:187中所示的氨基酸序列至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR具有SEQ ID NO:188中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:188中所示的氨基酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1CAR具有SEQ ID NO:189中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:189中所示的氨基酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方案中的一些中，该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列，或与SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列编码。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR为由SEQ ID NO:156中所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:156中所示的核苷酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR为由SEQ ID NO:157中所示的核苷酸序列或与SEQ IDNO:157中所示的核苷酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR为由SEQ ID NO:158中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:158中所示的核苷酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR为由SEQ ID NO:159中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:159中所示的核苷酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR为由SEQ ID NO:160中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:160中所示的核苷酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。在任何实施方案中的一些中，抗ROR1 CAR为由SEQID NO:161中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:161中所示的核苷酸序列具有至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。
2.例示性特征
在任何所提供的实施方案中的一些中，所提供的含有ROR1结合抗体或其片段的重组受体，例如CAR结合至，例如特异性结合至ROR1，例如癌细胞或肿瘤细胞表面上的ROR1。在这些实施方案中的任一个中，所提供的CAR中的抗体或抗原结合片段特异性结合ROR1，例如人类ROR1。例示性结合ROR1的重组受体，例如CAR，可展现任何结合亲和力、结合特异性及/或如本文中，例如I.A.2部分中所描述的抗原识别的其他特征，例如物种交叉反应性。在一些实施方案中，包括含抗体或其片段的细胞外抗原结合结构域的CAR展现与该抗体或其片段类似或实质上相同的结合特性及特征。在一些情况下，包括含抗体或其片段的细胞外抗原结合结构域的CAR展现与该抗体或其片段不同的结合特性及特征。
在一些实施方案中，所提供的CAR特异性结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白质。在本文任何实施方案中的一些中，ROR1指人类ROR1。抗体或其他结合分子(例如CAR)结合至ROR1或特异性结合至ROR1的观察结果未必意谓其结合至每一物种的ROR1。举例而言，在一些实施方案中，结合至ROR1的特征，例如与ROR1特异性结合及/或与含有参考抗体的参考受体，例如参考CAR竞争结合至ROR1，及/或在一些实施方案中以特定亲和力结合或在特定程度上竞争的能力指针对人类ROR1蛋白质的能力，且该抗体针对另一个物种(例如小鼠)的ROR1可能不具有此特征。在一些实施方案中，CAR结合至人类ROR1且结合至另一个物种，例如恒河猕猴或猕猴的ROR1。在一些实施方案中，CAR或其抗原结合片段结合至人类ROR1且不结合至另一个物种，例如小鼠的ROR1。在一些实施方案中，CAR结合至人类ROR1且结合至另一个物种，例如小鼠的ROR1。
在一些实施方案中，CAR结合至，例如特异性结合至人类ROR1，例如人类ROR1，例如SEQ ID NO:144中所示的人类ROR1(GenBank编号AAA60275.1；SEQ ID NO:215中所示的包括信号肽的序列，Uniprot编号Q01973)，或其等位基因变体或剪接变体的抗原决定基或区域。在一个实施方案中，人类ROR1具有SEQ ID NO:145或146中所示的氨基酸序列的转录物变体或同功异型物。在一些实施方案中，人类ROR1蛋白质包含SEQ ID NO:144、145、146或215中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR结合至ROR1的胞外区，例如人类ROR1的胞外区内存在的一或多个细胞外抗原决定基，例如对应于SEQ ID NO:144中所示的人类ROR1序列的残基1-377(对应于包括信号肽在内的SEQ ID NO:215中所示的人类ROR1序列的残基30-406)。
在一些实施方案中，CAR结合ROR1，例如人类ROR1的线性抗原决定基。在一些实施方案中，该一或多个抗原决定基包含构形抗原决定基。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段结合ROR1，例如人类ROR1的一或多个构形抗原决定基。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段结合人类ROR1的一或多个抗原决定基，例如包括序列FRSTIYGSRLRIRNL(如SEQ ID NO:199中所示)或SEQ ID NO:200-214中的任一个或本文表E2中所示的序列的一或多个抗原决定基。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段结合人类ROR1的一或多个抗原决定基，例如包括序列FRSTIYGSRLRIRNL(如SEQ ID NO:199中所示)的一或多个抗原决定基。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段除结合序列FRSTIYGSRLRIRNL(如SEQ ID NO:199中所示)外，还结合额外抗原决定基，例如一或多个构形抗原决定基。例示性一或多个额外抗原决定基包括(但不限于)SEQ ID NO:200-214中的任一个或本文表E2中所示的序列中的一或多个。
在一些实施方案中，该抗体结合至非人类ROR1，例如恒河猕猴(Macaca mulatta)ROR1(如SEQ ID NO:216中所示，Uniprot编号F6RUP2)或食蟹猕猴(Macaca fasicularis)ROR1(如SEQ ID NO:217中所示，Uniprot编号A0A2K5WTX7；或如SEQ ID NO:218中所示，Uniprot编号A0A2K5WTX4)。在一些方面中，非人类ROR1的细胞外结构域与人类ROR1序列至少99％一致。
在一些实施方案中，CAR结合至非人类ROR1，例如猴、兔、大鼠、小鼠或其他物种的ROR1。在一些实施方案中，CAR结合至小鼠(Mus musculus小家鼠)ROR1，例如小鼠ROR1，例如SEQ ID NO:171中所示的小鼠ROR1(GenBank编号NP_038873；SEQ ID NO:219中所示的包括信号肽的序列，Uniprot编号Q9Z139)的抗原决定基或区域。在一些实施方案中，CAR结合至人类ROR1且结合至小鼠ROR1。在一些实施方案中，一些所提供的抗ROR1抗体或其片段与非人类ROR1，例如小鼠ROR1的结合的范围为CAR与人类ROR1的结合的至少或至少约75％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或更高百分比。在一些实施方案中，这些抗体不结合至小鼠ROR1，例如SEQ ID NO:171中所示的小鼠ROR1。
在任何所提供的实施方案中的一些中，CAR，例如含有ROR1结合抗体或其抗原结合片段的CAR的结合范围不结合至非人类ROR1，视情况小鼠ROR1，不与其交叉反应，或以较低范围、水平或程度或亲和力与其结合。在一些实施方案中，抗ROR1抗体与不相关、非ROR1蛋白质或与非人类ROR1蛋白质，例如小鼠ROR1蛋白质，或其他非ROR1蛋白质的结合的范围低于或约低于所测量的CAR与人类ROR1的结合的50％、40％、30％、20％或10％。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段不结合至小鼠ROR1，例如SEQ ID NO:171或219中所示的小鼠ROR1。
在任何所提供的实施方案中的一些中，CAR或其抗原结合片段不结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质，视情况为人类ROR2蛋白质；不与其交叉反应；或以较低范围、水平或程度或亲和力与其结合。在一些实施方案中，一些所提供的CAR，例如含有ROR1结合抗体或其片段的CAR与非ROR1蛋白质，例如ROR2蛋白质的结合的范围比CAR与人类ROR1的结合低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段不结合至ROR2蛋白质，视情况为人类ROR2蛋白质，不与其交叉反应，或以较低水平或程度或亲和力与其结合。在一些实施方案中，所提供的CAR，例如含有ROR1结合抗体或其片段的CAR中有与小鼠ROR1的结合小于或约小于CAR与人类ROR1的结合的30％、20％或10％，例如小于或约小于10％。在一些实施方案中，所提供的CAR，例如含有ROR1结合抗体或其片段的CAR中有与ROR2，例如人类ROR2的结合小于或约小于CAR与人类ROR1的结合的30％、20％或10％，例如小于或小于约10％。在一些实施方案中，视情况在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体，所提供的CAR展现相同、实质上相同或较低水平或程度或亲和力的与ROR2蛋白质的结合。在一些方面中，与特定抗原(例如人类ROR1)的结合亲和力及/或特异性可使用评估结合的任何方法，例如本文I.A.2部分中所描述的任何方法评估。
在一些实施方案中，如通过多种已知方法中的任一种所测量，所提供的CAR能够以至少一定亲和力结合ROR1，例如人类ROR1。在一些实施方案中，亲和力由平衡解离常数(KD)表示。在一些实施方案中，亲和力由EC50表示。
在一些实施方案中，结合分子，例如CAR结合至，例如特异性结合至抗原，例如ROR1蛋白质或其中的抗原决定基，且其亲和力或KA(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M或M-1；假设双分子相互作用，等于此缔合反应的缔合速率[kon或ka]与解离速率[koff或kd]的比率)、结合亲和力(EC50)及/或平衡解离常数(KD；即，特定结合相互作用的平衡解离常数，单位为M；假设双分子相互作用，等于此缔合反应的解离速率[koff或kd]与缔合速率[kon或ka]的比率)或解离速率(解离速率常数；koff或kd)如本文中，例如本文I.A.2部分中所描述。举例而言，平衡解离常数KD范围可自10-5M至10-13M，例如10-7M至10-11M、10-7M至10-10M、10-7M至10-9M、10-8M至10-10M或10-9M至10-10M。
在某些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1 CAR与ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的结合亲和力(EC50)及/或平衡解离常数KD为或为约或小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM或更低，或由前述任何值所界定的范围。在一些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1 CAR与ROR1蛋白质的EC50及/或KD在或在约10nM与或与约90nM之间、在或在约20nM与或与约80nM之间、在或在约30nM与或与约70nM之间、在或在约40nM与或与约60nM之间、或在或在约40nM与或与约50nM之间。在某些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1 CAR与ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的EC50及/或KD为或为约10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM或100nM，或由前述任何值所界定的范围。在某些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1CAR与ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的EC50及/或KD为或为约10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM或100nM，或由前述任何值所界定的范围。在某些实施方案中，结合分子，例如抗ROR1 CAR与ROR1蛋白质，例如人类ROR1蛋白质的EC50及/或KD为或为约40nM、41nM、42nM、43nM、44nM或45nM，或由前述任何值所界定的范围。
在一些实施方案中，所提供的结合分子，例如抗ROR1 CAR具有较快解离速率(解离速率常数；koff或kd；单位为1/s或s-1)。在一些实施方案中，所提供的结合分子的解离速率(koff或kd)在或在约1×10-5s-1与或与约1×10-2s-1之间，例如在或在约5×10-5s-1与或与约9×10-3s-1之间、在或在约1×10-4s-1与或与约8×10-3s-1之间、在或在约5×10-4s-1与或与约7×10-3s-1之间、在或在约1×10-3s-1与或与约6×10-3s-1之间及在或在约4×10-3s-1与或与约6×10-3s-1之间。在一些实施方案中，所提供的结合分子的解离速率(koff或kd)至少或至少约1×10-5s-1、5×10-5s-1、1×10-4s-1、5×10-4s-1、1×10-3s-1、5×10-3s-1或1×10-2s-1。在一些实施方案中，所提供的结合分子的解离速率(koff或kd)至少或至少约6×10-4s-1、7×10-4s-1、8×10-4s-1、9×10-4s-1、1×10-3s-1、2×10-3s-1、3×10-3s-1、4×10-3s-1、5×10-3s-1、6×10-3s-1、7×10-3s-1、8×10-3s-1、9×10-3s-1或1×10-2s-1。在一些实施方案中，所提供的结合分子的解离速率(koff或kd)至少或至少约4×10-3s-1、5×10-3s-1或6×10-3s-1，或由前述任何值所界定的范围。在一些实施方案中，所提供的结合分子，例如抗ROR1 CAR的解离速率比参考抗ROR1CAR，例如抗ROR1CAR R12的解离速率快至少或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在一些实施方案中，可比较结合分子，例如抗ROR1 CAR对不同抗原，例如来自不同物种的ROR1蛋白质的结合亲和力以确定物种交叉反应性。举例而言，物种交叉反应性可分类为高交叉反应性或低交叉反应性。在一些实施方案中，可比较针对不同抗原，例如来自不同物种，例如来自人类、食蟹猕猴或小鼠的ROR1蛋白质的平衡解离常数KD以确定物种交叉反应性。在一些实施方案中，抗ROR1 CAR的物种交叉反应性可较高，例如抗ROR1 CAR与人类ROR1及与物种变体ROR1以类似程度结合，例如针对人类ROR1的KD与针对物种变体ROR1的KD的比率为或为约1。在一些实施方案中，抗ROR1 CAR的物种交叉反应性可较低，例如抗ROR1CAR对人类ROR1具有高亲和力，但对物种变体ROR1具有低亲和力，或反之亦然。举例而言，针对物种变体ROR1的KD与针对人类ROR1的KD的比率超过10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或更高，且该抗ROR1 CAR具有低物种交叉反应性。物种交叉反应性的程度可与已知CAR，例如参考CAR的物种交叉反应性相比较。
在一些实施方案中，所提供的CAR的特性或特征相对于所观察到的另一种CAR，例如参考CAR的特性描述。在一些实施方案中，参考CAR含有本文所描述的参考抗体或其片段，例如命名为R12的嵌合兔/人类IgG1抗体(参见例如Yang等人(2011)PloS ONE,6:e21018；美国专利申请案第US 2013/0251642号)；命名为2A2的小鼠抗人类ROR1抗体(参见例如Baskar等人(2012)MAbs,4:349-361；公开的美国专利申请案第US2012/20058051号)；国际PCT申请案第WO2014/031174号中所描述的人源化抗ROR1抗体；命名为99961的抗体的人源化变体作为细胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，CAR的亲和力大致等于或小于相应形式的参考CAR的亲和力，例如其EC50或KD比相应形式的参考CAR的EC50或KD要高不超过或不超过约1.5倍、或不超过或不超过约2倍、不超过或不超过约3倍及/或不超过或不超过约10倍。在一些实施方案中，CAR的亲和力大致等于或小于相应形式的参考CAR的亲和力，例如其EC50或KD比相应形式的参考CAR的EC50或KD要高至少或至少约1.5倍、至少或至少约2倍、至少或至少约3倍、至少或至少约5倍、至少或至少约10倍、至少或至少约20倍、至少或至少约25倍、至少或至少约30倍、至少或至少约40倍、至少或至少约50倍、或至少或至少约100倍。在一些实施方案中，CAR的亲和力大致等于或小于相应形式的参考CAR的亲和力，即，其亲和力比参考CAR的亲和力低或低约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或100倍。
在一些实施方案中，CAR的亲和力高于相应形式的参考CAR的亲和力，例如其EC50或KD比相应形式的参考CAR的EC50或KD低或低约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍或更低。
在一些实施方案中，CAR特异性结合至与参考CAR所结合的ROR1抗原决定基重叠的抗原决定基。在一些方面中，此类CAR中有与参考CAR结合至相同或类似的抗原决定基的CAR。在一些实施方案中，CAR与参考CAR，例如抗ROR1 CAR R12或其scFv片段(如SEQ ID NO:142中所示；参见例如Yang等人(2011)PloS ONE,6:e21018)结合至相同或类似抗原决定基或在ROR1的相同区域内或含有ROR1相同区域内的残基的抗原决定基。在一些实施方案中，CAR抑制参考CAR与ROR1，例如人类ROR1的结合及/或与参考CAR竞争结合至ROR1。
所提供的CAR中有展现抗原依赖性活性或信号传导，即，在无抗原，例如ROR1存在下及/或在非特异性抗原存在下明显不存在信号传导活性或存在背景水平的信号传导活性的CAR。因此，在一些方面中，所提供的CAR在无抗原，例如ROR1存在下不展现或仅展现背景水平或可耐受水平或较低水平的持续性信号传导或非抗原依赖性活性或信号传导。在一些实施方案中，所提供的表达抗ROR1 CAR的细胞展现生物活性或功能，包括细胞毒性活性、细胞因子产生及增殖能力。在一些实施方案中，视情况在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体，所提供的CAR受体展现相同、实质上相同或较高的抗原特异性信号传导及/或抗原依赖性活性或信号传导。
在一些实施方案中，所提供的CAR在无抗原，例如ROR1存在下不展现、展现降低或较低水平的活性或信号传导。在一些实施方案中，所提供的CAR展现降低、较低的持续性信号传导或非抗原依赖性信号传导或活性，或几乎不存在或完全不存在持续性信号传导或非抗原依赖性信号传导或活性，例如在无抗原存在下的信号传导或活性，使得该信号传导或活性小于或约小于该CAR在人类ROR1存在下的信号传导或活性的30％、20％或10％，例如小于或小于约10％。在一些实施方案中，视情况在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体(CAR)，所提供的CAR展现相同、实质上相同或较低的持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导。在一些方面中，在经工程改造成表达CAR的复数个细胞或细胞群中，该复数个中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％、或小于或小于约1％的细胞包含展现持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，参考ROR1特异性CAR包括具有的抗原结合结构域包含任何本文所描述的参考抗ROR1抗体，例如本文I.A.2部分中所描述者，例如R12、A2A或99961，或其抗原结合片段的CAR。
在一些实施方案中，所提供的CAR当暴露于非特异性抗原，例如不同但相关的蛋白质，例如ROR2时，不展现、展现降低或较低水平的活性或信号传导。在一些实施方案中，视情况在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体，所提供的CAR展现相同、实质上相同或较低水平或程度或亲和力的与ROR2蛋白质的结合。在一些实施方案中，所提供的CAR在ROR2例如人类ROR2存在下展现降低的信号传导或活性，使得该信号传导或活性小于或约小于在人类ROR1存在下该CAR的信号传导或活性的30％、20％或10％，例如小于或小于约10％。
在一些实施方案中，表达所提供的抗ROR1 CAR的经工程改造的细胞当在过继细胞疗法中给予受试者时，展现改善的生物活性或功能活性，例如抗肿瘤活性、肿瘤生长抑制、肿瘤体积减小、存留性、扩增或受试者的延长的存活期。在一些实施方案中，视情况在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于表达参考ROR1特异性嵌合抗原受体的经工程改造的细胞，表达所提供的CAR的经工程改造的细胞展现改善的生物活性或功能活性，例如抗肿瘤活性、肿瘤生长抑制、肿瘤体积减小、存留性、扩增或受试者的延长的存活期。在一些实施方案中，嵌合受体的生物活性或功能活性，例如细胞毒性活性，可使用多种已知方法中的任一种测量。该活性可以在活体外或活体内评估或测定。在一些实施方案中，可以在将细胞给予受试者(例如人类)之后评估活性。评估的参数包括经工程改造或天然的T细胞或其他免疫细胞与抗原例如在活体内特异性结合，例如通过成像测定；或离体特异性结合，例如通过ELISA或流动式细胞测量术测定。在某些实施方案中，经工程改造的细胞破坏靶细胞的能力可使用本领域中已知的任何适合方法测量，例如以下中所描述的细胞毒性分析：例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；及Herman等人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，细胞的生物活性还可通过分析某些细胞因子的表达及/或分泌来测量，这些细胞因子为例如白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFNγ)、白介素-4(IL-4)、TNF-α(TNFα)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、CD107a及/或TGF-β(TGFβ)。测量细胞因子的分析为本领域熟知的，且包括(但不限于)ELISA、细胞内细胞因子染色、流式细胞小球微阵列术(cytometric bead array)、RT-PCR、ELISPOT、流动式细胞测量术及生物分析，其中在测试样品存在下测试细胞响应于相关细胞因子的反应性(例如增殖)。在一些方面中，生物活性可使用疾病或病况的动物模型，例如肿瘤异种移植模型，并评估肿瘤负荷或负载的减小及/或存活率来测量。在一些方面中，生物活性通过评估临床结果，例如肿瘤负荷或负载的减小来测量。
在一些实施方案中，相较于给予表达参考CAR，例如抗ROR1R12的经工程改造的细胞，给予表达所提供的抗ROR1 CAR的经工程改造的细胞展现实质上改善的肿瘤生长抑制、活体内存留性及/或患有肿瘤的受试者的延长的存活期。在一些方面中，在患有各种类型的表达ROR1的癌症，包括(但不限于)肺癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、卵巢癌或套细胞淋巴瘤(MCL)的受试者中观察到此类改善。
在一些实施方案中，表达所提供的抗ROR1 CAR的经工程改造的细胞当在过继细胞疗法中给予受试者时，展现改善的存留性及扩增。在一些实施方案中，视情况在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于表达参考ROR1特异性嵌合抗原受体的经工程改造的细胞，表达所提供的CAR的经工程改造的细胞展现相同、实质上相同或较高的存留性及扩增。在一些方面中，表达任何所提供的受体(例如CAR)的经工程改造的细胞的增殖、扩增及/或存留可通过测定这些经工程改造的细胞，例如在过继细胞疗法中给予的细胞的暴露量、数量、浓度、存留及增殖来评估。在一些实施方案中，可评估例如来自给予了经工程改造的细胞的受试者，例如人类受试者或动物受试者的经工程改造的T细胞，例如在基于T细胞的疗法中给予的T细胞，或其子集，例如CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD3+CAR+细胞、CD4+CAR+细胞或CD8+CAR+细胞的暴露量、数量或水平。在一些方面中，该暴露量、数量、浓度、存留及增殖与药物动力学参数相关。在一些情况下，药物动力学可通过在给予后测量例如最大(峰值)血浆浓度(Cmax)、峰值时间(还即，出现最大血浆浓度(Cmax)的时间；Tmax)、最小血浆浓度(还即，各剂治疗剂，例如CAR+T细胞之间的最小血浆浓度；Cmin)、消除半衰期(T1/2)及曲线下面积(即，通过将时间相对于治疗剂CAR+T细胞的血浆浓度作图产生的曲线下面积；AUC)之类参数来评估。在给予后，血浆中特定治疗剂，例如CAR+T细胞的浓度可使用适于评估血液样品中治疗剂，例如CAR+T细胞的浓度的任何已知方法，或本文所描述的任何方法测量。举例而言，可使用基于核酸的方法，例如基于定量PCR(qPCR)或流动式细胞测量术的方法、或其他分析，例如免疫分析、ELISA或基于层析/质谱的分析。
在一些方面中，可采用报告分子细胞株监测经由表达抗ROR1CAR的细胞产生的非抗原依赖性活性及/或持续性信号传导。在一些实施方案中，T细胞株，例如Jurkat细胞株含有在内源性Nur77转录调控组件控制下表达的报告分子，例如荧光蛋白或其他可检测分子，例如红色荧光蛋白。在一些实施方案中，Nur77报告分子表达细胞固有的且取决于经由在T细胞中含有初级活化信号的重组报告分子、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域及/或包含免疫受体酪氨酸活化基元(ITAM)的信号传导结构域，例如CD3ζ链进行的信号传导。Nur77表达一般不受其他信号传导路径，例如细胞因子信号传导或toll样受体(toll-likereceptor，TLR)信号传导的影响，其可以细胞外源性方式作用且可能不依赖于经由重组受体进行的信号传导。因此，仅表达含有适当信号传导区的外源重组受体，例如抗ROR1 CAR的细胞在刺激(例如结合特定抗原)时能够表达Nur77。在一些情况下，Nur77表达还可对刺激(例如抗原)量显示出剂量依赖性反应。
在一些情况下，为评估受体(例如CAR)的特定活性、信号传导或功能的特异性、交叉反应性及/或抗原依赖性，可在特异性靶点抗原，例如人类ROR1存在及不存在下，或在特异性靶点抗原，例如人类ROR1存在下，及在不同、非特异性抗原，例如人类ROR2或非人类ROR1，例如小鼠ROR1存在下评估任何所描述的用于评估受体的活性、信号传导或生物功能的分析。
在任何实施方案中的一些中，例如在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于在ROR1蛋白质，例如人类ROR1存在下信号传导或活性的水平或程度，所提供的抗ROR1 CAR在ROR2蛋白质，例如人类ROR2存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。举例而言，在一些方面中，例如在相同或实质上相同的条件或分析下，所提供的抗ROR1 CAR在人类ROR2存在下展现的信号传导或活性的水平或程度比在人类ROR1存在下的信号传导或活性的水平或程度低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。
在任何实施方案中的一些中，例如在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于参考ROR1特异性CAR，所提供的抗ROR1 CAR在ROR2蛋白质，例如人类ROR2存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。在任何实施方案中的一些中，例如在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于参考ROR1特异性CAR，所提供的抗ROR1CAR在ROR2蛋白质，例如人类ROR2存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。在任何实施方案中的一些中，例如在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于参考ROR1特异性CAR，所提供的抗ROR1 CAR受体展现相同、实质上相同或较高的抗原特异性信号传导及/或抗原依赖性活性或信号传导。
在任何实施方案中的一些中，例如在相同或实质上相同的条件或分析下，相较于参考ROR1特异性CAR，所提供的抗ROR1 CAR展现相同、实质上相同或较低的持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导。举例而言，在一些实施方案中，例如在相同或实质上相同的条件或分析下，所提供的抗ROR1 CAR展现的持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导的水平或程度比参考ROR1特异性CAR的持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性的水平或程度低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，所提供的抗ROR1 CAR例如相较于具有一致氨基酸序列但由除去非剪接位点及/或密码子优化的核苷酸序列编码的替代性CAR在细胞表面上展现出改善的表达。在一些实施方案中，可评估在细胞表面上重组受体的表达。用于测定细胞表面上重组受体的表达的方法可包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):177ra38)、蛋白质L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)、抗原决定基标签及特异性结合至CAR多肽的单克隆抗体(参见WO2014190273)。在一些实施方案中，可例如通过流动式细胞测量术，使用能可检测地结合至重组受体或其部分的结合分子评估细胞，例如初代T细胞的表面上重组受体的表达。在一些实施方案中，用于检测重组受体的表达的结合分子为抗受试者基因型抗体，例如对结合结构域，例如scFv具特异性的抗受试者基因型促效剂抗体或其部分。在一些实施方案中，结合分子为或包含分离或纯化的抗原，例如以重组方式表达的抗原。
E.编码结合分子的聚核苷酸
还提供编码结合分子，例如抗ROR1抗体、其抗原结合片段、重组受体(例如嵌合抗原受体)及/或其部分，例如其链或片段的聚核苷酸。所提供的聚核苷酸中有编码本文所描述的抗ROR1抗体(例如抗原结合片段)或嵌合抗原受体的聚核苷酸。聚核苷酸可包括含天然及/或非天然存在的核苷酸及碱基的聚核苷酸，例如包括具有主链修饰的聚核苷酸。术语“核酸分子”、“核酸”、“核苷酸序列”及“聚核苷酸”可互换使用，且指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然及/或非天然核苷酸且包括(但不限于)DNA、RNA及PNA。“核酸序列”指构成核酸分子或聚核苷酸的核苷酸的线性序列。
提供聚核苷酸，其含有编码本文所描述的抗ROR1抗体或其抗原结合结构域中的任一种，或其任何部分、片段、链或结构域的核酸。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段含有多个结构域或链(例如重链及轻链)，且该抗体或其抗原结合片段全部在一个聚核苷酸中编码。还提供含有编码本文所描述的单链细胞表面蛋白质中的任一种的核酸的聚核苷酸。还提供含有编码本文所描述的偶联物中的任一种的核酸的聚核苷酸。还提供含有编码本文所描述的抗ROR1嵌合抗原受体中的任一种的核酸的聚核苷酸。在一些实施方案中，结合分子，例如抗体或其抗原结合片段或重组受体，含有多个结构域或链(例如重链及轻链)，且该结合分子全部在多于一个聚核苷酸，例如两个或两个以上聚核苷酸中编码。在一些实施方案中，这些聚核苷酸包含在载体中。
在一些方面中，提供聚核苷酸，其含有编码本文在例如I.A及I.D部分中所提供的结合分子中的任一个的核酸序列。在一些实施方案中，提供聚核苷酸，其含有编码本文例如在I.A及I.D部分中所提供的结合分子中的任一个的一部分、片段、链或结构域的核酸序列。
在一些情况下，编码ROR1结合分子，例如抗体或其抗原结合片段或重组受体(例如CAR)的聚核苷酸含有编码信号肽的信号序列，在一些情况下为在编码ROR1结合分子，例如抗体或其抗原结合片段或重组受体(例如CAR)的核酸序列上游编码，或在编码抗原结合结构域的核酸序列的5'末端接合的信号序列。在一些情况下，含有编码ROR1结合分子，例如抗体或其抗原结合片段或重组受体(例如CAR)的核酸序列的聚核苷酸含有编码信号肽的信号序列。在一些方面中，信号序列可编码来源于天然多肽的信号肽。在其他方面中，信号序列可编码异源或非天然信号肽。在一些方面中，非限制性例示性信号肽包括SEQ ID NO:43中所示，或由SEQ ID NO:44中所示的核苷酸序列编码的IgGκ链的信号肽。在一些方面中，非限制性例示性信号肽包括SEQ ID NO:45中所示且由SEQ ID NO:46中所示的核苷酸序列编码的GMCSFRα链的信号肽。在一些方面中，非限制性例示性信号肽包括SEQ ID NO:47中所示的CD8α信号肽的信号肽。在一些方面中，非限制性例示性信号肽包括SEQ ID NO:42中所示且由SEQ ID NO:190中所示的核苷酸序列编码的CD33信号肽的信号肽。在一些情况下，编码ROR1结合分子，例如抗体或其抗原结合片段或重组受体(例如CAR)的聚核苷酸可含有编码额外分子，例如替代标记物或其他标记物的核酸序列，或可含有额外组分，例如启动子、调控组件及/或多顺反子组件。在一些实施方案中，编码ROR1结合分子，例如抗体或其抗原结合片段或重组受体(例如CAR)的核酸序列可以可操作地连接至任何额外组分。
在一些实施方案中，提供的聚核苷酸含有编码抗体或其抗原结合片段或含有抗体或其抗原结合片段的重组受体的可变重链结构域(VH)的核酸序列。在一些实施方案中，提供的聚核苷酸含有编码抗体或其抗原结合片段或含有抗体或其抗原结合片段的重组受体的可变轻链结构域(VL)的核酸序列。在一些实施方案中，提供的聚核苷酸含有编码抗体或其抗原结合片段或含有抗体或其抗原结合片段的重组受体的可变重链结构域(VH)及可变轻链结构域(VL)的核酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:110、119、101或128中所示的序列，或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:113、122或104中所示的序列或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:110、119、101或128中所示的序列，或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:113、122或104中所示的序列，或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:110中所示的序列或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在一些实施方案中，该聚核苷酸含有编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:113中所示的序列或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码VH的核酸，其包含SEQID NO:119中所示的序列或与SEQ ID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在一些实施方案中，该聚核苷酸含有编码VL的核酸，其包含SEQ IDNO:122中所示的序列或与SEQ ID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:101中所示的序列或与SEQ ID NO:101具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在一些实施方案中，该聚核苷酸含有编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:104中所示的序列或与SEQ ID NO:104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码VH的核酸，其包含SEQID NO:128中所示的序列或与SEQ ID NO:128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在一些实施方案中，该聚核苷酸含有编码VL的核酸，其包含SEQ IDNO:104中所示的序列或与SEQ ID NO:104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:110中所示的序列或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:113中所示的序列或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:119中所示的序列或与SEQID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:122中所示的序列或与SEQ ID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:101中所示的序列或与SEQ ID NO:101具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:104中所示的序列或与SEQ ID NO:104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有：编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:128中所示的序列或与SEQID NO:128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:104中所示的序列或与SEQ ID NO:104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其包含SEQ IDNO:116、125、107或132中所示的序列，或与SEQ ID NO:116、125、107或132具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其包含SEQ ID NO:116中所示的序列或与SEQ ID NO:116具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其包含SEQ ID NO:125中所示的序列或与SEQ ID NO:125具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其包含SEQ ID NO:107中所示的序列或与SEQ ID NO:107具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码scFv的核酸，其包含SEQ ID NO:132中所示的序列或与SEQ IDNO:132具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码间隔子的核酸，其包含SEQ IDNO:30中所示的序列或与SEQ ID NO:30具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码间隔子的核酸，其包含SEQ ID NO:192中所示的序列或与SEQ ID NO:192具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码间隔子的核酸，其包含SEQ ID NO:193中所示的序列或与SEQ ID NO:193具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码间隔子的核酸，其包含SEQ ID NO:195中所示的序列或与SEQ ID NO:195具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
还提供针对密码子使用优化及/或经优化以消除剪接位点，例如隐蔽剪接位点的聚核苷酸。在一些实施方案中，聚核苷酸经修饰以优化密码子使用。在一些实施方案中，聚核苷酸针对在人类细胞，例如人类T细胞，例如初代人类T细胞中表达进行密码子优化。在一些实施方案中，聚核苷酸，例如编码本文所提供的抗体、受体(例如抗原受体，例如嵌合抗原受体)及/或ROR1特异性结合蛋白中的任一种的聚核苷酸，经修饰或已经修饰以减小异质性或含有本文所观察到的一或多个核酸序列(例如通过优化方法)以使多肽，例如CAR的特征相较于含有不同参考序列或尚未经优化的多肽有所改善。在一些实施方案中，该聚核苷酸通过剪接位点消除进行优化。此类特征中包括RNA异质性改善，例如由存在一或多个剪接位点，例如一或多个隐蔽剪接位点而引起的异质性改善；及/或所编码的蛋白质的表达及/或表面表达改善，例如在经工程改造成表达这些多肽的细胞或不同治疗性细胞组合物中表达的水平、均一性或一致性增加。在一些实施方案中，聚核苷酸可针对在人类细胞中表达进行密码子优化。
在自然界中，哺乳动物细胞中的基因组核酸序列一般在转录同时或紧接着转录经历处理，其中在一些情况下，自基因组脱氧核糖核酸(DNA)序列转录的初生前体信使核糖核酸(pre-mRNA)借助于剪接进行编辑以移除内含子，随后在真核细胞中进行外显子接合。剪接位点的共同序列为已知的，但在一些方面中，界定剪接位点的具体核苷酸信息可能较复杂，且基于可用方法可能无法显而易见。隐蔽剪接位点基于标准共同序列无法预测且可变地活化的剪接位点。因此，在真核细胞中表达后，pre-mRNA在隐蔽剪接位点处的可变剪接在所转录的mRNA产物中导致异质性。
所产生的用于表达转基因的聚核苷酸通常由不含内含子的核酸序列，例如互补DNA(cDNA)或其部分来构建。因此，预期此类序列不发生剪接。然而，cDNA序列内隐蔽剪接位点的存在可能在转录的mRNA中导致非预期或不合需要的剪接反应及异质性。此类异质性使得转译非预期的蛋白质产物，例如展现改变的表达及/或活性的具有可变氨基酸序列的截短的蛋白质产物。
在一些实施方案中，消除剪接位点，例如隐蔽剪接位点，可使转殖基因产物，例如自转殖基因转译的多肽，例如抗ROR1 CAR多肽的表达改善或优化。在编码的转殖基因，例如编码的ROR1CAR分子的隐蔽剪接位点处剪接会使蛋白质表达，例如在细胞表面上的表达减少，及/或使功能减少，例如减少细胞内信号传导。本文提供编码抗ROR1 CAR蛋白质的聚核苷酸，其已经优化以减少或消除隐蔽剪接位点。本文还提供编码抗ROR1 CAR蛋白质的聚核苷酸，其已针对密码子表达优化；及/或其中存在一或多个序列，例如通过本文关于剪接位点的方法或观察结果所鉴别的序列；及/或其中不存在所鉴别的剪接位点，例如本文所鉴别的剪接位点中的任一个。所提供的聚核苷酸中有当在某些条件下表达及/或引入指定细胞类型，例如人类T细胞，例如初代人类T细胞中时展现低于某种程度的RNA异质性或剪接形式的聚核苷酸，以及含有此类多肽及/或展现此类特性的细胞及组合物及制品。在一些实施方案中，转录的RNA的RNA异质性相较于未经修饰以移除隐蔽剪接位点及/或经历密码子优化的聚核苷酸减小超过或超过约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高百分比。在一些实施方案中，所提供的编码抗ROR1 CAR的聚核苷酸展现至少70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高百分比的转录的RNA的RNA同质性。
RNA异质性可通过本文所提供或描述或已知的多种方法中的任一种测定。在一些实施方案中，转录的核酸的RNA异质性通过以下方式测定：通过例如逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)使转录的核酸扩增，随后在一或多种扩增产物中检测一或多个差异，例如大小差异。在一些实施方案中，RNA异质性基于不同大小的扩增产物的数量或各种不同大小的扩增产物的比例来测定。在一些实施方案中，RNA，例如总RNA或细胞质聚腺苷酸化RNA，自表达待优化的转殖基因的细胞采集，且通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，使用对位于转录的RNA中转殖基因上游的5'非转译区(5'UTR)(在一些情况下对应于表达载体中启动子序列的一部分)具特异性的引子及对位于转录的RNA序列中所表达的转殖基因下游的3'非转译区(3'UTR)具特异性的引子或对转殖基因内的序列具特异性的引子进行扩增。在特定实施方案中，采用至少一个与5'非转译区(UTR)中的序列互补的引子及至少一个与3'非转译区(UTR)中的序列互补的引子来扩增转殖基因。吾人可解析RNA，例如信使RNA，且通过若干方法分析其异质性。非限制性例示性方法包括琼脂糖凝胶电泳、基于芯片的毛细电泳、分析型离心、场流动分级分离及层析，例如尺寸排阻层析或液相层析。
在一些实施方案中，提供的编码本文所提供的抗ROR1 CAR的聚核苷酸，或本文所提供的构建体包括用以移除可能造成剪接事件及/或减少表达及/或增加RNA异质性的一或多个剪接供体及/或受体位点的修饰。在一些实施方案中，所提供的聚核苷酸在间隔子区中的一或多个聚核苷酸中进行修饰以消除或减少剪接事件。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:111、120、102或129中所示的序列的编码VH的核酸，及含SEQ ID NO:114、123、105或131中所示的序列的编码VL的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:111中所示的序列的编码VH的核酸，及含SEQ ID NO:114中所示的序列的编码VL的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:120中所示的序列的编码VH的核酸，及含SEQ ID NO:123中所示的序列的编码VL的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:102中所示的序列的编码VH的核酸，及含SEQ ID NO:105中所示的序列的编码VL的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:129中所示的序列的编码VH的核酸，及含SEQ ID NO:131中所示的序列的编码VL的核酸。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:117、126、108或133中所示的序列的编码scFv的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ IDNO:117中所示的序列的编码scFv的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:126中所示的序列的编码scFv的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:108中所示的序列的编码scFv的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:133中所示的序列的编码scFv的核酸。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:136中所示的序列的编码间隔子的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:139中所示的序列的编码间隔子的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:196中所示的序列的编码间隔子的核酸。
提供对ROR1具特异性的例示性嵌合抗原受体(CAR)，及含有编码本文所描述的例示性CAR中的任一种的全部或一部分、片段、结构域或链的核酸序列的聚核苷酸。在一些实施方案中，例示性CAR含有ROR1结合抗体片段，例如I.A部分及/或表2中所描述者中的一种。在一些实施方案中，例示性CAR表E1及/或表3的每一列中所描述者。本文还提供编码CAR的聚核苷酸。在一些实施方案中，CAR可由多于一个不同的聚核苷酸，例如两个或两个聚核苷酸编码。在任何此类实施方案中的一些中，两个或两个以上聚核苷酸可各自含有编码CAR的一部分、片段、结构域或链的核酸。
本文还提供例示性经修饰的聚核苷酸，包括经修饰以实现密码子优化(O)及/或剪接位点消除(SSE)的聚核苷酸。此类聚核苷酸的SEQ ID NO:的实施例如表3中所示，其中提供了在剪接位点消除及密码子优化之前例示性CAR构建体各组分的核苷酸(nt)序列(N/O)、在剪接位点消除及优化之后CAR构建体各组分的核酸(nt)序列(O/SSE)及由这些核酸序列编码的相应氨基酸(aa)序列。这些组分包括抗ROR1 scFv、间隔子、跨膜(tm)结构域、4-1BB共刺激信号传导区序列(costim)、CD3ζ信号传导结构域(CD3ζ)。还提供在剪接位点消除及优化之后例示性CAR的完整序列(CAR)。在一些情况下，该聚核苷酸还包括CD33信号序列(ss)、T2A核糖体跳跃组件(T2A)及截短的EGF受体(EGFRt)序列。例示性CAR的聚核苷酸序列如SEQ ID NO:156-161中所示，其编码SEQ ID NO:184-189中所示的氨基酸序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列，或与SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:156中所示的序列或与SEQ ID NO:156中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ IDNO:156中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:157中所示的序列或与SEQ ID NO:157中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:157中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:158中所示的序列或与SEQ IDNO:158中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:158中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:159中所示的序列或与SEQ ID NO:159中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:159中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ IDNO:160中所示的序列或与SEQ ID NO:160中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:160中所示的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:161中所示的序列或与SEQ ID NO:161中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有SEQ ID NO:161中所示的序列。
在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列的核酸，或编码与SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽序列的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:184中所示的序列的核酸，或编码与SEQ IDNO:184中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽序列的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:184中所示的序列的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:185中所示的序列的核酸，或编码与SEQ ID NO:185中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽序列的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:185中所示的序列的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:186中所示的序列的核酸，或编码与SEQ ID NO:186中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽序列的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ IDNO:186中所示的序列的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ IDNO:187中所示的序列的核酸，或编码与SEQ ID NO:187中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽序列的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:187中所示的序列的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:188中所示的序列的核酸，或编码与SEQ ID NO:188中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽序列的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:188中所示的序列的核酸。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:189中所示的序列的核酸，或编码与SEQ ID NO:189中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽序列的序列。在任何实施方案中的一些中，该聚核苷酸含有编码SEQ ID NO:189中所示的序列的核酸。
Figure BDA0003187625950001471
Figure BDA0003187625950001481
II.经工程改造的细胞
还提供含有重组受体(例如嵌合抗原受体)的细胞，例如经工程改造的细胞，该重组受体为例如含有包括如本文所描述的抗ROR1抗体或片段的细胞外结构域的重组受体。还提供此类细胞的群体、含有此类细胞及/或富集此类细胞的组合物，例如其中表达ROR1结合分子的细胞构成组合物中总细胞或某一类型细胞，例如T细胞或CD8+或CD4+细胞的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比。这些组合物中有用于给药，例如用于过继细胞疗法的医药组合物及调配物。还提供用于向受试者，例如患者给予细胞及组合物的治疗方法。
因此，还提供表达含有抗体的重组受体的经基因工程改造的细胞，例如含有CAR的细胞。细胞一般为真核细胞，例如哺乳动物细胞，且通常为人类细胞。在一些实施方案中，细胞来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，为免疫系统的细胞，例如先天性或后天性免疫细胞，例如骨髓或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞及/或NK细胞。其他例示性细胞包括干细胞，例如多潜能(multipotent)及多能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多能干细胞(iPSC)。细胞通常为初代细胞，例如直接自受试者分离及/或自受试者分离且经冷冻的细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一或多个亚群，例如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，例如根据以下定义的细胞：功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位及/或存留能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌型态及/或分化程度。就待治疗的受试者而言，细胞可为同种异体细胞及/或自体细胞。方法包括现成方法。在一些方面中，例如在现成技术中，细胞多能及/或多潜能细胞，例如干细胞，例如诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，方法包括如本文所述，自受试者分离出细胞、对其进行制备、处理、培养及/或工程改造，以及在低温保存之前或之后将其再引入同一名患者体内。
T细胞及/或CD4+T细胞及/或CD8+T细胞的亚型及亚群中有未处理T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆型T细胞及其亚型，例如干细胞记忆型T(TSCM)、中央记忆型T(TCM)、效应记忆型T(TEM)或终末分化的效应记忆型T细胞；肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在及适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡性辅助T细胞；α/βT细胞及δ/γT细胞。
在一些实施方案中，细胞为自然杀手(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞为单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性球、树突状细胞、肥大细胞、嗜伊红血球及/或嗜碱性血球。
在一些实施方案中，细胞包括一或多个经由基因工程改造引入的聚核苷酸，且由此表达此类聚核苷酸的重组产物或经基因工程改造的产物。在一些实施方案中，聚核苷酸为异源聚核苷酸，还即，通常不存在于细胞或获自细胞的样品中，例如获自另一生物体或细胞的聚核苷酸，此类聚核苷酸例如在经工程改造的细胞及/或作为此类细胞来源的生物体中通常未发现。在一些实施方案中，聚核苷酸并非天然存在的聚核苷酸，例如在自然中未发现的聚核苷酸，包括含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的聚核苷酸的嵌合组合的聚核苷酸。在一些实施方案中，细胞(例如经工程改造的细胞)包含如本文所描述的载体(例如病毒载体、表达载体等)，例如包含编码本文所描述的重组受体的核酸的载体。
A.用于基因工程改造的载体及方法
还提供编码抗体及/或其部分，例如其链的核酸，例如聚核苷酸。所提供的核酸中有编码本文所描述的抗ROR1抗体(例如抗原结合片段)的核酸。还提供编码一或多种抗体及/或其部分的核酸，例如聚核苷酸，例如编码本文所描述的抗ROR1抗体(例如抗原结合片段)中的一或多种，及/或其他抗体及/或其部分，例如结合其他靶点抗原的抗体及/或其部分的核酸。还提供用于表达结合分子(例如抗ROR1结合分子)，包括含这些结合分子的重组受体(例如CAR)，以及用于制造表达此类结合分子的经基因工程改造的细胞的方法、核酸、组合物及试剂盒。在一些实施方案中，一或多个结合分子，包括重组受体(例如CAR)，可经基因工程改造至细胞或复数个细胞中。基因工程改造一般涉及将编码重组组分或经工程改造的组分的核酸引入细胞中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转型来引入。
核酸可包括含天然及/或非天然存在的核苷酸及碱基的核酸，例如包括具有主链修饰的核酸。术语“核酸分子”、“核酸”及“聚核苷酸”可互换使用，且指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然及/或非天然核苷酸且包括(但不限于)DNA、RNA及PNA。“核酸序列”指构成核酸分子或聚核苷酸的核苷酸的线性序列。在一些方面中，编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段的至少一部分(例如scFv)、偶联物、受体(例如CAR)的核酸序列可针对在人类细胞中表达进行优化，例如密码子优化，及/或经优化以减少或消除隐蔽剪接位点。
在一些实施方案中，聚核苷酸还包括一或多个额外序列，例如编码一或多个额外分子，例如标记物或启动子、调控组件及/或多顺反子组件的序列。在一些实施方案中，所提供的聚核苷酸包括本文中，例如I.E部分中所描述的聚核苷酸中的任一种。
还提供含有核酸，例如聚核苷酸的载体，以及含有这些载体的宿主细胞，例如用于制造抗体或其抗原结合片段。还提供用于制造抗体或其抗原结合片段的方法。核酸可编码包含抗体的VL区的氨基酸序列及/或包含抗体VH区的氨基酸序列(例如抗体的轻链及/或重链)。核酸可编码一或多个包含抗体的VL区的氨基酸序列及/或包含抗体VH区的氨基酸序列(例如抗体的轻链及/或重链)。在一些实施方案中，核酸，例如聚核苷酸按任何次序或取向编码抗体的一或多个VH区及/或一或多个VL区。在一些实施方案中，核酸，例如聚核苷酸编码VH区及VL区，且VH区的编码序列在VL区的编码序列的上游。在一些实施方案中，核酸，例如聚核苷酸编码VH区及VL区，且VL区的编码序列在VH区的编码序列的上游。
还提供含有核酸，例如聚核苷酸的载体，以及含有这些载体的经工程改造的细胞，例如表达例如重组受体的类结合分子的经工程改造的免疫细胞。还提供用于工程改造细胞，例如免疫细胞，以使其表达抗ROR1结合分子，例如重组受体，例如嵌合抗原受体(CAR)的方法。核酸可编码包含抗体的VL区的氨基酸序列及/或包含抗体VH区的氨基酸序列(例如抗体的轻链及/或重链)作为细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域及细胞内结构域，例如CD3ζ及共刺激信号传导结构域。
在另一实施方案中，提供一或多种包含此类聚核苷酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含此类聚核苷酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包括含编码含抗体VH区的氨基酸序列的核酸的载体(例如经该载体转型)。在另一个此类实施方案中，宿主细胞包括(例如经以下转型)：(1)含编码包含抗体VL区的氨基酸序列及包含抗体VH区的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)含编码包含抗体VL区的氨基酸序列的核酸的第一载体及含编码包含抗体VH区的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，宿主细胞包括含一或多种核酸的一或多种载体(例如经该一或多种载体转型)，该一或多种核酸编码包含一或多种抗体及/或其部分，例如其抗原结合片段的一或多个氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一或多个此类宿主细胞。在一些实施方案中，提供含有一或多个此类宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，该一或多个宿主细胞可表达不同抗体或相同抗体。在一些实施方案中，这些宿主细胞各自可表达超过一种抗体。
还提供制备抗ROR1嵌合抗原受体的方法。对于重组制造嵌合受体，可分离出编码例如本文所描述的嵌合受体抗体的核酸序列并将其插入一或多个载体中以在宿主细胞中进一步克隆及/或表达。此类核酸序列可使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合至编码抗体重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离及测序。在一些实施方案中，提供制造抗ROR1嵌合抗原受体的方法，其中该方法包含在适于表达受体的条件下，培养包含如上文所提供的编码抗体的核酸序列的宿主细胞。
还提供制造抗ROR1抗体(包括抗原结合片段)的方法。对于重组制造抗ROR1抗体，可分离出例如上文所描述的编码抗体的核酸序列或聚核苷酸，并将其插入一或多个载体中以在宿主细胞中进一步克隆及/或表达。此类核酸序列可使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合至编码抗体重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离及测序。在一些实施方案中，提供制造抗ROR1抗体的方法，其中该方法包含在适于表达抗体的条件下，培养包含如上文所提供的编码抗体的核酸序列的宿主细胞，及视情况自该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。
除原核生物的外，真核微生物，例如丝状真菌或酵母适用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径经修饰成仿真或接近人类细胞中的糖基化路径，由此产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体的真菌及酵母株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
可用于表达多肽的例示性真核细胞包括(但不限于)COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44。Lec13 CHO细胞及FUT8 CHO细胞；PER.
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细胞；及NSO细胞。在一些实施方案中，抗体重链及/或轻链(例如VH区及/或VL区)可在酵母中表达。参见例如美国公开案第US 2006/0270045 A1号。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞基于其对重链及/或轻链(例如VH区及/或VL区)进行所需转译后修饰的能力来选择。举例而言，在一些实施方案中，CHO细胞产生多肽，这些多肽的唾液酸化水平高于293细胞中所产生的相同多肽。
在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段在无细胞系统中制造。例示性无细胞系统描述于例如Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
所提供的实施方案进一步包括用于表达及产生抗体及其他抗原结合蛋白的载体及宿主细胞及其他表达系统，包括真核及原核宿主细胞，包括细菌、丝状真菌及酵母，以及哺乳动物细胞，例如人类细胞，以及无细胞表达系统。
在一些实施方案中，基因转移通过以下实现：首先刺激细胞，例如通过将细胞与诱导例如增殖、存活及/或活化之类反应的刺激物组合来刺激细胞，例如通过细胞因子或活化标记物的表达进行测量该刺激；随后转导经活化的细胞，并在培养物中扩增至足够临床应用的数量。
在一些情形下，刺激因子(例如淋巴因子或细胞因子)的过度表达可能对受试者有毒。因此，在一些情形下，经工程改造的细胞包括使得细胞对活体内阴性选择敏感(例如在过继免疫疗法中给予时)的基因区段。举例而言，在一些方面中，细胞经工程改造以使得其可因其所给予的患者的活体内条件变化而消除。可阴性选择的表型可由赋予对所给予药剂(例如化合物)的敏感性的基因的插入而产生。可阴性选择的基因包括赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的单纯性疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell2:223,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因、细菌胞嘧啶脱胺酶(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
在一些方面中，细胞进一步经工程改造以促进细胞因子或其他因子的表达。用于引入经基因工程改造的组分，例如抗原受体，例如CAR的各种方法为熟知的，且可与所提供的方法及组合物一起使用。例示性方法包括用于转移编码受体的聚核苷酸的方法，包括经由病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子及电穿孔来进行。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒粒子，例如来源于猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体将重组聚核苷酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体，例如基于HIV-1慢病毒的载体(慢病毒载体；参见例如Amado等人,Science.1999年7月30日；285(5428):674-676)，或逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy,2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol TherNucl Acids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557)将重组聚核苷酸转移至T细胞中。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或慢病毒载体具有长末端重复序列(LTR)。在一些实施方案中，载体来源于莫罗尼鼠类白血病病毒(Moloney murine leukemia virusMoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠类胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)或人类免疫缺陷病毒2型(HIV-2/SIV)。在一些实施方案中，载体为自灭活的(SIN)。在一些实施方案中，载体为条件复制型(可移动的)载体。大部分慢病毒载体来源于人类、猫科动物或猿慢病毒。大部分逆转录病毒载体来源于鼠类逆转录病毒。在一些实施方案中，慢病毒或逆转录病毒包括来源于任何禽类或哺乳动物细胞来源者。慢病毒或逆转录病毒通常具有双嗜性，意谓其能够感染包括人类在内的若干物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因置换逆转录病毒gag、pol及/或env序列。慢病毒转导的方法为已知的。例示性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。多种例示性逆转录病毒系统也已有描述(例如Amado等人(1999)Science 285(5428):674-676；美国专利第5,219,740号、第6,207,453；5,219,740号；Miller及Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；及Boris-Lawrie及Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。
在一些实施方案中，经由电穿孔将重组聚核苷酸转移至T细胞中(参见例如Chicaybam等人(2013)PLoS ONE 8(3):e60298，及Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，经由转位将重组聚核苷酸转移至T细胞中(参见例如Manuri等人(2010)Hum Gene Ther21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther NuclAcids 2,e74；及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。将遗传物质引入免疫细胞中并在免疫细胞中表达的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子性脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston(1990),Nature 346:776-777)；及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人(1987)Mol.Cell Biol.7:2031-2034)。用于转移编码重组产物的聚核苷酸的其他方法及载体例如WO2014055668及美国专利第7,446,190号中所描述者。
在额外聚核苷酸，例如供引入的基因中有改善疗法结果，例如通过促进所转染细胞的存活力及/或功能来改善疗法结果的聚核苷酸；提供基因标记物以选择及/或评价估细胞，例如评估活体内存活或定位的基因；改善安全性，例如通过使细胞对活体内阴性选择敏感来改善安全性的基因，如Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；及Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)所描述；还参见Lupton等人的公开案PCT/US91/08442及PCT/US94/05601，其描述了使用通过使显性阳性可选择标记物与阴性可选择标记物融合得到的双功能选择性融合基因。参见例如Riddell等人,美国专利第6,040,177号，第14-17行。
在一些实施方案中，载体或构建体可含有启动子及/或增强子或调控所编码重组受体的表达的调控组件。在一些实施例中，启动子及/或增强子或调控组件可为条件依赖性启动子、增强子及/或调控组件。在一些实施例中，这些组件驱动转基因的表达。在一些实施例中，CAR转基因可操作地连接至启动子，例如具有HTLV1增强子的EF1α启动子(SEQ ID NO:164)。在一些实施例中，CAR转殖基因可操作地连接至位于转基因下游的土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控组件(WPRE；SEQ ID NO:165)。
在一些实施方案中，载体或构建体可含有驱动一或多个核酸分子的表达的单个启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子，例如转录物可为多顺反子(双顺反子或三顺反子，参见例如美国专利第6,060,273号)。举例而言，在一些实施方案中，转录单元可经工程改造为含有内部核糖体进入位点(IRES)的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的讯息对基因产物(例如编码第一及第二嵌合受体)进行共表达。举例而言，在一些实施方案中，载体或构建体可含有处于单个启动子调控下的编码本文所提供的抗ROR1受体(例如抗ROR1CAR)的核酸及编码不同分子的核酸，这些核酸通过IRES隔开。
或者，在一些情况下，单个启动子可引导RNA的直接表达，该RNA在单个开放阅读框架(ORF)中含有由编码自裂解肽(例如2A裂解序列)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))的序列彼此隔开的两个或三个基因(例如编码第一及第二结合分子，例如抗体重组受体)。因此，ORF编码单个多肽，该多肽在转译期间(在T2A的情况下)或之后裂解为个别蛋白质。在一些情况下，肽，例如T2A可使核糖体在2A组件的C末端跳跃(核糖体跳跃)合成肽键，由此在2A序列的一端与接下来的肽下游之间产生分离(参见例如de Felipe.GeneticVaccines and Ther.2:13(2004)及deFelipe等人,Traffic 5:616-626(2004))。已知许多2A组件。可用于本文所揭示的方法及聚核苷酸中的2A序列的实施例不限于如美国专利公开案第20070116690号中所描述的来自口蹄疫病毒的2A序列(F2A，例如SEQ ID NO:21或168)、来自马A型鼻炎病毒的2A序列(E2A，例如SEQ ID NO:20或167)、来自明脉扁刺蛾(Thoseaasigna)病毒的2A序列(T2A，例如SEQ ID NO:6、17或166)及来自猪捷申病毒-1的2A序列(P2A，例如SEQ ID NO:18或19)。在一些实施方案中，一或多个不同或独立的启动子驱动编码一或多个结合分子(例如重组受体)的一或多个核酸分子的表达。
本文所提供的重组受体中的任一种，例如抗ROR1重组受体及/或额外重组受体，均可由含有呈任何组合或布置的一或多个编码这些受体的核酸分子的聚核苷酸编码。举例而言，一个、两个、三个或超过三个聚核苷酸可编码一个、两个、三个或超过三个不同受体或结构域。在一些实施方案中，一个载体或构建体含有编码一或多种重组受体的核酸分子，且独立载体或构建体含有编码额外结合分子，例如抗体及/或重组受体，例如抗ROR1受体(例如抗ROR1 CAR)的核酸分子。
在一些实施方案中，核酸分子还可编码一或多种替代标记物，例如荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP))或细胞表面标记物(例如截短的表面标记物，例如截短的EGFR(tEGFR))，其可用于确定细胞经转导或工程改造以表达受体。举例而言，在一些方面中，外源性标记物基因与经工程改造的细胞疗法结合使用以容许检测或选择细胞，且在一些情况下，还促进通过ADCC进行的细胞自杀。例示性标记物基因包括截短的表皮生长因子受体(EGFRt)，其可与所关注的转殖基因(例如CAR或TCR)一起在经转导的细胞中共表达(参见例如美国专利第8,802,374号)。EGFRt含有由抗体西妥昔单抗(cetuximab)
Figure BDA0003187625950001561
识别的抗原决定基。出于此原因，
Figure BDA0003187625950001562
可用于鉴别或选择已经EGFRt构建体工程改造的细胞，包括在还经另一重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))共同工程改造的细胞中进行鉴别或选择。
在一些实施方案中，编码结合分子的核酸进一步含有编码一或多种标记物的核酸序列。在一些实施方案中，该一或多种标记物为转导标记物、替代标记物及/或选择标记物。
在一些实施方案中，该标记物为转导标记物或替代标记物。转导标记物或替代标记物可用于检测引入了聚核苷酸，例如编码重组受体的聚核苷酸的细胞。在一些实施方案中，转导标记物可指示或确定细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记物能在细胞表面上与例如CAR的类重组受体共表达的蛋白质。在特定实施方案中，此类替代标记物为经修饰成具有极低或没有活性的表面蛋白质。在某些实施方案中，替代标记物在该编码重组受体的聚核苷酸上编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列可操作地连接至编码标记物的核酸序列，这些核酸序列视情况通过内部核糖体进入位点(IRES)，或编码自裂解肽或引起核糖体跳跃的肽，例如2A序列，例如T2A、P2A、E2A或F2A的核酸隔开。在一些情况下，外源性标记物基因可与经工程改造的细胞结合使用以容许检测或选择细胞，且在一些情况下，还促进细胞自杀。
例示性替代标记物可包括细胞表面多肽的截短形式，例如不具功能性且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号，及/或不内化或不能内化的截短形式。例示性截短的细胞表面多肽，包括生长因子或其他受体的截短形式，例如截短的人类表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，如SEQ ID NO:7、16或153中所示的例示性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其经修饰形式。tEGFR可含有由抗体西妥昔单抗
Figure BDA0003187625950001571
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的抗原决定基，该抗体或结合分子可用于鉴别或选择已经tEGFR构建体及所编码的外源性蛋白质工程改造的细胞及/或消除或分离表达所编码的外源性蛋白质的细胞。参见美国专利第8,802,374号及Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面中，标记物，例如替代标记物，包括CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人类CD19)或表皮生长因子受体(例如tEGFR)的全部或一部分(例如截短形式)。
在一些实施方案中，标记物为或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)；增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，例如超倍GFP(sfGFP)；红色荧光蛋白(RFP)，例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2；强化型蓝荧光蛋白质(CFP)；蓝绿色荧光蛋白(BFP)；增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)及黄色荧光蛋白(YFP)，及其变体，包括这些荧光蛋白的物种变体、单体变体及经密码子优化及/或增强的变体。在一些实施方案中，标记物为或包含酶，例如荧光素酶、来自大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。例示性发光报导基因包括荧光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记物为选择标记物。在一些实施方案中，选择标记物为或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记物为抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记物为向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记物为或包含嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因、潮霉素(Hygromycin)抗性基因、杀稻瘟菌素(Blasticidin)抗性基因、新霉素(Neomycin)抗性基因、遗传霉素(Geneticin)抗性基因或吉欧霉素(Zeocin)抗性基因，或其经修饰形式。
在一些实施方案中，编码标记物的核酸可操作地连接至编码接头序列，例如可裂解接头序列，例如T2A的聚核苷酸。举例而言，标记物及视情况存在的接头序列可为如PCT公开案第WO2014031687号中所揭示的任一个。举例而言，标记物可为截短的EGFR(tEGFR)，其视情况连接至接头序列，例如T2A可裂解接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的例示性多肽包含SEQ ID NO:7、16或153中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7、16或153展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标记物为非天然出现在T细胞上或非天然出现在于T细胞的表面上的分子，例如细胞表面蛋白质，或其一部分。
在一些实施方案中，该分子为非自身分子，例如非自身蛋白质，即，不能被过继转移入的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，标记物不具有治疗功能及/或不产生除用作基因工程改造的标记物，例如以选择成功地工程改造的细胞之外的作用。在其他实施方案中，标记物可为治疗分子或以其他方式发挥某种所需作用的蛋白，例如细胞在活体内所遇到的配体，例如共刺激或免疫检查点分子，用以在过继转移并碰到配体时增强及/或减弱细胞反应。
还提供含有核酸分子、载体或构建体中的一或多种，例如上文所描述的任何核酸分子、载体或构建体的组合物。在一些实施方案中，这些核酸分子、载体、构建体或组合物可用于对细胞，例如T细胞进行工程改造以表达结合分子，例如抗体或重组受体，及/或额外结合分子中的任一个。
B.用于工程改造的细胞的制备
在一些实施方案中，经工程改造的细胞的制备包括一或多个培养及/或制备步骤。用于引入重组受体(例如CAR)的细胞可自样品，例如生物样品，例如获自或来源于受试者的样品分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者为患有疾病或病况、或需要细胞疗法、或将被给予细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者为需要特定治疗性干预，例如过继细胞疗法的人类，对于过继细胞疗法而言，细胞经历分离、处理及/或工程改造。
因此，在一些实施方案中，细胞为初代细胞，例如初代人类细胞。样品包括直接自受试者取得的组织、流体及其他样品，以及由一或多个处理步骤得到的样品，该一或多个处理步骤例如分离、离心、基因工程改造(例如用病毒载体转导)、洗涤及/或培育。生物样品可为直接获自生物学来源的样品或经处理的样品。生物样品包括(但不限于)体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液及汗液、组织及器官样品，包括由其得到的经处理样品。
在一些方面中，作为细胞来源或分离出细胞的样品为血液或血液源性样品，或为或来源于血球分离术或白细胞清除术产物。例示性样品包括全血、外周血液单核细胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、组织切片、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠道相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰脏、乳房、骨骼、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官，及/或由其得到的细胞。在细胞疗法，例如过继细胞疗法的情形中，样品包括自体及同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞来源于细胞株，例如T细胞株。在一些实施方案中，细胞为获自异种来源，例如获自小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一或多个制备步骤及/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实施例中，对细胞进行洗涤、离心及/或在一或多种试剂存在下培育，以例如移除不想要的组分，富集所需组分，溶解或移除对特定试剂敏感的细胞。在一些实施例中，细胞为基于一或多种特性，例如密度、黏附特性、大小、敏感性及/或对特定组分的抗性进行分离。
在一些实施例中，细胞自受试者的循环血液获得，例如通过血球分离术或白细胞清除术获得。在一些方面中，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核白血细胞、红血细胞及/或血小板，且在一些方面中含有除红血细胞及血小板以外的细胞。
在一些实施方案中，对自受试者收集的血细胞进行洗涤，例如以移除血浆部分并将细胞置放于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施方案中，细胞用磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)洗涤。在一些实施方案中，洗涤溶液不含钙及/或镁及/或多种或全部二价阳离子。在一些方面中，洗涤步骤为根据制造商的说明书，利用半自动化“流过式(flow-through)”离心机(例如Cobe 2991细胞处理器，Baxter)实现。在一些方面中，洗涤步骤根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)实现。在一些实施方案中，使细胞在洗涤之后再悬浮于多种生物兼容性缓冲液，例如无Ca++/Mg++的PBS中。在某些实施方案中，移除血细胞样品各组分，并将细胞直接再悬浮于培养基中。
在一些实施方案中，方法包括基于密度的细胞分离方法，例如通过溶解红血细胞及经由Percoll或Ficoll梯度离心，自外周血液制备白血细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一或多个特定分子，例如表面标记物(例如表面蛋白质)、细胞内标记物或核酸在细胞中的表达或存在，分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可使用基于此类标记物进行分离的任何已知方法。在一些实施方案中，分离基于亲和力或免疫亲和力的分离。举例而言，在一些方面中，分离包括基于细胞中一或多种标记物(通常为细胞表面标记物)的表达或表达水平来分离细胞及细胞群，例如通过与特异性结合至此类标记物的抗体或结合搭配物一起培育，随后一般进行洗涤步骤并将已结合抗体或结合搭配物的细胞与未结合至抗体或结合搭配物的细胞分离。
此类分离步骤可基于阳性选择，其中保留已结合试剂的细胞以进一步使用；及/或阴性选择，其中保留未结合至抗体或结合搭配物的细胞。在一些实施例中，两个部分皆保留以供进一步使用。在一些方面中，阴性选择可为特别有用的，其中无法获得特异性鉴别异质群体中的一种细胞类型的抗体，因此，分离以基于除所需群体外的细胞所表达的标记物最佳地进行。
分离无需对表达特定标记物的特定细胞群或细胞进行100％富集或移除。举例而言，对特定类型的细胞，例如表达标记物的细胞的阳性选择或富集指增加此类细胞的数量或百分比，但无需使不表达该标记物的细胞完全不存在。同样，对特定类型的细胞，例如表达标记物的细胞的阴性选择、移除或耗竭指减少此类细胞的数量或百分比，但无需使所有此类细胞完全移除。
在一些实施例中，进行多轮分离步骤，其中对来自一个步骤的经阳性或阴性选择的部分进行另一个分离步骤，例如后续阳性或阴性选择。在一些实施例中，单个分离步骤可同时耗竭表达多个标记物的细胞，例如通过将细胞与各自对作为阴性选择靶点的标记物具特异性的复数种抗体或结合搭配物一起培育实现。同样，多种细胞类型可通过将细胞与各种细胞类型上所表达的复数种抗体或结合搭配物一起培育来同时进行阳性选择。
例如，在一些方面中，特定T细胞亚群，例如阳性或高水平表达一或多种表面标记物的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+及/或CD45RO+T细胞，通过阳性或阴性选择技术分离。
举例而言，CD3+、CD28+T细胞可使用抗CD3/抗CD28偶联的磁性珠粒(例如
Figure BDA0003187625950001611
M-450CD3/CD28T细胞扩增剂，MACSiBeadsTM等)进行阳性选择。
在一些实施方案中，分离通过阳性选择富集特定细胞群，或通过阴性选择耗竭特定细胞群来进行。在一些实施方案中，阳性或阴性选择分别通过将细胞与特异性结合至在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记物+)或以相对较高水平(标记物高)表达的一或多种表面标记物的一或多种抗体或其他结合剂一起培育实现。
在一些实施方案中，通过对在非T细胞，例如在B细胞、单核细胞或其他白血球上表达的标记物(例如CD14)进行阴性选择，将T细胞自PBMC样品分离。在一些方面中，使用CD4+或CD8+选择步骤分离CD4+辅助T细胞与CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+及CD8+细胞群可通过对在一或多种原初、记忆型及/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记物进行阳性或阴性选择而进一步分选成亚群。
在一些实施方案中，CD8+细胞通过例如基于与各别亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择而进一步富集或耗竭原初、中心记忆型、效应记忆型及/或中心记忆型干细胞。在一些实施方案中，进行中心记忆型T(TCM)细胞富集以在给予后增加某些特征，例如改善长期存活、扩增及/或植入，在一些方面中该富集在此类亚群中特别稳固(参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701)。在一些实施方案中，将富集TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞组合将进一步增强反应。
在实施方案中，记忆型T细胞同时存在于CD8+末梢血液淋巴细胞的CD62L+与CD62L-亚群中。PBMC可例如使用抗CD8及抗CD62L抗体富集或耗竭CD62L-CD8+及/或CD62L+CD8+部分。
在一些实施方案中，中心记忆型T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于对表达或高水平表达CD45RA及/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面中，通过耗竭表达CD4、CD14、CD45RA的细胞及对表达CD62L的细胞进行阳性选择或富集来分离富含TCM细胞的CD8+群体。在一个方面中，中心记忆型T(TCM)细胞的富集自基于CD4表达所选择的阴性细胞部分开始进行，这些细胞基于CD14及CD45RA的表达进行阴性选择，且基于CD62L进行阳性选择。这些选择在一些方面中同时进行的且在其他方面中依序(依任一次序)进行的。在一些方面中，还使用在制备CD8+细胞群或亚群中所用的相同的基于CD4表达的选择步骤产生CD4+细胞群或亚群，以使得由基于CD4的分离得到的阳性及阴性部分均得到保留且用于这些方法之后续步骤中，视情况遵循一或多个其他阳性或阴性选择步骤。
在一个特定实施例中，对PBMC样品或其他白血细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中阴性及阳性部分均得到保留。接着，基于CD14及CD45RA的表达对阴性部分进行阴性选择，且基于中心记忆型T细胞特有的标记物，例如CD62L或CCR7进行阳性选择，其中阳性及阴性选择以任一次序进行。
通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群将CD4+T辅助细胞分选为原初、中心记忆型及效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，原初CD4+T淋巴细胞CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中心记忆型CD4+细胞为CD62L+及CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞为CD62L-及CD45RO-。
在一个实施例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合液通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合搭配物结合至固体载体或基质，例如磁性珠粒或顺磁性珠粒，以允许分离供阳性及/或阴性选择的细胞。举例而言，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术分开或分离细胞及细胞群(评述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In vitro and In vivo,第17-25页,编辑:S.A.Brooks及U.Schumacher
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Humana Press Inc.,Totowa,NJ中)。
在一些方面中，将待分离的细胞的样品或组合物与可磁化或磁性反应性小材料，例如磁性反应性粒子或微粒，例如顺磁性珠粒(例如
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或
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珠粒)一起培育。磁性反应材料，例如粒子，一般直接或间接附接至结合搭配物，例如抗体，该结合搭配物特异性结合至需要分离，例如需要阴性或阳性选择的一或多个细胞或细胞群上存在的分子，例如表面标记物。
在一些实施方案中，磁性粒子或珠粒包含结合至特定结合成员，例如抗体或其他结合搭配物上的磁性反应性材料。有许多熟知磁性反应材料可用于磁性分离方法中。适合的磁性粒子包括Molday的美国专利第4,452,773号及欧洲专利说明书EP 452342B中所描述的粒子，这些专利以引用的方式并入本文中。胶体大小的粒子，例如Owen的美国专利第4,795,698号及Liberti等人的美国专利第5,200,084号中所描述的粒子，为其他实施例。
培育一般在一定条件下进行，借此附接至磁性粒子或珠粒的抗体或结合搭配物或特异性结合至此类抗体或结合搭配物的分子，例如二次抗体或其他试剂，特异性结合至样品内的细胞上的细胞表面分子(若存在)。
在一些方面中，将样品置放于磁场中，且附接有具磁反应性或可磁化粒子的细胞将被吸引至磁体且与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面中，在同一选择步骤期间进行阳性及阴性选择的组合，其中保留阳性及阴性部分且进一步处理或经历进一步分离步骤。
在某些实施方案中，磁性反应性粒子涂布有一次抗体或其他结合搭配物、二次抗体、凝集素、酶或抗生蛋白链菌素。在某些实施方案中，磁性粒子经由涂布一或多种标记物具特异性的一次抗体而附接至细胞。在某些实施方案中，细胞(而非珠粒)经一次抗体或结合搭配物标记，且接着添加涂布细胞类型特异性二次抗体或其他结合搭配物(例如抗生蛋白链菌素)的磁性粒子。在某些实施方案中，涂布抗生蛋白链菌素的磁性粒子与生物素化一次或二次抗体结合使用。
在一些实施方案中，磁性反应性粒子保持附接至细胞，这些细胞随后将经历培育、培养及/或工程改造；在一些方面中，这些粒子保持附接至细胞以向患者给予。在一些实施方案中，自细胞移除可磁化或磁性反应性粒子。自细胞移除可磁化粒子的方法是已知的且包括例如使用未标记的竞争性抗体、可磁化粒子或抗体与可裂解接头的偶联物等。在一些实施方案中，可磁化粒子是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择经由磁性活化细胞分选术
Figure BDA0003187625950001641
(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)进行。磁性活化细胞分选
Figure BDA0003187625950001642
系统能够高纯度选择附接有磁化粒子的细胞。在某些实施方案中，
Figure BDA0003187625950001643
以在施加外部磁场之后依序溶离非靶点及靶点物种的模式操作。即，附接至磁化粒子的细胞保持在适当位置，而未附接的物种被溶离。接着，在此第一个溶离步骤完成之后，使在磁场中截留且防止溶离的物种以某种方式释放，以使其可被溶离及回收。在某些实施方案中，非靶点细胞经标记且自异质细胞群耗竭。
在某些实施方案中，分离(isolation)或分离(separation)使用进行这些方法的分离(isolation)、细胞制备、分离(separation)、处理、培育、培养配制物及/或调配步骤中的一或多个的系统、装置或设备进行。在一些方面中，该系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，以例如使误差、使用者操作及/或污染减到最少。在一个实施例中，该系统如WO2009/072003或US 20110003380中所描述的系统。
在一些实施方案中，该系统或设备在整合式或自含式系统中及/或以自动化或可程序化方式进行分离、处理、工程改造及调配步骤中的一或多个，例如全部。在一些方面中，该系统或设备包括与该系统或设备通信的计算机及/或计算机程序，由此允许使用者对处理、分离、工程改造及调配步骤进行程序化、控制、评估其结果及/或调整其各个方面。
在一些方面中，分离及/或其他步骤使用
Figure BDA0003187625950001651
系统(Miltenyi Biotec)进行，例如用于在封闭且无菌的系统中以临床规模水平自动分离细胞。组件可包括整合式微电脑、磁力分离单元、蠕动泵及各种夹管阀。在一些方面中，整合式计算机控制仪器的所有组件且引导系统依标准化顺序执行重复程序。在一些方面中，磁力分离单元包括可移动永久磁体及用于选择管柱的固持器。蠕动泵控制通过整个管组的流动速率且连同夹管阀一起确保通过系统的缓冲液的流量控制及细胞的持续悬浮。
在一些方面中，
Figure BDA0003187625950001652
系统使用以无菌、非热解溶液形式供应的抗体偶合的可磁化粒子。在一些实施方案中，细胞经磁性粒子标记之后，洗涤细胞以移除过量粒子。接着，将细胞制剂袋连接至管组，管组随后又连接至含有缓冲液的袋及细胞收集袋。管组由预组装的无菌管组成，包括前管柱及分离管柱，且仅供单次使用。起始分离程序之后，系统自动地将细胞样品施加至分离管柱上。经标记的细胞保留在管柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤移除。在一些实施方案中，用于本文所描述的方法的细胞群未标记且未保留在管柱中。在一些实施方案中，用于本文所描述的方法的细胞群经标记且保留在管柱中。在一些实施方案中，用于本文所描述的方法的细胞群在移除磁场之后自管柱溶离，且收集于细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS
Figure BDA0003187625950001653
系统(Miltenyi Biotec)进行分离及/或其他步骤。在一些方面中，CliniMACS
Figure BDA0003187625950001654
系统装备有细胞处理单元，其允许自动洗涤及通过离心对细胞进行分级分离。CliniMACS
Figure BDA0003187625950001655
系统还可包括机载照相机及影像识别软件，该软件通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。举例而言，外周血液可自动分离成红血球、白血球及血浆层。CliniMACS
Figure BDA0003187625950001656
系统还可包括整合式细胞培育室，其实现细胞栽培方案，例如细胞分化及扩增、抗原负载及长期细胞培养。输入端允许无菌移除及补充培养基且可使用整合式显微镜监测细胞(参见例如Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；及Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701)。
在一些实施方案中，本文所描述的细胞群经由流动式细胞测量术收集及富集(或耗竭)，其中将针对多种细胞表面标记物染色的细胞载运于流体流中。在一些实施方案中，本文所描述的细胞群经由制备级(FACS)分选来收集及富集(或耗竭)。在某些实施方案中，本文所描述的细胞群通过使用微机电系统(MEMS)芯片与基于FACS的检测系统的组合来收集及富集(或耗竭)(参见例如WO 2010/033140；Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；及Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在两种情况下，细胞可用多种标记物标记，由此允许高纯度分离明确确定的T细胞亚群。
在一些实施方案中，抗体或结合搭配物经一或多种可检测标记物标记，以促进根据阳性及/或阴性选择进行的分离。举例而言，分离可基于与经荧光标记的抗体的结合。在一些实施例中，将基于对一或多种细胞表面标记物具特异性的抗体或其他结合搭配物的结合，例如通过荧光活化细胞分选(FACS)，包括制备级(FACS)及/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞测量检测系统的组合分离的细胞载运于流体流中。此类方法允许基于多种标记物同时进行阳性及阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、培育及/或工程改造之前或之后冷冻，例如低温保藏细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻及随后的解冻步骤移除粒细胞且在一定程度上移除细胞群中的单核细胞。在一些实施方案中，将细胞悬浮于冷冻溶液中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮于冷冻溶液中，以移除血浆及血小板。在一些方面中，可使用多种已知冷冻溶液及参数中的任一种。一个实施例涉及使用含有20％DMSO及8％人类血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他适合的细胞冷冻培养基。接着，用培养基对其进行1:1稀释，使得DMSO及HSA的最终浓度分别为10％及4％。接着，细胞以每分钟1℃的速率冷冻至-80℃且储存于液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，所提供的方法包括栽培、培育、培养及/或基因工程改造步骤。举例而言，在一些实施方案中，提供对耗竭的细胞群进行培育及/或工程改造的方法及起始培养的组合物。
因此，在一些实施方案中，在起始培养的组合物中培育细胞群。培育及/或工程改造可在培养容器中进行，例如用于培养或栽培细胞的单元、腔室、孔、管柱、管、管组、阀、小瓶、培养盘、袋或其他容器。
在一些实施方案中，细胞在基因工程改造之前或结合基因工程改造进行培育及/或培养。培育步骤可包括培养、栽培、刺激、活化及/或繁殖。在一些实施方案中，组合物或细胞在刺激条件或刺激剂存在下培育。此类条件包括经设计以诱导群体中的细胞增殖、扩增、活化及/或存活、模拟抗原暴露及/或使用于基因工程改造(例如用于引入重组抗原受体)的细胞预装配的条件。
这些条件可包括以下一或多种：特定培养基；温度；氧含量；二氧化碳含量；时间；药剂，例如养分、氨基酸、抗生素、离子及/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合搭配物、融合蛋白、重组可溶性受体及经设计以使细胞活化的任何其他药剂。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够刺激或活化TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一或多种药剂，例如配体。在一些方面中，该药剂开启或起始T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可包括例如结合至固体载体，例如珠粒的抗体，例如对TCR组分及/或共刺激受体具特异性的抗体，例如抗CD3、抗CD28，及/或一或多种细胞因子。视情况，扩增方法可以进一步包含向培养基中添加抗CD3及/或抗CD28抗体(例如至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2及/或IL-15，例如至少约10个单位/毫升浓度的IL-2。
在一些方面中，培育根据例如Riddell等人的美国专利第6,040,177号；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；及/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701中所描述的技术的类技术进行。
在一些实施方案中，T细胞通过以下方式扩增：向起始培养的组合物中添加饲养细胞，例如非分裂末梢血液单核细胞(PBMC)(例如使所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多PBMC饲养细胞用于待扩增的初始群中的各T淋巴细胞)；及培育培养物(例如保持足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面中，非分裂饲养细胞可包含γ射线照射过的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，PBMC经约3000至3600拉德(rads)范围内的γ射线照射以防止细胞分裂。在一些方面中，在添加T细胞群之前，将饲养细胞添加至培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适于人类T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25℃，一般为至少约30℃，且一般为或为约37℃。视情况，培育可进一步包含添加EBV转型的非分裂类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。LCL可用约6000至10,000拉德范围内的γ射线照射。在一些方面中，LCL饲养细胞以任何适合量提供，例如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1。
在实施方案中，抗原特异性T细胞，例如抗原特异性CD4+及/或CD8+T细胞通过用抗原刺激原初或抗原特异性T淋巴细胞来获得。举例而言，针对细胞巨大病毒抗原的抗原特异性T细胞株或纯系可通过自经感染的受试者分离T细胞并在活体外用该抗原刺激这些细胞来产生。
C.用于多重靶向的经工程改造的细胞、载体及组合物
还提供可结合至及/或靶向多种抗原的细胞，例如经工程改造的细胞。在一些实施方案中，选择性及特异性的改善经由靶向多种抗原的策略来达成。此类策略一般涉及多个抗原结合结构域，这些抗原结合结构域通常存在于不同的经基因工程改造的抗原受体上且特异性结合至不同抗原。在一些实施方案中，细胞经工程改造成能够结合超过一种抗原。举例而言，在一些实施方案中，细胞经工程改造成表达多特异性结合分子。在一些实施方案中，细胞表达多个结合分子，例如重组受体，这些结合分子各自可靶向一种抗原或多种抗原，例如一种受体靶向ROR1，例如本文所描述的任一种，且另一种受体靶向另一种抗原，例如肿瘤抗原。在一些方面中，将复数个经基因工程改造的抗原受体引入细胞中，这些抗原受体特异性结合至不同抗原，这些抗原各自在作为这些细胞的靶点的疾病或病况或其组织或细胞中或其上表达。在一些方面中，此类特征可解决脱靶效应、或减小脱靶效应的可能性、或增加功效。举例而言，在疾病或病况中表达的单个抗原还在非病变或正常细胞上或其中表达的情况下，此类多重靶向方法可通过需要经多种抗原受体结合来提供对所需细胞类型的选择性，以便使细胞活化或诱导特定效应功能。在一些实施方案中，复数个细胞可经工程改造成表达一或多个不同的结合分子，例如重组受体，该一或多个不同的结合分子各自可靶向一种抗原或多种抗原。
还提供含有本文所描述的结合分子中的任一个的多特异性细胞，例如含有包括抗ROR1抗体或其抗原结合片段的细胞表面蛋白质及额外细胞表面蛋白质的细胞，该额外细胞表面蛋白质例如额外嵌合受体，其结合至不同抗原或ROR1上的不同抗原决定基。在一些实施方案中，提供表达重组受体的细胞的组合物，其中结合分子、多特异性结合分子及/或重组受体中的一或多个结合及/或靶向ROR1。还提供含有表达一或多个不同的结合分子，例如重组受体的复数个细胞的细胞组合物，该一或多个不同的结合分子可靶向一或多种抗原。在一些实施方案中，多特异性结合分子及/或重组受体靶向ROR1上的一或多个不同抗原决定基。
在一些实施方案中，提供细胞组合物，其中各类型的细胞表达一或多个结合分子，例如重组受体。在一些实施方案中，细胞包括含一或多种核酸的一或多种载体(例如经该一或多种载体转染)，该一或多种核酸编码构成一或多种抗体及/或其部分，例如其抗原结合片段的一或多个氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一或多个此类细胞。在一些实施方案中，提供含有一或多个此类细胞的组合物。在一些实施方案中，该一或多个细胞可表达不同抗体或相同抗体。在一些实施方案中，这些细胞各自表达一或多种抗体，例如超过一种抗体。在一些实施方案中，这些细胞各自表达多特异性结合分子，例如多特异性受体，例如CAR。
在一些实施方案中，这些细胞包括靶向ROR1及与特定疾病或病况相关的第二或额外抗原的多重靶向策略。在一些实施方案中，该第二或额外抗原是多特异性结合分子及/或多个结合分子及/或各自经工程改造成表达一或多种重组受体的复数个细胞(例如一或多个细胞)的靶点。在一些实施方案中，靶向第二或额外抗原的重组受体在与ROR1结合分子相同的细胞上或在不同细胞上表达。
在一些实施方案中，在用于多重靶向策略的第二或额外抗原中包括这些抗原中的至少一种通用肿瘤抗原或其家族成员的抗原。在一些实施方案中，该第二或额外抗原在肿瘤上表达的抗原。在一些实施方案中，本文所提供的ROR1结合分子靶向与该第二或额外抗原相同的肿瘤类型上的抗原。在一些实施方案中，该第二或额外抗原还可为通用肿瘤抗原，或可为一种肿瘤类型特有的肿瘤抗原。在一些实施方案中，细胞进一步包含额外经基因工程改造的抗原受体，其识别在待治疗的疾病或病况上表达的第二或额外抗原且诱导刺激或活化信号。
例示性抗原包括CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CD138、B7、MUC-1、Ia、HM1.24、HLA-DR、肌腱蛋白、血管生成因子、VEGF、PIGF、ED-B纤维结合蛋白、癌基因、癌基因产物、CD66a-d、坏死抗原、Ii、IL-2、T101、TAC、IL-6、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、B细胞成熟抗原(BCMA)、Her2、L1-CAM、间皮素、CEA、B型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD24、CD30、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、erbB二聚体、EGFR vIII、FBP、FCRL5、FCRH5、胚胎型乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、刘易斯Y(Lewis Y)、L1-细胞黏附分子(L1-CAM)、黑色素相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、黑素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活素(survivin)、EGP2、EGP40、TAG72、B7-H6、IL-13受体a2(IL-13Ra2)、CA9、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胚胎型AchR、NKG2D配体、双重抗原、与通用标签相关的抗原、睾丸癌抗原、MUC1、MUC16、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2(ephrinB2)、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、威尔姆斯氏肿瘤1(Wilms Tumor 1，WT-1)、细胞周期素、细胞周期素A2、CCL-1、hTERT、MDM2、CYP1B、WT1、活素(livin)、AFP、p53、细胞周期素(D1)、CS-1、BCMA、BAFF-R、TACI、CD56、TIM-3、CD123、L1-细胞黏附分子、MAGE-A1、MAGE A3、细胞周期素例如细胞周期素A1(CCNA1)及/或病原体特异性抗原、生物素化分子、由HIV、HCV、HBV及/或其他病原体表达的分子，及/或在一些方面中其新抗原决定基或新抗原。在一些实施方案中，抗原与通用标签缔合或通用标签。
在一些实施方案中，复数种抗原，例如第一抗原，例如ROR1，以及第二或额外抗原在作为靶点的细胞、组织或疾病或病况上，例如在癌细胞上表达。在一些方面中，该细胞、组织、疾病或病况与癌症或肿瘤、或与癌症或肿瘤相关。该复数种抗原中的一或多种一般还在不希望作为细胞疗法的靶点的细胞，例如正常或非患病细胞或组织及/或经工程改造的细胞本身上表达。在此类实施方案中，通过需要连接多种受体来达成细胞反应，实现特异性及/或功效。
在一些实施方案中，细胞及方法包括多重靶向策略，例如表达细胞上的两种或两种以上经基因工程改造的受体，这些受体各自识别不同抗原且通常各自包括不同的细胞内信号传导组分。此类多重靶向策略描述于例如WO 2014055668(描述活化及共刺激CAR的组合，例如靶向个别地存在于脱靶，例如正常细胞上，但仅一起存在于待治疗的疾病或病况的细胞上的两种不同抗原)及Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)(描述表达活化及抑制性CAR的细胞，例如活化CAR结合至在正常或非病变细胞及待治疗疾病或病况的细胞上表达的一种抗原，且抑制性CAR结合至仅在正常细胞或不需要治疗的细胞上表达的另一种抗原的细胞)中。
在一些实施方案中，提供复数个细胞，其各自经工程改造成表达一或多种重组受体。举例而言，在一些实施方案中，一个细胞经工程改造成表达结合及/或靶向ROR1的结合分子，且另一个细胞经工程改造成表达结合及/或靶向额外或第二抗原的结合分子。在一些实施方案中，这些细胞可各自表达多特异性结合分子，例如多特异性重组受体，其中一或多种靶点抗原是ROR1。在一些此类实施方案中，复数个细胞可一起或分开地给予。在一些实施方案中，将复数个细胞中的一些与其他细胞同时或并行地给予，例如在同一天给予，及/或与该复数个中的另一经工程改造的细胞按任何次序依序或间歇地给予。举例而言，在一些实施方案中，将表达ROR1结合分子，例如CAR的经工程改造的细胞与表达结合不同靶点抗原或ROR1上的不同抗原决定基的结合分子的另一经工程改造的细胞同时给予，或按任何次序依序给予。在一些实施方案中，复数个细胞可在同一组合物中或在不同组合物中。例示性细胞组合物包括以下III部分中所描述的组合物。
III.医药组合物
还提供包括ROR1结合分子、免疫偶联物、重组受体及经工程改造的细胞的组合物，包括医药组合物及调配物。还提供包含表达本文所提供的ROR1结合分子，例如重组受体(例如CAR)的经工程改造的细胞的组合物，包括医药组合物及调配物。
提供医药调配物，其包含ROR1结合分子(例如抗体)、免疫偶联物、重组受体(例如嵌合抗原受体)、表达这些分子(例如抗体或重组受体)的经工程改造的细胞、表达这些分子(例如重组受体)的复数个经工程改造的细胞及/或用于组合治疗或疗法的额外药剂。这些医药组合物及调配物一般包括一或多种可选的医药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，该组合物包括至少一种额外治疗剂。
术语“医药调配物”指呈容许所含活性成分的生物活性有效的形式且不含对给予该调配物的受试者具有不可接受毒性的额外组分的制剂。
“医药学上可接受的载剂”指医药调配物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。医药学上可接受的载剂包括(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面中，载剂的选择部分地由特定细胞、结合分子及/或抗体及/或由给药方法决定。因此，存在多种适合调配物。举例而言，该医药组合物可含有防腐剂。适合防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠及苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)。在一些方面中，使用两种或两种以上防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常占总组合物约0.0001重量％至约2重量％。载剂描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)中。医药学上可接受的载剂在所用剂量及浓度下一般对接受者无毒，且包括(但不限于)：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、双醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，例如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白质配合物)；及/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面中，组合物中包括缓冲剂。适合的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸及盐。在一些方面中，使用两种或两种以上缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常占总组合物约0.001重量％至约4重量％。用于制备可给予的医药组合物的方法是已知的。例示性方法更详细地描述于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)。
本文所描述的抗体的调配物可包括冻干调配物及水溶液。
调配物或组合物还可含有超过一种可用于特定适应症、疾病或病况的活性成分，该适应症、疾病或病况用结合分子或细胞，较佳地具有与该结合分子或细胞互补的活性的结合分子或细胞治疗，其中各别活性剂彼此间无不利影响。这些活性成分宜以有效达成预期目的的量组合存在。因此，在一些实施方案中，医药组合物进一步包括其他医药活性剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、道诺霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲胺喋呤、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，细胞或抗体以盐，例如医药学上可接受的盐的形式给予。适合的医药学上可接受的酸加成盐包括衍生自无机酸及有机酸的酸加成盐，这些无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸及硫酸，且这些有机酸例如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、反丁烯二酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸及芳基磺酸，例如对甲苯磺酸。
活性成分可包覆于微胶囊、胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊)或巨乳液中。在某些实施方案中，医药组合物调配为包合复合物，例如环糊精包合复合物形式；或调配为脂质体形式。脂质体可用于使宿主细胞(例如T细胞或NK细胞)靶向特定组织。有许多方法可用于制备脂质体，例如以下文献中所述的方法：例如Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980)，以及美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028及5,019,369。
在一些方面中，医药组合物可采用定时释放型、延迟释放型及持续释放型递送系统，使得组合物的递送在待治疗部位敏化之前发生且递送时间足以引起待治疗部位的敏化。多种类型的释放递送系统可用且已知的。此类系统可避免重复给予组合物，由此增加受试者及医师的便利性。
在一些实施方案中，医药组合物含有有效治疗或预防疾病或病况的量，例如治疗有效量或预防有效量的结合分子及/或细胞。在一些实施方案中，治疗或预防功效通过定期评估所治疗的受试者来监测。对于在数天或更长时间内重复给予，取决于病况，重复治疗直至出现所希望的疾病症状抑制为止。然而，其他给药方案可为有用的且可经确定。所需剂量可通过单次快速注射给予组合物、通过多次快速注射给予组合物或通过连续输注给予组合物来递送。
在某些实施方案中，在含有结合分子的经基因工程改造的细胞的情况下，向受试者给予在或在约1×106至或至约1×1011个范围内的细胞，例如在或在约1×106至或至约5×1010个范围内的细胞(例如为或约为5×106个细胞、为或约为2.5×107个细胞、为或为约5×108个细胞、为或为约1×109个细胞、为或为约5×109个细胞、为或为约2×1010个细胞、为或为约3×1010个细胞、为或为约4×1010个细胞，或由任何两个前述值界定的范围)，例如在或在约1×107至或至约1×1011个范围内的细胞(例如为或为约2×107个细胞、为或为约3×107个细胞、为或为约4×107个细胞、为或为约6×107个细胞、为或为约7×107个细胞、为或为约8×107个细胞、为或为约9×107个细胞、为或为约1×1010个细胞、为或为约2.5×1010个细胞、为或为约5×1010个细胞、为或为约7.5×1010个细胞、为或为约9×1010个细胞，或由任何两个前述值界定的范围)，且在一些情况下在或在约1×108至或至约5×1010个范围内的细胞(例如为或为约1.2×108个细胞、为或为约2.5×108个细胞、为或为约3.5×108个细胞、为或为约4.5×108个细胞、为或为约6.5×108个细胞、为或为约8×108个细胞、为或为约9×108个细胞、为或为约3×109个细胞、为或为约3×1010个细胞、为或为约4.5×1010个细胞)或在这些范围之间的任何值，及/或以每公斤受试者的体重计的此类数量的细胞。
活性成分可使用标准给药技术、调配物及/或装置给予。提供调配物及用于储存及给予组合物的装置，例如注射器及小瓶。给予的细胞可为自体或异源的。举例而言，免疫细胞、免疫反应性细胞或祖细胞可自一名受试者获得且给予同一名受试者或不同的兼容性受试者。外周血液源性免疫反应性细胞或其后代(例如活体内、离体或活体外来源)可经由局部注射给予，包括导管给予、全身注射、局部注射、静脉内注射或非经肠给予。当给予治疗性组合物(例如含有经基因修饰的免疫细胞，例如T细胞的医药组合物)时，一般将其调配为单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
调配物包括供经口、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、经皮、肌肉内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的调配物。在一些实施方案中，细胞群非经肠给予。如本文所使用，术语“非经肠的”包括静脉内、肌肉内、皮下、经直肠、经阴道、颅内、胸内及腹膜内给予。在一些实施方案中，细胞群通过静脉内、腹膜内或皮下注射，使用周边全身性递送向受试者给予。
在一些实施方案中，组合物以无菌液体制剂形式提供，例如等张水溶液、悬浮液、乳液、分散液或黏性组合物，在一些方面中，其可经缓冲至所选pH值。液体制剂通常比凝胶、其他黏性组合物及固体组合物容易制备。另外，液体组合物的给予在某种程度上更方便，尤其是通过注射给予。另一方面，黏性组合物可在适当黏度范围内调配以使与特定组织接触的时间段更长。液体或黏性组合物可包含载剂，这些载剂可为含有例如水、生理食盐水、磷酸盐缓冲生理食盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其适合混合物的溶剂或分散介质。
无菌可注射溶液可通过将结合分子并入溶剂，例如混有适合载剂、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理食盐水、葡萄糖、右旋糖或其类似物的溶剂中来制备。组合物还可经冻干。取决于给予途径及所需制剂，组合物可含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或黏度增强性添加剂、防腐剂、调味剂、颜料及其类似物。在一些方面中，可查询标准文本以制备适合制剂。
可添加增强组合物的稳定性及无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂及缓冲剂。微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其类似物来实现。可注射医药形式的延长吸收可通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝及明胶来实现。
可以制备持续释放型制剂。持续释放型制剂的适合实施例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，这些基质呈成形制品形式，例如呈膜或微胶囊形式。
用于活体内给予的调配物一般是无菌的。无菌性可通过例如经无菌过滤膜过滤来容易地实现。
还提供用于组合疗法的医药组合物。用于本文所描述的组合疗法的任何额外药剂，例如IV.B部分中所描述的药剂可与本文所描述的ROR1结合分子(例如抗体)、免疫偶联物、重组受体(例如嵌合抗原受体)及/或表达这些分子(例如重组受体)的经工程改造的细胞一起制备为一或多种医药组合物形式并给予。组合疗法可以一或多种医药组合物形式给予，例如其中结合分子、重组受体及/或细胞与额外药剂在同一医药组合物中或在独立医药组合物中。举例而言，在一些实施方案中，该额外药剂是额外经工程改造的细胞，例如经工程改造成表达靶向不同抗原或ROR1上的不同抗原决定基的不同重组受体的细胞，并以同一组合物或以独立组合物形式给予。在一些实施方案中，该医药组合物各自根据特定结合分子、重组受体、细胞(例如经工程改造的细胞)及/或额外药剂、及特定给药方案及/或递送方法而调配为适合调配物形式。
IV.方法及用途
还提供使用ROR1结合分子、免疫偶联物、重组受体、经工程改造的细胞以及其医药组合物及调配物的方法，例如治疗方法，以及其用途，其例如用于治疗表达ROR1的疾病、病况及病症；及/或检测、诊断及预后方法。还提供组合疗法及/或治疗的方法。
A.治疗及预防方法及用途
还提供给予ROR1结合分子(包括抗ROR1抗体，例如抗体片段)及含有其的蛋白质(例如重组受体(例如CAR))、表达重组受体(例如CAR)的经工程改造的细胞、表达这些受体的复数个经工程改造的细胞及/或包含其的组合物的方法及其用途，例如治疗及预防用途。此类方法及用途包括治疗方法及用途，例如其涉及向患有与ROR1相关的疾病、病况或病症，例如与ROR1表达相关，及/或细胞或组织表达，例如特异性表达ROR1的疾病、病况或病症的受试者给予分子(例如ROR1结合分子、重组受体)、细胞(例如经工程改造的细胞)或含有其的组合物。在一些实施方案中，该分子、细胞及/或组合物以有效实现疾病或病症的治疗的量给予。本文提供结合分子(例如抗ROR1抗体或其抗原结合片段)、重组受体(例如CAR)及细胞(例如经工程改造的细胞)在此类方法及治疗中，以及在制备药剂以便进行此类治疗方法中的用途。用途包括结合分子、CAR、抗体及细胞在此类方法及治疗中以及在制备药剂以便进行此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，这些方法通过向患有、曾患有或疑似患有疾病或病况的受试者给予结合分子或细胞或包含其的组合物来进行。在一些实施方案中，这些方法借此治疗受试者的疾病或病况或病症。本文还提供本文所提供的组合物，例如医药组合物中的任一种用于治疗与ROR1相关的疾病或病症，例如表达ROR1的癌症的用途。
如本文所使用，“治疗(treatment)”(及其文法变化形式，例如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指疾病或病况或病症、或症状、不良作用或后果、或与其相关的表型的完全或部分改善或减轻。所需治疗作用包括(但不限于)预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理性结果、预防癌转移、减缓疾病进展速率、改善或缓和疾病状态及缓解或改善预后。这些术语不暗示疾病的完全治愈或任何症状的完全消除或对所有症状或结果均有作用。
如本文所使用，“延迟疾病发展”意谓推迟、阻碍、减慢、阻滞、稳定及/或推迟疾病(例如癌症)的发展。取决于所治疗的疾病及/或个体的病史，此延迟可具有不同时间长度。本领域技术人员将显而易见，充分或显著延迟可实际上涵盖预防，因为该个体不发展该疾病。举例而言，可延迟晚期癌症，例如癌转移的发展。
如本文所使用，“预防”包括针对可能易患疾病但尚未诊断患有该疾病的受试者的疾病发生或复发提供预防作用。在一些实施方案中，使用所提供的分子及组合物延迟疾病发展或减慢疾病进展。
如本文所使用，“抑制”功能或活性是使功能或活性相较于除所关注的条件或参数以外其余皆相同的条件，或相较于另一条件有所减小。举例而言，抑制肿瘤生长的抗体或组合物或细胞使肿瘤生长速率相较于在无该抗体或组合物或细胞存在下的肿瘤生长速率减小。
在给予情形下，一种药剂，例如医药调配物、结合分子、抗体或细胞或组合物的“有效量”指在必要剂量/量下及在必要时间段内有效达成所需结果，例如治疗或预防结果的量。
一种药剂，例如医药调配物、结合分子、抗体或细胞的“治疗有效量”指在必要剂量/量下及在必要时间段内达成所需治疗结果，例如治疗疾病、病况或病症，及/或治疗的药物动力学或药效学作用的量。治疗有效量可根据例如受试者的疾病状态、年龄、性别及体重以及所给予的细胞群的类因素而变化。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量，例如治疗有效量给予分子、细胞及/或组合物。
“预防有效量”指在必要剂量下及在必要的时间段内有效达成所需预防结果的量。通常但非必需，由于预防剂量在患病之前或在疾病早期用于受试者，故预防有效量将小于治疗有效量。
如本文所使用，“受试者”是哺乳动物，例如人类或其他动物，且通常是人类。
待治疗的疾病中有任何ROR1相关疾病或病况，或特异性表达ROR1的疾病或病况。在某些疾病及病况中，ROR1在恶性细胞及癌症上表达。在一些实施方案中，该疾病或病况是表达ROR1的癌症。可治疗的ROR1相关疾病或病况包括(但不限于)B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况选自CLL、MCL、卵巢癌、肺癌、胰腺癌或乳腺癌。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况是CLL。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况是MCL。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况是卵巢癌。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况是肺癌。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况是胰腺癌。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况是乳腺癌。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况是肺癌，且肺癌选自肺腺癌、腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)及非典型性类癌。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况是肺癌，且肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病况是乳腺癌，且乳腺癌三阴性乳腺癌。
在一些方面中，在某些疾病及病况中，ROR1是在恶性细胞及癌症上表达，包括与实体肿瘤或恶性血液病相关的癌症。在一些实施方案中，该疾病或病况是表达ROR1的癌症。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症中有癌症，例如表达ROR1的癌症。在一些实施方案中，癌症与实体肿瘤或恶性血液病相关。
在一些实施方案中，癌症与表达ROR1的实体肿瘤相关。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是与实体肿瘤相关的癌症，例如神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。在一些实施方案中，肺癌非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面中，三阴性乳腺癌指对表达雌激素受体、孕酮受体及人类表皮生长因子受体2(HER2)呈阴性的乳腺癌。
在一些实施方案中，癌症与表达ROR1的恶性血液病相关。在一些实施方案中，该与ROR1相关的疾病或病症是B细胞相关病症。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是与恶性血液病相关的癌症，例如B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤或套细胞淋巴瘤(MCL)。
在一些实施方案中，方法包括向患有ROR1相关疾病或病况，例如表达ROR1的癌症的受试者给予表达所提供的结合分子的经工程改造的细胞(例如T细胞)。在特定实施方案中，经工程改造的细胞(例如T细胞)表达含有所提供的抗体或其抗原结合片段(例如scFv)作为抗原结合结构域的重组受体，例如CAR。在一些实施方案中，经工程改造的细胞对所治疗的受试者而言为自体的。在一些实施方案中，经工程改造胞对于所治疗的受试者而言为同种异体的，在此情况下，这些细胞获自患病受试者且在给予经工程改造的细胞之前工程改造成具有重组受体(例如CAR)。
在一些情况下，据报导，工程改造获自患有例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的类疾病或病症的受试者的初代T细胞以使其表达重组受体产生相较于来自患有其他恶性血液病的受试者的初代细胞功能减弱的经工程改造的T细胞(参见例如Gorgun等人,J ClinInvest.2005年7月；115(7):1797-805；Ramsay等人,J Clin Invest.2008年7月；118(7):2427-37；Riches等人,Discov Med.2013年12月；16(90):295-302)。在一些情况下，如本文所描述，所提供的重组受体可由获自患有CLL的受试者且未观察到功能减弱的初代T细胞表达。在一些方面中，表达所提供的结合分子，例如靶向ROR1的重组受体的经工程改造的细胞可成功地使用来自患有例如CLL的类疾病或病症的受试者的细胞产生。
在一些实施方案中，这些方法可鉴别患有、疑似患有ROR1相关疾病或病症、或有患上该疾病或病症的风险的受试者。因此，提供用于鉴别患有与ROR1表达升高相关的疾病或病症的受试者及选择这些受试者以用所提供的ROR1结合分子，包括任何抗ROR1抗体，例如抗体片段及含有其的蛋白质(例如嵌合受体)，及/或表达这些重组受体的经工程改造的细胞治疗的方法。
举例而言，可针对与ROR1表达升高相关的疾病或病症，例如表达ROR1的癌症的存在来筛选受试者。在一些实施方案中，这些方法包括针对ROR1相关疾病，例如肿瘤的存在进行筛选或检测。因此，在一些方面中，样品可自疑似患有与ROR1表达升高相关的疾病或病症的患者获得且分析其ROR1表达水平。在一些方面中，可选择对ROR1相关疾病或病症测试呈阳性的受试者以通过本发明方法进行治疗，且可向该受试者给予治疗有效量的如本文所描述的抗ROR1抗体、靶向ROR1的CAR、含有CAR的细胞或其医药组合物。在一些实施方案中，可使用这些方法随时间，例如在通过这些方法治疗之前、期间或之后监测表达ROR1的组织(例如肿瘤)的大小或密度。
在一些实施方案中，受试者患有持续性或复发性疾病，例如在用另一种ROR1特异性抗体及/或表达靶向ROR1的嵌合受体的细胞及/或其他疗法，包括化学疗法、放射及/或造血干细胞移植(HSCT)，例如同种异体HSCT治疗之后患有持续性或复发性疾病。在一些实施方案中，尽管受试者对另一种ROR1靶向疗法变得具有抗性，但该给予仍有效地治疗受试者。在一些实施方案中，受试者未复发，但经测定具有复发的风险，例如有高复发风险，且因此预防性给予化合物或组合物，以例如降低复发可能性或防止复发。
在一些实施方案中，治疗不会诱导受试者对疗法的免疫反应，及/或不会诱导此类反应达到妨碍有效治疗疾病或病况的程度。在一些方面中，免疫原性及/或移植物抗宿主反应的程度小于使用不同但类似疗法所观察到的程度。举例而言，在一些实施方案中，在使用表达包括所提供的抗ROR1抗体的CAR的细胞进行的过继细胞疗法的情况下，免疫原性程度相较于包括与所提供的抗体(例如小鼠或兔或人源化抗体)结合至类似，例如重叠的抗原决定基及/或竞争结合至ROR1的不同抗体的CAR有所降低。
在一些实施方案中，方法包括过继细胞疗法，其中向受试者给予表达所提供的ROR1靶向受体(例如含有ROR1靶向抗体或其片段)的经基因工程改造的细胞。此类给予可促进细胞以靶向ROR1的方式活化，例如T细胞活化，由此使疾病或病症的细胞成为破坏的靶点。
因此，所提供的方法及用途包括用于过继细胞疗法的方法及用途。在一些实施方案中，这些方法包括向受试者、组织或细胞，例如患有疾病、病况或病症、有患疾病、病况或病症的风险或疑似患有疾病、病况或病症者给予细胞或含有细胞的组合物。在一些实施方案中，向患有待治疗的特定疾病或病况的受试者给予细胞、细胞群及组合物，例如经由过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法给予。在一些实施方案中，细胞或组合物给予受试者，例如患有疾病或病况、或有患疾病或病况的风险的受试者。在一些方面中，这些方法借此治疗，例如改善疾病或病况的一或多种症状，例如通过减小表达ROR1的癌症中的肿瘤负荷进行治疗。
给予用于过继细胞疗法的细胞的方法是已知的且可与所提供的方法及组合物结合使用。举例而言，过继T细胞疗法方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开案第2003/0170238号；Rosenberg的美国专利第4,690,915号；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方案中，细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法，通过自体转移进行，其中细胞自将接受细胞疗法的受试者或自来源于此受试者的样品分离及/或以其他方式制备。因此，在一些方面中，细胞来源于需要治疗的受试者，例如患者且细胞在分离及处理之后给予该受试者。
在一些实施方案中，细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法，通过同种异体转移进行，其中细胞自除将接受或最终接受该细胞疗法的受试者(例如第一受试者)以外的受试者分离及/或以其他方式制备。在此类实施方案中，接着将这些细胞给予相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一与第二受试者在基因上相同。在一些实施方案中，第一与第二受试者在基因上类似。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。
在一些实施方案中，被给予细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，例如人类。在一些实施方案中，灵长类动物是猴或猿。受试者可为雄性或雌性且可为任何适龄受试者，包括婴儿、幼年、青年、成年及老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，例如啮齿动物。在一些实施例中，患者或受试者经过验证的用于疾病、过继细胞疗法及/或用于评估毒性结果，例如细胞因子释放症候群(CRS)的动物模型。
ROR1结合分子，例如抗体及含有这些抗体的嵌合受体以及表达其的细胞可通过任何适合方式给予，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjectival injection)、结膜下注射(subconjuntival injection)、眼球筋膜囊下注射(sub-Tenon's injection)、眼球后注射、眼球周注射，或后近巩膜递送。在一些实施方案中，其通过非经肠、肺内及鼻内给予，且若需要局部治疗，则经病灶内给予。非经肠输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、颅内、胸内或皮下给药。给药及给药可部分地取决于给药是短暂抑或长期的。各种给药时程包括(但不限于)单次给药或在各种时间点多次给药、快速注射给药及脉冲输注。
预防或治疗疾病时，结合分子或细胞的适当剂量可取决于待治疗疾病的类型、结合分子的类型、疾病的严重程度及病程、结合分子出于预防目的抑或治疗目的给予、先前疗法、患者的临床病史及对结合分子的反应，以及主治医师的判断。在一些实施方案中，组合物及分子及细胞宜一次性或经一系列治疗向患者给予。
取决于疾病的类型及严重程度，抗体的剂量可包括或包括约1μg/kg至或至约15mg/kg(例如为或为约0.1mg/kg至或至约10mg/kg)，为或为约1μg/kg至或至约100mg/kg或更高，为或为约0.05mg/kg至或至约10mg/kg，为或为约0.5mg/kg，为或为约2.0mg/kg，为或为约4.0mg/kg，或为或为约10mg/kg。可间歇地给予多次剂量，例如每周或每三周给予。起初可给予较高起始剂量，随后可给予一或多次较低剂量。
在某些实施方案中，向受试者给予的细胞或个别细胞亚型群在或在约1×105至或至约1×1011个细胞及/或以每公斤受试者的体重的该细胞量范围内，例如在或在约1×105至或至约5×1010个细胞范围内(例如为或为约5×106个细胞、为或为约2.5×107个细胞、为或为约5×108个细胞、为或为约1×109个细胞、为或为约5×109个细胞、为或为约2×1010个细胞、为或为约3×1010个细胞、为或为约4×1010个细胞，或由任何两个前述值界定的范围)、在或在约1×106至或至约5×1010个细胞范围内(例如为或为约5×106个细胞、为或为约2.5×107个细胞、为或为约5×108个细胞、为或为约1×109个细胞、为或为约5×109个细胞、为或为约2×1010个细胞、为或为约3×1010个细胞、为或为约4×1010个细胞，或由任何两个前述值界定的范围)，例如在或在约1×107至或至约1×1011个细胞范围内(例如为或为约2×107个细胞、为或为约3×107个细胞、为或为约4×107个细胞、为或为约6×107个细胞、为或为约7×107个细胞、为或为约8×107个细胞、为或为约9×107个细胞、为或为约1×1010个细胞、为或为约2.5×1010个细胞、为或为约5×1010个细胞、为或为约7.5×1010个细胞、为或为约9×1010个细胞，或由任何两个前述值界定的范围)，且在一些情况下在或在约1×108个细胞至或至约5×1010个细胞范围内(例如为或为约1.2×108个细胞、为或为约2.5×108个细胞、为或为约3.5×108个细胞、为或为约6.5×108个细胞、为或为约8×108个细胞、为或为约9×108个细胞、为或为约3×109个细胞、为或为约3×1010个细胞、为或为约4.5×1010个细胞)或在这些范围之间及/或以每公斤受试者的体重计的任何值。剂量可取决于疾病或病症及/或患者及/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，此类值指重组受体表达细胞的数量；在其他实施方案中，其指给予的T细胞或PBMC或总细胞的数量。
在一些实施方案中，例如，当受试者是人类时，剂量包括少于约5×108个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血液单核细胞(PBMC)，例如在或在约1×106至或至约5×108个此类细胞的范围内，例如为或为约2×106、5×106、1×107、5×107、1×108、1.5×108或5×108个总此类细胞，或在任何两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，例如，在受试者是人类的情况下，剂量包括超过或超过约1×106个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血液单核细胞(PBMC)且少于或少于约2×109个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或末梢血液单核细胞(PBMC)，例如在或在约2.5×107至或至约1.2×109个此类细胞范围内，例如为或为约2.5×107、5×107、1×108、1.5×108、8×108或1.2×109个总此类细胞，或在任何两个前述值之间的范围。
在一些实施方案中，经基因工程改造的细胞的剂量包含至少或至少约或是1×105至或至约5×108个总CAR表达(CAR+)T细胞、自或自约1×105至或至约2.5×108个总CAR+T细胞、自或自约1×105至或至约1×108个总CAR+T细胞、自或自约1×105至或至约5×107个总CAR+T细胞、自或自约1×105至或至约2.5×107个总CAR+T细胞、自或自约1×105至或至约1×107个总CAR+T细胞、自或自约1×105至或至约5×106个总CAR+T细胞、自或自约1×105至或至约2.5×106个总CAR+T细胞、自或自约1×105至或至约1×106个总CAR+T细胞、自或自约1×106至或至约5×108个总CAR+T细胞、自或自约1×106至或至约2.5×108个总CAR+T细胞、自或自约1×106至或至约1×108个总CAR+T细胞、自或自约1×106至或至约5×107个总CAR+T细胞、自或自约1×106至或至约2.5×107个总CAR+T细胞、自或自约1×106至或至约1×107个总CAR+T细胞、自或自约1×106至或至约5×106个总CAR+T细胞、自或自约1×106至或至约2.5×106个总CAR+T细胞、自或自约2.5×106至或至约5×108个总CAR+T细胞、自或自约2.5×106至或至约2.5×108个总CAR+T细胞、自或自约2.5×106至或至约1×108个总CAR+T细胞、自或自约2.5×106至或至约5×107个总CAR+T细胞、自或自约2.5×106至或至约2.5×107个总CAR+T细胞、自或自约2.5×106至或至约1×107个总CAR+T细胞、自或自约2.5×106至或至约5×106个总CAR+T细胞、自或自约5×106至或至约5×108个总CAR+T细胞、自或自约5×106至或至约2.5×108个总CAR+T细胞、自或自约5×106至或至约1×108个总CAR+T细胞、自或自约5×106至或至约5×107个总CAR+T细胞、自或自约5×106至或至约2.5×107个总CAR+T细胞、自或自约5×106至或至约1×107个总CAR+T细胞、自或自约1×107至或至约5×108个总CAR+T细胞、自或自约1×107至或至约2.5×108个总CAR+T细胞、自或自约1×107至或至约1×108个总CAR+T细胞、自或自约1×107至或至约5×107个总CAR+T细胞、自或自约1×107至或至约2.5×107个总CAR+T细胞、自或自约2.5×107至或至约5×108个总CAR+T细胞、自或自约2.5×107至或至约2.5×108个总CAR+T细胞、自或自约2.5×107至或至约1×108个总CAR+T细胞、自或自约2.5×107至或至约5×107个总CAR+T细胞、自或自约5×107至或至约5×108个总CAR+T细胞、自或自约5×107至或至约2.5×108个总CAR+T细胞、自或自约5×107至或至约1×108个总CAR+T细胞、自或自约1×108至或至约5×108个总CAR+T细胞、自或自约1×108至或至约2.5×108个总CAR+T细胞、或自或自约2.5×108至或至约5×108个总CAR+T细胞。在一些实施方案中，经基因工程改造的细胞的剂量包含自或自约2.5×107至或至约1.5×108个总CAR+T细胞，例如自或自约5×107至或至约1×108个总CAR+T细胞。
在一些实施方案中，经基因工程改造的细胞的剂量包含至少或至少约1×105个CAR+细胞、至少或至少约2.5×105个CAR+细胞、至少或至少约5×105个CAR+细胞、至少或至少约1×106个CAR+细胞、至少或至少约2.5×106个CAR+细胞、至少或至少约5×106个CAR+细胞、至少或至少约1×107个CAR+细胞、至少或至少约2.5×107个CAR+细胞、至少或至少约5×107个CAR+细胞、至少或至少约1×108个CAR+细胞、至少或至少约1.5×108个CAR+细胞、至少或至少约2.5×108个CAR+细胞、或至少或至少约5×108个CAR+细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包含给予包含自或自约1×105至或至约5×108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血液单核细胞(PBMC)、自或自约5×105至或至约1×107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血液单核细胞(PBMC)、或自或自约1×106至或至约1×107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血液单核细胞(PBMC)的多种细胞的剂量，各自包括端点在内。在一些实施方案中，细胞疗法包含给予一定剂量的细胞，这些细胞包含至少或至少约1×105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血液单核细胞(PBMC)的多种细胞，例如至少或至少约1×106个、至少或至少约1×107个、至少或至少约1×108个此类细胞。在一些实施方案中，该数量是针对CD3+或CD8+的总数，在一些情况下还针对重组受体表达(例如CAR+)细胞的总数。在一些实施方案中，细胞疗法包含给予包含自或自约1×105至或至约5×108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、自或自约5×105至或至约1×107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或自或自约1×106至或至约1×107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞的多种细胞的剂量，各自包括端点在内。在一些实施方案中，细胞疗法包含给予包含自或自约1×105至或至约5×108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、自或自约5×105至或至约1×107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或自或自约1×106至或至约1×107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞的多种细胞的剂量，各自包括端点在内。
在一些实施方案中，该剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+及CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人类的情况下，CD8+T细胞的剂量，包括含CD4+及CD8+T细胞的剂量包括在或在约1×106与或与约5×108个表达重组受体(例如CAR)的总CD8+细胞之间，例如在或在约5×106至或至约1×108个此类细胞范围内，例如为1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108、1.5×108或5×108个总此类细胞，或在任何两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者给予多次剂量，且这些剂量或总剂量各自可在任何前述值的范围内。在一些实施方案中，细胞的剂量包含给予自或自约1×107至或至约0.75×108个表达重组受体的总CD8+T细胞、自或自约1×107至或至约5×107个表达重组受体的总CD8+T细胞、自或自约1×107至或至约0.25×108个表达重组受体的总CD8+T细胞，各自包括端点在内。在一些实施方案中，细胞的剂量包含给予或给予约1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108、1.5×108、2.5×108或5×108个表达重组受体的总CD8+T细胞。
在一些实施方案中，该剂量的细胞，例如表达重组受体的T细胞以单次剂量给予受试者或在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长时间段内仅给予一次。
在一些实施方案中，细胞或抗体作为组合疗法的一部分给予，例如与另一种治疗性干预，例如另一种抗体或经工程改造的细胞或受体或药剂，例如细胞毒性剂或治疗剂，同时给予或按任何次序依序给予。
在一些实施方案中，细胞或抗体与一或多种额外治疗剂一起共给予，或与另一种治疗性干预结合，同时或按任何次序依序共给予。在一些情形下，细胞与另一种疗法在足够接近的时间共给予，以使得细胞群增强一或多种额外治疗剂的作用，或反的还然。在一些实施方案中，细胞或抗体在一或多种额外治疗剂之前给予。在一些实施方案中，细胞或抗体在一或多种额外治疗剂之后给予。
在一些方面中，一旦向哺乳动物(例如人类)给予细胞，即通过多种已知方法中的任一种来测量经工程改造的细胞群及/或抗体的生物活性。评估的参数包括经工程改造或天然的T细胞或其他免疫细胞与抗原例如在活体内的特异性结合，例如通过成像测定；或离体的特异性结合，例如通过ELISA或流动式细胞测量术测定。在某些实施方案中，经工程改造的细胞破坏靶点细胞的能力可使用本领域中已知的任何适合方法测量，例如以下中所描述的细胞毒性分析：例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；及Herman等人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，细胞的生物活性还可通过分析某些细胞因子，例如CD 107a、IFNγ、IL-2及TNF的表达及/或分泌来测量。在一些方面中，生物活性通过评估临床结果，例如肿瘤负荷或负载的减小来测量。
在某些实施方案中，经工程改造的细胞以多种方式修饰，由此增加其治疗或预防功效。举例而言，在一些实施方案中，由群体表达的经工程改造的CAR或TCR直接或经由接头间接与靶向部分共轭。使化合物，例如CAR或TCR与靶向部分共轭的实践已知的。参见例如Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)，及美国专利5,087,616。
B.组合疗法
还提供组合疗法的方法，该组合疗法包括ROR1结合分子(包括抗ROR1抗体，例如抗体片段)、偶联物及含有其的蛋白质(例如重组受体(例如CAR))、表达重组受体(例如CAR)的经工程改造的细胞、复数个表达这些受体的经工程改造的细胞及/或包含其的组合物的给予及使用，例如治疗性及预防性使用。
在一些实施方案中，本文所描述的ROR1结合分子(例如抗体)、免疫偶联物、重组受体(例如嵌合抗原受体)及/或表达这些分子(例如重组受体)的经工程改造的细胞作为组合治疗或组合疗法的一部分给予，例如与一或多种额外治疗性干预同时、按任何次序依序或间歇地给予。在一些实施方案中，该一或多种额外治疗性干预包括例如抗体、经工程改造的细胞、受体及/或药剂，例如表达重组受体的细胞，及/或细胞毒性剂或治疗剂，例如化学治疗剂。在一些实施方案中，组合疗法包括给予一或多种额外药剂、疗法及/或治疗，例如本文所描述的额外药剂、疗法及/或治疗中的任一种。在一些实施方案中，组合疗法包括给予一或多种用于治疗或疗法的额外药剂，例如免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、腺苷路径或腺苷受体拮抗剂或促效剂、及激酶抑制剂。在一些实施方案中，组合治疗或组合疗法包括额外治疗，例如手术治疗、移植及/或放射疗法。还提供组合治疗或组合疗法的方法，其包括给予本文所描述的结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体、细胞及/或组合物以及一或多种额外治疗性干预。
在一些实施方案中，用于组合治疗或组合疗法的额外药剂增强、加强及/或促进结合分子、重组受体、细胞及/或组合物的治疗作用的功效及/或安全性。在一些实施方案中，该额外药剂增强或改善所给予的细胞，例如表达结合分子或重组受体的细胞的功效、存活或存留性。在一些实施方案中，该额外药剂选自蛋白质磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫调节剂或降低调节T(Treg)细胞的水平或活性的药剂。在一些实施方案中，该额外药剂借助于减少或改善所给予的结合分子、重组受体、细胞及/或组合物的不良作用来增强其安全性。在一些实施方案中，该额外药剂可治疗相同的疾病、病况或伴随疾病。在一些实施方案中，该额外药剂可改善、减少或消除与给予结合分子、重组受体、细胞及/或组合物，例如表达CAR的细胞相关的一或多种毒性、不良作用或副作用。
在一些实施方案中，额外疗法、治疗或药剂包括化学疗法、放射疗法、手术、移植、过继细胞疗法、抗体、细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、保心药、免疫刺激剂、免疫抑制剂、免疫检查点抑制剂、抗生素、血管生成抑制剂、代谢调节剂或其他治疗剂，或其任何组合。在一些实施方案中，该额外药剂是蛋白质、肽、核酸、小分子药剂、细胞、毒素、脂质、碳水化合物或其组合，或任何其他类型的治疗剂，例如放射。在一些实施方案中，该额外疗法、药剂或治疗包括手术、化学疗法、放射疗法、移植、给予表达重组受体(例如CAR)的细胞、激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂、mTOR路径抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗体、免疫消融剂、抗体及/或其抗原结合片段、抗体偶联物、其他抗体疗法、细胞毒素、类固醇、细胞因子、肽疫苗、激素疗法、抗代谢物、代谢调节剂、抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶或p70S6激酶FK506或抑制p70S6激酶的药物、烷基化剂、蒽环霉素(anthracycline)、长春花生物碱(vinca alkaloid)、蛋白酶体抑制剂、GITR促效剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、溶瘤病毒及/或其他类型的免疫疗法。在一些实施方案中，该额外药剂或治疗是骨髓移植、使用化学治疗剂(例如氟达拉滨(fludarabine))的T细胞消融疗法、外部射束放射疗法(XRT)、环磷酰胺及/或抗体疗法。
在一些实施方案中，细胞、结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体及/或组合物，例如表达CAR的细胞，与其他经工程改造的细胞，例如其他表达CAR的细胞组合给予。在一些实施方案中，该额外药剂是激酶抑制剂，布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton's tyrosinekinase，Btk)抑制剂，例如依鲁替尼(ibrutinib)。在一些实施方案中，该额外药剂是腺苷路径或腺苷受体拮抗剂或促效剂。在一些实施方案中，该额外药剂是免疫调节剂，例如沙立度胺(thalidomide)或沙立度胺衍生物(例如来那度胺(lenalidomide))。在一些实施方案中，该额外疗法、药剂或治疗是细胞毒性剂或化学治疗剂、生物疗法(例如抗体，例如单克隆抗体；或细胞疗法)或抑制剂(例如激酶抑制剂)。
在一些实施方案中，将化学治疗剂(有时称作细胞毒性剂)给予受试者以破坏病变。在某些实施方案中，病变是肿瘤。在特定实施方案中，病变是癌变。在特定实施方案中，化学治疗剂是本领域技术人员已知可有效治疗、预防或改善例如癌症的类过度增生性病症的任何药剂。化学治疗剂包括(但不限于)小分子、合成药物、肽、多肽、蛋白质、核酸(例如DNA及RNA聚核苷酸，包括(但不限于)反义核苷酸序列、三螺旋及编码生物活性蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列)、抗体、合成或天然无机分子、模拟剂及合成或天然有机分子。在特定实施方案中，化学治疗药物包括烷基化剂、蒽环霉素、细胞骨架破坏剂(紫杉烷)、埃博霉素(epothilone)、组蛋白去乙酰酶抑制剂、拓朴异构酶抑制剂、拓朴异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物及前驱物类似物、肽抗生素、铂类药剂以及长春花生物碱及衍生物。
在某些实施方案中，通过给予化学治疗剂以在活体内调节经基因工程改造的细胞来破坏病变。化学治疗剂可包括(但不限于)阿巴瑞克(abarelix)、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利维甲酸(alitretinoin)、别嘌呤醇(allopurinol)、六甲蜜胺(altretamine)、阿米福汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、三氧化二砷、天冬酰胺酶、BCG活疫苗、贝伐单抗(bevaceizumab)、贝沙罗汀(bexarotene)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安(busulfan)、卡鲁睾酮(calusterone)、喜树碱(camptothecin)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、塞内昔布(celecoxib)、西妥昔单抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、西那卡塞(cinacalcet)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、放线菌素D(dactinomycin)、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、道诺霉素、地尼白介素(denileukindiftitox)、右雷佐生(dexrazoxane)、多西他赛(docetaxel)、小红莓、屈他雄酮(dromostanolone)、埃利奥特氏B溶液(Elliott's B solution)、表柔比星(epirubicin)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依西美坦(exemestane)、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟维司群(fulvestrant)、吉西他滨(gemcitabine)、吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、吉非替尼(gefitinib)、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、伊立替康(irinotecan)、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、左旋咪唑(levamisole)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(meclorethamine)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、美司钠(mesna)、甲胺喋呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、丝裂霉素C(mitomycin C)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、诺龙(nandrolone)、诺非单抗(nofetumomab)、奥利默森(oblimersen)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸盐(pamidronate)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegaspargase)、派非格司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、聚苯丙生(polifeprosan)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、利妥昔单抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、链脲菌素(streptozocin)、滑石、他莫昔芬(tamoxifen)、得舒(tarceva)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睪内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、拓朴替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、伐柔比星(valrubicin)、长春碱、长春新碱(vincristine)、长春瑞宾(vinorelbine)及唑来膦酸盐(zoledronate)。
在一些实施方案中，例示性化学治疗剂包括蒽环霉素(例如阿霉素，例如脂质体阿霉素)；长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨)；烷基化剂(例如环磷酰胺、达喀尔巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)；免疫细胞抗体(例如阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗(tositumomab))；抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物及腺苷脱胺酶抑制剂，例如氟达拉滨)；TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白质(GITR)促效剂；蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A(aclacinomycin A)、胶毒素(gliotoxin)或硼替佐米)；免疫调节药，例如沙立度胺或沙立度胺衍生物(例如来那度胺)。
在一些实施方案中，该额外疗法或治疗是细胞疗法，例如过继细胞疗法。在一些实施方案中，该额外疗法包括给予经工程改造的细胞，例如额外的表达CAR的细胞。在一些实施方案中，额外的经工程改造的细胞是表达与本文所提供的经工程改造的细胞，例如表达抗ROR1 CAR的细胞相同或不同的重组受体的表达CAR的细胞。在一些实施方案中，在额外的经工程改造的细胞上表达的重组受体，例如CAR，识别不同抗原及/或抗原决定基。在一些实施方案中，在额外的经工程改造的细胞上表达的重组受体，例如CAR，识别与本文所描述的重组受体所识别相同的抗原(例如ROR1)的不同抗原决定基。在一些实施方案中，在额外的经工程改造的细胞上表达的重组受体，例如CAR，识别不同抗原，例如不同肿瘤抗原或抗原组合。举例而言，在一些实施方案中，在额外的经工程改造的细胞上表达的重组受体，例如CAR，靶向表达早期谱标记物的癌细胞，例如癌症干细胞，而其他表达CAR的细胞靶向表达晚期谱标记物的癌细胞。在此类实施方案中，额外的经工程改造的细胞在给予(例如输注)本文所描述的表达CAR的细胞之前、同时或之后给予。在一些实施方案中，额外的经工程改造的细胞表达同种异体CAR。
在一些实施方案中，一或多个CAR分子的组态包含一个初级细胞内信号传导结构域及两个或两个以上(例如2、3、4或5个或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，一或多个CAR分子可具有相同或不同的初级细胞内信号传导结构域、相同或不同的共刺激信号传导结构域、或相同数量或不同数量的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，一或多个CAR分子可经组态成分离(split)的CAR，其中一个CAR分子包含抗原结合结构域及共刺激结构域(例如4-1BB)，而另一个CAR分子包含抗原结合结构域及初级细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)。
在一些实施方案中，该额外药剂是多特异性结合分子、及/或经工程改造成表达本文所描述的结合分子中的一或多个的细胞、及/或经工程改造成表达靶向不同抗原的额外结合分子，例如重组受体，例如CAR的细胞中的任一种。在一些实施方案中，额外药剂包括本文例如在I.C部分中所描述的细胞或复数个细胞中的任一种。在一些实施方案中，额外药剂是经工程改造成表达靶向不同抗原决定基及/或抗原，例如与疾病或病况相关的不同抗原的重组受体(例如CAR)的细胞。在一些实施方案中，额外药剂经工程改造成表达靶向疾病或病症，例如癌症或肿瘤中所表达的第二或额外抗原的重组受体，例如CAR的细胞。
在一些实施方案中，额外药剂是免疫调节剂。在一些实施方案中，组合疗法包括免疫调节剂，其可例如通过抑制免疫抑制信号传导或增强免疫刺激信号传导刺激、扩大及/或以其他方式增强抗肿瘤免疫反应，例如由给予经工程改造的细胞引起的抗肿瘤免疫反应。在一些实施方案中，免疫调节剂是肽、蛋白质或小分子。在一些实施方案中，蛋白质可为融合蛋白或重组蛋白。在一些实施方案中，免疫调节剂结合至免疫靶点，例如在免疫细胞，例如T细胞、B细胞或抗原呈现细胞上表达的细胞表面受体。举例而言，在一些实施方案中，免疫调节剂抗体或抗原结合抗体片段、融合蛋白、小分子或多肽。在一些实施方案中，结合分子、重组受体、细胞及/或组合物与额外药剂组合给予，该额外药剂是抗体或其抗原结合片段，例如单克隆抗体。
在一些实施方案中，免疫调节剂阻断、抑制或对抗免疫检查点路径的组分。免疫系统具有多条参与维持自身耐受性及用于调节免疫反应的抑制性路径。肿瘤可使用某些免疫检查点路径作为主要免疫抵抗机制，特别是针对肿瘤抗原特异性T细胞(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer12:252-264)，例如经工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞。由于许多此类免疫检查点通过配体-受体相互作用起始，故其可容易地由针对这些配体及/或其受体的抗体阻断。
因此，使用阻断免疫检查点路径的拮抗分子，例如小分子、核酸抑制剂(例如RNAi)或抗体分子的疗法正成为用于癌症及其他疾病的免疫疗法的有前景的途径。与大部分抗癌剂相对，检查点抑制剂不必直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配体以便增强免疫系统的内源性抗肿瘤活性。
如本文所使用，术语“免疫检查点抑制剂”指完全或部分地减少、抑制、干扰或调节一或多种检查点蛋白质的分子。检查点蛋白质调控T细胞活化或功能。这些蛋白质负责T细胞反应的共刺激或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白质调控并维持自身耐受性以及生理免疫反应的持续时间及幅度。在一些实施方案中，可向受试者给予可增强或加强免疫反应的额外药剂，该免疫反应例如由本文所提供的结合分子(例如ROR1结合分子)、细胞及/或组合物实现的针对疾病或病况，例如癌症(例如本文所描述的任何癌症)的免疫反应。
免疫检查点抑制剂包括以统计学显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制路径的任何药剂。此类抑制剂可包括小分子抑制剂或可包括抗体或其抗原结合片段，其结合至并阻断或抑制免疫检查点受体、配体及/或受体-配体相互作用。在一些实施方案中，调节、增强及/或刺激特定受体可克制免疫检查点路径组分。可作为阻断、抑制、调节、增强及/或刺激的靶点的例示性免疫检查点分子包括(但不限于)PD-1(CD279)、PD-L1(CD274、B7-H1)、PDL2(CD273、B7-DC)、CTLA-4、LAG-3(CD223)、TIM-3、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、GITR(TNFRSF18、AITR)、CD40、OX40(CD134、TNFRSF4)、CXCR2、肿瘤相关抗原(TAA)、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族且在所有NK、γδ及记忆型CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(还称为BY55)、CGEN-15049、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷及转型生长因子受体(TGFR；例如TGFRβ)。免疫检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段、或其他结合蛋白，其结合至并阻断或抑制及/或增强或刺激这些分子中的任一个或多个的活性。
例示性免疫检查点抑制剂包括曲美单抗(Tremelimumab)(CTLA-4阻断抗体，还称为替西单抗(ticilimumab)、CP-675,206)、抗OX40药、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1药；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1抗体)、CT-011(抗PD-1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PD-L1抗体)、BMS-936559(抗PD-L1抗体)、MPLDL3280A(抗PD-L1抗体)、MSB0010718C(抗PD-L1抗体)及伊匹单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4抗体，还称为
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MDX-010及MDX-101)。例示性免疫调节抗体包括(但不限于)达利珠单抗(Daclizumab)(Zenapax)、贝伐单抗(Bevacizumab)
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巴利昔单抗(Basiliximab)、伊匹单抗、纳武单抗、派立珠单抗(pembrolizumab)、MPDL3280A、皮立珠单抗(Pidilizumab)(CT-011)、MK-3475、BMS-936559、MPDL3280A(阿特珠单抗(Atezolizumab))、曲美单抗、IMP321、BMS-986016、LAG525、乌瑞鲁单抗(urelumab)、PF-05082566、TRX518、MK-4166、达西珠单抗(dacetuzumab)(SGN-40)、鲁卡木单抗(lucatumumab)(HCD122)、SEA-CD40、CP-870、CP-893、MEDI6469、MEDI6383、MOXR0916、AMP-224、MSB0010718C(艾维路单抗(Avelumab))、MEDI4736、PDR001、rHIgM12B7、尤洛库单抗(Ulocuplumab)、BKT140、瓦里木单抗(Varlilumab)(CDX-1127)、ARGX-110、MGA271、利瑞路单抗(lirilumab)(BMS-986015、IPH2101)、IPH2201、ARGX-115、埃玛图单抗(Emactuzumab)、CC-90002及MNRP1685A或其抗体结合片段。其他例示性免疫调节剂包括例如阿夫妥珠单抗(afutuzumab)(可购自
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)；派非格司亭(pegfilgrastim)
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来那度胺(CC-5013，
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)；沙立度胺
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艾可米得(actimid)(CC4047)；及IRX-2(包括白介素1、白介素2及干扰素γ的人类细胞因子混合物，CAS 951209-71-5，可购自IRXTherapeutics)。
程序性细胞死亡1(PD-1)是在B细胞、NK细胞及T细胞中表达的免疫检查点蛋白质(Shinohara等人,1995,Genomics 23:704-6；Blank等人,2007,Cancer ImmunolImmunother 56:739-45；Finger等人,1997,Gene 197:177-87；Pardoll(2012)NatureReviews Cancer 12:252-264)。PD-1的主要作用是限制周边组织中的T细胞在发炎期间响应于感染的活性以及限制自体免疫。PD-1表达在活化T细胞中得到诱导，且PD-1与其内源性配体中的一种的结合通过抑制刺激性激酶而起到抑制T细胞活化的作用。PD-1还起到抑制TCR“终止信号”的作用。PD-1在Treg细胞上高水平表达，且可在配体存在下增加其增殖(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer 12:252-264)。抗PD-1抗体已用于治疗黑素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、白血病、淋巴瘤及肾细胞癌(Topalian等人,2012,N Engl J Med 366:2443-54；Lipson等人,2013,Clin CancerRes 19:462-8；Berger等人,2008,Clin Cancer Res 14:3044-51；Gildener-Leapman等人,2013,Oral Oncol 49:1089-96；Menzies及Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85)。例示性抗PD-1抗体包括纳武单抗(BMS的Opdivo)、派立珠单抗(Merck的Keytruda)、皮立珠单抗(Cure Tech的CT-011)、拉立珠单抗(lambrolizumab)(Merck的MK-3475)、及AMP-224(Merck)，纳武单抗(又称为Opdivo、BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)是特异性阻断PD-1的完全人类IgG4单克隆抗体。纳武单抗(纯系5C4)及特异性结合至PD-1的其他人类单克隆抗体描述于US 8,008,449及WO2006/121168中。皮立珠单抗(CT-011；CureTech)是结合至PD-1的人源化IgG1k单克隆抗体。皮立珠单抗及其他人源化抗PD-1单克隆抗体描述于WO2009/101611中。派立珠单抗(先前称为拉立珠单抗，且还称为Keytruda、MK03475；Merck)是结合至PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。派立珠单抗及其他人源化抗PD-1抗体描述于US 8,354,509及WO2009/114335中。其他抗PD-1抗体尤其包括AMP 514(Amplimmune)，例如US 8,609,089、US 2010028330、US 20120114649及/或US 20150210769中所描述的抗PD-1抗体。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如描述于WO2010/027827及WO2011/066342中)是阻断PD-1与B7-H1之间相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。
PD-L1(还称为CD274及B7-H1)及PD-L2(还称为CD273及B7-DC)是PD-1的配体，其见于活化T细胞、B细胞、骨髓细胞、巨噬细胞及一些类型的肿瘤细胞上。抗肿瘤疗法已集中在抗PD-L1抗体。PD-1与PD-L1的复合物抑制CD8+T细胞的增殖并减少免疫反应(Topalian等人,2012,N Engl JMed 366:2443-54；Brahmer等人,2012,N Eng J Med 366:2455-65)。抗PD-L1抗体已用于治疗非小细胞肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌及恶性血液病(Brahmer等人,2012,N Eng J Med 366:2455-65；Ott等人,2013,Clin Cancer Res 19:5300-9；Radvanyi等人,2013,Clin Cancer Res 19:5541；Menzies及Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85；Berger等人,2008,Clin Cancer Res 14:13044-51)。例示性抗PD-L1抗体包括MDX-1105(Medarex)、MEDI4736(Medimmune)、MPDL3280A(Genentech)、BMS-935559(Bristol-Myers Squibb)及MSB0010718C。MEDI4736(Medimmune)是结合至PD-L1且抑制配体与PD-1的相互作用的人类单克隆抗体。MDPL3280A(Genentech/Roche)是结合至PD-L1的经人类Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A及针对PD-L1的其他人类单克隆抗体描述于美国专利第7,943,743号及美国公开案第20120039906号中。其他抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(参见WO2010/077634)及MDX-1105(还称为BMS-936559，及例如WO2007/005874中所描述的抗PD-L1结合剂)。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)，还称为CD152，用以调控T细胞活化的共抑制分子。CTLA-4仅仅在T细胞上表达的免疫球蛋白超家族成员。CTLA-4起到抑制T细胞活化的作用，且据报导其抑制辅助T细胞活性且增强调节T细胞的免疫抑制活性。尽管CTLA-4的确切作用机制仍在研究中，但已表明其通过在与CD28竞争结合至CD80及CD86中胜出以及向T细胞主动递送抑制剂信号来抑制T细胞活化(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer 12:252-264)。抗CTLA-4抗体已在临床试验中用于治疗黑素瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(Robert及Ghiringhelli,2009,Oncologist 14:848-61；Ott等人,2013,ClinCancer Res 19:5300；Weber,2007,Oncologist 12:864-72；Wada等人,2013,J Transl Med11:89)。抗CTLA-4的显著特征是抗肿瘤作用的动力学，其生理反应在初始治疗之后需要延滞长达6个月时间。在一些情况下，在治疗起始之后，肿瘤的大小可在发现减小之前实际上增加(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer 12:252-264)。例示性抗CTLA-4抗体包括伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)及曲美单抗(Pfizer)。伊匹单抗最近已被FDA批准用于治疗转移性黑素瘤(Wada等人,2013,J Transl Med 11:89)。
淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)，还称为CD223，是另一种免疫检查点蛋白质。LAG-3已与淋巴细胞活性抑制相关联，且在一些情况下与淋巴细胞失能的诱导相关联。LAG-3在免疫系统中的各种细胞上表达，包括B细胞、NK细胞及树突状细胞。LAG-3是II类MHC受体的天然配体，其在黑素瘤浸润性T细胞上，包括具有强效免疫抑制活性的T细胞上大量表达。例示性抗LAG-3抗体包括BMS-986016(Bristol-Myers Squib)，其是靶向LAG-3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗性LAG-3抗体，且IMP731(Immutep及GlaxoSmithKline)是耗竭性LAG-3抗体。其他LAG-3抑制剂包括IMP321(Immutep)，其是LAG3及Ig的可溶性部分的重组融合蛋白，其结合至II类MHC分子且活化抗原呈现细胞(APC)。其他抗体描述于例如WO2010/019570及US 2015/0259420中。
经显示，最初在活化Th1细胞上鉴别的T细胞免疫球蛋白结构域及黏蛋白结构域-3(TIM-3)是免疫反应的负调控子。阻断TIM-3将促进T细胞介导的抗肿瘤免疫且在一系列小鼠肿瘤模型中具有抗肿瘤活性。TIM-3阻断与其他免疫治疗剂(例如TSR-042、抗CD137抗体及其他)的组合在增加抗肿瘤作用方面可提供累加或协同作用。TIM-3表达已与包括黑素瘤、NSCLC及肾癌在内的多种不同肿瘤类型相关联，且另外，经显示，肿瘤内TIM-3的表达与包括NSCLC、子宫颈癌及胃癌在内的一系列肿瘤类型的不良预后相关。TIM-3的阻断还在促进针对多种慢性病毒性疾病的免疫性增加中受到关注。还已显示，TIM-3与包括半乳糖凝集素-9、磷脂酰丝氨酸及HMGB1在内的多种配体相互作用，但目前尚不清楚这些配体中的哪一种(若存在)与抗肿瘤反应的调控相关。在一些实施方案中，靶向TIM-3的抗体、抗体片段、小分子或肽抑制剂可结合至TIM-3的IgV结构域以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM-3的例示性抗体及肽描述于US 2015/0218274、WO2013/006490及US 2010/0247521中。其他抗TIM-3抗体包括RMT3-23的人源化形式(Ngiow等人,2011,Cancer Res,71:3540-3551)及纯系8B.2C12(Monney等人,2002,Nature,415:536-541)。抑制TIM-3及PD-1的双特异性抗体描述于US 2013/0156774中。
在一些实施方案中，额外药剂是CEACAM抑制剂(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5抑制剂)。在一些实施方案中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。例示性抗CEACAM-1抗体描述于WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251及WO 2014/022332中，例如单克隆抗体34B1、26H7及5F4；或其重组形式，如例如US2004/0047858、US 7,132,255及WO 99/052552中所描述。在一些实施方案中，抗CEACAM抗体结合至CEACAM-5，如例如Zheng等人PLoS One.(2011)6(6):e21146)中所描述，或与CEACAM-1及CEACAM-5交叉反应，如例如WO 2013/054331及US 2014/0271618中所描述。
4-1BB，还称为CD137，属于TNFR超家族的跨膜醣蛋白。4-1BB受体存在于活化T细胞及B细胞以及单核细胞上。例示性抗4-1BB抗体是乌瑞鲁单抗(BMS-663513)，其具有潜在免疫刺激及抗赘生活性。
肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)，还称为OX40及CD134，是TNFR超家族的另一个成员。OX40不会组成性表达于休眠原初T细胞上，且充当二级共刺激免疫检查点分子。例示性抗OX40抗体MEDI6469及MOXR0916(RG7888，Genentech)。
在一些实施方案中，额外药剂包括减少调节T细胞(Treg)群的分子。减少Treg细胞的数量(例如耗竭)的方法是本领域中已知的，且包括例如CD25耗竭、环磷酰胺给予及调节糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)功能。GITR是在活化T细胞上上调的TNFR超家族成员，其增强免疫系统。在血球分离术之前或在给予经工程改造的细胞(例如表达CAR的细胞)之前减少受试者中Treg细胞的数量可减少肿瘤微环境中不想要的免疫细胞(例如Treg)的数量且降低受试者复发的风险。在一些实施方案中，额外药剂包括靶向GITR及/或调节GITR功能的分子，例如GITR促效剂及/或耗竭调节T细胞(Treg)的GITR抗体。在一些实施方案中，额外药剂包括环磷酰胺。在一些实施方案中，GITR结合分子及/或调节GITR功能的分子(例如GITR促效剂及/或耗竭Treg的GITR抗体)在经工程改造的细胞(例如表达CAR的细胞)之前给予。举例而言，在一些实施方案中，GITR促效剂可在细胞血球分离术之前进行给予。在一些实施方案中，环磷酰胺在给予(例如输注或再输注)经工程改造的细胞(例如表达CAR的细胞)之前或在对细胞进行血球分离术之前给予受试者。在一些实施方案中，环磷酰胺及抗GITR抗体在给予(例如输注或再输注)经工程改造的细胞(例如表达CAR的细胞)之前或在对细胞进行血球分离术之前给予受试者。
在一些实施方案中，额外药剂是GITR促效剂。例示性GITR促效剂包括例如GITR融合蛋白及抗GITR抗体(例如二价抗GITR抗体)，例如美国专利第6,111,090号、欧洲专利第090505B 1号、美国专利第8,586,023号、PCT公开案第WO 2010/003118号及第2011/090754号中所描述的GITR融合蛋白；或例如美国专利第7,025,962号、欧洲专利第1947183B 1号、美国专利第7,812,135号、美国专利第8,388,967号、美国专利第8,591,886号、欧洲专利第EP 1866339号、WO 2011/028683、WO 2013/039954、WO2005/007190、WO 2007/133822、WO2005/055808、WO 99/40196、WO 2001/03720、WO99/20758、WO2006/083289、WO 2005/115451、美国专利第7,618,632号及WO 2011/051726中所描述的抗GITR抗体。例示性抗GITR抗体是TRX518。
在一些实施方案中，额外药剂增强所给予的细胞(例如表达CAR的细胞)的肿瘤浸润或转移(transmigration)。举例而言，在一些实施方案中，额外药剂刺激CD40，例如CD40L，例如重组人类CD40L。分化簇40(CD40)还为TNFR超家族的成员。CD40是在抗原呈现细胞上发现的共刺激蛋白质，且介导广泛多种免疫及发炎性反应。CD40还在一些恶性病上表达，在此情况下，其促进增殖。例示性抗CD40抗体是达西珠单抗(SGN-40)、鲁卡木单抗(Novartis，拮抗剂)、SEA-CD40(Seattle Genetics)及CP-870,893。在一些实施方案中，增强肿瘤浸润的额外药剂包括酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼(sunitnib)、肝素酶及/或趋化因子受体，例如CCR2、CCR4及CCR7。
在一些实施方案中，额外药剂是沙立度胺的结构或功能类似物或衍生物及/或E3泛素连接酶抑制剂。在一些实施方案中，免疫调节剂结合至塞勒布隆(cereblon，CRBN)。在一些实施方案中，免疫调节剂结合至CRBN E3泛素连接酶复合物。在一些实施方案中，免疫调节剂结合至CRBN及CRBN E3泛素连接酶复合物。在一些实施方案中，免疫调节剂使CRBN的蛋白质或基因表达上调。在一些方面中，CRBN是CRL4CRBN E3泛素连接酶的基质接附蛋白，并调节该酶的特异性。在一些实施方案中，结合至CRB或CRBN E3泛素连接酶复合物将抑制E3泛素连接酶活性。在一些实施方案中，免疫调节剂诱导KZF1(伊卡洛斯(Ikaros))及IKZF3(艾俄洛斯(Aiolos))的泛素化及/或诱导IKZF1(伊卡洛斯)及IKZF3(艾俄洛斯)的降解。在一些实施方案中，免疫调节剂诱导CRL4CRBN E3泛素连接酶对酪蛋白激酶1A1(CK1α)的泛素化。在一些实施方案中，CK1α泛素化引起CK1α降解。
在一些实施方案中，额外药剂是伊卡洛斯(IKZF1)转录因子的抑制剂。在一些实施方案中，额外药剂增进伊卡洛斯的泛素化。在一些实施方案中，额外药剂增进伊卡洛斯的降解。在一些实施方案中，额外药剂下调伊卡洛斯的蛋白质或基因表达。在一些实施方案中，给予额外药剂使伊卡洛斯蛋白质水平降低。
在一些实施方案中，额外药剂是艾俄洛斯(IKZF3)转录因子的抑制剂。在一些实施方案中，额外药剂增进艾俄洛斯的泛素化。在一些实施方案中，额外药剂增进艾俄洛斯的降解。在一些实施方案中，额外药剂下调艾俄洛斯的蛋白质或基因表达。在一些实施方案中，给予额外药剂使艾俄洛斯蛋白质水平降低。
在一些实施方案中，额外药剂是伊卡洛斯(IKZF1)及艾俄洛斯(IKZF3)两种转录因子的抑制剂。在一些实施方案中，额外药剂增进伊卡洛斯及艾俄洛斯两者的泛素化。在一些实施方案中，额外药剂增进伊卡洛斯及艾俄洛斯两者的降解。在一些实施方案中，额外药剂增进伊卡洛斯及艾俄洛斯两者的泛素化及降解。在一些实施方案中，给予额外药剂使艾俄洛斯蛋白质水平及伊卡洛斯蛋白质水平均降低。
在一些实施方案中，额外药剂是选择性细胞因子抑制性药物(SelCID)。在一些实施方案中，额外药剂抑制磷酸二酯酶-4(PDE4)的活性。在一些实施方案中，额外药剂抑制CDC25磷酸酶的酶活性。在一些实施方案中，额外药剂改变CDC25磷酸酶的细胞内运输。
在一些实施方案中，额外药剂是沙立度胺(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-lH-异吲哚-l,3(2H)-二酮)或沙立度胺的类似物或衍生物。在某些实施方案中，沙立度胺衍生物包括具有类似生物活性的沙立度胺的结构变体。例示性沙立度胺衍生物包括(但不限于)来那度胺(REVLIMMUNOMODULATORY COMPOUNDTM；Celgene Corporation)、泊利度胺(pomalidomide)(又称为ACTIMMUNOMODULATORY COMPOUNDTM或POMALYSTTM(CelgeneCorporation))、CC-1088、CDC-501及CDC-801，以及美国专利第5,712,291号、第7,320,991号及第8,716,315号；美国申请案第2016/0313300号；及PCT公开案第WO 2002/068414号及第WO 2008/154252号中所揭示的化合物。
在一些实施方案中，额外药剂是如以引用的方式并入本文中的美国专利第5,635,517号中所描述的在苯并环中经氨基取代的1-氧代-及1,3二氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉。
在一些实施方案中，额外药剂是下式的化合物：
Figure BDA0003187625950002001
其中X及Y中的一个是-C(O)-且X及Y中的另一个是-C(O)-或-CH2-，且R5是氢或低碳数烷基；或其医药学上可接受的盐。在一些实施方案中，X是-C(O)-且Y是-CH2-。在一些实施方案中，X及Y均为-C(O)-。在一些实施方案中，R5是氢。在其他实施方案中，R5是甲基。
在一些实施方案中，额外药剂是属于经取代的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)邻苯二甲酸酯免疫调节化合物及经取代的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚类别的化合物，例如美国专利第6,281,230号、第6,316,471号、第6,335,349号及第6,476,052号；以及国际专利申请案第PCT/US97/13375号(国际公开案第WO 98/03502号)中所描述者，各案以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，额外药剂下式的化合物：
Figure BDA0003187625950002011
其中
X及Y中的一个是-C(O)-且X及Y中的另一个是-C(O)-或-CH2-；
(1)R1、R2、R3及R4各自独立地为卤基、具有1至4个碳原子的烷基或具有1至4个碳原子的烷氧基，或
(2)R1、R3、R4及R5中的一个是-NHRa且R1、R2、R3及R4中的其余部分是氢，其中Ra是氢或具有1至8个碳原子的烷基；
R5是氢或具有1至8个碳原子的烷基、苯甲基或卤基；
其限制条件为，若X及Y是-C(O)-且(i)R1、R2、R3及R4各自是氟；或(ii)R1、R2、R3及R4中的一个是氨基，则R5不为氢；
或其医药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，额外药剂是属于美国专利第7,091,353号、美国专利公开案第2003/0045552号及国际申请案第PCT/USOI/50401号(国际公开案第WO02/059106号)中所揭示的异吲哚类免疫调节化合物类别的化合物，各案以引用的方式并入本文中。举例而言，在一些实施方案中，额外药剂是[2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基]-酰胺；(2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基)-氨基甲酸第三丁酯；4-(氨基甲基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮；N-(2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基)-乙酰胺；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}环丙基-甲酰胺；2-氯-N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}乙酰胺；N-(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)-3-吡啶基甲酰胺；3-{1-氧代-4-(苯甲基氨基)异吲哚啉-2-基}哌啶-2,6-二酮；2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-4-(苯甲基氨基)异吲哚啉-1,3-二酮；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}丙酰胺；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}-3-吡啶基甲酰胺；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}庚酰胺；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}-2-呋喃基甲酰胺；乙酸{N-(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨甲酰基}甲酯；N-(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)戊酰胺；N-(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)-2-噻吩基甲酰胺；N-{[2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲基}(丁基氨基)甲酰胺；N-{[2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲基}(辛基氨基)甲酰胺；或N-{[2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲基}(苯甲基氨基)甲酰胺。
在一些实施方案中，额外药剂属于美国专利申请公开案第2002/0045643号、国际公开案第WO 98/54170号及美国专利第6,395,754号中所揭示的异吲哚类免疫调节化合物类别的化合物，各案以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，额外药剂以引用的方式并入本文中的美国专利第5,798,368号中所描述的四取代的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉。在一些实施方案中，额外药剂以引用的方式并入本文中的美国专利第6,403,613号中所揭示的1-氧代及1,3-二氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉。在一些实施方案中，额外药剂如美国专利第6,380,239号及美国专利第7,244,759号中所描述的在吲哚啉环的4位或5位经取代的1-氧代或1,3-二氧代异吲哚啉，两项专利两者均以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，额外药剂是2-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-4-氨甲酰基-丁酸或4-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-4-氨甲酰基-丁酸。在一些实施方案中，免疫调节化合物是4-氨甲酰基-4-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1,3-二氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基}-丁酸、4-氨甲酰基-2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1,3-二氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基}-丁酸、2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1,3-二氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基}-4-苯基氨甲酰基-丁酸或2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1,3-二氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基}-戊二酸。
在一些实施方案中，额外药剂是如以引用的方式并入本文中的美国专利第6,458,810号中所描述的在2位经2,6-二氧代-3-羟基六氢吡啶-5-基取代的异吲哚啉-1-酮或异吲哚啉-1,3-二酮。在一些实施方案中，免疫调节化合物是3-(5-氨基-2-甲基-4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮，或其对映异构体或对映异构体混合物；或其医药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、共晶体、晶笼化合物或多晶型物。在一些实施方案中，免疫调节化合物是3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苯甲氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
在一些实施方案中，额外药剂如Oshima,K.等人,Nihon Rinsho.,72(6):1130-5(2014)；Millrine,D.等人,Trends Mol Med.,23(4):348-364(2017)；及Collins等人,Biochem J.,474(7):1127-1147(2017)中所描述。
在一些实施方案中，额外药剂包括沙立度胺药物或其类似物及/或其衍生物，例如来那度胺、泊利度胺或阿普司特(apremilast)。参见例如Bertilaccio等人,Blood(2013)122:4171；Otahal等人,Oncoimmunology(2016)5(4):e1115940；Fecteau等人,Blood(2014)124(10):1637-1644；及Kuramitsu等人,Cancer Gene Therapy(2015)22:487-495)。来那度胺((RS)-3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮；又称为雷利米得(Revlimid))是沙立度胺的合成衍生物，且具有多种免疫调节作用，包括在T细胞与抗原呈现细胞(APC)之间强制形成免疫突触。在一些实施方案中，额外药剂是来那度胺、泊利度胺、阿多米德(avadomide)，来那度胺、泊利度胺、阿多米德的立体异构体，或其医药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、共晶体、晶笼化合物或其多晶型物。在一些实施方案中，免疫调节化合物实来那度胺、来那度胺的立体异构体或其医药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、共晶体、晶笼化合物或其多晶型物。在一些实施方案中，免疫调节化合物实来那度胺或((RS)-3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)。
在某些实施方案中，通过向受试者给予沙立度胺衍生物来那度胺，即((RS)-3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)来破坏病变。来那度胺被FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤、与5q缺失相关的骨髓发育不良症候群且最近被批准用于治疗复发性/难治性套细胞淋巴瘤(MCL)。来那度胺一般是沙立度胺的合成衍生物，且当前被理解为具有多种免疫调节作用，包括在T细胞与抗原呈现细胞(APC)之间强制形成免疫突触。举例而言，在一些情况下，来那度胺调节T细胞反应且使CD4+及CD8+T细胞中白介素(IL)-2的产生增加，诱导辅助T细胞(Th)反应自Th2转换成Th1，抑制调节T细胞(Treg)亚群扩增，并改善滤泡性淋巴瘤及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中免疫突触的机能(Otahal等人,Oncoimmunology(2016)5(4):e1115940)。来那度胺在患有多发性骨髓瘤(MM)的患者中还具有直接肿瘤破坏活性，且通过影响淋巴组织微环境中所发现的支持性细胞，例如类抚育细胞(nurse-like cell)来直接及间接地调节CLL肿瘤细胞的存活。来那度胺还可响应于T细胞经由CD3接合的活化或树突状细胞介导的活化来增进T细胞增殖及干扰素-γ产生。此外，来那度胺被认为可减少包括TNF-a、IL-1、IL-6及IL-12在内的促炎性细胞因子的增殖并经由增加NK细胞活化来增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。来那度胺还可诱导恶性B细胞高水平表达免疫刺激分子，例如CD80、CD86、HLA-DR、CD95及CD40(Fecteau等人,Blood(2014)124(10):1637-1644)。塞勒布隆(一种E3泛素连接酶)被鉴别为沙立度胺诱导的致畸作用的主要靶点(Ito,T.等人,(2010)Science 327:1345-1350)。来那度胺还靶向塞勒布隆且经显示，此导致c-Myc及IRF4表达减少，同时还使p21的表达增加，由此引起G1细胞周期停滞(Lopez-Girona等人(2012)Leukemia 26:2326-2335)。
在一些实施方案中，额外药剂是B细胞抑制剂。在一些实施方案中，额外药剂选自以下的一或多种B细胞抑制剂：CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、CD79a、CD79b、CD179b、FLT-3或ROR1的抑制剂，或其组合。在一些实施方案中，B细胞抑制剂是抗体(例如单特异性或双特异性抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，额外药剂是表达靶向B细胞靶点的重组受体的经工程改造的细胞，这些B细胞靶点例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、CD79a、CD79b、CD179b、FLT-3或ROR1。
在一些实施方案中，额外药剂是CD20抑制剂，例如抗CD20抗体(例如抗CD20单特异性或双特异性抗体)或其片段。例示性抗CD20抗体包括(但不限于)利妥昔单抗、奥伐木单抗(ofatumumab)、奥克珠单抗(ocrelizumab)(还称为GA101或RO5072759)、维托珠单抗(veltuzumab)、欧比托珠单抗(obinutuzumab)、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)(还称为AME-133v或奥卡拉珠单抗)及Pro131921(Genentech)。参见例如Lim等人,Haematologica.(2010)95(1):135-43。在一些实施方案中，抗CD20抗体包含利妥昔单抗。利妥昔单抗结合至CD20且引起表达CD20的细胞的细胞溶解的嵌合小鼠/人类单克隆抗体IgG1κ。在一些实施方案中，额外药剂包括利妥昔单抗。在一些实施方案中，CD20抑制剂是小分子。
在一些实施方案中，额外药剂是CD22抑制剂，例如抗CD22抗体(例如抗CD22单特异性或双特异性抗体)或其片段。例示性抗CD22抗体包括依帕珠单抗(epratuzumab)及RFB4。在一些实施方案中，CD22抑制剂是小分子。在一些实施方案中，抗体是单特异性抗体，其视情况与第二药剂，例如化学治疗剂共轭。举例而言，在一些实施方案中，抗体是抗CD22单克隆抗体-MMAE偶联物(例如DCDT2980S)。在一些实施方案中，抗体是抗CD22抗体的scFv，例如抗体RFB4的scFv。在一些实施方案中，scFv与假单胞菌外毒素-A(例如BL22)的全部或片段融合。在一些实施方案中，scFv与假单胞菌外毒素-A(例如帕西妥莫单抗(moxetumomabpasudotox))的全部或片段(例如38kDa片段)融合。在一些实施方案中，抗CD22抗体是抗CD19/CD22双特异性抗体，其视情况与毒素共轭。举例而言，在一些实施方案中，抗CD22抗体包含抗CD19/CD22双特异性部分(例如两个scFv配体，其识别人类CD19及CD22)，其视情况连接至白喉毒素(DT)的全部或一部分，例如白喉毒素(DT)之前389个氨基酸，即DT 390，例如配体定向毒素，例如DT2219ARL)。在一些实施方案中，双特异性部分(例如抗CD 19/抗CD22)连接至毒素，例如脱糖基化蓖麻毒素A链(例如Combotox)。
在一些实施方案中，免疫调节剂是细胞因子。在一些实施方案中，免疫调节剂是细胞因子或是诱导细胞因子在肿瘤微环境中的表达增加的药剂。细胞因子具有与T细胞扩增、分化、存活及动态平衡相关的重要功能。可向接受本文所提供的结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体、细胞及/或组合物的受试者给予的细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18及IL-21中的一或多种。在一些实施方案中，所给予的细胞因子是IL-7、IL-15或IL-21，或其组合。在一些实施方案中，向对给予经工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞具有次佳反应的受试者给予细胞因子改善所给予的细胞，例如表达CAR的细胞的功效及/或抗肿瘤活性。
“细胞因子”意谓由一种细胞群释放的作为细胞间介体作用于另一种细胞的蛋白质的通用术语。此类细胞因子的实施例是淋巴激素、单核球激素及传统多肽激素。细胞因子中包括生长激素，例如人类生长激素、N-甲硫胺酰基人类生长激素及牛生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素(thyroxine)；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)及促黄体激素(LH)；肝生长因子；纤维母细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α及肿瘤坏死因子-β；缪勒氏管抑制性物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小板生长因子；转型生长因子(TGF)，例如TGF-α及TGF-β；胰岛素样生长因子-I及胰岛素样生长因子-II；红血球生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，例如干扰素-α、干扰素-β及干扰素-γ；群落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；及粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF及kit配体(KL)。如本文所使用，术语细胞因子包括来自天然源或来自重组细胞培养物的蛋白质，及天然序列细胞因子的生物活性等效物。举例而言，免疫调节剂细胞因子，且该细胞因子IL-4、TNF-α、GM-CSF或IL-2。
在一些实施方案中，额外药剂包括白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其组合，例如hetIL-15(Admune Therapeutics,LLC)。hetIL-15IL-15及IL-15Rα的异二聚非共价复合物。hetIL-15描述于例如U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413及U.S.2011/0081311中。在一些实施方案中，免疫调节剂可含有一或多种细胞因子。举例而言，白介素可包括白血球白介素注射液(Multikine)，其为天然细胞因子的组合。在一些实施方案中，免疫调节剂是Toll样受体(TLR)促效剂、佐剂或细胞因子。
在一些实施方案中，额外药剂是改善或中和与细胞疗法相关的一或多种毒性或副作用的药剂。在一些实施方案中，额外药剂是选自类固醇(例如皮质类固醇)、TNFα抑制剂及IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的实施例是抗TNFα抗体分子，例如英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab pegol)及戈利木单抗(golimumab)。TNFα抑制剂的另一实施例是融合蛋白，例如依那西普(entanercept)。TNFα的小分子抑制剂包括(但不限于)黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱(pentoxifylline))及安非他酮(bupropion)。IL-6抑制剂的一个实施例是抗IL-6抗体分子，例如托西利单抗(tocilizumab)、沙瑞卢单抗(sarilumab)、艾思莫单抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301及FM101。在一些实施方案中，抗IL-6抗体分子是托西利单抗。在一些实施方案中，额外药剂是IL-1R抑制剂，例如阿那白滞素(anakinra)。
在一些实施方案中，额外药剂是腺苷水平及/或腺苷路径组分的调节剂。腺苷可在体内充当免疫调节剂。举例而言，非选择性活化腺苷受体亚型的腺苷及一些腺苷类似物减少嗜中性白血球产生的发炎性氧化性产物(Cronstein等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.451:291,1985；Roberts等人,Biochem.J.,227:669,1985；Schrier等人,J.Immunol.137:3284,1986；Cronstein等人,Clinical Immunol.Immunopath.42:76,1987)。在一些情况下，细胞外腺苷或腺苷类似物的浓度可在特定环境，例如肿瘤微环境(TME)中增加。在一些情况下，腺苷或腺苷类似物信号传导取决于低氧或参与低氧或其调控的因子，例如低氧诱导性因子(HIF)。在一些实施方案中，腺苷信号传导增加可增加细胞内cAMP及cAMP依赖性蛋白质激酶，由此引起对促炎性细胞因子产生的抑制，且可导致免疫抑制分子的合成及Treg的发育(Sitkovsky等人,Cancer Immunol Res(2014)2(7):598-605)。在一些实施方案中，额外药剂可减小或逆转腺苷、腺苷类似物及/或腺苷信号传导的免疫抑制作用。在一些实施方案中，额外药剂可减小或逆转低氧驱动的A2腺苷激导性T细胞免疫抑制。在一些实施方案中，额外药剂是选自腺苷受体的拮抗剂、细胞外腺苷降解剂、CD39/CD73胞外酶产生腺苷的抑制剂及低氧-HIF-1α信号传导的抑制剂。在一些实施方案中，额外药剂是腺苷受体拮抗剂或促效剂。
通过细胞外腺苷的抑制剂(例如防止细胞外腺苷形成、降解细胞外腺苷、使其无活性及/或减少细胞外腺苷的药剂)及/或腺苷受体抑制剂(例如腺苷受体拮抗剂)抑制或减少细胞外腺苷或腺苷受体可增强免疫反应，例如巨噬细胞、嗜中性白血球、粒细胞、树突状细胞、T细胞及/或B细胞介导的反应。另外，Gs蛋白质介导的cAMP依赖性细胞内路径的抑制剂及腺苷受体触发的Gi蛋白质介导的细胞内路径的抑制剂还可增加急性及慢性发炎。
在一些实施方案中，额外药剂是腺苷受体拮抗剂或促效剂，例如腺苷受体A2a、A2b、A1及A3中的一或多种的拮抗剂或促效剂。A1及A3抑制刺激腺苷酸环化酶活性，而A2a及A2b刺激腺苷酸环化酶活性。某些腺苷受体，例如A2a、A2b及A3可在发炎期间抑制或减少免疫反应。因此，拮抗免疫抑制腺苷受体可强化、加强或增强免疫反应，例如由所给予的细胞，例如表达CAR的T细胞引起的免疫反应。在一些实施方案中，额外药剂抑制细胞外腺苷产生及腺苷经由腺苷受体触发的信号传导。举例而言，可通过抑制或减少产生腺苷的局部组织低氧；通过降解积累的细胞外腺苷(或使其无活性)；通过防止或减少腺苷受体在免疫细胞上的表达；及/或通过抑制/拮抗腺苷配体经由腺苷受体的信号传导来增进免疫反应、局部组织发炎及靶点组织破坏。
拮抗剂是倾向于取消另一种物质的作用的任何物质，其是结合至细胞受体而不引发生物反应的药剂。在一些实施方案中，拮抗剂作为腺苷受体，例如A2a、A2b或A3受体的拮抗剂的化合物。在一些实施方案中，拮抗剂是结合腺苷受体但不触发Gi蛋白质依赖性细胞内路径的肽或拟肽。例示性拮抗剂描述于美国专利第5,565,566号、第5,545,627,5,981,524号、第5,861,405号、第6,066,642号、第6,326,390号、第5,670,501号、第6,117,998号、第6,232,297号、第5,786,360号、第5,424,297号、第6,313,131号、第5,504,090号及第6,322,771号中。
在一些实施方案中，额外药剂是A2受体(A2R)拮抗剂，例如A2a拮抗剂。例示性A2R拮抗剂包括KW6002(伊曲茶碱(istradefyline))、SCH58261、咖啡碱、副黄嘌呤、3,7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤(DMPX)、8-(间氯苯乙烯基)咖啡碱(CSC)、MSX-2、MSX-3、MSX-4、CGS-15943、ZM-241385、SCH-442416、普雷迪南(preladenant)、韦帕迪兰(vipadenant)(BII014)、V2006、ST-1535、SYN-115、PSB-1115、ZM241365、FSPTP及靶向A2R表达的抑制性核酸(例如siRNA或shRNA)，或靶向A2R的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，额外药剂是描述于例如以下中的A2R拮抗剂：Ohta等人,Proc Natl Acad Sci U S A(2006)103:13132-13137；Jin等人,Cancer Res.(2010)70(6):2245-2255；Leone等人,Computational and Structural Biotechnology Journal(2015)13:265-272；Beavis等人,Proc Natl Acad Sci U S A(2013)110:14711-14716；及Pinna,A.,Expert OpinInvestig Drugs(2009)18:1619-1631；Sitkovsky等人,Cancer Immunol Res(2014)2(7):598-605；US 8,080,554；US 8,716,301；US 20140056922；WO2008/147482；US 8,883,500；US 20140377240；WO02/055083；US 7,141,575；US 7,405,219；US 8,883,500；US 8,450,329；及US 8,987,279。
在一些实施方案中，拮抗剂是特异性结合编码腺苷受体的mRNA的反义分子、抑制性核酸分子(例如小抑制性RNA(siRNA))或催化性核酸分子(例如核糖核酸酶)。在一些实施方案中，反义分子、抑制性核酸分子或催化性核酸分子结合编码A2a、A2b或A3的核酸。在一些实施方案中，反义分子、抑制性核酸分子或催化性核酸靶向腺苷受体下游的生物化学路径。举例而言，反义分子或催化性核酸可抑制参与Gs蛋白质或Gi蛋白质依赖性细胞内路径的酶。在一些实施方案中，额外药剂包括腺苷受体，例如A2a、A2b或A3的显性阴性突变形式。
在一些实施方案中，抑制细胞外腺苷的额外药剂包括使细胞外腺苷无功能(或减弱此类功能)的药剂，例如修饰腺苷的结构以抑制腺苷经由腺苷受体进行信号传导的能力的物质。在一些实施方案中，额外药剂是细胞外腺苷产生酶或腺苷降解酶、其修饰形式或其调节剂。举例而言，在一些实施方案中，额外药剂是选择性结合并破坏腺苷，由此消除或显著降低内源性形成的腺苷经由腺苷受体进行信号传导且终止发炎的能力的酶(例如腺苷脱胺酶)或另一种催化性分子。
在一些实施方案中，额外药剂是腺苷脱胺酶(ADA)或其修饰形式，例如重组ADA及/或聚乙二醇修饰的ADA(ADA-PEG)，其可抑制细胞外腺苷的局部组织积累。ADA-PEG已用于治疗患有ADA SCID的患者(Hershfield(1995)Hum Mutat.5:107)。在一些实施方案中，抑制细胞外腺苷的药剂包括防止或减少细胞外腺苷形成、及/或防止或减少细胞外腺苷积累，由此消除或显著减弱腺苷的免疫抑制作用的药剂。在一些实施方案中，额外药剂特异性抑制参与包括核转录因子调节剂在内的促发炎分子的合成及/或分泌的调控的酶及蛋白质。抑制腺苷受体表达或Gs蛋白质或Gi蛋白质依赖性细胞内路径或cAMP依赖性细胞内路径的表达可使免疫反应增加/增强。
在一些实施方案中，额外药剂可靶向产生或制备细胞外腺苷的胞外酶。在一些实施方案中，额外药剂靶向CD39及CD73胞外酶，其以串联方式起作用以产生细胞外腺苷。CD39(还称为胞外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶)将细胞外ATP(或ADP)转化成5'AMP。随后，CD73(还称为5'核苷酸酶)将5'AMP转化成腺苷。CD39的活性在NDP激酶及腺苷酸激酶作用下是可逆的，而CD73的活性是不可逆的。CD39及CD73在包括内皮细胞及Treg在内的肿瘤基质细胞上，以及多种癌细胞上表达。举例而言，CD39及CD73在内皮细胞上的表达在肿瘤微环境的低氧条件下增加。肿瘤低氧可由不充分的血液供应及杂乱的肿瘤血管，损害氧气递送引起(Carroll及Ashcroft(2005),Expert.Rev.Mol.Med.7(6):1-16)。低氧还抑制腺苷酸激酶(AK)，其将腺苷转化成AMP，导致极高细胞外腺苷浓度。因此，腺苷响应于低氧而以高浓度释放，其为在实体肿瘤中或周围的肿瘤微环境(TME)常常出现的情况。在一些实施方案中，额外药剂是抗CD39抗体或其抗原结合片段、抗CD73抗体或其抗原结合片段(例如MEDI9447或TY/23)、α-β-亚甲基-腺苷二磷酸(ADP)、ARL 67156、POM-3、IPH52中的一或多种(参见例如Allard等人Clin Cancer Res(2013)19(20):5626-5635；Hausler等人,Am J Transl Res(2014)6(2):129-139；Zhang,B.,Cancer Res.(2010)70(16):6407-6411)。
在一些实施方案中，额外药剂是低氧诱导性因子1α(HIF-1α)信号传导的抑制剂。HIF-1α的例示性抑制剂包括地高辛(digoxin)、吖啶黄素(acriflavine)、长寿蛋白(sirtuin)-7及加利特皮(ganetespib)。
在一些实施方案中，额外药剂包括蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂，例如本文所描述的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂。在一些实施方案中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如本文所描述的SHP-1抑制剂，例如葡萄糖酸锑钠。在一些实施方案中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂，例如本文所描述的SHP-2抑制剂。
在一些实施方案中，额外药剂是激酶抑制剂。激酶抑制剂，例如CDK4激酶抑制剂、BTK激酶抑制剂、MNK激酶抑制剂或DGK激酶抑制剂，可调控肿瘤细胞中存在的组成性活性存活路径及/或调节免疫细胞的功能。在一些实施方案中，激酶抑制剂是布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，例如依鲁替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(PI3K)抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如CDK4/6抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可为例如mTORC1抑制剂及/或mTORC2抑制剂，例如mTORC1抑制剂及/或mTORC2抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是MNK抑制剂或PI3K/mTOR双重抑制剂。在一些实施方案中，其他例示性激酶抑制剂包括AKT抑制剂哌立福新(perifosine)、mTOR抑制剂替西罗莫司(temsirolimus)、Src激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)及福他替尼(fostamatinib)、JAK2抑制剂帕瑞替尼(pacritinib)及芦可替尼(ruxolitinib)、PKCβ抑制剂恩扎妥林(enzastaurin)及苔藓虫素(bryostatin)、以及AAK抑制剂阿立塞替(alisertib)。
在一些实施方案中，激酶抑制剂选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。在一些实施方案中，BTK抑制剂不会减小或抑制白介素-2诱导性激酶(ITK)的激酶活性，且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。
在一些实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如依鲁替尼(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮；还称为PCI-32765)。在一些实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如依鲁替尼(PCI-32765)。在一些实施方案中，给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个周期的依鲁替尼。在一些实施方案中，BTK抑制剂是国际申请案WO 2015/079417中所描述的BTK抑制剂。
在一些实施方案中，激酶抑制剂是PI3K抑制剂。PI3K是参与细胞周期调控及淋巴瘤存活的PI3K/Akt/mTOR路径的中心。例示性PI3K抑制剂包括艾德昔布(idelalisib)(PI3Kδ抑制剂)。在一些实施方案中，额外药剂是艾德昔布及利妥昔单抗。
在一些实施方案中，额外药剂是哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)的抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂选自以下的mTOR抑制剂：替西罗莫司；瑞达莫司(ridaforolimus)(还称为AP23573及MK8669)；依维莫司(everolimus)(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；斯马匹莫(simapimod)；AZD8055；PF04691502；SF1126；及XL765。在一些实施方案中，额外药剂是有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的抑制剂，例如维罗非尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)及曲美替尼(trametinib)。
在一些实施方案中，额外药剂是调控促凋亡蛋白或抗凋亡蛋白的药剂。在一些实施方案中，额外药剂包括B细胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制剂(例如维奈托克(venetoclax)，还称为ABT-199或GDC-0199；或ABT-737)。维奈托克是抑制抗凋亡蛋白BCL-2的小分子(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基}-1-哌嗪基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺)。调节促凋亡蛋白或抗凋亡蛋白的其他药剂包括BCL-2抑制剂ABT-737、纳维克拉斯(navitoclax)(ABT-263)；获得最大功效的Mcl-1siRNA或Mcl-1抑制剂类视黄素N-(4-羟基苯基)瑞汀酰胺(4-HPR)。在一些实施方案中，额外药剂提供促凋亡刺激物，例如重组肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导性配体(TRAIL)，其可通过结合至肿瘤细胞表面上的TRAIL死亡受体DR-4及DR-5、或TRAIL-R2促效性抗体来活化细胞凋亡路径。
在一些实施方案中，额外药剂包括吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。IDO是催化氨基酸L-色氨酸降解为犬尿氨酸的酶。许多癌症过度表达IDO，例如前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、子宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头部癌及肺癌。浆细胞样树突状细胞(pDC)、巨噬细胞及树突状细胞(DC)可表达IDO。在一些方面中，L-色氨酸减少(例如通过IDO催化)通过诱导T细胞失能及细胞凋亡而产生免疫抑制环境。因此，在一些方面中，IDO抑制剂可例如通过减少所给予的表达CAR的细胞的抑制或死亡来增强本文所描述的结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体、细胞及/或组合物的功效。例示性IDO抑制剂包括(但不限于)1-甲基-色氨酸、吲哚莫德(indoximod)及INCB024360(艾卡哚司他(epacadostat))。
在一些实施方案中，额外药剂包括细胞毒性剂，例如CPX-351(CelatorPharmaceuticals)、阿糖胞苷(cytarabine)、道诺霉素、沃萨洛辛(vosaroxin)(SunesisPharmaceuticals)、沙帕他滨(sapacitabine)(Cyclacel Pharmaceuticals)、伊达比星(idarubicin)或米托蒽醌(mitoxantrone)。在一些实施方案中，额外药剂包括低甲基化剂，例如DNA甲基转移酶抑制剂，例如阿扎胞苷(azacitidine)或地西他滨(decitabine)。
在另一个实施方案中，额外疗法是移植，例如同种异体干细胞移植。
在一些实施方案中，额外疗法是淋巴细胞耗竭疗法(lymphodepleting therapy)。在一些实施方案中，淋巴细胞耗竭例如在给予经工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞之前对受试者执行。在一些实施方案中，淋巴细胞耗竭包含给予美法仑、环磷氮介(Cytoxan)、环磷酰胺及氟达拉滨中的一或多种。在一些实施方案中，淋巴细胞耗竭化学疗法是在给予(例如输注)经工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞之前、同时或之后给予受试者。在一个实施例中，淋巴细胞耗竭化学疗法是在给予经工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞之前给予受试者。
在一些实施方案中，额外药剂是溶瘤病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒能够在癌细胞中选择性复制，且触发癌细胞死亡或减慢癌细胞生长。在一些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞无作用或具有极小作用。溶瘤病毒包括(但不限于)溶瘤腺病毒、溶瘤单纯性疱疹病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤小病毒、溶瘤痘疮病毒、溶瘤辛必斯病毒(oncolytic Sinbisvirus)、溶瘤流感病毒或溶瘤RNA病毒(例如溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤新城疫病毒(NewcastleDisease Virus，NDV)、溶瘤麻疹病毒或溶瘤水泡性口炎病毒(VSV))。
其他例示性组合疗法、治疗及/或药剂包括抗过敏剂、止吐药、镇痛剂及辅助疗法。在一些实施方案中，额外药剂包括细胞保护剂，例如神经保护剂、自由基清除剂、心脏保护剂、蒽环霉素外渗中和剂及营养物。
在一些实施方案中，用作额外药剂的抗体与治疗剂，例如化学治疗剂(例如环磷氮介、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、脱甲基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷基化剂、抗微管或抗有丝分裂剂)、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐剂)、疼痛舒解剂或本文所描述的细胞保护剂偶联或以其他方式结合。在一些实施方案中，额外药剂是抗体-药物偶联物。
在一些实施方案中，额外药剂可在DNA、RNA或蛋白质层面上调节、抑制或刺激特定因子，以增强或加强本文所提供的结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体、细胞及/或组合物的功效。在一些实施方案中，额外药剂可在核酸(例如DNA或RNA)层面上，在所给予的细胞，例如经工程改造成表达重组受体(例如CAR)的细胞内调节因子。在一些实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)、类转录活化因子效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)可用于抑制经工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞中抑制性分子的表达。在一些实施方案中，抑制剂是shRNA。在一些实施方案中，抑制性分子在经工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞内受抑制。在一些实施方案中，编码dsRNA分子的核酸分子可操作地连接至启动子，例如HI源性或U6源性启动子，由此使抑制性分子的表达抑制的dsRNA分子在经工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞内表达，该dsRNA分子抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子的表达。参见例如Brummelkamp TR等人(2002)Science 296:550-553；Miyagishi M等人(2002)Nat.Biotechnol.19:497-500。
在一些实施方案中，额外药剂能够破坏编码抑制性分子，例如本文所描述的任何免疫检查点抑制剂的基因。在一些实施方案中，破坏是通过缺失，例如缺失整个基因、外显子或区域；及/或用外源序列置换；及/或通过在该基因内，通常在该基因的外显子内的突变，例如读框转移或错义突变实现。在一些实施方案中，破坏使得提前终止密码子并入至基因中，由此使抑制性分子不表达或不以能够在细胞表面上表达及/或能够介导细胞信号传导的形式表达。破坏一般在DNA层面上进行。破坏一般为永久、不可逆或非暂时的。
在一些方面中，破坏是通过基因编辑，例如使用特异性结合至作为破坏靶点的区域处的基因或与其杂交的DNA结合蛋白或DNA结合核酸进行。在一些方面中，该蛋白质或核酸与核酸酶偶合或复合，例如偶合或复合成嵌合或融合蛋白形式。举例而言，在一些实施方案中，破坏是使用对所破坏的基因具特异性的包含靶向DNA的蛋白质及核酸酶的融合物来实现，该核酸酶例如锌指核酸酶(ZFN)或TAL效应核酸酶(TALEN)或RNA引导的核酸酶，例如成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统，例如CRISPR-Cas9系统。在一些实施方案中，制备或产生经基因工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞的方法包括向细胞群中引入编码经基因工程改造的抗原受体(例如CAR)的核酸分子及编码靶向抑制性分子的药剂的核酸分子，该靶向抑制性分子的药剂是一种基因编辑核酸酶，例如对抑制性分子具特异性的包含靶向DNA的蛋白质及核酸酶的融合物，该核酸酶例如ZFN或TALEN、或RNA引导的核酸酶，例如CRISPR-Cas9系统的核酸酶。
本文所描述的额外药剂中的任一种均可经制备且与本文所描述的ROR1结合分子(例如抗体)、免疫偶联物、重组受体(例如嵌合抗原受体)及/或表达这些分子(例如重组受体)的经工程改造的细胞一起以组合疗法形式给予，例如以包含组合疗法的一或多种药剂及医药学上可接受的载剂(例如本文所描述的任何载剂)的医药组合物形式给予。在一些实施方案中，ROR1结合分子(例如抗体)、免疫偶联物、重组受体(例如嵌合抗原受体)、表达这些分子(例如重组受体)的经工程改造的细胞、表达这些分子(例如重组受体)的复数个经工程改造的细胞可与额外药剂、疗法或治疗同时、并行地或按任何次序依序给予，其中此类给予向受试者的体内提供治疗有效水平的这些药剂中的每一种。这些药剂可例如作为同一医药组合物的一部分或使用相同的递送方法与本文所描述的结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体、细胞及/或组合物共给予。在一些实施方案中，在给予经工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞之前，将额外药剂与这些细胞一起培育。
在一些实施例中，一或多种额外药剂是在给予本文所描述的结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体、细胞及/或组合物之后或之前，间隔所选时间段给予。在一些实施例中，该时间段是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月。在一些实施例中，将该一或多种额外药剂给予多次，及/或将本文所描述的结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体、细胞及/或组合物给予多次。举例而言，在一些实施方案中，额外药剂是在本文所描述的结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体、细胞及/或组合物之前给予，例如在该给药之前两周、12天、10天、8天、一周、6天、5天、4天、3天、2天或1天给予。举例而言，在一些实施方案中，额外药剂是在本文所描述的结合分子(例如ROR1结合分子)、重组受体、细胞及/或组合物之后给予，例如在该给药之后两周、12天、10天、8天、一周、6天、5天、4天、3天、2天或1天给予。
额外药剂的剂量可为任何治疗有效量，例如本文所描述的任何剂量，且额外药剂的适当剂量可取决于待治疗疾病的类型；所给予的结合分子、重组受体、细胞及/或组合物的类型、剂量及/或频率；疾病的严重程度及病程；结合分子、重组受体、细胞及/或组合物出于预防目的抑或出于治疗目的给予；先前疗法；患者的临床病史及其对结合分子、重组受体、细胞及/或组合物的反应；及主治医师的判断。结合分子、重组受体、细胞及/或组合物及/或额外药剂及/或疗法可一次性给予、重复给予或经一系列治疗给予患者。
C.诊断及检测方法
还提供涉及使用所提供的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段检测ROR1，例如与表达ROR1的疾病或病况相关的诊断及/或预后方法的方法。在一些实施方案中，这些方法包括将生物样品与该抗体或其抗原结合片段一起培育及/或向受试者给予该抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，例如肿瘤或癌症组织。在某些实施方案中，接触是在容许抗ROR1抗体与ROR1结合且检测在抗ROR1抗体与ROR1之间是否形成复合物的条件下进行。此类方法可为活体外或活体内方法。在一个实施方案中，使用抗ROR1抗体(例如抗原结合片段)选择适合用抗ROR1抗体(例如抗原结合片段)或重组受体治疗的受试者，例如其中ROR1是用于选择患者的生物标记物。
在一些实施方案中，使样品，例如细胞、组织样品、溶解产物、组合物或由其得到的其他样品与抗ROR1抗体(例如抗原结合片段)接触，并测定或检测该抗体与该样品(例如样品中ROR1)的结合或该抗体与该样品之间复合物的形成。当与相同组织类型的参考细胞相比，展示出或检测到测试样品中的结合时，其可指示相关疾病或病况的存在。在一些实施方案中，样品来自人类组织。
可使用已知用于检测特异性抗体-抗原结合的各种方法。例示性免疫分析包括荧光偏振免疫分析(FPIA)、荧光免疫分析(FIA)、酶免疫分析(EIA)、散射浊度测量型抑制免疫分析(nephelometric inhibition immunoassay，NIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)。指示部分或标记基团可附接至受试者抗体且经选择以便满足该方法的各种用途的需求，这些用途通常由分析设备及兼容性免疫分析程序的可用性决定。例示性标记包括放射性核素(例如125I、131I、35S、3H或32P)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、荧光素酶或β-半乳糖苷酶)、荧光部分或蛋白质(例如荧光素、若丹明(rhodamine)、藻红素、GFP或BFP)或发光部分(例如Quantum Dot Corporation(Palo Alto,Calif.)供应的QdotTM纳米粒子)。用于执行上文所提及的各种免疫分析的通用技术是本领域技术人员已知的。
出于诊断的目的，抗体(例如抗原结合片段)可用可检测部分标记，该可检测部分包括(但不限于)放射性同位素、荧光标记及本领域中已知的各种酶基质标记。标记与抗体偶联的方法是已知的。
在一些实施方案中，抗体无需经标记，且其存在可使用结合至这些抗体的经标记抗体检测。
在一些实施方案中，所提供的抗体(例如抗原结合片段)可用于任何已知的分析方法中，例如竞争性结合分析、直接及间接夹心分析，及免疫沉淀分析。Zola,MonoclonalAntibodies:A Manual of Techniques,第147-158页(CRC Press,Inc.1987)。
抗体(例如抗原结合片段)及多肽还可用于活体内诊断分析，例如活体内成像。一般而言，抗体经放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I或3H)标记，使得在向受试者给予后，可对所关注的细胞或组织进行活体内定位。
抗体(例如抗原结合片段)还可在病理学中用作染色试剂，例如使用已知技术。
V.制品或试剂盒
还提供含有所提供的结合分子(例如抗体)、重组受体(例如CAR)、经基因工程改造的细胞及/或包含其的组合物的制品或试剂盒。制品可包括容器及在容器上或与容器相联的标签或药品说明书。适合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、试管、IV溶液袋等。容器可由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。在一些实施方案中，容器具有无菌接取口。例示性容器包括静脉内溶液袋、小瓶，包括具有可由注射用针刺穿的塞子的容器。制品或试剂盒可进一步包括药品说明书，其指示组合物可用于治疗特定病况，例如本文所描述的病况(例如表达ROR1的癌症)。替代地或另外，制品或试剂盒可进一步包括含医药学上可接受的缓冲液的另一个或同一个容器。其可进一步包括其他材料，例如其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及/或注射器。
标签或药品说明书可指示组合物用于治疗个体的表达ROR1或与ROR1相关的疾病、病症或病况。在容器上或与容器相联的标签或药品说明书可指示有关重构及/或使用调配物的指导。标签或药品说明书可进一步指示调配物可用于或意欲用于皮下、静脉内或其他给予模式以治疗或预防个体的与表达ROR1或与ROR1相关的疾病、病症或病况。在一些方面中，标签或药品说明书可包括使用说明书，例如有关在一些方面中根据本文所描述的方法或用途中的任一种给予抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、细胞或组合物的说明。
在一些实施方案中，容器装有单独或与另一种有效治疗、预防及/或诊断病况的组合物组合的组合物。制品或试剂盒可包括(a)容纳有组合物(还即，第一药剂)的第一容器，其中该组合物包括抗体(例如抗ROR1抗体)或其抗原结合片段或重组受体(例如CAR)；及(b)容纳有组合物(还即，第二药剂)的第二容器，其中该组合物包括另一药剂，例如细胞毒性剂或其他治疗剂，且该制品或试剂盒进一步包含在有关以有效量的第二药剂治疗受试者的标签或药品说明书上的指示。
VI.定义
如本文所使用，提及抗体的“相应形式”意谓当比较两种抗体的特性或活性时，使用相同的抗体形式来比较该特性。举例而言，若陈述抗体活性大于第一抗体的相应形式的活性，则意谓该抗体的特定形式(例如scFv)的活性大于该第一抗体的scFv形式。
“效应功能”指可归于抗体Fc区的生物活性，其随抗体同型而变化。抗体效应功能的实施例包括：C1q结合及补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；及B细胞活化。
术语“Fc区”在本文中用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区及变体型Fc区。在一个实施方案中，人类IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另外说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号系统，还称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“完全抗体”在本文中可互换使用，指结构实质上类似于原初抗体结构或具有含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“经分离”抗体是已与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，纯度通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或逆相HPLC)测定。关于抗体纯度评估方法的评述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“经分离”核酸是指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。经分离核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所包含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
“编码抗ROR1抗体的经分离核酸”指编码抗体重链及轻链(或其片段)的一或多个核酸分子，包括呈单一载体或独立载体形式的此类核酸分子及存在于宿主细胞中一或多个位置处的此类核酸分子。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞株”及“宿主细胞培养物”可互换使用且指引入了外源核酸的细胞，包括此类细胞之后代。宿主细胞包括“转化株”及“经转化细胞”，其包括初代经转化细胞及由其得到的后代，不考虑继代次数。后代的核酸含量与母细胞可能不完全相同，而且可能含有突变。本文中包括针对原始经转化细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变后代。
如本文所使用，“氨基酸序列一致性百分比(％)”及“一致性百分比”及“序列一致性”当结合氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，定义为在比对序列且必要时引入空位以达成最大序列一致性百分比之后且在不将任何保守性取代视为序列一致性的一部分的情况下，候选序列(例如受试者抗体或片段)中与参考多肽序列中氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列一致性百分比的目的进行的对准可通过在本领域的技能范围内的各种方式，例如使用公开可得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域技术人员可测定用于对准序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长内达成最大对准所需的任何算法。
氨基酸取代可包括多肽中的一个氨基酸经另一个氨基酸置换。取代可为保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸取代。可将氨基酸取代引入所关注的结合分子(例如抗体)中且根据所需活性，例如保持/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC筛选产物。
氨基酸一般可根据以下共同侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守性取代可涉及将这些类别之一的成员用同一类别的另一成员交换。在一些实施方案中，非保守性氨基酸取代可涉及将这些类别之一的成员交换为另一类别的成员。
如本文所使用，术语“载体”指这样一种核酸分子，该核酸分子能够传播其所连接的另一核酸分子。该术语包括呈自我复制核酸结构的载体以及并入引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“药品说明书”用以指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用此类治疗产品有关的适应症、用法、剂量、给予、组合疗法、禁忌及/或警告的信息。
除非本文另外明确规定，否则如本文所使用，单数形式“一个(种)(a/an)”及“该”包括复数个(种)指示物。举例而言，“一个(种)”意谓“至少一个(种)”或“一或多个(种)”。应理解，本文所描述的方面、实施方案及变化形式包括“包含方面、实施方案及变化形式”、“由方面、实施方案及变化形式组成”及/或“基本上由方面、实施方案及变化形式组成”。
在本申请通篇，所主张的主题的各种方面均以范围形式呈现。应理解，范围形式的描述仅为方便及简洁起见，且不应解释为对所主张主题的范围的坚定限制。因此，范围的描述应视为特定地揭示的所有可能子范围以及该范围内的个别数值。举例而言，在提供值范围的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每一中间值及该所述范围内的任何其他所述值或中间值均涵盖于所主张的主题内。这些较小范围的上限及下限可独立地包括在较小范围内且还涵盖于所主张的主题内，满足所述范围内任何特别排除的限制。在所述范围包括这些限值中的一个或两个的情况下，排除这些所包括的限值中的任一个或两个的范围还包括在所主张的主题中。不管范围的宽度如何，此均适用。
如本文所使用，术语“约”指本领域技术人员易于知晓的各别值的常见误差范围。本文中提及“约”某一值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的实施方案。举例而言，提及“约X”的描述包括有关“X”的描述。
如本文所使用，“组合物”指两种或两种以上产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可为溶液、悬浮液、液体、粉末、糊膏、水溶液、非水性溶液或其任何组合。
如本文所使用，陈述细胞或细胞群对特定标记物呈“阳性”指细胞上或细胞中特定标记物，通常为表面标记物的可检测的存在。当提及表面标记物时，该术语指如通过流动式细胞测量术，例如通过用特异性结合至该标记物的抗体染色且检测该抗体，检测到表面表达的存在，其中该染色可通过流动式细胞测量术检测，其水平实质上高于使用同型匹配对照物，在其他方面相同的条件下进行相同程序所检测到的染色，及/或水平实质上类似于已知对该标记物呈阳性的细胞的染色，及/或水平实质上高于已知对该标记物呈阴性的细胞的染色。
如本文所使用，陈述细胞或细胞群对特定标记物呈“阴性”指特定标记物，通常为表面标记物并未明显可检测地存在于细胞上或细胞中。当提及表面标记物时，该术语指如通过流动式细胞测量术，例如用特异性结合至该标记物的抗体染色且检测该抗体，未检测到表面表达，其中通过流动式细胞测量术未检测到该染色，其水平实质上高于使用同型匹配对照物，在其他方面相同的条件下进行相同程序所检测到染色，及/或其水平实质上低于已知对该标记物呈阳性的细胞的染色，及/或其水平实质上类似于已知对该标记物呈阴性的细胞的染色。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语、表示法以及其他技术及科学术语意欲具有与一般熟知所主张主题的本领域技术人员通常所理解相同的含义。在一些情况下，为清楚起见及/或方便参考，在本文中定义具有通常所理解含义的术语，且本文中包括此类定义不应必然解释为表示与本领域中通常所理解存在实质性差异。
VII.例示性实施方案
所提供的实施方案：
1.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中该VH区包括含SEQ ID NO:67、82或52中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、含SEQ ID NO:71、86、56或97中所示的序列的重链互补决定区2(CDR-H2)及含SEQ ID NO:73、88、58或99中所示的序列的重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)。
2.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；
该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；
该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、56及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或
该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、97及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
3.如实施方案1或实施方案2的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
4.如实施方案1或实施方案2的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
5.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:112、121、103或130内所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且
该VL区包含SEQ ID NO:115、124或106内所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)。
6.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:112内所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包含SEQ ID NO:115内所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；
该VH区包含SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；
该VH区包含SEQ ID NO:103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或
该VH区包含SEQ ID NO:130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
7.如实施方案5或实施方案6的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包含SEQ ID NO:112内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 115内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
8.如实施方案5或实施方案6的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包含SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
9.如实施方案1、2、5及6中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112、121、103或130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且
该VL区为或包含与SEQ ID NO:115、124或106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
10.如实施方案1、2及5至7中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
11.如实施方案1至10中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
12.如实施方案1至10中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
13.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112、121、103或130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且
该VL区为或包含与SEQ ID NO:115、124或106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
14.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
15.如实施方案13或实施方案14的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
16.如实施方案13或实施方案14的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
17.如实施方案1、2、5、6、9、10、13及14中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中：
该VH区为或包含SEQ ID NO:112、121、103或130中所示的序列，且
该VL区为或包含SEQ ID NO:115、124或106中所示的序列。
18.如实施方案1、2、5、6、9、10、13、14及17中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中：
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
19.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：
该VH区为或包含SEQ ID NO:112、121、103或130中所示的序列，且
该VL区为或包含SEQ ID NO:115、124或106中所示的序列。
20.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
21.如实施方案1至20中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列。
22.如实施方案1至20中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列。
23.如实施方案1、2、5、6、9、10、13、14及17至20中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:110、119、101或128，或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:113、122或104，或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
24.如实施方案1、2、5、6、9、10、13、14、17至20及23中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:111、120、102或129编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:114、123、105或131编码的氨基酸序列。
25.如实施方案1至24中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:110或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:113，或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
26.如实施方案1至25中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:111编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:114编码的氨基酸序列。
27.如实施方案1至24中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:119，或与SEQ ID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:122，或与SEQID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
28.如实施方案1至25中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:120编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:123编码的氨基酸序列。
29.如实施方案1至28中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗ROR1抗体或其抗原结合片段是经分离的。
30.如实施方案1至29中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗ROR1抗体或其抗原结合片段是重组的。
31.如实施方案1至30中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区的至少一部分是人类的或来自人类蛋白质。
32.如实施方案1至31中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该其抗原结合片段包含单链片段，视情况单链Fv(scFv)。
33.如实施方案1至32中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区在该VL区的氨基末端。
34.如实施方案1至32中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区在该VL区的羧基末端。
35.如实施方案1至34中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区与该VL区通过可挠性接头接合。
36.如实施方案35的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该可挠性接头包含SEQID NO:41中所示的序列。
37.如实施方案32、33、35及36中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:118、127、109或134中所示的序列，或与SEQ ID NO:118、127、109或134具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
38.如实施方案32、33及35至37中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:118中所示的序列。
39.如实施方案32、33及35至37中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:127中所示的序列。
40.如实施方案32、33及35至37中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:116、125、107或132，或与SEQ ID NO:116、125、107或132具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
41.如实施方案32、33、35至37及40中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:117、126、108或133编码的氨基酸序列。
42.如实施方案32至41中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:116，或与SEQ ID NO:116具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
43.如实施方案32至42中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:117编码的氨基酸序列。
44.如实施方案32至41中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:125，或与SEQ ID NO:125具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
45.如实施方案32至41及43中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:126编码的氨基酸序列。
46.如实施方案1至45中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗ROR1抗体或片段进一步包含免疫球蛋白恒定区或其变体的至少一部分。
47.如实施方案46的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中免疫球蛋白恒定区的该部分包含铰链区或其变体的至少一部分。
48.如实施方案46或实施方案47的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中免疫球蛋白恒定区或其变体的至少一部分包含CH2区及/或CH3区或其变体的至少一部分。
49.如实施方案46至48中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中免疫球蛋白恒定区或其变体的至少一部分是人类的或来自人类蛋白质或其变体。
50.如实施方案1至49中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗ROR1抗体或其抗原结合片段特异性结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白质，视情况为人类ROR1。
51.如实施方案50的抗ROR1抗体或其抗原结合片段其中该人类ROR1蛋白质包含SEQ ID NO:144、145或146中所示的氨基酸序列。
52.如实施方案1至51中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗ROR1抗体或其抗原结合片段不结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质；不与受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质交叉反应；或以较低水平或程度或亲和力与受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质结合；视情况为人类ROR2蛋白质；。
53.如实施方案1至52中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗ROR1抗体或其抗原结合片段与人类ROR2的结合的范围、水平或程度或亲和力比与人类ROR1的结合的范围、水平或程度或亲和力低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。
54.一种单链细胞表面蛋白质，其包含如实施方案1至53和244-265中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段。
55.一种偶联物，其包含如实施方案1至53和244-265中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段及异源分子或部分。
56.如实施方案55的偶联物，其中该异源分子或部分是治疗部分。
57.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包括含如实施方案1至53和244-265中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段的细胞外抗原结合结构域及细胞内信号传导区。
58.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中该VH区包括含SEQ ID NO:67、82或52中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、含SEQ ID NO:71、86、56或97中所示的序列的重链互补决定区2(CDR-H2)及含SEQ IDNO:73、88、58或99中所示的序列的重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含SEQ ID NO:75、90或60中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、含SEQ ID NO:77、92或62中所示的序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)以及含SEQ ID NO:79、94或64中所示的序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)。
59.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；
该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；
该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、56及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或
该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、97及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
60.如实施方案58或实施方案59的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
61.如实施方案58或实施方案59的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
62.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:112、121、103或130内所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且
该VL区包含SEQ ID NO:115、124或106内所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)。
63.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:112内所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包含SEQ ID NO:115内所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；
该VH区包含SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；
该VH区包含SEQ ID NO:103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或
该VH区包含SEQ ID NO:130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
64.如实施方案62或实施方案63的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区包含SEQ IDNO:112内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 115内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
65.如实施方案62或实施方案63的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区包含SEQ IDNO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
66.如实施方案58、59、62及63中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112、121、103或130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且
该VL区为或包含与SEQ ID NO:115、124或106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
67.如实施方案58、59及62至64中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
68.如实施方案58至67中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
69.如实施方案58至67中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
70.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112、121、103或130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且
该VL区为或包含与SEQ ID NO:115、124或106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
71.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
72.如实施方案70或实施方案71的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
73.如实施方案70或实施方案71的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
74.如实施方案58、59、62、63、66、67、70及71中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中：
该VH区为或包含SEQ ID NO:112、121、103或130中所示的序列，且
该VL区为或包含SEQ ID NO:115、124或106中所示的序列。
75.如实施方案58、59、62、63、66、67、70、71及74中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中：
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
76.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：
该VH区为或包含SEQ ID NO:112、121、103或130中所示的序列，且
该VL区为或包含SEQ ID NO:115、124或106中所示的序列。
77.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区的细胞外抗原结合结构域，及细胞内信号传导区，其中：
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
78.如实施方案58至77中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列。
79.如实施方案58至77中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列。
80.如实施方案58、59、62、63、66、67、70、71及74至77中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:110、119、101或128，或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:113、122或104，或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
81.如实施方案中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体58、59、62、63、66、67、70、71、74至77及80，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:111、120、102或129编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:114、123、105或131编码的氨基酸序列。
82.如实施方案58至81中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:110，或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:113，或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
83.如实施方案58至82中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:111编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:114编码的氨基酸序列。
84.如实施方案58至81中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:119，或与SEQ ID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:122，或与SEQ ID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
85.如实施方案58至82中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区为或包含由SEQ ID NO:120编码的氨基酸序列，且该VL区为或包含由SEQ ID NO:123编码的氨基酸序列。
86.如实施方案58至85中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1抗体或其抗原结合片段是经分离的。
87.如实施方案58至86中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1抗体或其抗原结合片段是重组的。
88.如实施方案58至87中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区及该VL区的至少一部分是人类的或来自人类蛋白质。
89.如实施方案58至88中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该其抗原结合片段包含单链片段，视情况为单链Fv(scFv)。
90.如实施方案58至89中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区在该VL区的氨基末端。
91.如实施方案58至89中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区在该VL区的羧基末端。
92.如实施方案58至91中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该VH区与该VL区通过可挠性接头接合。
93.如实施方案92的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该可挠性接头包含SEQ ID NO:41中所示的序列。
94.如实施方案89、90、92及93中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:118、127、109或134中所示的序列，或与SEQ ID NO:118、127、109或134具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
95.如实施方案89、90及92至94中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:118中所示的序列。
96.如实施方案89、90及92至94中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:127中所示的序列。
97.如实施方案89、90及92至94中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:116、125、107或132，或与SEQ ID NO:116、125、107或132具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
98.如实施方案89、90、92至94及40中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:117、126、108或133编码的氨基酸序列。
99.如实施方案89至98中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:116，或与SEQ ID NO:116具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
100.如实施方案89至99中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:117编码的氨基酸序列。
101.如实施方案89至98中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:125，或与SEQ ID NO:125具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
102.如实施方案89至98及100中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该scFv为或包含由SEQ ID NO:126编码的氨基酸序列。
103.如实施方案58至102中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其进一步包含间隔子。
104.如实施方案103的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的至少一部分。
105.如实施方案103或实施方案104的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分。
106.如实施方案103至105中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度小于或小于约15个氨基酸。
107.如实施方案103至106中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含与SEQ ID NO:1、26、27、29、31、32、33或135具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
108.如实施方案105至107中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中铰链区的至少一部分包含IgG4铰链区、视情况为人类IgG4铰链区，或其变体的全部或一部分。
109.如实施方案105至107中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中铰链区的至少一部分包含IgG2铰链区、视情况为人类IgG2铰链区，或其变体的全部或一部分。
110.如实施方案103至109中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQ ID NO:135中所示的序列。
111.如实施方案103至110中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含由SEQ ID NO:192，或与SEQ ID NO:192具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
112.如实施方案103至111中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含由SEQ ID NO:136编码的氨基酸序列。
113.如实施方案103至112中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的CH3区的至少一部分。
114.如实施方案103至113中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中CH3区的至少一部分包含IgG4 CH3及/或IgG2 CH3的全部或一部分，其中该IgG4 CH3视情况是人类IgG4CH3且该IgG2 CH3视情况是人类IgG2 CH3。
115.如实施方案103至114中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分及CH3区的至少一部分。
116.如实施方案103至115中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度为或为约111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个氨基酸，或其长度在前述任何值之间。
117.如实施方案103至116中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度为或为约120个氨基酸。
118.如实施方案103至117中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含与SEQ ID NO:138具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
119.如实施方案103至118中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQ ID NO:138中所示的序列。
120.如实施方案103至119中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含由SEQ ID NO:193，或与SEQ ID NO:193具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
121.如实施方案103至120中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含由SEQ ID NO:139编码的氨基酸序列。
122.如实施方案103至121中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的CH2区的至少一部分。
123.如实施方案103至122中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中CH2区的至少一部分包含IgG4 CH2及/或IgG2 CH2的全部或一部分，其中该IgG4 CH2视情况是人类IgG4CH2且该IgG2 CH2视情况是人类IgG2 CH2。
124.如实施方案103至123中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分、CH2的至少一部分及CH3区的至少一部分。
125.如实施方案103至124中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度为或为约130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229或230个氨基酸，或其长度在前述任何值之间。
126.如实施方案103至125中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该铰链区、该CH2区及该CH3区中的一或多个包含来自人类IgG4的CH2区的全部或一部分及CH3区的全部或一部分。
127.如实施方案103至125中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该铰链区、该CH2区及该CH3区中的一或多个是嵌合的且包含来自人类IgG4及人类IgG2的铰链、CH2区及CH3区。
128.如实施方案103至125中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含IgG4/2嵌合铰链区或相较于人类IgG4铰链包含至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链区；IgG2/4嵌合CH2区；以及IgG4 CH3区。
129.如实施方案103至125中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含与SEQ ID NO:194具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
130.如实施方案103至129中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQ ID NO:194中所示的序列。
131.如实施方案103至130中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含由SEQ ID NO:195，或与SEQ ID NO:195具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列编码的氨基酸序列。
132.如实施方案103至131中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含由SEQ ID NO:196编码的氨基酸序列。
133.如实施方案58至132中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导区包含细胞内信号传导结构域。
134.如实施方案133的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分及/或包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
135.如实施方案133或实施方案134的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导结构域为或包含CD3-ζ(CD3ζ)链或其功能变体或信号传导部分的细胞质信号传导结构域。
136.如实施方案133至135中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导结构域是人类的或来自人类蛋白质。
137.如实施方案133至136中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导结构域为或包含SEQ ID NO:13、14或15中所示的序列，或与SEQ ID NO:13、14或15具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
138.如实施方案133至137中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导结构域为或包含SEQ ID NO:13中所示的序列。
139.如实施方案133至138中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导区进一步包含共刺激信号传导区。
140.如实施方案139的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子或其信号传导部分的细胞内信号传导结构域。
141.如实施方案139或实施方案140的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS或其信号传导部分的细胞内信号传导结构域。
142.如实施方案140至141中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区是人类的或来自人类蛋白质。
143.如实施方案140至142中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区包含CD28的细胞内信号传导结构域。
144.如实施方案140至143中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区为或包含SEQ ID NO:10中所示的序列，或与SEQ ID NO:10具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
145.如实施方案140至144中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。
146.如实施方案140至142及145中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区为或包含SEQ ID NO:12中所示的序列，或与SEQ ID NO:12具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
147.如实施方案58至146中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其进一步包含跨膜区。
148.如实施方案140至147中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区在该跨膜区与该细胞内信号传导结构域之间。
149.如实施方案147或实施方案148的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜区为或包含来自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域。
150.如实施方案147至149中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜区为或包含来源于CD28的跨膜结构域。
151.如实施方案147至150中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜区是人类的或来自人类蛋白质。
152.如实施方案147至151中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域为或包含SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
153.如实施方案147至152中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序包含：该细胞外抗原结合结构域、该间隔子、该跨膜区及该细胞内信号传导区。
154.如实施方案58至153中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序包含：含scFv的细胞外抗原结合结构域；含经修饰的IgG4铰链，视情况含SEQ ID NO:135中所示的序列的间隔子；跨膜结构域，视情况为来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域，视情况含4-1BB的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。
155.如实施方案58至153中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序包含：含scFv的细胞外抗原结合结构域；含经修饰的IgG4铰链-CH3，视情况含SEQ ID NO:138中所示的序列的间隔子；跨膜结构域，视情况为来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域，视情况含4-1BB的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。
156.如实施方案58至155中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列，或与SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
157.如实施方案58至156中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:184中所示的序列，或与SEQ ID NO:184中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
158.如实施方案58至157中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:184中所示的序列。
159.如实施方案58至156中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:185中所示的序列，或与SEQ ID NO:185中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
160.如实施方案58至156及159中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:185中所示的序列。
161.如实施方案58至156中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列，或与SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列编码。
162.如实施方案58至158及161中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:156中所示的序列，或与SEQ ID NO:156中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列编码。
163.如实施方案58至158、161及162中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:156中所示的序列编码。
164.如实施方案58至156及159至161中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:157中所示的序列，或与SEQ ID NO:157中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列编码。
165.如实施方案58至156、159至161及164中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体由SEQ ID NO:157中所示的序列编码。
166如实施方案58至165中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体特异性结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白质，视情况为人类ROR1。
167.如实施方案166的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该人类ROR1蛋白质包含SEQ IDNO:144、145或146中所示的氨基酸序列。
168.如实施方案58至167中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体不结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质；不与受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质交叉反应；或以较低水平或程度或亲和力与受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质结合，视情况为人类ROR2蛋白质。
169.如实施方案58至168中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体与人类ROR2的结合的范围、水平或程度或亲和力比视情况在相同或实质上相同的条件或分析下与人类ROR1的结合的范围、水平或程度或亲和力低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。
170.如实施方案58至169中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中相较于在ROR1蛋白质，视情况为人类ROR1存在下，视情况在相同或实质上相同的条件或分析下信号传导或活性的水平或程度，所述抗ROR1嵌合抗原受体在ROR2蛋白质，视情况为人类ROR2存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。
171.如实施方案58至170中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中所述抗ROR1嵌合抗原受体在人类ROR2存在下展现的信号传导或活性的水平或程度比在人类ROR1存在下，视情况在相同或实质上相同的条件或分析下信号传导或活性的水平或程度低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。
172.如实施方案58至171中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体视情况在相同或实质上相同的条件或分析下的情形，所述抗ROR1嵌合抗原受体在ROR2蛋白质，视情况为人类ROR2存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。
173.如实施方案58至172中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体视情况在相同或实质上相同的条件或分析下的情形，该抗ROR1嵌合抗原受体在ROR2蛋白质，视情况为人类ROR2存在下展现相同、实质上相同或较低水平或程度的信号传导或活性。
174.如实施方案58至173中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体视情况在相同或实质上相同的条件或分析下的情形，该抗ROR1嵌合抗原受体展现相同、实质上相同或较高的抗原特异性信号传导及/或抗原依赖性活性或信号传导。
175.如实施方案58至174中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中相较于参考ROR1特异性嵌合抗原受体视情况在相同或实质上相同的条件或分析下的情形，该抗ROR1嵌合抗原受体展现相同、实质上相同或较低的持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导。
176.如实施方案58至175中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体展现的持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导的水平或程度比参考ROR1特异性嵌合抗原受体视情况在相同或实质上相同的条件或分析下的持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性的水平或程度低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。
177.如实施方案172至176中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该参考ROR1特异性嵌合抗原受体包含抗ROR1抗体R12或抗ROR1抗体2A2或其抗原结合片段，视情况来自R12或2A2的scFv。
178.一种聚核苷酸，其包含编码如实施方案1至53和224-265中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合结构域、如实施方案54的单链细胞表面蛋白质、如实施方案55或实施方案56的偶联物或如实施方案57至177和266-297中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体的核酸。
179.如实施方案178的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含编码VH的核酸，其包含SEQID NO:110、119、101或128中所示的序列，或与SEQ ID NO:110、119、101或128具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其包含SEQ IDNO:113、122或104中所示的序列，或与SEQ ID NO:113、122或104具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
180.如实施方案178或实施方案179的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:110中所示的序列，或与SEQ ID NO:110具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:113中所示的序列，或与SEQ ID NO:113具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
181.如实施方案178或实施方案179的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含编码VH的核酸，其包含SEQ ID NO:119中所示的序列，或与SEQ ID NO:119具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列；及编码VL的核酸，其包含SEQ ID NO:122中所示的序列，或与SEQ ID NO:122具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
182.如实施方案178至180中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含编码scFv的核酸，其包含SEQ ID NO:116、125、107或132中所示的序列，或与SEQ ID NO:116、125、107或132具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
183.如实施方案178至180及182中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含编码scFv的核酸，其包含SEQ ID NO:116中所示的序列，或与SEQ ID NO:116具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
184.如实施方案178至180及182中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含编码scFv的核酸，其包含SEQ ID NO:125中所示的序列，或与SEQ ID NO:125具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
185.如实施方案178至184中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含编码scFv的核酸，其包含SEQ ID NO:192中所示的序列，或与SEQ ID NO:192具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
186.如实施方案178至184中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含编码间隔子的核酸，其包含SEQ ID NO:193中所示的序列，或与SEQ ID NO:193具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
187.如实施方案178至184中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含编码间隔子的核酸，其包含SEQ ID NO:195中所示的序列，或与SEQ ID NO:195具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
188.如实施方案187的聚核苷酸，其中编码该抗ROR1抗体或其抗原结合结构域、该单链细胞表面蛋白质、该偶联物或该抗ROR1嵌合抗原受体的核酸包含至少一个经修饰的剪接供体及/或剪接受体位点，所述经修饰的剪接供体及/或受体位点包含对应于参考剪接供体位点及/或参考剪接受体位点的一或多个核苷酸修饰。
189.如实施方案188的聚核苷酸，其中该一或多个核苷酸修饰包含核酸取代。
190.如实施方案188或实施方案189的聚核苷酸，其中这些参考剪接受体及/或参考剪接供体位点是典型、非典型或隐蔽的剪接位点。
191.如实施方案188至190中任一个的聚核苷酸，其中：
该一个或多个参考剪接供体及/或参考剪接受体位点具有至少或至少约0.4、0.5、0.6、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.99或1.0分的剪接位点预测性分数；及/或
预测该一个或多个参考剪接供体及/或参考剪接受体位点参与剪接事件的机率为至少或至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
192.如实施方案188至191中任一个的聚核苷酸，其中：
该一个或多个参考剪接供体及/或参考剪接受体位点具有至少或至少约0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.99或1.0分的剪接位点预测分数性；及/或
预测该一个或多个参考剪接供体及/或参考剪接受体位点参与剪接事件的机率为至少或至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
193.如实施方案188至192中任一个的聚核苷酸，其中该一或多个核苷酸修饰中的至少一个是在该参考剪接受体及/或参考剪接供体位点的剪接位点接合处的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基内。
194.如实施方案188至193中任一个的聚核苷酸，其中该一或多个核苷酸修饰是沉默的及/或产生简并密码子及/或不改变所编码蛋白质的氨基酸序列。
195.如实施方案188至194中任一个的聚核苷酸，其中当在细胞中表达该聚核苷酸时，由该聚核苷酸转录的RNA，视情况信使RNA(mRNA)展现至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％或至少或至少约95％的RNA同质性。
196.如实施方案188至195中任一个的聚核苷酸，其中当在细胞中表达时，自该聚核苷酸转录的RNA，视情况信使RNA(mRNA)展现相较于自参考聚核苷酸转录的mRNA的异质性减小的异质性，该参考聚核苷酸编码与该聚核苷酸相同的氨基酸序列，其中该参考聚核苷酸相比于该聚核苷酸的不同在于在该编码间隔子的核酸中存在一或多个剪接供体位点及/或一或多个剪接受体位点及/或包含一或多个核苷酸修饰。
197.如实施方案196的聚核苷酸，其中该RNA异质性减小了超过或超过约10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％或更高百分比。
198.如实施方案196或实施方案197的聚核苷酸，其中自该参考聚核苷酸转录的RNA，视情况信使RNA(mRNA)展现大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％或更高百分比的RNA异质性。
199.如实施方案188至198中任一个的聚核苷酸，其中该RNA同质性及/或异质性通过琼脂糖凝胶电泳、基于芯片的毛细电泳、分析型超速离心、场流动分级分离或液相层析测定。
200.如实施方案188至199中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸针对在人类细胞中表达进行密码子优化。
201.如实施方案178、179、182、185、186及188至200中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包括含SEQ ID NO:111、120、102或129中所示的序列的编码VH的核酸，及含SEQ IDNO:114、123、105或131中所示的序列的编码VL的核酸。
202.如实施方案178至180、182、183、185、186及198至201中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包括编码含SEQ ID NO:111中所示的序列的VH的核酸，及编码含SEQ ID NO:114中所示的序列的VL的核酸。
203.如实施方案178、179、181、182、184至186及198至201中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包括编码含SEQ ID NO:120中所示的序列的VH的核酸，及编码含SEQ ID NO:123中所示的序列的VL的核酸。
204.如实施方案178、179、182、185、186及188至201中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包括编码含SEQ ID NO:117、126、108或133中所示的序列的scFv的核酸。
205.如实施方案178至180、182、183、185、186、198至201及204中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包括编码含SEQ ID NO:117中所示的序列的scFv的核酸。
206.如实施方案178、179、181、182、184至186、198至201及204中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包括编码含SEQ ID NO:126中所示的序列的scFv的核酸。
207.如实施方案178至185及188至206中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包括编码含SEQ ID NO:136中所示的序列的间隔子的核酸。
208.如实施方案178至184、186及188至206中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包括编码含SEQ ID NO:139中所示的序列的间隔子的核酸。
209.如实施方案178至184及187至206中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包括编码含SEQ ID NO:196中所示的序列的间隔子的核酸。
210.如实施方案178至186及188至209中任一个的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列，或与SEQ ID NO:156、157、158、159、160或161中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
211.如实施方案178至186及188至210中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含SEQ ID NO:156中所示的序列，或与SEQ ID NO:156中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
212.如实施方案178至186及188至211中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含SEQ ID NO:156中所示的序列。
213.如实施方案178至186及188至210中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含SEQ ID NO:157中所示的序列，或与SEQ ID NO:157中所示的序列展现至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
214.如实施方案178至186、188至210及213中任一个的聚核苷酸，其中该聚核苷酸包含SEQ ID NO:157中所示的序列。
215.如实施方案178至214中任一个的聚核苷酸，其进一步包含CD33信号序列、GM-CSF信号序列、CD8信号序列或Igκ信号序列。
216.如实施方案178至214中任一个的聚核苷酸，其进一步包含CD33信号序列。
217.如实施方案215或实施方案216的聚核苷酸，其中该CD33信号序列如SEQ IDNO:190中或与SEQ ID NO:190具有至少或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列中所示。
218.一种载体，其包含如实施方案178至217中的任一个的聚核苷酸。
219.如实施方案218的载体，其中该载体是病毒载体。
220.如实施方案219的载体，其中该病毒载体是反转录病毒载体或慢病毒载体。
221.一种细胞，其包含如实施方案1至53中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如实施方案55或实施方案56的偶联物、如实施方案54的单链细胞表面蛋白质、如实施方案57至177和266-297中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体、如实施方案178至217中任一个的聚核苷酸或如实施方案218至220中任一个的载体。
222.如实施方案221的细胞，其是淋巴细胞。
223.如实施方案222的细胞，其是NK细胞或T细胞。
224.如实施方案222或实施方案223的细胞，其中该细胞是T细胞且该T细胞是CD4+或CD8+T细胞。
225.如实施方案221至224中任一个的细胞，其中该细胞是获自受试者的初代细胞。
226.如实施方案221至225中任一个的细胞，其中在复数个这些细胞中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％、或小于或小于约1％的细胞包含展现持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导的抗ROR1嵌合抗原受体。
227.一种组合物，其包含如实施方案1至53和244-265中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如实施方案55或实施方案56的偶联物、如实施方案54的单链细胞表面蛋白质或如实施方案57至177和266-297中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体。
228.一种组合物，其包含如实施方案221至226中任一个的细胞。
229.如实施方案227或实施方案228的组合物，其进一步包含医药学上可接受的赋形剂。
230.如实施方案228或实施方案229的组合物，其中该组合物包含CD4+及CD8+T细胞且CD4+与CD8+T细胞的比率为或为约1:3至3:1，视情况为或为约1:2至2:1，视情况为或为约1:1。
231.如实施方案227至230中任一个的组合物，其中在复数个这些细胞中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％、或小于或小于约1％的细胞包含展现持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导的抗ROR1嵌合抗原受体。
232.一种治疗方法，其包含向患有与ROR1相关的疾病或病症的受试者给予如实施方案227至231中任一个的组合物。
233.一种治疗方法，其包含向患有与ROR1相关的疾病或病症的受试者给予如实施方案1至53和244-265中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如实施方案55或实施方案56的偶联物、如实施方案54的单链细胞表面蛋白质、如实施方案57至177和266-297中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体、如实施方案178至217中任一个的聚核苷酸、如实施方案218至220中任一个的载体或如实施方案221至226中任一个的细胞。
234.如实施方案227至231中任一个的组合物，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。
235.一种如实施方案227至231中任一个的组合物的用途，其用于制造供治疗与ROR1相关的疾病或病症用的药剂。
236.一种如实施方案227至231中任一个的组合物的用途，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。
237.如实施方案232至236和298至311中任一个的供使用的方法、组合物或用途，其中该与ROR1相关的疾病或病症与ROR1表达相关。
238.如实施方案232至237和298至311中任一个的供使用的方法、组合物或用途，其中该与ROR1相关的疾病或病症是B细胞相关病症。
239.如实施方案232至238和298至311中任一个的供使用的方法、组合物或用途，其中该与ROR1相关的疾病或病症是癌症。
240.如实施方案239的供使用的方法、组合物或用途，其中该癌症是表达ROR1的癌症。
241.如实施方案240的供使用的方法、组合物或用途，其中该表达ROR1的癌症选自由以下组成的群：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。
242.一种试剂盒，其包含如实施方案1至53和244-265中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如实施方案54的单链细胞表面蛋白质、如实施方案55或实施方案56的偶联物、如实施方案57至177和266-297中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体、如实施方案221至226的细胞或如实施方案227至231中任一个的组合物，及使用说明书，视情况其中这些说明书关于视情况根据如实施方案234至241中任一个的方法、组合物或用途给予该抗ROR1抗体或其抗原结合片段、该单链细胞表面蛋白质、该偶联物、该抗ROR1嵌合抗原受体、该细胞或该组合物。
243.一种制品，其包含如实施方案1至53和244-265中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如实施方案54的单链细胞表面蛋白质、如实施方案55或实施方案56的偶联物、如实施方案57至177和266-297中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体、如实施方案221至226的细胞、如实施方案227至231中任一个的组合物或如实施方案242的试剂盒。
244.如实施方案1-53中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO：52、56及58中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。245.如实施方案1-53中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO：52、97及99中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
246.如实施方案1-53中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包含SEQ ID NO：103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID NO：106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
247.如实施方案1-53中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包含SEQ ID NO：130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID NO：106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
248.如实施方案1-53中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
249.如实施方案1-53中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
250.如实施方案1-53中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列。
251.如实施方案1-53中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
252.如实施方案1至53及244-251中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是全长抗体。
253.如实施方案1至53及244-251中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是抗原结合片段。
254.如实施方案1至53及244-253中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗ROR1抗体或其抗原结合片段是重组的。
255.如实施方案1至53及244-254中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区是人类的或来自人类蛋白质。
256.如实施方案1至53及244-255中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFV为或包含SEQ ID NO：109中所示的序列。
257.如实施方案1至53及244-255中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:134中所示的序列。
258.如实施方案1至53及244-257中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗ROR1抗体或其抗原结合片段特异性结合至由SEQ ID NO:199中所示的序列组成的抗原决定基或SEQ ID NO:199中所示的序列内存在的抗原决定基。
259.如实施方案1至53及244-257中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段进一步结合至由选自SEQ ID NO:200-214中的任一个的序列组成的一或多个抗原决定基或选自SEQ ID NO:200-214中的任一个的序列内存在的抗原决定基。
260.如实施方案1至53及244-259中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-11M至约1×10-7M的平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质。
261.如实施方案1至53及244-260中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-8M至约1×10-7M的平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质。
262.如实施方案1至53及244-260中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约5×10-11M至约1×10-10M的平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质。
263.如实施方案1至53及244-262中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-5 1/s至约1×10-2 1/s的解离速率常数(kd或koff)结合至人类ROR1蛋白质。
264.如实施方案1至53及244-263中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-3 1/s至约1×10-2 1/s的解离速率常数(kd或koff)结合至人类ROR1蛋白质。
265.如实施方案1至53及244-263中任一个的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-5 1/s至约1×10-4 1/s的解离速率常数(kd或koff)结合至人类ROR1蛋白质。
266.如实施方案55-177中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中铰链区的至少一部分包含IgG4铰链区、视情况为人类IgG4铰链区或其变体的全部或一部分。
267.如实施方案55-177中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中铰链区的至少一部分包含IgG2铰链区，视情况为人类IgG2铰链区，或其变体的全部或一部分。
268.如实施方案55-177中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQ ID NO:1中所示的序列。
269.如实施方案55-177中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQ ID NO:135中所示的序列。
270.如实施方案55-177中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分及CH3区的至少一部分。
271.如实施方案55-177及270中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中CH3区的至少一部分包含IgG4 CH3及/或IgG2 CH3的全部或一部分，其中该IgG4 CH3视情况是人类IgG4CH3且该IgG2 CH3视情况是人类IgG2 CH3。
272.如实施方案55-177、270及271中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度为或为约111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个氨基酸，或其长度在前述任何值之间。
273.如实施方案55-177和270-272中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度为或为约120个氨基酸。
274.如实施方案55-177和270-273中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含与SEQ ID NO:3或138具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
275.如实施方案55-177和270-274中任一个的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQ ID NO:3或138中所示的序列。
276.如实施方案55-177中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分、CH2的至少一部分及CH3区的至少一部分。
277.如实施方案55-177和276中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中CH2区的至少一部分包含IgG4 CH2及/或IgG2 CH2的全部或一部分，其中该IgG4 CH2视情况是人类IgG4CH2且该IgG2 CH2视情况是人类IgG2 CH2。
278.如实施方案55-177、276及277中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度为或为约130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229或230个氨基酸，或其长度在前述任何值之间。
279.如实施方案55-177及276-278中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中：
该铰链区、该CH2区及该CH3区中的一或多个包含来自人类IgG4的CH2区的全部或一部分及CH3区的全部或一部分；或
该铰链区、该CH2区及该CH3区中的一或多个是嵌合的且包含来自人类IgG4及人类IgG2的铰链、CH2区及CH3区；或该间隔子包含IgG4/2嵌合铰链区或相较于人类IgG4铰链包含至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链区；IgG2/4嵌合CH2区；以及IgG4 CH3区。
280.如实施方案55-177及276-279中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含与SEQ ID NO:37或194具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
281.如实施方案55-177及276-280中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQ ID NO:37或194中所示的序列。
282.如实施方案57-177及266-281中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜区为或包含来自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域。
283.如实施方案57-177及266-282中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜区为或包含来自CD28，视情况来自人类CD28的跨膜结构域。
284.如实施方案57-177及266-283中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域为或包含SEQ ID NO:8或149、或与SEQ ID NO:8或149具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
285.如实施方案57-177及266-284中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导区进一步包含共刺激信号传导区。
286.如实施方案57-177及266-285中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列，或与SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
287.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:184中所示的序列，或与SEQ ID NO:184中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
288.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:184中所示的序列。
289.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:185中所示的序列，或与SEQ ID NO:185中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
290.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:185中所示的序列。
291.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:186中所示的序列，或与SEQ ID NO:186中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
292.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:186中所示的序列。
293.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:187中所示的序列，或与SEQ ID NO:187中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
294.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:187中所示的序列。
295.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:188中所示的序列，或与SEQ ID NO:188中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
296.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:188中所示的序列。
297.如实施方案57-177及266-286中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:189中所示的序列，或与SEQ ID NO:189中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
298.一种治疗方法，其包含向患有与ROR1相关的疾病或病症的受试者给予如实施方案221至226中任一项的细胞或如实施方案227至231中任一项的组合物。
299.如实施方案221至226中任一项的细胞或如实施方案227至231中任一项的组合物，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。
300.一种如实施方案221至226中任一项的细胞或如实施方案227至231中任一项的组合物的用途，其用于制造用作治疗与ROR1相关的疾病或病症的药剂。
301.一种如实施方案221至226中任一项的细胞或如实施方案227至231中任一项的组合物的用途，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。
302.如实施方案232至241及298至302中任一项的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该与ROR1相关的疾病或病症是癌症。
303.如实施方案302的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该癌症是表达ROR1的癌症。
304.如实施方案232至241及298至303中任一项的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该癌症与表达ROR1的实体肿瘤或表达ROR-1的恶性血液病相关。
305.如实施方案232至241及298至304中任一项的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该癌症与表达ROR1的实体肿瘤相关。
306.如实施方案304或实施方案305的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该与实体肿瘤相关的癌症选自由以下组成的群：神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。
307.如实施方案306的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌瘤及非典型性类癌。
308.如实施方案307的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该肺癌是NSCLC。
309.如实施方案306的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。
310.如实施方案232至241及298至304中任一个的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该癌症与表达ROR1的恶性血液病相关。
311.如实施方案310的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该恶性血液病选自由以下组成的群：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's Lymphoma)或套细胞淋巴瘤(MCL)。
VIII.实施例
以下实施例仅出于说明目的而包括在本发明内，且并不意欲限制本发明的范围。
实施例1：产生并评估抗ROR1抗体
通过对经基因工程改造的小鼠进行免疫接种来产生特异性结合至表达ROR1的细胞的例示性抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体，并对其加以评估。
A.产生抗体
用与组氨酸标签融合的人类ROR1的重组细胞外结构域(ECD)对小鼠进行免疫接种，这些小鼠经基因修饰以产生含有完全人类抗体可变区的抗体(Trianni,Inc.,SanFrancisco,CA)。收集脾脏、淋巴结及骨髓，并通过基于免疫亲和力的选择富集ROR1特异性记忆型B细胞及浆细胞。
对来自经富集部分的细胞群进行抗体可变重(VH)链及可变轻(VL)链的高通量单细胞配对测序。高通量单细胞抗体测序如WO2012/048340、WO2012/048341、WO2016/044227及WO2016/176322中普遍描述的那样执行。测序方法采用具有小液滴及分子条形码的单细胞小液滴在单细胞层面上鉴别细胞群中存在的大量单细胞各自的个别抗体VH及VL序列对。选择抗体VH/VL对序列进行合成，并以VH及VL链取向(VH-VL)或VL-VH取向合成呈单链Fv片段(scFv)形式的聚核苷酸，这些聚核苷酸编码配对的候选物中的每一种。
B.产生抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)
将合成的scFv编码序列克隆至例示性聚核苷酸构建体中，以产生编码嵌合抗原受体(CAR)的候选聚核苷酸，这些CAR含有候选scFv作为抗原结合结构域。确切地说，聚核苷酸CAR构建体含有编码以下的核酸序列：信号肽；候选抗ROR1 scFv；选自三个例示性间隔子的间隔子：含有经修饰的IgG4/IgG2-铰链CH2-CH3的间隔子(SEQ ID NO:194)、含有经修饰的IgG4铰链-CH3的间隔子(SEQ ID NO:138)、或含有经修饰的IgG4铰链区的间隔子(SEQ IDNO:135)；人类CD28跨膜结构域；人类4-1BB细胞内信号传导区；以及人类CD3-ζ细胞内信号传导区。这些构建体还在CAR编码序列与编码用作转导标记物的绿色荧光蛋白的序列之间含有下游T2A核糖体跳跃组件(SEQ ID NO:6)。将编码CAR的聚核苷酸构建体克隆至慢病毒表达载体中以转导T细胞。
C.评估候选抗ROR1 CAR
如上文所描述，产生约400种编码候选抗ROR1 CAR的构建体，并将含有编码各种候选抗ROR1 CAR的构建体的病毒制剂个别地引入含有Nur77基因嵌入报告分子的Jurkat T细胞株中(参见例如2019/089982)。Nur77基因嵌入细胞株含有编码在内源性Nur77基因座处基因嵌入的报告分子(例如红色荧光蛋白)的核酸序列，Nur77通过来自T细胞受体的信号刺激及/或经由含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的分子诱导的立即早期反应基因。对Jurkat报告分子细胞中CAR的细胞表面表达、抗原依赖性及非抗原依赖性信号传导、以及与相关但不同的抗原ROR2的交叉反应性进行评估。
转导之后，评价报告分子细胞在与靶点细胞共培养之后的红色荧光蛋白表达情况，这些靶点细胞包括K562人类骨髓性白血病细胞(ROR1阴性)、经转导以高水平表达ROR1的K562细胞、经转导以低水平表达ROR1的K562细胞及表达非特异性抗原ROR2的K562细胞。为了进一步评估非抗原依赖性活性，在无表达抗原的靶点细胞存在下单独培养经转导的报告分子细胞。还评估经转导的报告分子细胞的GFP(转导标记物)表达情况以及可溶性重组ROR1-Fc(可溶性人类ROR1与IgG的Fc区融合)的结合情况。
经候选抗ROR1 CAR转导的Jurkat报告分子细胞展现：不同水平的抗原特异性活性，此由与高水平或低水平表达ROR1的表达ROR1的靶点细胞共培养之后报告分子的表达指示；不同水平的非抗原依赖性(持续性)信号传导，此由与不表达ROR1的K562细胞共培养之后或在无表达抗原的靶点细胞存在下培养之后报告分子的表达指示；不同水平的非特异性活性，此由与表达非特异性抗原ROR2的细胞共培养之后报告分子的表达指示；以及与可溶性ROR1-Fc的不同水平结合。选择展现高ROR1抗原依赖性活性、低持续性信号传导、高ROR1-Fc结合及低ROR2交叉反应性的候选CAR以在初代人类T细胞中进行评估。
实施例2：在初代T细胞中评估CAR表达及功能
在初代人类T细胞中评估如实施例1中所描述选择的抗ROR1CAR的表达及功能。
通过基于免疫亲和力的富集自三名人类供体之一的白血球清除术样品中分离出CD4+及CD8+T细胞。将分离的CD4+及CD8+T细胞以约1:1比率混合，用编码如实施例1中所描述选择的抗ROR1 CAR之一(个别地命名为A-Z及A1-M1之一)的慢病毒制剂刺激并转导，并在用于扩增的条件下培养。该三名人类供体在白血球清除术样品中存在的T细胞亚群百分比方面不同(例如小于15％的原初T细胞、约40-60％的原初T细胞或约20％的效应记忆型RAT细胞(TEMRA))，表明患病受试者间T细胞亚群存在变化。作为对照，以类似方式，用编码抗CD19 CAR、参考抗ROR1 CAR(兔源性参考抗体R12，scFv如SEQ ID NO:143中所示)或自不同来源获得的两种抗ROR1CAR(命名为N1、O1)之一的慢病毒制剂刺激并转导初代T细胞。
用盘结合的ROR1-Fc刺激表达CAR的初代T细胞，并在24小时之后，通过流动式细胞测量术，利用细胞内细胞因子染色(ICS)评估IFN-γ、TNF-α及IL-2的细胞内水平。测定产生IFN-γ、TNF-α及IL-2的细胞的百分含量，以及每个细胞的产量(如通过平均荧光强度(MFI)测定)。在刺激之后，还针对T细胞活化标记物(例如CD25)、共刺激标记物、指示某些T细胞亚型(例如记忆细胞亚型)的标记物、其他T细胞标记物(例如CD4及CD8、ROR1-Fc结合)的细胞表面表达，对表达CAR的初代T细胞进行染色，并评估GFP转导标记物的表达。
表达CAR的初代T细胞还通过与表达ROR1的三阴性人类乳腺癌细胞株(MDA-MB-231(
Figure BDA0003187625950002631
HTB-26TM)以1:4的效应物:靶点(E:T)比率共培养来进行刺激，并评估细胞毒性及细胞因子产生情况。MDA-MB-231细胞株用NucLight红(NLR)标记以容许通过显微镜检查来追踪靶点细胞。通过测量在0与72小时之间的时间段内活靶点细胞的损失来评估细胞溶解活性，该测量通过红色荧光信号的变化测定。还评估上清液中细胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-2的产生情况。
如图1中所示，在用盘结合的重组ROR1-Fc刺激24小时之后，通过ICS测定，相较于表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞中各细胞因子的水平，某些表达候选抗ROR1 CAR的T细胞在GFP+CD4+T细胞中展现相当或较大的相对细胞内IFN-γ、TNF-α或IL-2表达量。如图2中所示，在与表达ROR1的MDA-MB-231靶点细胞的共培养分析中，相较于表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞中的细胞因子分泌，某些所选候选物还展现相当或较多的IFN-γ、TNF-α或IL-2分泌。相较于通过ICS显示相当或较大细胞因子表达量的抗ROR1候选物的数量，较少的抗ROR1候选物在共培养分析中相较于参考抗ROR1(R12)CAR展现相当或较多的细胞因子分泌。
这些结果显示，经工程改造成表达候选抗ROR1 CAR的初代人类T细胞在通过重组抗原或表达抗原的靶点细胞刺激之后具有不同反应。
实施例3：所选抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)的聚核苷酸优化
在候选抗ROR1 CAR中，基于如实施例2中所描述评估来自3名不同供体的经工程改造的初代人类T细胞的功能活性的结果，进一步选出六(6)种候选CAR。对编码所选候选CAR的构建体进行密码子优化(CO)并评估潜在剪接位点，且以一种保守的方式进行修饰，例如通过不改变所编码的氨基酸序列进行修饰，包括消除编码CAR的聚核苷酸构建体中潜在的预测剪接位点(SSE)。进一步修饰这些构建体以用截短的受体替代GFP转导标记物作为CAR表达的替代转导标记物。
表E1列出对应于所选候选CAR的抗原结合结构域的氨基酸(aa)序列，包括相应可变重(VH)链及可变轻(VL)链以及各链的互补决定区(CDR，根据Kabat编号)的氨基酸序列的序列识别号(SEQ ID NO:)。参考R12 CAR的VH及VL链的序列识别号(SEQ ID NO:)还示于表E1中。例示性CAR含有呈VH-VL取向的scFv。
Figure BDA0003187625950002641
Figure BDA0003187625950002651
为评估由这些聚核苷酸编码的CAR的活性，用编码该6种候选CAR之一或编码作为对照的参考抗ROR1(R12)CAR的慢病毒制剂刺激并转导通过基于免疫亲和力的富集自来自二(2)名人类供体受试者的白血球清除术样品分离的CD4+及CD8+T细胞。
将表达候选CAR的细胞与经NucLight红(NLR)标记的表达ROR1的人类非小细胞肺癌细胞株H1975(
Figure BDA0003187625950002652
CRL-5908TM)共培养，并评估细胞毒性及细胞因子产生情况。通过测量在0与70小时之间的时间段内活靶点细胞的损失来评估细胞溶解活性，该测量通过红色荧光信号的变化测定。还评估在共培养70小时之后上清液中细胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-2的产生情况。作为对照，评估仅含靶点细胞的培养物及模拟细胞(不表达CAR)与靶点细胞的共培养物。
如图3A-图3B中所示，测试的所有候选抗ROR1 CAR针对H1975靶点细胞均显示类似的活体外细胞毒性活性。如图4A-图4B中所示，测试的所有候选抗ROR1 CAR在与H1975靶点细胞活体外共培养之后以各种水平产生IFN-γ、TNF-α及IL-2。结果显示，在密码子优化及剪接位点消除之后，所有测试构建体在与H1975(NSCLC)细胞株的共培养物中均展示细胞毒性。在本分析中测试的CAR中，表达抗ROR1 CAR-A、抗ROR1 CAR-F及抗ROR1 CAR-G的细胞一般展现最高的细胞因子产生量，对于所评估的各种细胞因子，这些细胞的细胞因子产生量类似于或大于表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞中细胞因子的细胞因子产生量。特定言之，相较于其他候选抗ROR1 CAR及参考抗ROR1(R12)CAR，表达抗ROR1 CAR-F的细胞展现最高的IL-2产生量。这些结果与候选CAR在与H1975靶点细胞的共培养物中的稳固活体外功能活性一致。
还评估在与其他表达ROR1的靶点细胞株以1:4的E:T比率共培养之后上清液中细胞因子IL-2的产生情况，这些靶点细胞株包括MDA-MB-231人类三阴性乳腺癌细胞、A549人类上皮肺癌细胞及BT-549人类上皮乳房导管癌细胞。如图4C中所示，测试的所有候选抗ROR1 CAR在与MDA-MB-231、A549及BT-549靶点细胞活体外共培养之后以各种水平产生IL-2。结果显示，当与全部各种靶点细胞共培养时，相较于其他候选抗ROR1 CAR及参考抗ROR1(R12)CAR，表达抗ROR1 CAR-F的细胞展现最高的IL-2产生量。
实施例4：表达抗ROR1 CAR的T细胞在动物模型中活体内过继转移之后的抗肿瘤作用
在荷瘤动物模型中，通过监测过继转移细胞之后的肿瘤，评估例示性经工程改造的表达抗ROR1 CAR的初代人类T细胞的抗肿瘤作用，这些荷瘤动物模型包括H1975人类非小细胞肺癌异种移植模型及MDA-MB-231人类三阴性乳腺癌异种移植模型。向小鼠给予由一名人类供体产生的经工程改造的初代人类T细胞制剂，这些T细胞表达如表E1中所列的抗ROR1CAR-A、CAR-F、CAR-G、CAR-I、CAR-R及CAR-B1中的一种或表达参考抗ROR1(R12)CAR，且已在实施例3中所描述的活体外分析中进行评估。
A.H1975非小细胞肺癌模型
1.研究1
分别对八十(80)只NOD.Cg.PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下注射约5×106个H1975非小细胞肺癌细胞。在肿瘤植入之后第16天，每组中的五(5)只小鼠接受单次静脉内(i.v.)注射的1×106个细胞(低剂量)或3×106个细胞(高剂量)的表达抗ROR1 CAR-A、CAR-F、CAR-G、CAR-I、CAR-R及CAR-B1中的一种或表达参考抗ROR1(R12)CAR的经工程改造的初代人类T细胞。作为对照，向小鼠给予3×106个不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。在约65天里，评估存活率、肿瘤体积及血液中循环CAR+细胞的数量。
通过在给予后每3至6天测定肿瘤体积来监测过继转移的抗ROR1 CAR+T细胞的抗肿瘤活性。图5A(低剂量)及图5B(高剂量)描绘所有经治疗小鼠的平均肿瘤体积；在此描绘中，肿瘤曲线在一组第一只小鼠死于疾病之后结束。由所有个别小鼠得到的结果显示于图5C(低剂量)或图5D(高剂量)中。如图5A-图5D中所示，表达候选抗ROR1 CAR的初代人类T细胞在H1975小鼠模型中显示不同水平的抗肿瘤活性。如由肿瘤体积减小所示，表达抗ROR1CAR-F的初代人类T细胞在给予高剂量的测试抗ROR1 CAR(包括抗ROR(R12)参考CAR)之后展现最高的抗肿瘤活性。确切地说，给予表达抗ROR1 CAR-F的细胞引起长达52天的平均肿瘤消退(低于基线)，相比的下，表达参考R12 CAR的细胞引起6天的平均肿瘤消退。80％的用高剂量表达抗ROR1 CAR-F的细胞治疗的带H1975肿瘤的小鼠(5只中有4只)展现完全且持久的肿瘤清除，而用高剂量的表达参考R12 CAR的细胞治疗的动物未展现完全肿瘤清除。在低剂量下，5只给予表达抗ROR1 CAR-F的细胞的动物中有3只展现长达17天的低于基线的肿瘤消退，而5只给予表达R12 CAR的细胞的动物中仅1只展现低于基线的肿瘤消退。
评估如上文所描述治疗的小鼠的存活情况。每组的卡普兰-迈耶存活曲线显示于图6A-图6B中。如所示，给予表达候选CAR的初代人类T细胞对经治疗小鼠的存活显示出不同的影响。在此模型中，在测试剂量中的一种或两种下，给予表达抗ROR1 CAR-F或抗ROR1CAR-A的初代人类T细胞的小鼠展现的存活期类似于或长于给予参考抗ROR1(R12)CAR的T细胞的小鼠的存活期。在此模型中，给予表达抗ROR1 CAR-F的细胞的小鼠展现最长的存活期，在起始给予最高剂量的表达CAR的细胞之后65天，约100％的小鼠存活。
在给予低剂量(图7A及图7B)或高剂量(图7C及图7D)的表达CAR的T细胞之后第10天及第24天，测定每只小鼠的血液中表达CD4+及CD8+CAR的细胞的平均数量。另外，在给予低剂量(图7E)或高剂量(图7F)的表达CAR的T细胞之后第10天及第24天，测定每只小鼠的血液中表达CD3+CAR的细胞(CD45+CD3+CAR+)的平均数量。如图7A-图7F中所示，在给予较高剂量CAR+T细胞的小鼠中观察到较高的平均CAR+T细胞数量。在此模型中，表达抗ROR1 CAR-F的T细胞在以低剂量及高剂量给予后展现稳固的扩增。在输注后10天，对于高剂量及低剂量，表达CAR-F的细胞的平均计数分别为每微升血液226.5及13.1个细胞，相比之下，对于高剂量及低剂量，表达R12的细胞的平均计数分别为每微升血液7.6及2.5个细胞。在输注后24天，在高剂量及低剂量下，表达CAR-F的细胞的平均计数分别为每微升血液471.8及44.0个细胞，相比之下，在高剂量及低剂量下，表达R12的细胞的计数分别为每微升血液27.6及4.2个细胞。
2.研究2
在使用相同H1975小鼠模型的不同研究中，基于肿瘤体积测量值对植入H1975肿瘤的六十四(64)只小鼠分段，并通过单次静脉内(i.v.)注射给予1×106个细胞(低剂量)或3×106个细胞(高剂量)的表达抗ROR1 CAR-F、抗ROR1 CAR-A或参考抗ROR1(R12)CAR的经工程改造的初代人类T细胞，每组中有八(8)只小鼠。作为对照，向小鼠给予3×106个不表达CAR的细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。测量肿瘤体积持续约70天，并测量循环CAR+T细胞数量及存活期持续约40天。
给予低剂量或高剂量抗ROR1 CAR-F、CAR-A或R12参考CAR的小鼠的平均肿瘤体积变化分别显示于图8A及图8B中。个别小鼠的平均肿瘤体积变化显示于图8C中。给予表达抗ROR1 CAR-F的细胞在15天时引起平均肿瘤消退(低于基线)，相比的下，给予表达参考R12CAR的细胞未展现低于基线的平均肿瘤消退(图8B)。25％的用高剂量的表达抗ROR1 CAR-F的细胞治疗的带H1975肿瘤的小鼠(8只中有2只)展现完全且持久的肿瘤清除，而12.5％的用高剂量的表达参考R12 CAR的细胞治疗的小鼠(8只中有1只)展现完全肿瘤清除。
在CAR T细胞转移后，每周至少两次监测小鼠的肿瘤生长及身体状况，持续69天，并在肿瘤体积超过1500mm3时、在经历肿瘤溃疡时、在呈现重度异种移植物抗宿主疾病(xGvHD)的病征时或在因其他原因而濒死时，实施安乐死。各组中小鼠的存活率显示于图9A-图9B中。给予模拟处理的细胞的H1975异种移植小鼠的中值存活期为20天。给予高剂量或低剂量R12 CAR T细胞的动物的中值存活期分别为33天及29天。给予低剂量抗ROR1 CAR-F的小鼠的中值存活期为存活至37.5天，且给予高剂量的中值存活期未测定，其中62.5％(8只中有5只)的动物在研究结束时仍存活。
在给予之后第7天、第14天及第21天时每微升血液中的平均CD4+及CD8+CAR+T细胞计数显示于图10A-图10D中。与上述研究的结果一致，相较于其他表达CAR的细胞的平均计数，表达CAR-F的细胞的平均计数是最高的，特别是在第21天时及/或在CD4+T细胞中(图10A及图10C)，或是在高剂量下(图10C及图10D)。在给予高剂量后7天、14天及21天，表达抗ROR1CAR-F的T细胞分别显示出每微升血液37.6、105.6及46.6个细胞的平均计数，而表达参考R12的细胞显示出每微升血液28.9、39.8及20.3个细胞的平均计数。在给予较低剂量后第7天、第14天及第21天，表达抗ROR1CAR-F的细胞分别显示出每微升血液2.2、55.4及6.9个细胞的平均计数，而表达参考R12的细胞分别显示出每微升血液3.1、40.8及5.5个细胞的平均计数。
图11A及图11B描绘在给予之后14天时肿瘤中存在的CD4+及CD8+CAR+T细胞的数量。在第14天时肿瘤中CAR+细胞的数量在所测试的CAR之间是类似的。
3.总结
如所示，如通过肿瘤体积减小、较长存活期及循环CAR+T细胞的数量增加所指示，给予表达抗ROR1 CAR-F的细胞的带有H1975肺腺癌异种移植肿瘤的小鼠相较于给予参考抗ROR1 R12 CAR的小鼠展现较高的抗肿瘤活性。在给予表达抗ROR1 CAR-A的细胞与给予表达抗ROR1 R12 CAR的细胞的小鼠中，抗肿瘤活性、存活期及CAR+T细胞数量是类似的。
B.MDA-MB-231三阴性乳腺癌模型
对六十四(64)只NOD.Cg.PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠分别皮下注射1×106个表达萤火虫荧光素酶的MDA-MB-231细胞。在肿瘤植入之后第7天，每组中的八(8)只小鼠接受单次静脉内(i.v.)注射的1×106个细胞(低剂量)或3×106个细胞(高剂量)剂量的表达抗ROR1 CAR-A、抗ROR1 CAR-F或参考抗ROR1(R12)CAR的经工程改造的初代人类T细胞。作为对照，向小鼠给予3×106个不表达CAR的T细胞(模拟)或不对小鼠进行治疗。评估肿瘤负荷的生物发光成像及血液中循环CAR+细胞的数量的流动式细胞测量分析，持续约100天。
在给予CAR-T细胞后，每4至7天通过生物发光成像监测过继转移的表达CAR的T细胞的抗肿瘤活性。对于生物发光成像，小鼠接受腹膜内(i.p.)注射的再悬浮于PBS中的荧光素基质(PerkinElmer,Waltham,MA)(每公斤体重约150mg)。使小鼠麻醉且基本上如WO2015/095895中所描述进行成像。在各时间点测定总通量(光子/秒)。
来自经治疗小鼠的生物发光影像及平均总通量测量值(p/s)在给予低剂量的表达CAR的细胞后的结果分别显示于图12B及图13A中；或在给予高剂量的表达CAR的细胞后的结果分别显示于图12C及图13B中。图12A描绘未治疗小鼠或给予模拟T细胞的小鼠的生物发光影像。图13C描绘个别小鼠的总通量测量值(p/s)。
在低剂量或高剂量下平均肿瘤体积的变化分别显示于图14A及图14B中。如所示，相较于给予表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞的小鼠，观察到给予低剂量及高剂量的表达抗ROR1 CAR-F的细胞的小鼠一般具有较低程度的生物发光信号，指示经治疗动物的肿瘤生长随时间减慢及/或较低程度的肿瘤生长。观察到给予低剂量及高剂量的表达抗ROR1 CAR-A的细胞的小鼠一般具有与给予表达参考抗ROR1(R12)CAR的细胞的小鼠类似的生物发光信号。
在相同研究中，在给予高剂量及低剂量的表达抗ROR1 CAR F及参考CAR R12的T细胞后直至另一时间点的平均肿瘤体积变化分别显示于图14C及图14D中。对于每一治疗条件，在高剂量或低剂量下个别经治疗小鼠的肿瘤体积结果显示于图14E中。给予表达抗ROR1CAR-F的细胞引起平均肿瘤消退(低于基线，如通过BLI测量)至少35天，此时，终止BLI测量。参考R12 CAR在高剂量(图14C及图14E)或低剂量(图14D及图14E)下不展现低于基线的平均肿瘤消退。根据皮下肿瘤体积，50％的给予高剂量的表达抗ROR1 CAR-F的细胞的小鼠(8只中有4只)展现完全且持久的肿瘤清除，而仅12.5％的用高剂量的表达R12 CAR的细胞治疗的小鼠(8只中有1只)展现完全肿瘤清除(图14C及图14E)。在低剂量下，25％(8只中有2只)的用表达抗ROR1 CAR-F的细胞治疗的动物展现完全肿瘤清除，而用低剂量的表达参考R12CAR的细胞治疗的动物未产生完全肿瘤清除(图14D及图14E)。
在CAR T细胞转移后，每周至少两次监测小鼠的肿瘤生长及身体状况，持续97天，并在肿瘤体积超过1500mm3时、在经历肿瘤溃疡时、在显示重度xGvHD的病征(例如由xGvHD引起的重度皮炎及/或20％体重减轻)时或在因其他原因而濒死时，实施安乐死。评估如上文所描述治疗的小鼠的存活情况。每组的卡普兰-迈耶存活曲线显示于图15A-图15B中。未治疗小鼠的中值存活期是61天。在高剂量下，给予表达抗ROR1 CAR-F的细胞、表达R12参考CAR的细胞或模拟处理的细胞的小鼠的中值存活期未测定，因为62.5％(8只中有5只)的给予模拟处理的细胞的动物在研究结束时存活，且在给予CAR T细胞的任一组中均未发生死亡(图15A)。在低剂量下，给予低剂量的表达R12 CAR的细胞的小鼠的中值存活期是96天，其中8只动物中仅3只在研究结束时仍存活，而在给予表达CAR-F的细胞的小鼠中观察到100％存活(8只全部存活)(图15B)。
在给予低剂量(图16A-图16B)或高剂量(图16C-图16D)的表达CAR的T细胞之后第7天、第14天、第21天及第30天，测定动物的血液中表达CD4+及CD8+CAR的细胞的平均数量。还在第7天、第14天、第21天及第30天时测定给予表达抗ROR1 CAR-F或R12参考CAR的细胞的每只小鼠的血液中表达CD3+CAR的细胞(CD45+CD3+CAR+)的平均数量，显示于图16E中。在高剂量下，在第7天、第14天、第21天及第30天时表达CAR-F的T细胞的平均计数分别为每微升血液5.0、19.4、50.7及119.2个细胞，相比的下，表达R12的T细胞的平均计数为每微升血液6.0、5.4、3.9及5.4个细胞。给予低剂量还显示类似的扩增，其中在第7天、第14天、第21天及第30天时表达CAR-F的细胞的平均计数分别为每微升血液1.4、4.9、20.9及58.5个细胞，相比的下，表达R12的细胞的平均计数为每微升血液1.3、0.6、0.9及0.4个细胞。如所示，当给予高剂量及低剂量时，表达抗ROR1 CAR-F的细胞在MDA-MB-231小鼠模型中展现高扩增。确切地说，表达抗ROR1 CAR F的细胞自给予之后第14天开始直至第30天展现实质上高的扩增。
C.结论
使用包括三阴性乳腺癌异种移植肿瘤模型在内的二种不同的活体内小鼠肿瘤模型，结果证实，给予抗ROR1 CAR-F的小鼠具有高抗肿瘤活性及T细胞扩增，以及延长的存活期。根据大部分测量值，表达抗ROR1CAR-F的细胞相较于抗ROR1参考R12 CAR显示出改善。
实施例5：由患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的人类受试者产生的表达抗ROR1CAR的T细胞
由患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的人类受试者产生经工程改造的表达抗RORCAR的初代T细胞并在活体外评估细胞毒性及细胞因子产生情况。
A.由患有CLL的受试者产生表达抗ROR1 CAR的细胞
将来自患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的人类受试者的初代T细胞工程改造成表达例示性抗ROR1 CAR，即如以上实施例3中所描述的抗ROR1 CAR-F。
通过基于免疫亲和力的富集自患有CLL的两名人类供体之一的白血球清除术样品中分离出CD4+及CD8+T细胞。将分离的CD4+及CD8+T细胞以约1:1比率混合，用编码如实施例3中所描述的抗ROR1 CAR-F、作为对照的抗CD19 CAR或参考抗ROR1 CAR(R12)的慢病毒制剂刺激并转导，且在用于扩增的条件下培养。评估CD4及CD8耗竭的白血球清除术样品中CD19及ROR1的表达量并在分析中用作靶点细胞群。对于这些患有CLL的受试者中的一个(CLL供体1)，ROR1表达量较低，几乎与经工程改造成响应于四环素衍生物多西环素表达ROR1的K562人类慢性骨髓性白血病(CML)细胞株在不添加多西环素情况下的表达量一样低(参见实施例9)。
B.细胞溶解活性及细胞因子产生
评估来自患有CLL的受试者的表达例示性抗ROR1 CAR F的初代T细胞的细胞溶解活性。
在一个实验中，用Rapid Red细胞标记试剂标记自受试者获得的靶点细胞(CD4及CD8耗竭的白血球清除术样品)以容许通过显微镜检查追踪靶点细胞，并将这些细胞与表达CAR的细胞以2.5:1及0.25:1的E:T比率培育，或将其与模拟细胞一起培养或单独培养作为对照。通过测量在0与60小时之间的时间段内红色荧光信号相较于对照的损失来评估细胞溶解活性。
如图17中所示，对于两位供体及两种E:T比率，当与表达CAR的细胞共培养时，来自经标记的靶点细胞的红色荧光信号损失要快于在单独培养或与模拟转导的细胞共培养的靶点细胞中所观察到的由正常细胞分裂引起的预期损失。相较于与表达抗ROR1 R12的细胞共培养，在将靶点细胞与表达抗ROR1 CAR-F的细胞共培养之后观察到靶点细胞的较大损失，且该损失与靶点细胞在与表达抗CD19 CAR的细胞共培养之后的损失相当。
在一个不同实验中，通过流动式细胞测量术评估表达ROR1的靶点细胞的损失。为此，用CellTraceTM紫(CTV)细胞增殖试剂标记经工程改造的表达CAR的细胞，并将其与来自患有CLL的受试者的靶点细胞以2.5:1及0.25:1的E:T比率共培养。在第4天收集上清液以评价细胞因子产生情况(IFN-γ、TNF-α及IL-2)并收集细胞以通过流动式细胞测量术评估CTV水平。
如图18A中所示，与由患有CLL的受试者产生的表达抗ROR1CAR F的细胞共培养的ROR1+靶点细胞的数量相较于单独培养的靶点细胞或与仿真转导的T细胞共培养的靶点细胞实质上减少。对于两位患者，该减少要大于与表达R12的细胞以两种E:T比率共培养所观察到的减少。如图18B-图18C中所示，由患有CLL的受试者产生的表达抗ROR1 CAR F的细胞分裂(图18B)并在与来自同一受试者的靶点细胞共培养时产生IFN-γ、TNF-α及IL-2(图18C)。增殖及细胞因子产生情况类似于或高于在相同条件下测试的表达R12的细胞的情况。
这些结果与来自患有CLL的人类受试者的初代T细胞成功地产生表达例示性抗ROR1 CAR F的经工程改造的T细胞的观察结果一致。这些细胞当与来自同一受试者的表达ROR1的靶点细胞一起培育时存活，展现细胞溶解活性，产生细胞因子并增殖，在一些情况下，甚至当靶点细胞低水平表达ROR1时还如此。结果证实，表达例示性抗ROR1 CAR F的细胞可用来自患有CLL的受试者的细胞产生，这些来自患有CLL的受试者的细胞先前曾报导为难以产生经工程改造的表达CAR的细胞(参见例如Gorgun等人,JClin Invest.2005年7月；115(7):1797-805；Ramsay等人,J Clin Invest.2008年7月；118(7):2427-37；Riches等人,Discov Med.2013年12月；16(90):295-302)。结果还显示，表达例示性抗ROR1 CAR的细胞有效杀灭表达甚至较低水平ROR1的靶点细胞，由此展示高敏感性。根据大部分测量值，表达抗ROR1CAR-F的细胞相较于表达抗ROR1参考R12 CAR的细胞显示出改善。
实施例6：在B细胞恶性疾病动物模型中表达抗ROR1 CAR的T细胞在活体内过继转移之后的抗肿瘤作用
在播散性人类B细胞恶性疾病的动物模型中，通过在细胞过继转移之后监测肿瘤来评估例示性经工程改造的表达抗ROR1 CAR(CAR+)的初代人类T细胞的抗肿瘤作用。如以上实施例3中所描述，向小鼠给予由人类供体产生的表达例示性抗ROR1 CAR-F的经工程改造的初代人类T细胞制剂，与给予表达参考抗ROR1(R12)CAR或抗CD19 CAR的经工程改造的初代人类T细胞相比较。
在第0天，对NOD.Cg.PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠静脉内注射1.0×106个表达萤火虫荧光素酶及绿色荧光蛋白(FfLuc-GFP)的人类套细胞淋巴瘤(MCL)JeKo-1细胞。在对小鼠腹膜内注射3mg D-荧光素之后数分钟，通过检测生物发光，利用生物发光成像(BLI)来评估肿瘤负荷。在第6天，将小鼠随机分成数组以平衡肿瘤负荷。在第7天，对小鼠给予每只小鼠1×106个细胞(低剂量)或3×106个细胞(高剂量)的剂量的由人类供体产生的表达例示性抗ROR1 CAR-F或参考抗ROR1(R12)CAR的经工程改造的初代人类T细胞。作为对照，小鼠不接受任何T细胞或接受3×106个来自同一供体的模拟处理的T细胞。在给予后，监测小鼠的肿瘤负荷及存活情况，持续139天。在给予后，监测循环CAR+T细胞的数量，持续28天。
图19A(高剂量)及图19B(低剂量)描绘所有经治疗小鼠的平均肿瘤体积。由所有个别小鼠得到的结果显示于图19C(高剂量)或图19D(低剂量)中。如图19A及图19C中所示，给予3×106个(高剂量)表达抗ROR1CAR-F的细胞或抗CD19 CAR+细胞的JeKo-1 MCL异种移植小鼠产生平均肿瘤消退(低于基线)，持续至少111天(BLI测量的最后一天)。相比的下，给予R12 CAR+细胞的小鼠展现平均肿瘤消退仅持续27天。如图19B及图19D中所示，在1×106个细胞的较低剂量下，给予表达CAR-F的细胞在整个研究过程(长达111天)中产生平均肿瘤消退。相比的下，给予抗CD19 CAR+细胞的小鼠展现平均肿瘤消退持续36天，而给予R12参考抗ROR1 CAR的小鼠未观察到平均肿瘤消退。
在给予CAR T细胞后，每周至少两次监测小鼠的身体状况，持续139天，且当濒死或展现重度异种移植物抗宿主疾病(xGvHD)的病征时实施安乐死。每组的卡普兰-迈耶存活曲线显示于图20A(高剂量)及图20B(低剂量)中。未治疗的JeKo-1异种移植小鼠的中值存活期是26.5天。给予3×106个模拟处理的细胞的动物的中值存活期是56天。用任一剂量的表达抗ROR1CAR-F的T细胞治疗的所有动物的中值存活期均无法测定，因为75％(8只中有6只)的给予高剂量(3×106个细胞；图20A)或低剂量(1×106个细胞；图20B)的动物在研究结束时仍存活。值得注意的是，在给予抗ROR1 CAR-F的小鼠中观察到的死亡与xGvHD而非淋巴瘤负荷相关。给予低剂量及高剂量的R12 CAR+T细胞的动物的中值存活期分别为70天及106天。接受低剂量抗CD19 CAR+T细胞的小鼠的中值存活期无法测定(8只动物中有7只存活至研究结束)且接受高剂量的小鼠的中值存活期是139天(8只动物中有4只存活)。该组中的死亡还主要与xGvHD而非淋巴瘤负荷相关。
在给予CAR+T细胞之后第7天、第14天、第21天及第28天，通过流动式细胞测量术评估每只小鼠的末梢血液中CAR+T细胞的平均数量。如图21中所示，在给予所检查的两种剂量之后的第21天或第28天，表达抗ROR1 CAR-F的细胞显示在外周血液中的循环CAR+T细胞浓度最大。在高剂量下，抗CD19 CAR+T细胞在给药后第14天展示的扩增(172.5个细胞/微升血液)实质上大于表达抗ROR1 CAR-F的细胞(77.0个细胞/微升血液)或表达R12 CAR的细胞(25.0个细胞/微升血液)。然而，到第21天，在低剂量下，表达抗ROR1 CAR-F的细胞的计数(140.9个细胞/微升血液)相较于R12 CAR+细胞(0.3个细胞/微升血液)及抗CD19 CAR+细胞(17.2个细胞/微升血液)的计数实质上增加。在高剂量下，观察到表达抗ROR1 CAR-F的细胞有类似的扩增增加，每微升血液有392.7个细胞，相比的下，R12 CAR+细胞及抗CD19CAR+细胞分别为每微升血液10.2个及66.8个细胞。在给予细胞后第28天还观察到此扩增的改善。
结果证实，在MCL小鼠异种移植模型中给予例示性抗ROR1CAR-F的小鼠具有高抗肿瘤活性、改善的T细胞扩增及延长的存活期。根据大部分测量值，表达抗ROR1 CAR-F的细胞相较于抗ROR1参考R12 CAR显示出显著改善，且针对MCL显示出相较于表达抗CD19 CAR细胞类似或改善的活性。
实施例7：抗原决定基定位
使用完全不连续抗原决定基定位，通过肽化学连接至支架上(Chemical Linkageof Peptides onto Scaffolds，CLIPS；Pepscan Presto BV,Lelystad,The Netherlands；参见例如Timmerman等人(2007)J.Mol.Recognit.20:283-329)评估由例示性抗ROR1 CAR-F及CAR-G(如SEQ ID NO:118中所示的scFv序列)中所包含的例示性抗ROR1抗原结合结构域识别的抗原决定基。使用抗ROR1 scFv克隆进行定位，在克隆纯系中，scFv与人类Fc融合(scFv-hFc；IgG1)或与小鼠Fc融合(scFv-mFc)。
由短暂转染的HEK293细胞表达例示性抗ROR1 scFv-mFc及scFv-hFc并纯化，且通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及分析型尺寸排阻层析法(SEC)进行评估。由短暂转染的HEK293细胞重组表达ROR1的细胞外结构域(ROR1 ECD)并纯化，且通过SDS-PAGE及SEC进行评估。结果显示抗ROR1 scFv-hFc、scFv-mFc及ROR1-ECD的高纯度组合物(对于scFv-hFc及ROR1-ECD，>99％纯度，<1％的高分子量多聚体；对于scFv-mFc，>97％纯度，<3％的高分子量多聚体)。
由人类ROR1产生各种长度的线性及结构化合成肽集合库(例如SEQ ID NO:144-146中所示)，这些合成肽集合库各自相差一个氨基酸残基。制备的结构化肽集合库将不同长度的肽固定成确定的3D结构，包括ROR1的任何单环、双环、α-螺旋及β-转角区段。将这些集合库布置成组合图以得到以无偏差方式表示ROR1的构形及/或不连续抗原决定基的环及线性肽的组合。
根据ROR1的个别及组合线性及结构化肽与结合物，产生基于ELISA的热图。对肽内显示阳性结合的所有残基执行迭代性双丙氨酸取代(对于野生型丙氨酸残基，甘氨酸经取代)。确定当经丙氨酸取代时引起70％或更大结合减少的氨基酸为抗原决定基的核心组分。
分析抗原决定基定位显示，结合至不连续、构形依赖性抗原决定基的例示性抗ROR1 CAR-F及CAR-G(如SEQ ID NO:118中所示的scFv序列)中所包含的例示性抗ROR1抗原结合结构域的scFv-hFC主要以氨基酸FRSTIYGSRLRIRNL(如SEQ ID NO:199中所示；对应于SEQ ID NO:144中所示的人类ROR1序列的残基78-92)为中心。表E2阐述由抗原决定基定位鉴别的抗原决定基。观察到的大部分结合与FRSTIYGSRLRIRNL(SEQ ID NO:199)的多个部分组合，此与抗原决定基的不同区域之间存某种协同性一致。
表E2.例示性抗ROR1抗原结合结构域的结合抗原决定基
Figure BDA0003187625950002761
Figure BDA0003187625950002771
由在双丙氨酸取代后≥70％的结合减少所确定的核心残基加下划线并以粗体显示。*可能含有该抗原决定基的多个较小部分。
实施例8：抗ROR1抗原结合结构域的亲和力及结合动力学
通过表面等离子共振(SPR)评估例示性抗ROR1抗原结合结构域与抗原ROR1的结合亲和力及动力学。
A.结合亲和力及动力学
通过表面等离子共振(SPR)，使用BiacoreTM T200仪器及BiacoreTM T200评价软件v3测定重组人类ROR1与例示性ROR1 CAR的结合结构域之间相互作用的平衡解离常数(KD)、缔合速率常数(ka或kon)及解离速率常数(kd或koff)。确切地说，评估如以上实施例3及表E1中所描述的CAR的scFv结合结构域，包括scFv ROR1-1、ROR1-2、ROR1-3及ROR1-4(分别如SEQID NO:118、127、109及134中所示；CAR-A、CAR-F、CAR-G、CAR-I、CAR-R及CAR-B1的scFv结合结构域)及参考CAR R12(SEQ ID NO:142)的抗原结合结构域。
使用重组产生的抗ROR1 scFv结合结构域及带有C末端6×His标签的ROR1细胞外结构域(ROR1 ECD 6×His)进行结合亲和力及动力学分析。这些结合结构域构建为scFv与鼠类免疫球蛋白重链IgG2a的Fc部分的融合物形式(scFv-mFc)。鼠类IgG2a结构域含有减少Fc受体及补体结合的4个点突变。通过免校准的浓度分析(CFCA)测定ROR1 ECD 6×His的活性浓度。
对于SPR，使用抗小鼠IgG捕捉表面芯片(小鼠抗体捕捉试剂盒2型(MouseAntibody Capture Kit type 2)，目录号29215281；及S系列传感器芯片CM5，目录号29104988，GE Healthcare Bio-Sciences)将抗ROR1 scFv-mFc结合结构域捕捉于流槽上，同时出于参考目的，使另一流槽保持空白。通过随后注射浓度为183、61.0、20.33、6.78及2.26nM且在活性及参考流槽上具有不同解离的重组人类ROR1来实施多循环动力学。
使用多循环动力学，将多种浓度的ROR1 ECD注射于scFv-mFc结合的芯片上。使用单价1:1模型分析传感器图谱并计算相互作用的亲和力及动力学测量值。
图22A-图22E描绘抗ROR1 scFv ROR1-1(SEQ ID NO:118；图22A)、ROR1-2(SEQ IDNO:127；图22B)、ROR1-3(SEQ ID NO:109；图22C)及ROR1-4(SEQ ID NO:134；图22D)以及参考CAR R12的scFv抗原结合结构域(SEQ ID NO:142；图22E)的双参考传感器图谱。抗ROR1scFv结合结构域与ROR1之间相互作用的亲和力(平衡解离常数，KD)阐述于表E3中。测量抗ROR1 scFv ROR1-1(CAR-F的结合结构域)与ROR1之间相互作用的亲和力(平衡解离常数，KD)是42nM，且观察到该相互作用的动力学缔合速率常数(ka或kon；缔合速率)及解离速率常数(kd或koff；解离速率)分别为ka＝1.2×105 1/Ms及kd＝5.0×10-3 1/s。相较于参考R12scFv结合结构域，抗ROR1 scFv ROR1-1(CAR-F的结合结构域)展现实质上较高的KD(较低亲和力)及较快的解离速率(kd或koff)。相较于参考R12 scFv结合结构域，抗ROR1scFv ROR1-2(CAR-A的结合结构域)展现实质上较低的KD(较高亲和力)及较慢的解离速率(kd或koff)。
表E3.例示性抗ROR1结合结构域的亲和力及结合动力学.
Figure BDA0003187625950002781
B.抗原决定基分组
在抗原决定基分组分析中使用SPR来比较例示性ROR1结合结构域所识别的抗原决定基结合区与抗ROR1参考R12结合结构域的抗原决定基。将参考R12 scFv结合结构域固定于表面上，引入ROR1 ECD 6×His并使其结合至R12结合结构域，且注射例示性抗ROR1 CAR的重组scFv结合结构域，包括scFv ROR1-1、ROR1-2、ROR1-3及ROR1-4(分别如SEQ ID NO:118、127、109及134中所示；CAR-A、CAR-F、CAR-G、CAR-I、CAR-R及CAR-B1的scFv结合结构域)，以评估重组scFv是否结合至ROR1中与该R12结合结构域所结合类似的区域。结果显示，候选抗ROR1 scFv结合结构域ROR1-1、ROR1-2、ROR1-3及ROR1-4与scFv R12竞争结合至ROR1ECD，此与候选scFv结合结构域可结合至与R12结合结构域所结合重叠的抗原决定基或区域的观察结果一致。
实施例9：抗ROR1抗原结合结构域的抗原敏感性评估
针对在使用ROR1表达量可调控的表达ROR1的细胞株刺激之后产生细胞因子及细胞毒性活性的能力来评价表达例示性抗ROR1 CAR-F及参考抗ROR1 CAR R12的T细胞的抗原敏感性。
将K562人类骨髓性白血病细胞株工程改造成响应于四环素衍生物多西环素(TetOn)表达ROR1。相较于内源性表达ROR1的细胞株，经工程改造的K562-ROR1-TetOn细胞株在基线时极低水平地表达ROR1，甚至在无多西环素处理下还如此。
转导2×104个K562-ROR1-TetOn或亲本K562靶点细胞以使其稳定表达
Figure BDA0003187625950002791
NucLight红。将R10培养基(RPMI 1640；1×BME、1×NEAA、1×NaPyr、10％热灭活FBS)添加至光学透明的96孔平底盘中。使解冻的表达CAR的T细胞以1.6×106个CAR+细胞/毫升浓度再悬浮于R10培养基中。接着，将CAR-T添加至K562靶点细胞中，达到每孔8×104个细胞的最终CAR+T细胞计数，以产生4:1的E:T比率。使用DMSO将盐酸多西环素稀释至所希望的浓度(2ng/mL-512ng/mL)并在技术性一式三份中，将其添加至涂铺的CAR-T/靶点细胞混合物中。在37℃/5％CO2下培育各盘72小时，并使用
Figure BDA0003187625950002792
定期测量NucLight红荧光。
如图23中所示，在与单独多西环素一起培育之后K562-ROR1-TetOn细胞上的ROR1表达量显示，ROR1表达量随多西环素浓度增加而增加。在培育72小时之后，自含有表达抗ROR1 CAR-F或参考R12 CAR的T细胞的孔收集上清液，这些孔中混有表达递增量的ROR1的K562-ROR1-TetOn靶点细胞。如图24中所示，在测试的所有ROR1表达量下，表达CAR-F的T细胞引起相较于表达R12的细胞相当或较大的IFNγ、IL-2及TNFα产生量。如图25A-图25B中所示，如通过测定红色荧光信号随时间的损失来分析细胞毒性功能显示，表达CAR-F的细胞对较低ROR1水平的反应比表达R12的细胞有效，表明具有较高抗原敏感性，同时如通过缺乏对亲本细胞株的反应所展示，不存在特异性损失。
实施例10：结合特异性评估
通过各种方法评估例示性抗ROR1 CAR-F的结合结构域的潜在脱靶结合及物种交叉反应性。
A.质膜蛋白质数组
基于质膜蛋白质数组评估脱靶结合。该基于芯片的平台含有超过4400组经基因工程改造成过度表达个别人类细胞外膜蛋白质的细胞，这些人类细胞外膜蛋白质一起占人类细胞外蛋白质组的超过75％。该仪器板还包括超过1000个系栓的分泌蛋白质靶点。产生scFv-Fc(如SEQ ID NO:118中所示的scFv序列)并用于在数组中针对细胞进行免疫组织化学(IHC)分析。执行确证筛选。测定scFv对ROR1具有高选择性，且未鉴别出额外特异性相互作用，包括与ROR2的相互作用。此这些结果指示表达抗ROR1CAR-F的细胞具有脱靶活性的风险较低。
B.物种交叉反应性
表E4显示人类(智人(Homo sapiens))、恒河猕猴、食蟹猕猴及小鼠(小家鼠)之间ROR1的细胞外结构域(ECD)同源性。ROR1的ECD在人类与非人类灵长类动物之间100％保守。
表E4.各物种的ROR1 ECD同源性
恒河猕猴 食蟹猕猴 小家鼠
智人 100％ 100％ 98.7％
人类ROR1的细胞外结构域氨基酸30-406
智人：Uniprot Q01973(如SEQ ID NO:214中所示)
恒河猕猴：Uniprot F6RUP2(如SEQ ID NO:215中所示)
食蟹猕猴：Uniprot A0A2K5WTX7(如SEQ ID NO:216中所示)、Uniprot A0A2K5WTX4(如SEQ ID NO:217中所示)
小家鼠：Uniprot Q9Z139(如SEQ ID NO:218中所示)
通过将含有Nur77-tdTomato报告分子且表达抗ROR1 CAR-F或参考R12 CAR的经工程改造的Jurkat T细胞株(如上文实施例1.C中所描述)与经工程改造成表达小鼠ROR1的CT26鼠类纤维母细胞(CT26-mROR1)、经工程改造成表达人类ROR1的CT26细胞(CT26-hROR1)或未修饰的CT26细胞或未修饰的K562人类骨髓性白血病细胞共培养，并评估该报告分子的表达，来评估抗ROR1 CAR-F及R12 CAR的物种交叉反应性。
如图26中所示，尽管在人类与小鼠ROR1之间存在98.7％的同源性，但关于抗ROR1CAR-F或R12 CAR与小鼠表达ROR1的靶点细胞的结合未观察到交叉反应性。
本发明的范围不意欲局限于具体揭示的实施方案，这些实施方案提供用于例如说明本发明的各种方面。根据说明书及本文中的教导将对所述组合物及方法的各种修改显而易见。此类变化形式可在不背离本发明的真正范围及精神的情况下实践且意欲在本发明的范围内。
序列
Figure BDA0003187625950002811
Figure BDA0003187625950002821
Figure BDA0003187625950002831
Figure BDA0003187625950002841
Figure BDA0003187625950002851
Figure BDA0003187625950002861
Figure BDA0003187625950002871
Figure BDA0003187625950002881
Figure BDA0003187625950002891
Figure BDA0003187625950002901
Figure BDA0003187625950002911
Figure BDA0003187625950002921
Figure BDA0003187625950002931
Figure BDA0003187625950002941
Figure BDA0003187625950002951
Figure BDA0003187625950002961
Figure BDA0003187625950002971
Figure BDA0003187625950002981
Figure BDA0003187625950002991
Figure BDA0003187625950003001
Figure BDA0003187625950003011
Figure BDA0003187625950003021
Figure BDA0003187625950003031
Figure BDA0003187625950003041
Figure BDA0003187625950003051
Figure BDA0003187625950003061
Figure BDA0003187625950003071
Figure BDA0003187625950003081
Figure BDA0003187625950003091
Figure BDA0003187625950003101
Figure BDA0003187625950003111
Figure BDA0003187625950003121
Figure BDA0003187625950003131
Figure BDA0003187625950003141
Figure BDA0003187625950003151
Figure BDA0003187625950003161
Figure BDA0003187625950003171
Figure BDA0003187625950003181
Figure BDA0003187625950003191
Figure BDA0003187625950003201
Figure BDA0003187625950003211
Figure BDA0003187625950003221
Figure BDA0003187625950003231
Figure BDA0003187625950003241
Figure BDA0003187625950003251
Figure BDA0003187625950003261
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
<120> 对受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)具特异性的抗体及嵌合抗原受体
<130> 735042017740
<150> 62/798,456
<151> 2019-01-29
<160> 219
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3 间隔子
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3 间隔子
<400> 4
gaatctaagt acggaccgcc ttgtcctcca tgtcctggcc agccaagaga accccaggtg 60
tacacactgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 120
gtcaagggct tctacccttc cgatatcgcc gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag 180
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc 240
cggctgaccg tggacaagag cagatggcaa gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg 300
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagtctctga gcctgagcct gggcaag 357
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28
<300>
<308> P10747
<309> 1989-07-01
<313> (153)..(179)
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28
<300>
<308> P10747
<309> 1989-07-01
<313> (114)..(179)
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28
<300>
<308> P10747
<309> 1989-07-01
<313> (180)..(220)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28 (LL to GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 4-1BB
<300>
<308> Q07011.1
<309> 1995-02-01
<313> (214)..(255)
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3ζ
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> REPEAT
<222> (5)..(9)
<223> SGGGG重复5次
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 24
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X是半胱氨酸或苏氨酸
<400> 25
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 26
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 27
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 28
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 28
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 29
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链) O/SSE
<400> 30
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtccc 36
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 31
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 32
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 33
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3 间隔子
<400> 34
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 35
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3 间隔子
<400> 35
gaatctaagt acggaccgcc ttgtcctcca tgtcctgctc ctccagttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcagaac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggacgt gtcccaagag gatcctgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat cagcaaggcc 360
aagggccagc caagagaacc ccaggtgtac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc aagggcttct acccttccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggct cattcttcct gtacagccgg ctgaccgtgg acaagagcag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 660
tctctgagcc tgagcctggg caag 684
<210> 36
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3 间隔子
<400> 36
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 37
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4/IgG2铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3 间隔子
<400> 37
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 38
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4/IgG2铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3 间隔子
<400> 38
gaatctaagt acggaccgcc ctgccctccc tgccctgctc ctcctgtggc tggaccaagc 60
gtgttcctgt ttccacctaa gcctaaagat accctgatga tttcccgcac acctgaagtg 120
acttgcgtgg tcgtggacgt gagccaggag gatccagaag tgcagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aagtccacaa tgctaagact aaaccccgag aggaacagtt tcagtcaact 240
taccgggtcg tgagcgtgct gaccgtcctg catcaggatt ggctgaacgg gaaggagtat 300
aagtgcaaag tgtctaataa gggactgcct agctccatcg agaaaacaat tagtaaggca 360
aaagggcagc ctcgagaacc acaggtgtat accctgcccc ctagccagga ggaaatgacc 420
aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtc aaaggcttct atccaagtga catcgccgtg 480
gagtgggaat caaatgggca gcccgagaac aattacaaga ccacaccacc cgtgctggac 540
tctgatggaa gtttctttct gtattccagg ctgaccgtgg ataaatctcg ctggcaggag 600
ggcaacgtgt tctcttgcag tgtcatgcac gaagccctgc acaatcatta tacacagaag 660
tcactgagcc tgtccctggg caaa 684
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4GS 接头
<400> 39
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3GS 接头
<400> 40
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (4GS)3 接头
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33信号肽
<400> 42
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类IgG-κ信号肽
<400> 43
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly
20
<210> 44
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类IgG-κ信号序列
<400> 44
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctccgg agcatacgga 60
<210> 45
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号肽
<400> 45
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 46
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号序列
<400> 46
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8 α信号肽
<400> 47
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 48
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> IgG2 Fc (Uniprot P01859)
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 49
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> IgG4 Fc (Uniprot P01861)
<400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 50
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 51
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5 10
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 52
Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 53
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
1 5
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 54
Ser Ala Tyr Asn Gly Asn
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 55
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Lys
1 5 10
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 56
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 57
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 58
Asp Glu Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 59
Ala Arg Asp Glu Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1
<400> 60
Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Ser Tyr Ala Ile Ala
1 5 10
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1
<400> 61
Ser Gly His Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2
<400> 62
Leu Asn Ser Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2
<400> 63
Leu Asn Ser Asp Gly Ser His
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3
<400> 64
Gln Thr Trp Gly Thr Gly Ile Arg Val
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 65
Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 66
Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 67
Asn Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 68
Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr Tyr
1 5
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 69
Tyr Thr Ser Gly Ser
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 70
Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn
1 5
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 71
Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 72
Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 73
Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 74
Ala Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1
<400> 75
Arg Met Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1
<400> 76
Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2
<400> 77
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 78
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2
<400> 78
Ala Ala Ser
1
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3
<400> 79
Gln Gln Tyr Asp Ser Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 80
Gly Gly Ser Ile Asn Ser Thr Thr Ser
1 5
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 81
Gly Gly Ser Ile Asn Ser Thr Thr Ser Tyr Trp Ala
1 5 10
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 82
Ser Thr Thr Ser Tyr Trp Ala
1 5
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 83
Gly Gly Ser Ile Asn Ser Thr Thr Ser Tyr
1 5 10
<210> 84
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 84
Tyr Ser Gly Lys
1
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 85
Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Lys Thr Tyr
1 5
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 86
Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Lys Thr Tyr Asn Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 87
Ile Phe Tyr Ser Gly Lys Thr
1 5
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 88
Phe Asp Tyr Gly Phe His Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 89
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 89
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Phe His Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1
<400> 90
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1
<400> 91
Gln Ser Ile Thr Ser Asp Tyr
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2
<400> 92
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 93
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2
<400> 93
Gly Ala Ser
1
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3
<400> 94
Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Tyr Thr
1 5
<210> 95
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 95
Ser Ala Tyr Thr Gly Asn
1 5
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 96
Trp Ile Ser Ala Tyr Thr Gly Asn Thr Arg
1 5 10
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 97
Trp Ile Ser Ala Tyr Thr Gly Asn Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 98
Ile Ser Ala Tyr Thr Gly Asn Thr
1 5
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 99
Glu Glu Gly Ala Thr Thr Asp Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 100
Ala Arg Glu Glu Gly Ala Thr Thr Asp Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 101
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 101
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaagtat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatgag 300
gatattttga ctggttacaa ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 102
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH O/SSE
<400> 102
caggtgcagc tggttcaatc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacggca tcagctgggt ccgacaggct 120
cctggacaag gcttggaatg gatgggctgg atcagcgcct acaacggcaa caccaaatac 180
gcccagaaac tgcagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcacaag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag atccgatgac accgccgtgt actactgcgc cagagatgag 300
gacatcctga ccggctacaa ctactacggc atggacgtgt ggggccaggg cacaacagtg 360
acagtttctt ct 372
<210> 103
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 103
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Glu Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 104
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 104
cagcttgtgc tgactcaatc gccctctgcc tctgcctccc tgggagcctc ggtcaagctc 60
acctgcactc tgagcagtgg gcacagcagc tacgccatcg catggcatca gcagcagcca 120
gagaagggcc ctcggtactt gatgaagctt aacagtgatg gcagccacag caagggggac 180
gggatccctg atcgcttctc aggctccagc tctggggctg agcgctacct caccatctcc 240
agcctccagt ctgaggatga ggctgactat tactgtcaga cctggggcac tggcattcgg 300
gtgttcggtg gaggaaccaa actgactgtc ctaggc 336
<210> 105
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL O/SSE
<400> 105
caactggtgc tgacacagtc tcctagcgcc tctgcttctc tgggagccag cgtgaagctg 60
acctgtacac tgtctagcgg ccacagcagc tacgccattg cttggcatca gcagcagccc 120
gagaagggcc ctagatacct gatgaagctg aacagcgacg gcagccactc taaaggcgac 180
ggcatccccg atagattcag cggcagttct agcggagccg agcgctacct gacaatcagc 240
tctctgcaat ccgaggacga ggccgactac tactgtcaga catggggcac cggcatcaga 300
gtgtttggcg gaggcaccaa gctgacagtg cttgga 336
<210> 106
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 106
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Lys Leu Asn Ser Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Gly
85 90 95
Thr Gly Ile Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 107
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL)
<400> 107
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaagtat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatgag 300
gatattttga ctggttacaa ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct caggtggtgg tggtagcggc ggcggcggct ctggtggtgg tggatcccag 420
cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 480
tgcactctga gcagtgggca cagcagctac gccatcgcat ggcatcagca gcagccagag 540
aagggccctc ggtacttgat gaagcttaac agtgatggca gccacagcaa gggggacggg 600
atccctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 660
ctccagtctg aggatgaggc tgactattac tgtcagacct ggggcactgg cattcgggtg 720
ttcggtggag gaaccaaact gactgtccta ggc 753
<210> 108
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL) O/SSE
<400> 108
caggtgcagc tggttcaatc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacggca tcagctgggt ccgacaggct 120
cctggacaag gcttggaatg gatgggctgg atcagcgcct acaacggcaa caccaaatac 180
gcccagaaac tgcagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcacaag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag atccgatgac accgccgtgt actactgcgc cagagatgag 300
gacatcctga ccggctacaa ctactacggc atggacgtgt ggggccaggg cacaacagtg 360
acagtttctt ctggcggcgg aggatctggc ggaggtggaa gcggaggcgg tggatctcaa 420
ctggtgctga cacagtctcc tagcgcctct gcttctctgg gagccagcgt gaagctgacc 480
tgtacactgt ctagcggcca cagcagctac gccattgctt ggcatcagca gcagcccgag 540
aagggcccta gatacctgat gaagctgaac agcgacggca gccactctaa aggcgacggc 600
atccccgata gattcagcgg cagttctagc ggagccgagc gctacctgac aatcagctct 660
ctgcaatccg aggacgaggc cgactactac tgtcagacat ggggcaccgg catcagagtg 720
tttggcggag gcaccaagct gacagtgctt gga 753
<210> 109
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL)
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Glu Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr
145 150 155 160
Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Ser Tyr Ala Ile Ala Trp His Gln
165 170 175
Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Asn Ser Asp
180 185 190
Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Gly Thr Gly Ile Arg Val
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
245 250
<210> 110
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 110
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggagg ctccatcagt aattactact ggagctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagtt ctttgaccgc cgcggacacg gccatatatt actgtgcgag gtattacgat 300
attttgactg gtttctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 111
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH O/SSE
<400> 111
caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc ctagcgaaac actgagcctg 60
acctgtaccg tgtctggcgg cagcatctcc aactactact ggtcctggat cagacagcct 120
gccggcaaag gcctggaatg gatcggcaga atctacacca gcggcagcac caactacaac 180
cccagcctga agtccagagt gaccatgagc gtggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
aagctgagca gcctgacagc cgccgatacc gccatctact actgtgcccg gtactacgat 300
atcctgaccg gcttcttcga ctactggggc cagggaacac tggtcacagt ttctagc 357
<210> 112
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 112
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 113
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 113
gtcatctgga tgacccagtc tccatcctta ctctctgcat ctacaggaga cagtgtcacc 60
atcagttgtc ggatgagtca ggacattagc agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctgagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagttc cctgcagtct 240
gaagattttg ctacttatta ctgtcaacag tatgatagtt tccctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaattcaa acgg 324
<210> 114
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL O/SSE
<400> 114
gtgatttgga tgacacagag ccctagcctg ctgagcgcca gcacaggcga tagcgtgacc 60
atcagctgca gaatgagcca ggacatcagc agctacctgg cttggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ctgaactgct gatctatgcc gcttccagtc tgcagagcgg cgtgccatct 180
agattttccg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga caatcagctc cctgcagtcc 240
gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag tacgacagct tccctccaac ctttggccag 300
ggcaccaagg tggaattcaa gcgc 324
<210> 115
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 115
Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Phe Lys Arg
100 105
<210> 116
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL)
<400> 116
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggagg ctccatcagt aattactact ggagctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagtt ctttgaccgc cgcggacacg gccatatatt actgtgcgag gtattacgat 300
attttgactg gtttctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 360
ggtggtggta gcggcggcgg cggctctggt ggtggtggat ccgtcatctg gatgacccag 420
tctccatcct tactctctgc atctacagga gacagtgtca ccatcagttg tcggatgagt 480
caggacatta gcagttattt agcctggtat cagcaaaaac cagggaaagc ccctgagctc 540
ctgatctatg ctgcatccag tttgcaaagt ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga 600
tctgggacag acttcactct caccatcagt tccctgcagt ctgaagattt tgctacttat 660
tactgtcaac agtatgatag tttccctccg acgttcggcc aagggaccaa ggtggaattc 720
aaacgg 726
<210> 117
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL) O/SSE
<400> 117
caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc ctagcgaaac actgagcctg 60
acctgtaccg tgtctggcgg cagcatctcc aactactact ggtcctggat cagacagcct 120
gccggcaaag gcctggaatg gatcggcaga atctacacca gcggcagcac caactacaac 180
cccagcctga agtccagagt gaccatgagc gtggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
aagctgagca gcctgacagc cgccgatacc gccatctact actgtgcccg gtactacgat 300
atcctgaccg gcttcttcga ctactggggc cagggaacac tggtcacagt ttctagcgga 360
ggcggaggat ctggtggcgg aggaagtggc ggaggcggtt ctgtgatttg gatgacacag 420
agccctagcc tgctgagcgc cagcacaggc gatagcgtga ccatcagctg cagaatgagc 480
caggacatca gcagctacct ggcttggtat cagcagaagc ctggcaaggc ccctgaactg 540
ctgatctatg ccgcttccag tctgcagagc ggcgtgccat ctagattttc cggcagcggc 600
tctggcaccg acttcaccct gacaatcagc tccctgcagt ccgaggactt cgccacctac 660
tattgccagc agtacgacag cttccctcca acctttggcc agggcaccaa ggtggaattc 720
aagcgc 726
<210> 118
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL)
<400> 118
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser
145 150 155 160
Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Phe
225 230 235 240
Lys Arg
<210> 119
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 119
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcaac agtactactt cctactgggc ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggactatct tttatagtgg gaaaacctac 180
aacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atgtccgtag acacgtccaa gaaccacttc 240
tccctgaagg tgaactctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgaggttt 300
gactacggtt ttcatgatgc ttttgatatc tggggccagg ggacaatggt caccgtctct 360
tca 363
<210> 120
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH O/SSE
<400> 120
cagctccagc tgcaagaatc tggacctggc ctggtcaagc ccagcgagac actgtctctg 60
acctgtacag tgtccggcgg cagcatcaat agcaccacaa gctactgggc ctggatcaga 120
cagcctcctg gcaaaggcct ggaatggatc ggcaccatct tctacagcgg caagacctac 180
aacaacccca gcctgaagtc cagagtgacc atgagcgtgg acaccagcaa gaaccacttc 240
agcctgaaag tgaacagcgt gacagccgcc gataccgccg tgtactactg cgccagattc 300
gactacggct tccacgacgc cttcgacatc tggggccagg gcacaatggt cacagtttct 360
agc 363
<210> 121
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 121
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Thr
20 25 30
Thr Ser Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Lys Thr Tyr Asn Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Phe His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 122
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 122
gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtattacc agcgactact tatcctggta ccaacaaaaa 120
cctgggcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca ccagggccac tggcatccca 180
gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240
cctgaagatt ttgtagttta ttactgtcag caggattata acttgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgg 324
<210> 123
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL O/SSE
<400> 123
gagattgtga tgacacagag ccccgccact ctgagcctta gtcctggcga aagagccaca 60
ctgagctgca gagccagcca gagcatcacc agcgattacc tgagctggta tcagcagaag 120
cccggacagg ctcccagact gctgatctat ggcgcctcta caagagccac cggcattccc 180
gcccgctttt ctggctctgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatatc tagcctgcag 240
cctgaggact tcgtggtgta ctattgccag caggactaca acctgtacac cttcggccag 300
gggaccaagc tggaaatcaa gaga 324
<210> 124
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 124
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 125
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL)
<400> 125
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcaac agtactactt cctactgggc ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggactatct tttatagtgg gaaaacctac 180
aacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atgtccgtag acacgtccaa gaaccacttc 240
tccctgaagg tgaactctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgaggttt 300
gactacggtt ttcatgatgc ttttgatatc tggggccagg ggacaatggt caccgtctct 360
tcaggtggtg gtggtagcgg cggcggcggc tctggtggtg gtggatccga aattgtaatg 420
acacagtctc cagccaccct gtctttgtct ccaggggaaa gagccaccct ctcctgcagg 480
gccagtcaga gtattaccag cgactactta tcctggtacc aacaaaaacc tgggcaggct 540
cccaggctcc tcatctatgg tgcatccacc agggccactg gcatcccagc caggttcagt 600
ggcagtgggt ctgggacaga cttcactctc accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt 660
gtagtttatt actgtcagca ggattataac ttgtacactt ttggccaggg gaccaagctg 720
gagatcaaac gg 732
<210> 126
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL) O/SSE
<400> 126
cagctccagc tgcaagaatc tggacctggc ctggtcaagc ccagcgagac actgtctctg 60
acctgtacag tgtccggcgg cagcatcaat agcaccacaa gctactgggc ctggatcaga 120
cagcctcctg gcaaaggcct ggaatggatc ggcaccatct tctacagcgg caagacctac 180
aacaacccca gcctgaagtc cagagtgacc atgagcgtgg acaccagcaa gaaccacttc 240
agcctgaaag tgaacagcgt gacagccgcc gataccgccg tgtactactg cgccagattc 300
gactacggct tccacgacgc cttcgacatc tggggccagg gcacaatggt cacagtttct 360
agcggaggcg gaggatctgg tggcggagga agtggcggag gcggttctga gattgtgatg 420
acacagagcc ccgccactct gagccttagt cctggcgaaa gagccacact gagctgcaga 480
gccagccaga gcatcaccag cgattacctg agctggtatc agcagaagcc cggacaggct 540
cccagactgc tgatctatgg cgcctctaca agagccaccg gcattcccgc ccgcttttct 600
ggctctggaa gcggcaccga cttcaccctg accatatcta gcctgcagcc tgaggacttc 660
gtggtgtact attgccagca ggactacaac ctgtacacct tcggccaggg gaccaagctg 720
gaaatcaaga ga 732
<210> 127
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL)
<400> 127
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Thr
20 25 30
Thr Ser Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Lys Thr Tyr Asn Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Phe His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala
180 185 190
Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg
<210> 128
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 128
caggttcagc tgctgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acactggtaa cacaaggtat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaagaa 300
ggagctacta cggactacga ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gactgcggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 129
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH O/SSE
<400> 129
caggttcagc tgcttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacggca tcagctgggt ccgacaggct 120
cctggacaag gcttggaatg gatgggctgg atcagcgcct acaccggcaa taccagatac 180
gcccagaaac tgcagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcacaag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag atccgatgac accgccgtgt actactgcgc cagagaagaa 300
ggcgccacca ccgactacga ctactacggc atggatgtgt ggggccaggg aacagccgtg 360
acagtttctt ct 372
<210> 130
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 130
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Thr Gly Asn Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Gly Ala Thr Thr Asp Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 131
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL O/SSE
<400> 131
caactggttc tgacacagag cccaagcgcc tctgcatctc tgggagcttc cgtgaagctg 60
acctgcacac tgtctagcgg ccacagcagc tatgccattg cctggcatca gcaacagccc 120
gagaagggcc ctagatacct gatgaagctg aacagcgacg gcagccactc taaaggcgac 180
ggcatccccg atagattcag cggcagttct agcggagccg agcgctacct gacaatcagc 240
tctctgcaat ccgaggacga ggccgattac tactgtcaga catggggcac cggcatcaga 300
gtgtttggcg gcggaacaaa gctgaccgtg ctgggc 336
<210> 132
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL)
<400> 132
caggttcagc tgctgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acactggtaa cacaaggtat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaagaa 300
ggagctacta cggactacga ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gactgcggtc 360
accgtctcct caggtggtgg tggtagcggc ggcggcggct ctggtggtgg tggatcccag 420
cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 480
tgcactctga gcagtgggca cagcagctac gccatcgcat ggcatcagca gcagccagag 540
aagggccctc ggtacttgat gaagcttaac agtgatggca gccacagcaa gggggacggg 600
atccctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 660
ctccagtctg aggatgaggc tgactattac tgtcag 696
<210> 133
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL) O/SSE
<400> 133
caggttcagc tgcttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacggca tcagctgggt ccgacaggct 120
cctggacaag gcttggaatg gatgggctgg atcagcgcct acaccggcaa taccagatac 180
gcccagaaac tgcagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcacaag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag atccgatgac accgccgtgt actactgcgc cagagaagaa 300
ggcgccacca ccgactacga ctactacggc atggatgtgt ggggccaggg aacagccgtg 360
acagtttctt ctggtggcgg aggatctggc ggaggtggaa gcggcggagg cggatctcaa 420
ctggttctga cacagagccc aagcgcctct gcatctctgg gagcttccgt gaagctgacc 480
tgcacactgt ctagcggcca cagcagctat gccattgcct ggcatcagca acagcccgag 540
aagggcccta gatacctgat gaagctgaac agcgacggca gccactctaa aggcgacggc 600
atccccgata gattcagcgg cagttctagc ggagccgagc gctacctgac aatcagctct 660
ctgcaatccg aggacgaggc cgattactac tgtcagacat ggggcaccgg catcagagtg 720
tttggcggcg gaacaaagct gaccgtgctg ggc 753
<210> 134
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (VH-VL)
<400> 134
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Thr Gly Asn Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Gly Ala Thr Thr Asp Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr
145 150 155 160
Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Ser Tyr Ala Ile Ala Trp His Gln
165 170 175
Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Asn Ser Asp
180 185 190
Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Gly Thr Gly Ile Arg Val
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
245 250
<210> 135
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4铰链 间隔子
<400> 135
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met
1 5 10
<210> 136
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4铰链 间隔子 O/SSE
<400> 136
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccatg 39
<210> 137
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3 间隔子 O/SSE
<400> 137
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccggcc agccaagaga gccccaggtt 60
tacacactgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaatc aggtgtccct gacatgcctg 120
gtcaagggct tctacccctc cgatatcgcc gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag 180
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gacagcgacg gcagtttctt cctgtatagt 240
agactcaccg tggataaatc aagatggcaa gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg 300
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aaaagcctga gcctgtctct gggcaag 357
<210> 138
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3 间隔子
<400> 138
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met
115 120
<210> 139
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3 间隔子 O/SSE
<400> 139
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccggcc agccaagaga gccccaggtt 60
tacacactgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaatc aggtgtccct gacatgcctg 120
gtcaagggct tctacccctc cgatatcgcc gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag 180
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gacagcgacg gcagtttctt cctgtatagt 240
agactcaccg tggataaatc aagatggcaa gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg 300
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aaaagcctga gcctgtctct gggcaagatg 360
<210> 140
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4/IgG2铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3 间隔子 O/SSE
<400> 140
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660
agcctgagcc tgtctctggg caag 684
<210> 141
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A O/SSE
<400> 141
cttgaaggtg gtggcgaagg cagaggcagc ctgcttacat gcggagatgt ggaagagaac 60
cccggaccta ga 72
<210> 142
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R12 VH-VL scFv
<400> 142
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu
145 150 155 160
Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln
165 170 175
Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr
180 185 190
Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
195 200 205
Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
245
<210> 143
<211> 745
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R12 VH-VL scFv
<400> 143
caagaacagc tggtggaatc tggcggcaga ctggttacac ctggcggaag cctgacactg 60
agctgtaaag ccagcggctt cgacttcagc gcctactaca tgagctgggt ccgacaggcc 120
cctggcaaag gactggaatg gatcgccaca atctacccca gctccggcaa gacctactac 180
gccacatggg tcaacggccg gttcaccatc agcagcgaca acgcccagaa caccgtggac 240
ctgcagatga actctctgac agccgccgac cgggccacct acttttgtgc cagagatagc 300
tacgccgacg acggcgccct gttcaatatt tggggacctg gcacactcgt gaccatctct 360
agcggaggcg gaggaagtgg tggcggagga tcaggcggtg gtggatctga actggtgctg 420
acacagagcc cctctgtgtc tgctgctctg ggaagccctg ccaagatcac atgtaccctg 480
agcagcgccc acaagaccga caccatcgac tggtatcagc agctgcaggg cgaagcccct 540
agatacctga tgcaggttca gagcgacggc agctacacca aaagacctgg cgtgcccgat 600
agattcagcg gcagttcttc tggcgccgat cgctacctga tcatcccttc tgtgcaagcc 660
gacgatgagg ccgactatta ctgcggagcc gattacatcg gcggctacgt tttcggtggc 720
ggcacacagt tgacagtgac aggcg 745
<210> 144
<211> 908
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 人类ROR1 GenBank: AAA60275.1
<400> 144
Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser
1 5 10 15
Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp
20 25 30
Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu
35 40 45
His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys
50 55 60
Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser
100 105 110
Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser
115 120 125
Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr
130 135 140
Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala
165 170 175
Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln
180 185 190
Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu
195 200 205
Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu
210 215 220
Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser
225 230 235 240
Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile
260 265 270
Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr
275 280 285
Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln
290 295 300
Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala
305 310 315 320
Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro
325 330 335
Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe
340 345 350
Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys
355 360 365
Glu Lys Asn Lys Met Glu Ile Leu Tyr Ile Leu Val Pro Ser Val Ala
370 375 380
Ile Pro Leu Ala Ile Ala Leu Leu Phe Phe Phe Ile Cys Val Cys Arg
385 390 395 400
Asn Asn Gln Lys Ser Ser Ser Ala Pro Val Gln Arg Gln Pro Lys His
405 410 415
Val Arg Gly Gln Asn Val Glu Met Ser Met Leu Asn Ala Tyr Lys Pro
420 425 430
Lys Ser Lys Ala Lys Glu Leu Pro Leu Ser Ala Val Arg Phe Met Glu
435 440 445
Glu Leu Gly Glu Cys Ala Phe Gly Lys Ile Tyr Lys Gly His Leu Tyr
450 455 460
Leu Pro Gly Met Asp His Ala Gln Leu Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys
465 470 475 480
Asp Tyr Asn Asn Pro Gln Gln Trp Thr Glu Phe Gln Gln Glu Ala Ser
485 490 495
Leu Met Ala Glu Leu His His Pro Asn Ile Val Cys Leu Leu Gly Ala
500 505 510
Val Thr Gln Glu Gln Pro Val Cys Met Leu Phe Glu Tyr Ile Asn Gln
515 520 525
Gly Asp Leu His Glu Phe Leu Ile Met Arg Ser Pro His Ser Asp Val
530 535 540
Gly Cys Ser Ser Asp Glu Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Leu Asp His
545 550 555 560
Gly Asp Phe Leu His Ile Ala Ile Gln Ile Ala Ala Gly Met Glu Tyr
565 570 575
Leu Ser Ser His Phe Phe Val His Lys Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile
580 585 590
Leu Ile Gly Glu Gln Leu His Val Lys Ile Ser Asp Leu Gly Leu Ser
595 600 605
Arg Glu Ile Tyr Ser Ala Asp Tyr Tyr Arg Val Gln Ser Lys Ser Leu
610 615 620
Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ala Ile Met Tyr Gly Lys Phe
625 630 635 640
Ser Ser Asp Ser Asp Ile Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile
645 650 655
Phe Ser Phe Gly Leu Gln Pro Tyr Tyr Gly Phe Ser Asn Gln Glu Val
660 665 670
Ile Glu Met Val Arg Lys Arg Gln Leu Leu Pro Cys Ser Glu Asp Cys
675 680 685
Pro Pro Arg Met Tyr Ser Leu Met Thr Glu Cys Trp Asn Glu Ile Pro
690 695 700
Ser Arg Arg Pro Arg Phe Lys Asp Ile His Val Arg Leu Arg Ser Trp
705 710 715 720
Glu Gly Leu Ser Ser His Thr Ser Ser Thr Thr Pro Ser Gly Gly Asn
725 730 735
Ala Thr Thr Gln Thr Thr Ser Leu Ser Ala Ser Pro Val Ser Asn Leu
740 745 750
Ser Asn Pro Arg Tyr Pro Asn Tyr Met Phe Pro Ser Gln Gly Ile Thr
755 760 765
Pro Gln Gly Gln Ile Ala Gly Phe Ile Gly Pro Pro Ile Pro Gln Asn
770 775 780
Gln Arg Phe Ile Pro Ile Asn Gly Tyr Pro Ile Pro Pro Gly Tyr Ala
785 790 795 800
Ala Phe Pro Ala Ala His Tyr Gln Pro Thr Gly Pro Pro Arg Val Ile
805 810 815
Gln His Cys Pro Pro Pro Lys Ser Arg Ser Pro Ser Ser Ala Ser Gly
820 825 830
Ser Thr Ser Thr Gly His Val Thr Ser Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn
835 840 845
Gln Glu Ala Asn Ile Pro Leu Leu Pro His Met Ser Ile Pro Asn His
850 855 860
Pro Gly Gly Met Gly Ile Thr Val Phe Gly Asn Lys Ser Gln Lys Pro
865 870 875 880
Tyr Lys Ile Asp Ser Lys Gln Ala Ser Leu Leu Gly Asp Ala Asn Ile
885 890 895
His Gly His Thr Glu Ser Met Ile Ser Ala Glu Leu
900 905
<210> 145
<211> 520
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 人类ROR1同种型2
<400> 145
Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser
1 5 10 15
Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp
20 25 30
Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu
35 40 45
His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys
50 55 60
Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser
100 105 110
Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser
115 120 125
Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr
130 135 140
Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala
165 170 175
Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln
180 185 190
Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu
195 200 205
Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu
210 215 220
Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser
225 230 235 240
Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile
260 265 270
Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr
275 280 285
Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln
290 295 300
Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala
305 310 315 320
Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro
325 330 335
Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe
340 345 350
Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys
355 360 365
Glu Lys Asn Lys Met Glu Ile Leu Tyr Ile Leu Val Pro Ser Val Ala
370 375 380
Ile Pro Leu Ala Ile Ala Leu Leu Phe Phe Phe Ile Cys Val Cys Arg
385 390 395 400
Asn Asn Gln Lys Ser Ser Ser Ala Pro Val Gln Arg Gln Pro Lys His
405 410 415
Val Arg Gly Gln Asn Val Glu Met Ser Met Leu Asn Ala Tyr Lys Pro
420 425 430
Lys Ser Lys Ala Lys Glu Leu Pro Leu Ser Ala Val Arg Phe Met Glu
435 440 445
Glu Leu Gly Glu Cys Ala Phe Gly Lys Ile Tyr Lys Gly His Leu Tyr
450 455 460
Leu Pro Gly Met Asp His Ala Gln Leu Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys
465 470 475 480
Asp Tyr Asn Asn Pro Gln Gln Trp Thr Glu Phe Gln Gln Glu Ala Ser
485 490 495
Leu Met Ala Glu Leu His His Pro Asn Ile Val Cys Leu Leu Gly Ala
500 505 510
Val Thr Gln Glu Gln Pro Val Cys
515 520
<210> 146
<211> 364
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 人类ROR1同种型3
<400> 146
Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser
1 5 10 15
Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp
20 25 30
Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu
35 40 45
His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys
50 55 60
Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser
100 105 110
Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser
115 120 125
Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr
130 135 140
Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala
165 170 175
Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln
180 185 190
Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu
195 200 205
Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu
210 215 220
Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser
225 230 235 240
Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile
260 265 270
Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr
275 280 285
Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln
290 295 300
Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala
305 310 315 320
Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro
325 330 335
Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe
340 345 350
Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Gly Lys
355 360
<210> 147
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 147
atgttttggg tgctggtcgt ggtcggaggg gtgctggcct gttacagcct gctggtgaca 60
gtcgctttca tcatcttctg ggtg 84
<210> 148
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜结构域(O/SSE)
<400> 148
atgttctggg tgctcgtggt cgttggcgga gtgctggcct gttacagcct gctggttacc 60
gtggccttca tcatcttttg ggtc 84
<210> 149
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 149
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 150
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-ζ源性细胞内信号传导结构域 (O/SSE)
<400> 150
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgct ccagcctatc agcagggcca aaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg gagaagagaa gagtacgacg tgctggataa gcggagaggc 120
agagatcctg aaatgggcgg caagcccaga cggaagaatc ctcaagaggg cctgtataat 180
gagctgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgc 240
agaagaggca agggacacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300
tatgacgcac tgcacatgca ggccctgcca cctaga 336
<210> 151
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的EGFR (tEGFR)序列
<400> 151
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600
cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660
ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720
aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780
acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840
gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900
gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960
ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020
ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074
<210> 152
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的EGFR (tEGFR)序列(O/SSE)
<400> 152
atgctgctcc tcgtgacaag cctgctcctg tgtgaactcc ctcatccagc ttttctgctc 60
attcctcgga aagtgtgcaa cggcatcggc atcggagagt tcaaggacag cctgagcatc 120
aatgccacca acatcaagca cttcaagaat tgcaccagca tcagcggcga cctgcacatt 180
ctgcctgtgg cctttagagg cgacagcttc acccacacac ctccactgga tccccaagag 240
ctggatatcc tgaaaaccgt gaaagagatt accggattcc tcctgatcca agcctggcca 300
gagaacagaa ccgatctgca cgccttcgag aacctcgaga tcatcagagg ccggaccaaa 360
cagcacggcc agtttagcct ggctgtggtg tctctgaaca tcaccagtct gggcctgaga 420
agcctgaaag aaatctccga cggcgacgtg atcatctccg gaaacaagaa cctgtgctac 480
gccaacacca tcaactggaa gaagctgttc ggcacctccg gccagaaaac aaagatcatc 540
tctaaccggg gcgagaacag ctgcaaggcc accggacaag tttgtcacgc cctgtgtagc 600
cctgaaggct gttggggacc cgaacctaga gactgtgtgt cctgccggaa tgtgtcccgg 660
ggcagagaat gtgtggataa gtgcaacctg ctggaaggcg agccccgcga gtttgtggaa 720
aacagcgagt gcatccagtg tcaccccgag tgtctgcccc aggccatgaa cattacatgc 780
accggcagag gccccgacaa ctgtattcag tgcgcccact acatcgacgg ccctcactgc 840
gtgaaaacat gtccagctgg cgtgatggga gagaacaaca ccctcgtgtg gaagtatgcc 900
gacgccggac atgtgtgcca cctgtgtcac cctaattgca cctacggctg taccggacct 960
ggcctggaag gatgccctac aaacggccct aagatcccca gcattgccac cggaatggtt 1020
ggagccctgc tgcttctgtt ggtggtggcc ctcggaatcg gcctgttcat gtga 1074
<210> 153
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的EGFR (tEGFR)序列
<400> 153
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 154
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB细胞内共信号传导序列
<400> 154
aagcggggga gaaagaaact gctgtatatt ttcaaacagc cctttatgag acctgtgcag 60
actacccagg aggaagacgg atgcagctgt aggtttcccg aggaagagga aggaggctgt 120
gagctg 126
<210> 155
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB细胞内共信号传导序列(O/SSE)
<400> 155
aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 120
gagctg 126
<210> 156
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 156
caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc ctagcgaaac actgagcctg 60
acctgtaccg tgtctggcgg cagcatctcc aactactact ggtcctggat cagacagcct 120
gccggcaaag gcctggaatg gatcggcaga atctacacca gcggcagcac caactacaac 180
cccagcctga agtccagagt gaccatgagc gtggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
aagctgagca gcctgacagc cgccgatacc gccatctact actgtgcccg gtactacgat 300
atcctgaccg gcttcttcga ctactggggc cagggaacac tggtcacagt ttctagcgga 360
ggcggaggat ctggtggcgg aggaagtggc ggaggcggtt ctgtgatttg gatgacacag 420
agccctagcc tgctgagcgc cagcacaggc gatagcgtga ccatcagctg cagaatgagc 480
caggacatca gcagctacct ggcttggtat cagcagaagc ctggcaaggc ccctgaactg 540
ctgatctatg ccgcttccag tctgcagagc ggcgtgccat ctagattttc cggcagcggc 600
tctggcaccg acttcaccct gacaatcagc tccctgcagt ccgaggactt cgccacctac 660
tattgccagc agtacgacag cttccctcca acctttggcc agggcaccaa ggtggaattc 720
aagcgcgagt ctaaatacgg accgccttgt cctccttgtc ccatgttctg ggtgctcgtg 780
gtcgttggcg gagtgctggc ctgttacagc ctgctggtta ccgtggcctt catcatcttt 840
tgggtcaagc ggggcagaaa gaagctgctc tacatcttca agcagccctt catgcggccc 900
gtgcagacca cacaagagga agatggctgc tcctgcagat tccccgagga agaagaaggc 960
ggctgcgagc tgagagtgaa gttcagcaga tccgccgacg ctccagccta tcagcagggc 1020
caaaaccagc tgtacaacga gctgaacctg gggagaagag aagagtacga cgtgctggat 1080
aagcggagag gcagagatcc tgaaatgggc ggcaagccca gacggaagaa tcctcaagag 1140
ggcctgtata atgagctgca gaaagacaag atggccgagg cctacagcga gatcggaatg 1200
aagggcgagc gcagaagagg caagggacac gatggactgt accagggcct gagcaccgcc 1260
accaaggata cctatgacgc actgcacatg caggccctgc cacctaga 1308
<210> 157
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 157
cagctccagc tgcaagaatc tggacctggc ctggtcaagc ccagcgagac actgtctctg 60
acctgtacag tgtccggcgg cagcatcaat agcaccacaa gctactgggc ctggatcaga 120
cagcctcctg gcaaaggcct ggaatggatc ggcaccatct tctacagcgg caagacctac 180
aacaacccca gcctgaagtc cagagtgacc atgagcgtgg acaccagcaa gaaccacttc 240
agcctgaaag tgaacagcgt gacagccgcc gataccgccg tgtactactg cgccagattc 300
gactacggct tccacgacgc cttcgacatc tggggccagg gcacaatggt cacagtttct 360
agcggaggcg gaggatctgg tggcggagga agtggcggag gcggttctga gattgtgatg 420
acacagagcc ccgccactct gagccttagt cctggcgaaa gagccacact gagctgcaga 480
gccagccaga gcatcaccag cgattacctg agctggtatc agcagaagcc cggacaggct 540
cccagactgc tgatctatgg cgcctctaca agagccaccg gcattcccgc ccgcttttct 600
ggctctggaa gcggcaccga cttcaccctg accatatcta gcctgcagcc tgaggacttc 660
gtggtgtact attgccagca ggactacaac ctgtacacct tcggccaggg gaccaagctg 720
gaaatcaaga gagagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccat gttctgggtg 780
ctcgtggtcg ttggcggagt gctggcctgt tacagcctgc tggttaccgt ggccttcatc 840
atcttttggg tcaagcgggg cagaaagaag ctgctctaca tcttcaagca gcccttcatg 900
cggcccgtgc agaccacaca agaggaagat ggctgctcct gcagattccc cgaggaagaa 960
gaaggcggct gcgagctgag agtgaagttc agcagatccg ccgacgctcc agcctatcag 1020
cagggccaaa accagctgta caacgagctg aacctgggga gaagagaaga gtacgacgtg 1080
ctggataagc ggagaggcag agatcctgaa atgggcggca agcccagacg gaagaatcct 1140
caagagggcc tgtataatga gctgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1200
ggaatgaagg gcgagcgcag aagaggcaag ggacacgatg gactgtacca gggcctgagc 1260
accgccacca aggataccta tgacgcactg cacatgcagg ccctgccacc taga 1314
<210> 158
<211> 1629
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 158
caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc ctagcgaaac actgagcctg 60
acctgtaccg tgtctggcgg cagcatctcc aactactact ggtcctggat cagacagcct 120
gccggcaaag gcctggaatg gatcggcaga atctacacca gcggcagcac caactacaac 180
cccagcctga agtccagagt gaccatgagc gtggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
aagctgagca gcctgacagc cgccgatacc gccatctact actgtgcccg gtactacgat 300
atcctgaccg gcttcttcga ctactggggc cagggaacac tggtcacagt ttctagcgga 360
ggcggaggat ctggtggcgg aggaagtggc ggaggcggtt ctgtgatttg gatgacacag 420
agccctagcc tgctgagcgc cagcacaggc gatagcgtga ccatcagctg cagaatgagc 480
caggacatca gcagctacct ggcttggtat cagcagaagc ctggcaaggc ccctgaactg 540
ctgatctatg ccgcttccag tctgcagagc ggcgtgccat ctagattttc cggcagcggc 600
tctggcaccg acttcaccct gacaatcagc tccctgcagt ccgaggactt cgccacctac 660
tattgccagc agtacgacag cttccctcca acctttggcc agggcaccaa ggtggaattc 720
aagcgcgagt ctaaatacgg accgccttgt cctccttgtc ccggccagcc aagagagccc 780
caggtttaca cactgcctcc aagccaagag gaaatgacca agaatcaggt gtccctgaca 840
tgcctggtca agggcttcta cccctccgat atcgccgtgg aatgggagag caatggccag 900
cctgagaaca actacaagac cacacctcct gtgctggaca gcgacggcag tttcttcctg 960
tatagtagac tcaccgtgga taaatcaaga tggcaagagg gcaacgtgtt cagctgcagc 1020
gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaaa gcctgagcct gtctctgggc 1080
aagatgttct gggtgctcgt ggtcgttggc ggagtgctgg cctgttacag cctgctggtt 1140
accgtggcct tcatcatctt ttgggtcaag cggggcagaa agaagctgct ctacatcttc 1200
aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagacc acacaagagg aagatggctg ctcctgcaga 1260
ttccccgagg aagaagaagg cggctgcgag ctgagagtga agttcagcag atccgccgac 1320
gctccagcct atcagcaggg ccaaaaccag ctgtacaacg agctgaacct ggggagaaga 1380
gaagagtacg acgtgctgga taagcggaga ggcagagatc ctgaaatggg cggcaagccc 1440
agacggaaga atcctcaaga gggcctgtat aatgagctgc agaaagacaa gatggccgag 1500
gcctacagcg agatcggaat gaagggcgag cgcagaagag gcaagggaca cgatggactg 1560
taccagggcc tgagcaccgc caccaaggat acctatgacg cactgcacat gcaggccctg 1620
ccacctaga 1629
<210> 159
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 159
caggtgcagc tggttcaatc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacggca tcagctgggt ccgacaggct 120
cctggacaag gcttggaatg gatgggctgg atcagcgcct acaacggcaa caccaaatac 180
gcccagaaac tgcagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcacaag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag atccgatgac accgccgtgt actactgcgc cagagatgag 300
gacatcctga ccggctacaa ctactacggc atggacgtgt ggggccaggg cacaacagtg 360
acagtttctt ctggcggcgg aggatctggc ggaggtggaa gcggaggcgg tggatctcaa 420
ctggtgctga cacagtctcc tagcgcctct gcttctctgg gagccagcgt gaagctgacc 480
tgtacactgt ctagcggcca cagcagctac gccattgctt ggcatcagca gcagcccgag 540
aagggcccta gatacctgat gaagctgaac agcgacggca gccactctaa aggcgacggc 600
atccccgata gattcagcgg cagttctagc ggagccgagc gctacctgac aatcagctct 660
ctgcaatccg aggacgaggc cgactactac tgtcagacat ggggcaccgg catcagagtg 720
tttggcggag gcaccaagct gacagtgctt ggagagtcta aatacggacc gccttgtcct 780
ccttgtcccg gccagccaag agagccccag gtttacacac tgcctccaag ccaagaggaa 840
atgaccaaga atcaggtgtc cctgacatgc ctggtcaagg gcttctaccc ctccgatatc 900
gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagaccac acctcctgtg 960
ctggacagcg acggcagttt cttcctgtat agtagactca ccgtggataa atcaagatgg 1020
caagagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1080
cagaaaagcc tgagcctgtc tctgggcaag atgttctggg tgctcgtggt cgttggcgga 1140
gtgctggcct gttacagcct gctggttacc gtggccttca tcatcttttg ggtcaagcgg 1200
ggcagaaaga agctgctcta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccaca 1260
caagaggaag atggctgctc ctgcagattc cccgaggaag aagaaggcgg ctgcgagctg 1320
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgct ccagcctatc agcagggcca aaaccagctg 1380
tacaacgagc tgaacctggg gagaagagaa gagtacgacg tgctggataa gcggagaggc 1440
agagatcctg aaatgggcgg caagcccaga cggaagaatc ctcaagaggg cctgtataat 1500
gagctgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgc 1560
agaagaggca agggacacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 1620
tatgacgcac tgcacatgca ggccctgcca cctaga 1656
<210> 160
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 160
cagctccagc tgcaagaatc tggacctggc ctggtcaagc ccagcgagac actgtctctg 60
acctgtacag tgtccggcgg cagcatcaat agcaccacaa gctactgggc ctggatcaga 120
cagcctcctg gcaaaggcct ggaatggatc ggcaccatct tctacagcgg caagacctac 180
aacaacccca gcctgaagtc cagagtgacc atgagcgtgg acaccagcaa gaaccacttc 240
agcctgaaag tgaacagcgt gacagccgcc gataccgccg tgtactactg cgccagattc 300
gactacggct tccacgacgc cttcgacatc tggggccagg gcacaatggt cacagtttct 360
agcggaggcg gaggatctgg tggcggagga agtggcggag gcggttctga gattgtgatg 420
acacagagcc ccgccactct gagccttagt cctggcgaaa gagccacact gagctgcaga 480
gccagccaga gcatcaccag cgattacctg agctggtatc agcagaagcc cggacaggct 540
cccagactgc tgatctatgg cgcctctaca agagccaccg gcattcccgc ccgcttttct 600
ggctctggaa gcggcaccga cttcaccctg accatatcta gcctgcagcc tgaggacttc 660
gtggtgtact attgccagca ggactacaac ctgtacacct tcggccaggg gaccaagctg 720
gaaatcaaga gagagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgg ccagccaaga 780
gagccccagg tttacacact gcctccaagc caagaggaaa tgaccaagaa tcaggtgtcc 840
ctgacatgcc tggtcaaggg cttctacccc tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaat 900
ggccagcctg agaacaacta caagaccaca cctcctgtgc tggacagcga cggcagtttc 960
ttcctgtata gtagactcac cgtggataaa tcaagatggc aagagggcaa cgtgttcagc 1020
tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaaaagcct gagcctgtct 1080
ctgggcaaga tgttctgggt gctcgtggtc gttggcggag tgctggcctg ttacagcctg 1140
ctggttaccg tggccttcat catcttttgg gtcaagcggg gcagaaagaa gctgctctac 1200
atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg cagaccacac aagaggaaga tggctgctcc 1260
tgcagattcc ccgaggaaga agaaggcggc tgcgagctga gagtgaagtt cagcagatcc 1320
gccgacgctc cagcctatca gcagggccaa aaccagctgt acaacgagct gaacctgggg 1380
agaagagaag agtacgacgt gctggataag cggagaggca gagatcctga aatgggcggc 1440
aagcccagac ggaagaatcc tcaagagggc ctgtataatg agctgcagaa agacaagatg 1500
gccgaggcct acagcgagat cggaatgaag ggcgagcgca gaagaggcaa gggacacgat 1560
ggactgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct atgacgcact gcacatgcag 1620
gccctgccac ctaga 1635
<210> 161
<211> 1656
<212> DNA
<213> 抗ROR1 CAR
<400> 161
caggttcagc tgcttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacggca tcagctgggt ccgacaggct 120
cctggacaag gcttggaatg gatgggctgg atcagcgcct acaccggcaa taccagatac 180
gcccagaaac tgcagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcacaag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag atccgatgac accgccgtgt actactgcgc cagagaagaa 300
ggcgccacca ccgactacga ctactacggc atggatgtgt ggggccaggg aacagccgtg 360
acagtttctt ctggtggcgg aggatctggc ggaggtggaa gcggcggagg cggatctcaa 420
ctggttctga cacagagccc aagcgcctct gcatctctgg gagcttccgt gaagctgacc 480
tgcacactgt ctagcggcca cagcagctat gccattgcct ggcatcagca acagcccgag 540
aagggcccta gatacctgat gaagctgaac agcgacggca gccactctaa aggcgacggc 600
atccccgata gattcagcgg cagttctagc ggagccgagc gctacctgac aatcagctct 660
ctgcaatccg aggacgaggc cgattactac tgtcagacat ggggcaccgg catcagagtg 720
tttggcggcg gaacaaagct gaccgtgctg ggcgagtcta aatacggacc gccttgtcct 780
ccttgtcccg gccagccaag agagccccag gtttacacac tgcctccaag ccaagaggaa 840
atgaccaaga atcaggtgtc cctgacatgc ctggtcaagg gcttctaccc ctccgatatc 900
gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagaccac acctcctgtg 960
ctggacagcg acggcagttt cttcctgtat agtagactca ccgtggataa atcaagatgg 1020
caagagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1080
cagaaaagcc tgagcctgtc tctgggcaag atgttctggg tgctcgtggt cgttggcgga 1140
gtgctggcct gttacagcct gctggttacc gtggccttca tcatcttttg ggtcaagcgg 1200
ggcagaaaga agctgctcta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccaca 1260
caagaggaag atggctgctc ctgcagattc cccgaggaag aagaaggcgg ctgcgagctg 1320
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgct ccagcctatc agcagggcca aaaccagctg 1380
tacaacgagc tgaacctggg gagaagagaa gagtacgacg tgctggataa gcggagaggc 1440
agagatcctg aaatgggcgg caagcccaga cggaagaatc ctcaagaggg cctgtataat 1500
gagctgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgc 1560
agaagaggca agggacacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 1620
tatgacgcac tgcacatgca ggccctgcca cctaga 1656
<210> 162
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 162
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 163
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 163
Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 164
<211> 544
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF1α启动子及HTLV1增强子
<400> 164
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540
ctac 544
<210> 165
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控组件(WPRE)
<400> 165
atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60
cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120
tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180
ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240
gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300
ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360
tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420
cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480
atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540
gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc 588
<210> 166
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A肽
<400> 166
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 167
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A肽
<400> 167
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 168
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A肽
<400> 168
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 169
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A肽
<400> 169
ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60
cccggcccta gg 72
<210> 170
<211> 3358
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 人类ROR1 GenBank: M97675.1
<400> 170
gagctggagc agccgccacc gccgccgccg agggagcccc gggacggcag cccctgggcg 60
cagggtgcgc tgttctcgga gtccgaccca gggcgactca cgcccactgg tgcgacccgg 120
acagcctggg actgacccgc cggcccaggc gaggctgcag ccagagggct gggaagggat 180
cgcgctcgcg gcatccagag gcggccaggc ggaggcgagg gagcaggtta gagggacaaa 240
gagctttgca gacgtccccg gcgtcctgcg agcgccagcg gccgggacga ggcggccggg 300
agcccgggaa gagcccgtgg atgttctgcg cgcggcctgg gagccgccgc cgccgccgcc 360
tcagcgagag gaggaatgca ccggccgcgc cgccgcggga cgcgcccgcc gctcctggcg 420
ctgctggccg cgctgctgct ggccgcacgc ggggctgctg cccaagaaac agagctgtca 480
gtcagtgctg aattagtgcc tacctcatca tggaacatct caagtgaact caacaaagat 540
tcttacctga cccttgatga accaatgaat aacatcacca cgtctctggg ccagacagca 600
gaactgcact gcaaagtctc tgggaatcca cctcccacca tccgctggtt caaaaatgat 660
gctcctgtgg tccaggagcc ccggaggctc tcctttcggt ccaccatcta tggctctcgg 720
ctgcggatta gaaacctcga caccacagac acaggctact tccagtgcgt ggcaacaaac 780
ggcaaggagg tggtttcttc cactggagtc ttgtttgtca agtttggccc ccctcccact 840
gcaagtccag gatactcaga tgagtatgaa gaagatggat tctgtcagcc atacagaggg 900
attgcatgtg caagatttat tggcaaccgc accgtctata tggagtcttt gcacatgcaa 960
ggggaaatag aaaatcagat cacagctgcc ttcactatga ttggcacttc cagtcactta 1020
tctgataagt gttctcagtt cgccattcct tccctgtgcc actatgcctt cccgtactgc 1080
gatgaaactt catccgtccc aaagccccgt gacttgtgtc gcgatgaatg tgaaatcctg 1140
gagaatgtcc tgtgtcaaac agagtacatt tttgcaagat caaatcccat gattctgatg 1200
aggctgaaac tgccaaactg tgaagatctc ccccagccag agagcccaga agctgcgaac 1260
tgtatccgga ttggaattcc catggcagat cctataaata aaaatcacaa gtgttataac 1320
agcacaggtg tggactaccg ggggaccgtc agtgtgacca aatcagggcg ccagtgccag 1380
ccatggaatt cccagtatcc ccacacacac actttcaccg cccttcgttt cccagagctg 1440
aatggaggcc attcctactg ccgcaaccca gggaatcaaa aggaagctcc ctggtgcttc 1500
accttggatg aaaactttaa gtctgatctg tgtgacatcc cagcttgcga ttcaaaggat 1560
tccaaggaga agaataaaat ggaaatcctg tacatactag tgccaagtgt ggccattccc 1620
ctggccattg ctttactctt cttcttcatt tgcgtctgtc ggaataacca gaagtcatcg 1680
tcggcaccag tccagaggca accaaaacac gtcagaggtc aaaatgtgga gatgtcaatg 1740
ctgaatgcat ataaacccaa gagcaaggct aaagagctac ctctttctgc tgtacgcttt 1800
atggaagaat tgggtgagtg tgcctttgga aaaatctata aaggccatct ctatctccca 1860
ggcatggacc atgctcagct ggttgctatc aagaccttga aagactataa caacccccag 1920
caatggatgg aatttcaaca agaagcctcc ctaatggcag aactgcacca ccccaatatt 1980
gtctgccttc taggtgccgt cactcaggaa caacctgtgt gcatgctttt tgagtatatt 2040
aatcaggggg atctccatga gttcctcatc atgagatccc cacactctga tgttggctgc 2100
agcagtgatg aagatgggac tgtgaaatcc agcctggacc acggagattt tctgcacatt 2160
gcaattcaga ttgcagctgg catggaatac ctgtctagtc acttctttgt ccacaaggac 2220
cttgcagctc gcaatatttt aatcggagag caacttcatg taaagatttc agacttgggg 2280
ctttccagag aaatttactc cgctgattac tacagggtcc agagtaagtc cttgctgccc 2340
attcgctgga tgccccctga agccatcatg tatggcaaat tctcttctga ttcagatatc 2400
tggtcctttg gggttgtctt gtgggagatt ttcagttttg gactccagcc atattatgga 2460
ttcagtaacc aggaagtgat tgagatggtg agaaaacggc agctcttacc atgctctgaa 2520
gactgcccac ccagaatgta cagcctcatg acagagtgct ggaatgagat tccttctagg 2580
agaccaagat ttaaagatat tcacgtccgg cttcggtcct gggagggact ctcaagtcac 2640
acaagctcta ctactccttc agggggaaat gccaccacac agacaacctc cctcagtgcc 2700
agcccagtga gtaatctcag taaccccaga tatcctaatt acatgttccc gagccagggt 2760
attacaccac agggccagat tgctggtttc attggcccgc caatacctca gaaccagcga 2820
ttcattccca tcaatggata cccaatacct cctggatatg cagcgtttcc agctgcccac 2880
taccagccaa caggtcctcc cagagtgatt cagcactgcc cacctcccaa gagtcggtcc 2940
ccaagcagtg ccagtgggtc gactagcact ggccatgtga ctagcttgcc ctcatcagga 3000
tccaatcagg aagcaaatat tcctttacta ccacacatgt caattccaaa tcatcctggt 3060
ggaatgggta tcaccgtttt tggcaacaaa tctcaaaaac cctacaaaat tgactcaaag 3120
caagcatctt tactaggaga cgccaatatt catggacaca ccgaatctat gatttctgca 3180
gaactgtaaa atgcacaact tttgtaaatg tggtatacag gacaaactag acggccgtag 3240
aaaagattta tattcaaatg tttttattaa agtaaggttc tcatttagca gacatcgcaa 3300
caagtacctt ctgtgaagtt tcactgtgtc ttaccaagca ggacagacac tcggccag 3358
<210> 171
<211> 908
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 小鼠ROR1; GenBank No. NP_038873
<400> 171
Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser
1 5 10 15
Trp Asn Thr Ser Ser Glu Ile Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Thr Leu Asp
20 25 30
Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu
35 40 45
His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Ser Ile Arg Trp Phe Lys
50 55 60
Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Ile Ser Phe Arg Ala
65 70 75 80
Thr Asn Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Lys Val Val Ser
100 105 110
Thr Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser
115 120 125
Pro Gly Ser Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr
130 135 140
Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala
165 170 175
Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln
180 185 190
Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu
195 200 205
Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu
210 215 220
Val Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser
225 230 235 240
Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile
260 265 270
Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr
275 280 285
Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln
290 295 300
Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Ser Phe Thr Ala
305 310 315 320
Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro
325 330 335
Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe
340 345 350
Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys
355 360 365
Glu Lys Asn Lys Met Glu Ile Leu Tyr Ile Leu Val Pro Ser Val Ala
370 375 380
Ile Pro Leu Ala Ile Ala Phe Leu Phe Phe Phe Ile Cys Val Cys Arg
385 390 395 400
Asn Asn Gln Lys Ser Ser Ser Pro Pro Val Gln Arg Gln Pro Lys Pro
405 410 415
Val Arg Gly Gln Asn Val Glu Met Ser Met Leu Asn Ala Tyr Lys Pro
420 425 430
Lys Ser Lys Ala Lys Glu Leu Pro Leu Ser Ala Val Arg Phe Met Glu
435 440 445
Glu Leu Gly Glu Cys Thr Phe Gly Lys Ile Tyr Lys Gly His Leu Tyr
450 455 460
Leu Pro Gly Met Asp His Ala Gln Leu Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys
465 470 475 480
Asp Tyr Asn Asn Pro Gln Gln Trp Thr Glu Phe Gln Gln Glu Ala Ser
485 490 495
Leu Met Ala Glu Leu His His Pro Asn Ile Val Cys Leu Leu Gly Ala
500 505 510
Val Thr Gln Glu Gln Pro Val Cys Met Leu Phe Glu Tyr Met Asn Gln
515 520 525
Gly Asp Leu His Glu Phe Leu Ile Met Arg Ser Pro His Ser Asp Val
530 535 540
Gly Cys Ser Ser Asp Glu Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Leu Asp His
545 550 555 560
Gly Asp Phe Leu His Ile Ala Ile Gln Ile Ala Ala Gly Met Glu Tyr
565 570 575
Leu Ser Ser His Phe Phe Val His Lys Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile
580 585 590
Leu Ile Gly Glu Gln Leu His Val Lys Ile Ser Asp Leu Gly Leu Ser
595 600 605
Arg Glu Ile Tyr Ser Ala Asp Tyr Tyr Arg Val Gln Ser Lys Ser Ser
610 615 620
Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ala Ile Met Tyr Gly Lys Phe
625 630 635 640
Ser Ser Asp Ser Asp Ile Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile
645 650 655
Phe Ser Phe Gly Leu Gln Pro Tyr Tyr Gly Phe Ser Asn Gln Glu Val
660 665 670
Ile Glu Met Val Arg Lys Arg Gln Leu Leu Pro Cys Ser Glu Asp Cys
675 680 685
Pro Pro Arg Met Tyr Ser Leu Met Thr Glu Cys Trp Asn Glu Ile Pro
690 695 700
Ser Arg Arg Pro Arg Phe Lys Asp Ile His Val Arg Leu Arg Ser Trp
705 710 715 720
Glu Gly Leu Ser Ser His Thr Ser Ser Thr Thr Pro Ser Gly Gly Asn
725 730 735
Ala Thr Thr Gln Thr Thr Ser Leu Ser Ala Ser Pro Val Ser Asn Leu
740 745 750
Ser Asn Pro Arg Phe Pro Asn Tyr Met Phe Pro Ser Gln Gly Ile Thr
755 760 765
Pro Gln Gly Gln Ile Ala Gly Phe Ile Gly Pro Ala Ile Pro Gln Asn
770 775 780
Gln Arg Phe Ile Pro Ile Asn Gly Tyr Pro Ile Pro Pro Gly Tyr Ala
785 790 795 800
Ala Phe Pro Ala Ala His Tyr Gln Pro Ala Gly Pro Pro Arg Val Ile
805 810 815
Gln His Cys Pro Pro Pro Lys Ser Arg Ser Pro Ser Ser Ala Ser Gly
820 825 830
Ser Thr Ser Thr Gly His Val Ala Ser Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn
835 840 845
Gln Glu Ala Asn Val Pro Leu Leu Pro His Met Ser Ile Pro Asn His
850 855 860
Pro Gly Gly Met Gly Ile Thr Val Phe Gly Asn Lys Ser Gln Lys Pro
865 870 875 880
Tyr Lys Ile Asp Ser Lys Gln Ser Ser Leu Leu Gly Asp Ser His Ile
885 890 895
His Gly His Thr Glu Ser Met Ile Ser Ala Glu Val
900 905
<210> 172
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A2 VH
<400> 172
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Ile Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 173
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A2 VL
<400> 173
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ile Met Ser Thr Thr Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 174
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 99961人源化VH
<400> 174
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Phe Asp Pro Tyr Asp Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val
65 70 75 80
Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 175
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 99961人源化VH
<400> 175
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Phe Asp Pro Tyr Asp Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val
65 70 75 80
Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 99961人源化VH
<400> 176
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Phe Asp Pro Tyr Asp Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val
65 70 75 80
Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 177
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 99961人源化VH
<400> 177
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Phe Asp Pro Tyr Asp Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val
65 70 75 80
Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 178
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 99961人源化VL
<400> 178
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln His Asp Glu Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 179
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 99961人源化VL
<400> 179
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln His Asp Glu Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 180
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 99961人源化VL
<400> 180
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln His Asp Glu Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 181
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 99961人源化VL
<400> 181
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln His Asp Glu Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 182
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-ζ源性细胞内信号传导结构域
<400> 182
agagtcaagt tttccaggtc cgccgacgct ccagcctacc agcaggggca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120
cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336
<210> 183
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28胞内结构域
<400> 183
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 184
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 184
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser
145 150 155 160
Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Phe
225 230 235 240
Lys Arg Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe
245 250 255
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
260 265 270
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys
275 280 285
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
290 295 300
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
305 310 315 320
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
325 330 335
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
340 345 350
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
355 360 365
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
385 390 395 400
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
405 410 415
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
420 425 430
Leu Pro Pro Arg
435
<210> 185
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 185
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Thr
20 25 30
Thr Ser Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Lys Thr Tyr Asn Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Phe His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala
180 185 190
Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
260 265 270
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg
275 280 285
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
290 295 300
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
305 310 315 320
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
325 330 335
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
340 345 350
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
355 360 365
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
370 375 380
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
385 390 395 400
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
405 410 415
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
420 425 430
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435
<210> 186
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 186
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser
145 150 155 160
Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Phe
225 230 235 240
Lys Arg Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln
245 250 255
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
260 265 270
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
275 280 285
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
290 295 300
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
325 330 335
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
340 345 350
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val
355 360 365
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
370 375 380
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
385 390 395 400
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
405 410 415
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
420 425 430
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
435 440 445
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
450 455 460
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
465 470 475 480
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
485 490 495
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
500 505 510
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
515 520 525
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535 540
<210> 187
<211> 552
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 187
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Glu Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr
145 150 155 160
Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Ser Tyr Ala Ile Ala Trp His Gln
165 170 175
Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Asn Ser Asp
180 185 190
Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Gly Thr Gly Ile Arg Val
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu Ser Lys Tyr Gly
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
260 265 270
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
275 280 285
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
290 295 300
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
305 310 315 320
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
325 330 335
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
355 360 365
Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
370 375 380
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg
385 390 395 400
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
405 410 415
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
420 425 430
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
435 440 445
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
450 455 460
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
465 470 475 480
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
485 490 495
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
500 505 510
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
515 520 525
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
530 535 540
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550
<210> 188
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 188
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Thr
20 25 30
Thr Ser Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Lys Thr Tyr Asn Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Phe His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala
180 185 190
Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
260 265 270
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
275 280 285
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
290 295 300
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
305 310 315 320
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
325 330 335
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
340 345 350
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu
355 360 365
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
370 375 380
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
385 390 395 400
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
405 410 415
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
420 425 430
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
435 440 445
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
450 455 460
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
465 470 475 480
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
485 490 495
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
500 505 510
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
515 520 525
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
530 535 540
Arg
545
<210> 189
<211> 552
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗ROR1 CAR
<400> 189
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Thr Gly Asn Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Gly Ala Thr Thr Asp Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr
145 150 155 160
Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Ser Tyr Ala Ile Ala Trp His Gln
165 170 175
Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Asn Ser Asp
180 185 190
Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Gly Thr Gly Ile Arg Val
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu Ser Lys Tyr Gly
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
260 265 270
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
275 280 285
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
290 295 300
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
305 310 315 320
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
325 330 335
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
355 360 365
Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
370 375 380
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg
385 390 395 400
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
405 410 415
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
420 425 430
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
435 440 445
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
450 455 460
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
465 470 475 480
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
485 490 495
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
500 505 510
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
515 520 525
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
530 535 540
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550
<210> 190
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33信号序列 (O/SSE)
<400> 190
atgcctctgc tgctgcttct gcctcttctt tgggctggtg ctctggct 48
<210> 191
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33信号序列 GenBank: M23197.1
<400> 191
atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ccctggct 48
<210> 192
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 192
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctatg 39
<210> 193
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3 间隔子
<400> 193
gaatctaagt acggaccgcc ttgtcctcca tgtcctggcc agccaagaga accccaggtg 60
tacacactgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 120
gtcaagggct tctacccttc cgatatcgcc gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag 180
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc 240
cggctgaccg tggacaagag cagatggcaa gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg 300
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagtctctga gcctgagcct gggcaag 357
<210> 194
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4/IgG2铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3 间隔子
<400> 194
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Met
225
<210> 195
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4/IgG2铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3 间隔子
<400> 195
gaatctaagt acggaccgcc ctgccctccc tgccctgctc ctcctgtggc tggaccaagc 60
gtgttcctgt ttccacctaa gcctaaagat accctgatga tttcccgcac acctgaagtg 120
acttgcgtgg tcgtggacgt gagccaggag gatccagaag tgcagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aagtccacaa tgctaagact aaaccccgag aggaacagtt tcagtcaact 240
taccgggtcg tgagcgtgct gaccgtcctg catcaggatt ggctgaacgg gaaggagtat 300
aagtgcaaag tgtctaataa gggactgcct agctccatcg agaaaacaat tagtaaggca 360
aaagggcagc ctcgagaacc acaggtgtat accctgcccc ctagccagga ggaaatgacc 420
aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtc aaaggcttct atccaagtga catcgccgtg 480
gagtgggaat caaatgggca gcccgagaac aattacaaga ccacaccacc cgtgctggac 540
tctgatggaa gtttctttct gtattccagg ctgaccgtgg ataaatctcg ctggcaggag 600
ggcaacgtgt tctcttgcag tgtcatgcac gaagccctgc acaatcatta tacacagaag 660
tcactgagcc tgtccctggg caaaatg 687
<210> 196
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4/IgG2铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3 间隔子 O/SSE
<400> 196
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660
agcctgagcc tgtctctggg caagatg 687
<210> 197
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 197
ttttgggtgc tggtcgtggt cggaggggtg ctggcctgtt acagcctgct ggtgacagtc 60
gctttcatca tcttctgggt g 81
<210> 198
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜结构域 (O/SSE)
<400> 198
ttctgggtgc tcgtggtcgt tggcggagtg ctggcctgtt acagcctgct ggttaccgtg 60
gccttcatca tcttttgggt c 81
<210> 199
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基1
<400> 199
Phe Arg Ser Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu
1 5 10 15
<210> 200
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基2
<400> 200
Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser Trp
1 5 10
<210> 201
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基3
<400> 201
His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp
1 5 10
<210> 202
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基4
<400> 202
Trp Phe Lys Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser
1 5 10 15
Phe Arg Ser Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu
20 25
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基5
<400> 203
Val Ser Ser Thr Gly Val Leu Phe Val
1 5
<210> 204
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基6
<400> 204
Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser Pro
1 5 10
<210> 205
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基7
<400> 205
Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro
1 5 10
<210> 206
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基8
<400> 206
Gln Pro Tyr Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn
1 5 10
<210> 207
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基9
<400> 207
Ser Gln Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro
1 5 10
<210> 208
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基10
<400> 208
Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu Thr Ser Ser Val Pro
1 5 10
<210> 209
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基11
<400> 209
Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser Asn Pro Met
1 5 10 15
Ile Leu Met Arg
20
<210> 210
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基12
<400> 210
Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu Pro Gln Pro
1 5 10
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基13
<400> 211
Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile Pro
1 5 10 15
<210> 212
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基14
<400> 212
Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg
1 5 10
<210> 213
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基15
<400> 213
Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala Leu Arg Phe
1 5 10
<210> 214
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1抗原决定基16
<400> 214
Asp Ser Lys Glu Lys Asn Lys Met Glu Ile Leu Tyr Ile Leu Val
1 5 10 15
<210> 215
<211> 937
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> ROR1 (Uniprot Q01973)
<400> 215
Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ala Ala Gln Glu Thr
20 25 30
Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser Trp Asn Ile
35 40 45
Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Glu Pro Met
50 55 60
Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu His Cys Lys
65 70 75 80
Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys Asn Asp Ala
85 90 95
Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser Thr Ile Tyr
100 105 110
Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp Thr Gly Tyr
115 120 125
Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser Ser Thr Gly
130 135 140
Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser Pro Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr Arg Gly Ile
165 170 175
Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met Glu Ser Leu
180 185 190
His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala Phe Thr Met
195 200 205
Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln Phe Ala Ile
210 215 220
Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu Thr Ser Ser
225 230 235 240
Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu Ile Leu Glu
245 250 255
Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser Asn Pro Met
260 265 270
Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu Pro Gln Pro
275 280 285
Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile Pro Met Ala
290 295 300
Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr Gly Val Asp
305 310 315 320
Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln Cys Gln Pro
325 330 335
Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala Leu Arg Phe
340 345 350
Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro Gly Asn Gln
355 360 365
Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe Lys Ser Asp
370 375 380
Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys Glu Lys Asn
385 390 395 400
Lys Met Glu Ile Leu Tyr Ile Leu Val Pro Ser Val Ala Ile Pro Leu
405 410 415
Ala Ile Ala Leu Leu Phe Phe Phe Ile Cys Val Cys Arg Asn Asn Gln
420 425 430
Lys Ser Ser Ser Ala Pro Val Gln Arg Gln Pro Lys His Val Arg Gly
435 440 445
Gln Asn Val Glu Met Ser Met Leu Asn Ala Tyr Lys Pro Lys Ser Lys
450 455 460
Ala Lys Glu Leu Pro Leu Ser Ala Val Arg Phe Met Glu Glu Leu Gly
465 470 475 480
Glu Cys Ala Phe Gly Lys Ile Tyr Lys Gly His Leu Tyr Leu Pro Gly
485 490 495
Met Asp His Ala Gln Leu Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Asp Tyr Asn
500 505 510
Asn Pro Gln Gln Trp Thr Glu Phe Gln Gln Glu Ala Ser Leu Met Ala
515 520 525
Glu Leu His His Pro Asn Ile Val Cys Leu Leu Gly Ala Val Thr Gln
530 535 540
Glu Gln Pro Val Cys Met Leu Phe Glu Tyr Ile Asn Gln Gly Asp Leu
545 550 555 560
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Glu Leu
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<211> 937
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> ROR1 (Uniprot Q9Z139)
<400> 219
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690 695 700
Val Arg Lys Arg Gln Leu Leu Pro Cys Ser Glu Asp Cys Pro Pro Arg
705 710 715 720
Met Tyr Ser Leu Met Thr Glu Cys Trp Asn Glu Ile Pro Ser Arg Arg
725 730 735
Pro Arg Phe Lys Asp Ile His Val Arg Leu Arg Ser Trp Glu Gly Leu
740 745 750
Ser Ser His Thr Ser Ser Thr Thr Pro Ser Gly Gly Asn Ala Thr Thr
755 760 765
Gln Thr Thr Ser Leu Ser Ala Ser Pro Val Ser Asn Leu Ser Asn Pro
770 775 780
Arg Phe Pro Asn Tyr Met Phe Pro Ser Gln Gly Ile Thr Pro Gln Gly
785 790 795 800
Gln Ile Ala Gly Phe Ile Gly Pro Ala Ile Pro Gln Asn Gln Arg Phe
805 810 815
Ile Pro Ile Asn Gly Tyr Pro Ile Pro Pro Gly Tyr Ala Ala Phe Pro
820 825 830
Ala Ala His Tyr Gln Pro Ala Gly Pro Pro Arg Val Ile Gln His Cys
835 840 845
Pro Pro Pro Lys Ser Arg Ser Pro Ser Ser Ala Ser Gly Ser Thr Ser
850 855 860
Thr Gly His Val Ala Ser Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn Gln Glu Ala
865 870 875 880
Asn Val Pro Leu Leu Pro His Met Ser Ile Pro Asn His Pro Gly Gly
885 890 895
Met Gly Ile Thr Val Phe Gly Asn Lys Ser Gln Lys Pro Tyr Lys Ile
900 905 910
Asp Ser Lys Gln Ser Ser Leu Leu Gly Asp Ser His Ile His Gly His
915 920 925
Thr Glu Ser Met Ile Ser Ala Glu Val
930 935

Claims (146)

1.一种抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:112内所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包含SEQ ID NO:115内所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；
该VH区包含SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；
该VH区包含SEQ ID NO:103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或
该VH区包含SEQ ID NO:130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
2.如权利要求1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包含SEQ ID NO:112内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 115内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
3.如权利要求1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包含SEQ ID NO:121内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 124内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
4.如权利要求1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包含SEQ ID NO:103内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
5.如权利要求1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包含SEQ ID NO:130内所含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包含SEQ ID:NO 106内所含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
6.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)及重链互补决定区3(CDR-H3)，且该VL区包括含分别如SEQ IDNO:75、77及79中所示的序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)及轻链互补决定区3(CDR-L3)；
该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；
该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、56及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；或
该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、97及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
7.如权利要求1、2及6中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:67、71及73中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:75、77及79中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
8.如权利要求1、3及6中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:82、86及88中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:90、92及94中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
9.如权利要求1、4及6中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、56及58中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
10.如权利要求1、5及6中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区包括含分别如SEQ ID NO:52、97及99中所示的序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且该VL区包括含分别如SEQ ID NO:60、62及64中所示的序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
11.如权利要求1或权利要求6的抗ROR1抗体或其抗原结合片段：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
12.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：
该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；
该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
13.如权利要求1、2、6、7、11及12中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:112具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:115具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
14.如权利要求1、3、6、8、11及12中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:121具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:124具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
15.如权利要求1、4、6、9、11及12中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:103具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
16.如权利要求1、5、6、10、11及12中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区为或包含与SEQ ID NO:130具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且该VL区为或包含与SEQ ID NO:106具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
17.如权利要求1、6、11及12中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中：
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
18.一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，其中：
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列；
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列；或
该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
19.如权利要求1、2、6、7、11、12、13、17及18中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:112及115中所示的序列。
20.如权利要求1、3、6、8、11、12、14、17及18中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:121及124中所示的序列。
21.如权利要求1、4、6、9、11、12、15、17及18中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:103及106中所示的序列。
22.如权利要求中1、5、6、10、11、12、16、17及18中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区为或包含分别如SEQ ID NO:130及106中所示的序列。
23.如权利要求1至22中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是全长抗体。
24.如权利要求1至22中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是抗原结合片段。
25.如权利要求1至24中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗ROR1抗体或其抗原结合片段是重组的。
26.如权利要求1至25中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区及该VL区是人类的或来自人类蛋白质。
27.如权利要求1至22及24至26中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该其抗原结合片段包括单链Fv(scFv)。
28.如权利要求27的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区在该VL区的氨基末端。
29.如权利要求27的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区在该VL区的羧基末端。
30.如权利要求27至29中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该VH区与该VL区通过可挠性接头接合。
31.如权利要求30的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该可挠性接头包含SEQ IDNO:41中所示的序列。
32.如权利要求27、28、30及31中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:118、127、109或134中所示的序列，或与SEQ ID NO:118、127、109或134具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
33.如权利要求27、28及30至32中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:118中所示的序列。
34.如权利要求27、28及30至32中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:127中所示的序列。
35.如权利要求27、28及30至32中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:109中所示的序列。
36.如权利要求27、28及30至32中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该scFv为或包含SEQ ID NO:134中所示的序列。
37.如权利要求1至36中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗ROR1抗体或其抗原结合片段特异性结合至人类受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白质。
38.如权利要求37的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该人类ROR1蛋白质包含SEQID NO:144、145或146中所示的氨基酸序列。
39.如权利要求37或权利要求38的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗ROR1抗体或其抗原结合片段特异性结合至由SEQ ID NO:199中所示的序列组成的抗原决定基或SEQ ID NO:199中所示的序列内存在的抗原决定基。
40.如权利要求37至39中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段进一步结合至由选自SEQ ID NO:200-214中的任一个的序列组成的一或多个抗原决定基或选自SEQ ID NO:200-214中的任一个的序列内存在的抗原决定基。
41.如权利要求1至40中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗ROR1抗体或其抗原结合片段不结合至受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质；不与受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质交叉反应；或以较低水平或程度或亲和力与受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)蛋白质结合，视情况指人类ROR2蛋白质。
42.如权利要求1至41中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗ROR1抗体或其抗原结合片段与人类ROR2的结合的范围、水平或程度或亲和力比与人类ROR1蛋白质的结合的范围、水平或程度或亲和力低至少或至少约75％、80％、90％、95％或99％。
43.如权利要求1至42中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-11M至约1×10-7M的平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质。
44.如权利要求1至43中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-8M至约1×10-7M的平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质。
45.如权利要求1至43中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约5×10-11M至约1×10-10M的平衡解离常数(KD)结合至人类ROR1蛋白质。
46.如权利要求1至45中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-5 1/s至约1×10-2 1/s的解离速率常数(kd或koff)结合至人类ROR1蛋白质。
47.如权利要求1至46中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-3 1/s至约1×10-2 1/s的解离速率常数(kd或koff)结合至人类ROR1蛋白质。
48.如权利要求1至46中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以从约1×10-5 1/s至约1×10-4 1/s的解离速率常数(kd或koff)结合至人类ROR1蛋白质。
49.一种单链细胞表面蛋白质，其包含如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段。
50.一种偶联物，其包含如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段及异源分子或部分。
51.如权利要求50的偶联物，其中该异源分子或部分治疗部分。
52.一种抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)，其包括含如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段的细胞外抗原结合结构域、跨膜区及细胞内信号传导区。
53.如权利要求52的抗ROR1嵌合抗原受体，其进一步在该细胞外抗原结合结构域与该跨膜结构域之间包含间隔子。
54.如权利要求53的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的至少一部分。
55.如权利要求53或权利要求54的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分。
56.如权利要求53至55中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度小于或小于约15个氨基酸。
57.如权利要求53至56中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含与SEQID NO:1、26、27、29、31、32、33或135具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
58.如权利要求53至57中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中铰链区的至少一部分包含IgG4铰链区、视情况为人类IgG4铰链区或其变体的全部或一部分。
59.如权利要求53至57中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中铰链区的至少一部分包含IgG2铰链区，视情况为人类IgG2铰链区，或其变体的全部或一部分。
60.如权利要求53至58中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQID NO:1中所示的序列。
61.如权利要求53至58中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQID NO:135中所示的序列。
62.如权利要求53至55中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分及CH3区的至少一部分。
63.如权利要求53至55及62中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中CH3区的至少一部分包含IgG4 CH3及/或IgG2 CH3的全部或一部分，其中该IgG4 CH3视情况是人类IgG4 CH3且该IgG2 CH3视情况是人类IgG2 CH3。
64.如权利要求53至55、62及63中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度为或为约111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个氨基酸，或其长度在前述任何值之间。
65.如权利要求53至55及62至64中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度为或为约120个氨基酸。
66.如权利要求53至55及62至65中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含与SEQ ID NO:3或138具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
67.如权利要求53至55及62至66中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQ ID NO:3或138中所示的序列。
68.如权利要求53至55中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白或其变体的铰链区的至少一部分、CH2的至少一部分及CH3区的至少一部分。
69.如权利要求53至55及68中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中CH2区的至少一部分包含IgG4 CH2及/或IgG2 CH2的全部或一部分，其中该IgG4 CH2视情况是人类IgG4 CH2且该IgG2 CH2视情况是人类IgG2 CH2。
70.如权利要求53至55、68及69中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度为或为约130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229或230个氨基酸，或其长度在前述任何值之间。
71.如权利要求53至55及68至70中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中：
该铰链区、该CH2区及该CH3区中的一或多个包含来自人类IgG4的CH2区的全部或一部分及CH3区的全部或一部分；或
该铰链区、该CH2区及该CH3区中的一或多个是嵌合的且包含来自人类IgG4及人类IgG2的铰链、CH2区及CH3区；或该间隔子包含IgG4/2嵌合铰链区或相较于人类IgG4铰链包含至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链区；IgG2/4嵌合CH2区；以及IgG4 CH3区。
72.如权利要求53至55及68至71中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含与SEQ ID NO:37或194具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
73.如权利要求53至55及68至72中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该间隔子为或包含SEQ ID NO:37或194中所示的序列。
74.如权利要求52至73中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜区为或包含来自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域。
75.如权利要求52至74中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜区为或包含来自CD28，视情况来自人类CD28的跨膜结构域。
76.如权利要求52至75中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域为或包含SEQ ID NO:8或149、或与SEQ ID NO:8或149具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
77.如权利要求52至76中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中细胞内信号传导区包含能够在T细胞中诱导初级活化信号的细胞内信号传导结构域，是T细胞受体(TCR)组分及/或包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
78.如权利要求52至77中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导结构域为或包含CD3-ζ(CD3ζ)链，视情况为人类CD3ζ链的细胞质信号传导结构域。
79.如权利要求52至78中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导结构域为或包含SEQ ID NO:13、14或15中所示的序列，或与SEQ ID NO:13、14或15具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
80.如权利要求52至79中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导结构域为或包含SEQ ID NO:13中所示的序列。
81.如权利要求52至80中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该细胞内信号传导区进一步包含共刺激信号传导区。
82.如权利要求81的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区在该跨膜区与该细胞内信号传导结构域之间。
83.如权利要求81或权利要求82的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子或其信号传导部分的细胞内信号传导结构域。
84.如权利要求81至83中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域。
85.如权利要求81至84中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区包含CD28，视情况为人类CD28的细胞内信号传导结构域。
86.如权利要求81至85中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区为或包含SEQ ID NO:10中所示的序列，或与SEQ ID NO:10具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
87.如权利要求81至84中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区包含4-1BB，视情况为人类4-1BB的细胞内信号传导结构域。
88.如权利要求81至84及87中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该共刺激信号传导区为或包含SEQ ID NO:12中所示的序列，或与SEQ ID NO:12具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
89.如权利要求81至88中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序包含：细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜区、及细胞内信号传导区。
90.如权利要求81至89中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域是scFv且该编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序包含：含该scFv的细胞外抗原结合结构域；含经修饰的IgG4铰链，视情况含SEQ ID NO:135中所示的序列的间隔子；跨膜结构域，视情况为来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域，视情况含4-1BB的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。
91.如权利要求81至89中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域是scFv且该编码的嵌合抗原受体自其N至C末端依序包含：含该scFv的细胞外抗原结合结构域；含经修饰的IgG4铰链-CH3，视情况含SEQ ID NO:138中所示的序列的间隔子；跨膜结构域，视情况为来自人类CD28的跨膜结构域；以及含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞质信号传导结构域及共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域，视情况含4-1BB的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。
92.如权利要求52至91中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列，或与SEQ ID NO:184、185、186、187、188或189中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
93.如权利要求52至92中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:184中所示的序列，或与SEQ ID NO:184中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
94.如权利要求52至93中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:184中所示的序列。
95.如权利要求52至92中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:185中所示的序列，或与SEQ ID NO:185中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
96.如权利要求52至92及95中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:185中所示的序列。
97.如权利要求52至92中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:186中所示的序列，或与SEQ ID NO:186中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
98.如权利要求52至92及97中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:186中所示的序列。
99.如权利要求52至92中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:187中所示的序列，或与SEQ ID NO:187中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
100.如权利要求52至92及99中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:187中所示的序列。
101.如权利要求52至92中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:188中所示的序列，或与SEQ ID NO:188中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
102.如权利要求52至92及101中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:188中所示的序列。
103.如权利要求52至92中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:189中所示的序列，或与SEQ ID NO:189中所示的序列展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
104.如权利要求52至92及103中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体，其中该抗ROR1嵌合抗原受体为或包含SEQ ID NO:189中所示的序列。
105.一种聚核苷酸，其包含编码如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合结构域的核酸。
106.一种聚核苷酸，其包含编码如权利要求49的单链细胞表面蛋白质的核酸。
107.一种聚核苷酸，其包含编码如权利要求50或权利要求51的偶联物的核酸。
108.一种聚核苷酸，其包含编码如权利要求52至104中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体的核酸。
109.如权利要求105至108中任一项的聚核苷酸，其中该聚核苷酸通过剪接位点消除进行优化。
110.如权利要求105至109中任一项的聚核苷酸，其中该聚核苷酸针对在人类细胞中表达进行密码子优化。
111.一种载体，其包含如权利要求105至110中任一项的聚核苷酸。
112.如权利要求111的载体，其中该载体是病毒载体。
113.如权利要求112的载体，其中该病毒载体是反转录病毒载体或慢病毒载体。
114.一种细胞，其包含如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如权利要求49的单链细胞表面蛋白质、或如权利要求50或权利要求51的偶联物。
115.一种细胞，其包含如权利要求52至104中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体。
116.一种细胞，其包含如权利要求105至110中任一项的聚核苷酸，或如权利要求111至113中任一项的载体。
117.如权利要求114至116中任一项的细胞，其是淋巴细胞。
118.如权利要求114至116中任一项的细胞，其是NK细胞或T细胞。
119.如权利要求114至118中任一项的细胞，其中该细胞是T细胞且该T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
120.如权利要求114至119中任一项的细胞，其中该细胞是获自受试者的初代细胞。
121.如权利要求114至120中任一项的细胞，其中在复数个该细胞中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％、或小于或小于约1％的细胞包含展现持续性(tonic)信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导的抗ROR1嵌合抗原受体。
122.一种组合物，其包含如权利要求114至121中任一项的细胞。
123.一种组合物，其包含如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如权利要求49的单链细胞表面蛋白质、如权利要求50或权利要求51的偶联物、或如权利要求52至104中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体。
124.如权利要求122或权利要求123的组合物，其进一步包含医药学上可接受的赋形剂。
125.如权利要求122或权利要求124的组合物，其中该组合物包含CD4+及CD8+T细胞且CD4+与CD8+T细胞的比率为从或从约1:3至3:1，视情况从或从约1:2至2:1，视情况为或为约1:1。
126.如权利要求122、124及125中任一项的组合物，其中在该组合物中的复数个细胞中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％、或小于或小于约1％的细胞包含展现持续性信号传导及/或非抗原依赖性活性或信号传导的抗ROR1嵌合抗原受体。
127.一种治疗方法，其包含向患有与ROR1相关的疾病或病症的受试者给予如权利要求114至121中任一项的细胞或如权利要求122至126中任一项的组合物。
128.如权利要求114至121中任一项的细胞或如权利要求122至126中任一项的组合物，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。
129.一种如权利要求114至121中任一项的细胞或如权利要求122至126中任一项的组合物的用途，其用于制造用作治疗与ROR1相关的疾病或病症的药剂。
130.一种如权利要求114至121中任一项的细胞或如权利要求122至126中任一项的组合物的用途，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。
131.一种治疗方法，其包含向患有与ROR1相关的疾病或病症的受试者给予如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如权利要求49的单链细胞表面蛋白质、如权利要求50或权利要求51的偶联物、如权利要求52至104中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体、如权利要求105至110中任一项的聚核苷酸或如权利要求111至113中任一项的载体。
132.如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如权利要求49的单链细胞表面蛋白质、如权利要求50或权利要求51的偶联物、如权利要求52至104中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体、如权利要求105至110中任一项的聚核苷酸、或如权利要求111至113中任一项的载体，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。
133.一种如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如权利要求49的单链细胞表面蛋白质、如权利要求50或权利要求51的偶联物、如权利要求52至104中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体、如权利要求105至110中任一项的聚核苷酸、或如权利要求111至113中任一项的载体的用途，其用于制造用作治疗与ROR1相关的疾病或病症的药剂。
134.一种如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如权利要求49的单链细胞表面蛋白质、如权利要求50或权利要求51的偶联物、如权利要求52至104中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体、如权利要求105至110中任一项的聚核苷酸、或如权利要求111至113中任一项的载体的用途，其用于治疗与ROR1相关的疾病或病症。
135.如权利要求127至134中任一项的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该与ROR1相关的疾病或病症是癌症。
136.如权利要求135的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该癌症是表达ROR1的癌症。
137.如权利要求127至136中任一项的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该癌症与表达ROR1的实体肿瘤或表达ROR-1的恶性血液病相关。
138.如权利要求127至137中任一项的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该癌症与表达ROR1的实体肿瘤相关。
139.如权利要求137或权利要求138的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该与实体肿瘤相关的癌症选自由以下组成的群：神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌及头颈癌。
140.如权利要求139的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌瘤及非典型性类癌。
141.如权利要求140的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该肺癌是NSCLC。
142.如权利要求139的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。
143.如权利要求127至137中任一项的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该癌症与表达ROR1的恶性血液病相关。
144.如权利要求143的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途，其中该恶性血液病选自由以下组成的群：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's Lymphoma)或套细胞淋巴瘤(MCL)。
145.一种试剂盒，其包含如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如权利要求49的单链细胞表面蛋白质、如权利要求50或权利要求51的偶联物、如权利要求52至104中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体、如权利要求105至110中任一项的聚核苷酸、如权利要求111至113中任一项的载体、如权利要求114至121中任一项的细胞、或如权利要求122至126中任一项的组合物，及使用说明书，视情况其中该说明书是关于视情况根据权利要求127至144中任一项的供使用的方法、细胞、组合物、抗体或其抗原结合片段、单链细胞表面蛋白质、偶联物、嵌合抗原受体、聚核苷酸或载体或用途给予该抗ROR1抗体或其抗原结合片段、该单链细胞表面蛋白质、该偶联物、该抗ROR1嵌合抗原受体、该细胞或该组合物。
146.一种制品，其包含如权利要求1至48中任一项的抗ROR1抗体或其抗原结合片段、如权利要求49的单链细胞表面蛋白质、如权利要求50或权利要求51的偶联物、如权利要求52至104中任一项的抗ROR1嵌合抗原受体、如权利要求105至110中任一项的聚核苷酸、如权利要求111至113中任一项的载体、如权利要求114至121中任一项的细胞、或如权利要求122至126中任一项的组合物、或如权利要求145的试剂盒。
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