CN115724973A

CN115724973A - 抗人ror1高亲和力兔单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN115724973A
Application number: CN202211173542.XA
Authority: CN
Inventors: 杨查理; 张永霞; 万定一; 鲁亮; 秦伏波; 代腾飞
Original assignee: Pujian Bio Wuhan Technology Co ltd
Current assignee: Pujian Bio Wuhan Technology Co ltd
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2042-09-26
Also published as: CN115724973B

Abstract

本发明公开了一种抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体及其应用，涉及生物医药技术领域，利用动物免疫、单个B细胞分选和单克隆抗体纯化筛选，成功获得了两种抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，并通过大量的试验证明了这两个抗体可以识别人ROR1蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒。利用该抗体对开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点。

Description

抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体及其应用。

背景技术

癌基因受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)是受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员之一。人源ROR1分子由三部分组成，包括胞外区、跨膜区和胞内区，胞外区包括一个免疫球蛋白样结构域(Ig)、两个富含半胱氨酸卷曲的结构域(FZD)和一个近膜Kringle结构域，胞内区含有一个酪氨酸激酶结构域(TKD)、两个丝/苏氨酸富集结构域(Ser/Thr)和一个脯氨酸富集结构域(PRD)。

ROR1在人正常组织中低表达或不表达，但在多种恶性肿瘤或组织中高度表达，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌等，这种在肿瘤高表达、在健康细胞低表达的特点使ROR1的临床价值大幅提升。大量研究表明，ROR1在促进肿瘤的生长和转移、诱导肿瘤细胞耐药和抑制细胞凋亡等方面发挥着重要作用。而关于ROR1的作用机制，目前主流的说法是ROR1可介导非经典的Wnt信号通路，尤其是Wnt5a，参与NF-κB亚基p65的磷酸化，激活肿瘤细胞中NF-κB通路，促进细胞迁移和侵袭。基于上述研究成果，ROR1作为一种具有高度识别性的肿瘤特异性标志物，已成为肿瘤治疗中一个潜在极具吸引力的靶点。因此，开发一种高灵敏度的人ROR1蛋白检测方法学，具有非常重要的意义。

现有技术中，对于抗ROR1的单克隆抗体已有一些研究成果。例如中国专利申请CN110590951A提供了一种ROR1单克隆抗体，这种单克隆抗体G3特异性通过与人ROR1的卷曲(Frizzled)域结合，效果优于结合于人ROR1其他结构域的治疗效果，对非小细胞肺腺癌具有突出的效果。

发明内容

本发明提供了一种全新的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，通过利用哺乳表达系统在体外重组表达的，经验证具有生物活性的人ROR1蛋白作为免疫原，利用基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术制备获得，检测灵敏度高，可以用于人ROR1蛋白的高灵敏度检测。具体通过以下技术实现。

一种抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体为第一抗体或第二抗体；

所述第一抗体的重链上的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.1-3所示；所述第一抗体的轻链上的互补决定区CDR1和CDR3的氨基酸序列依次如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述第一抗体的轻链上的互补决定区CDR2的氨基酸序列为KAS；

所述第二抗体的重链上的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.10-12所示；所述第二抗体的轻链上的互补决定区CDR1和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，所述第二抗体的轻链上的互补决定区CDR2的氨基酸序列为SAS。

本发明提供的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，包括两种抗体，即第一抗体和第二抗体，这两种抗体对人ROR1的亲和力均较高。两种抗体根据检测方法和检测目的的不同，既可以单独使用，也可以同时使用。

优选地，所述第一抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

更优选地，所述第一抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述第一抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

优选地，所述第二抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述第二抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

更优选地，所述第二抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述第二抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

本发明还提供了一种利用上述抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体在建立以非诊断目的的高灵敏度的人ROR1的酶联免疫检测方法中的应用。

需要指出的是，本发明所提供的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，不仅可以用于非治疗目的的人ROR1的酶联免疫检测，还能用于辅助检测方法，诊断癌症患病情况。

优选地，上述应用方法中，所述酶联免疫检测方法为双抗夹心法酶联免疫检测方法。

更优选地，上述应用方法中，所述双抗夹心法酶联免疫检测方法中，捕获抗体为所述第一抗体，检测抗体为经生物素标记的所述第二抗体。

本发明还提供了一种利用上述抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体在制备用于检测人ROR1的试剂或试剂盒中的应用，所述人ROR1为重组表达的人ROR1蛋白、细胞分泌的人ROR1蛋白或人血清中的ROR1蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

1、本发明提供的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，利用Biacore仪器测定其第一抗体和第二抗体的亲和力，第一抗体和重组表达的人ROR1结合的亲和常数为8.96×10^-13M，第二抗体和重组表达的人ROR1结合的亲和常数为1.42×10^-13M。本发明进一步开发了一种高灵敏度和特异性针对ROR1蛋白的双抗夹心法酶联免疫检测方法，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。

2、作为其中一种常用的制备方法，本发明用来制备抗人ROR1兔单克隆抗体的免疫原，是利用哺乳表达系统在体外重组表达的、经验证具有生物活性的人ROR1蛋白；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术；

3、本发明所提供的人ROR1双抗夹心酶联免疫检测方法，捕获抗体为本发明中的第一抗体，检测抗体为经生物素标记的第二抗体。当标准样品为体外重组表达的人ROR1蛋白时，检测灵敏度为156.25pg/mL，所建立的方法可以用于人ROR1蛋白的高灵敏度检测；

4、本发明所提供的人ROR1双抗夹心酶联免疫检测方法具有高特异性，和与人ROR1相似的其他人系列蛋白(例如ROR2等)均无交叉反应，且与小鼠及大鼠来源的ROR1蛋白也没有交叉反应。

附图说明

图1为实验例1中，进行动物免疫后的血清效价图；

图2为实验例1中B淋巴细胞的分选结果；

图3为实验例1中，8株重组的兔单抗凝胶电泳图；

图4为实验例2中，不同浓度的第一抗体的亲和力检测结果；

图5为实验例2中，不同浓度的第二抗体的亲和力检测结果；

图6为利用第一抗体和第二抗体所建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的标准曲线；

图7为利用第一抗体和第二抗体所建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的特异性检测结果；

图8为第一抗体的稳定性试验结果；

图9为第二抗体的稳定性试验结果。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

实验例1：人ROR1兔单克隆抗体的制备

1、人ROR1兔单克隆抗体的制备

(1)动物免疫：

为了获得识别人ROR1蛋白的兔单克隆抗体，该发明以自主生产的重组人ROR1蛋白为免疫原(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)，免疫4只新西兰大白兔(由湖北省实验动物研究中心提供)，分别标记为1#、2#、3#、4#；每只大白兔免疫250μg，首次免疫将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，间隔2周取125μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次，三次免疫后用ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，用125μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

如图1所示，在各个稀释倍数中，血清效价最高的为3#新西兰大白兔，故选取3#新西兰大白兔作为实验对象分离脾脏。

(2)脾脏细胞分离

将3#新西兰大白兔脾脏置于含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM基础培养基中，用手术刀片切为碎块后转移到100μm的细胞筛网中研磨。将所得细胞悬浊液滤去体积较大的细胞团块和组织包膜，在450g下离心7min，去上清后保留脾脏细胞团。脾脏细胞团用常规PBS缓冲液重悬并裂解红细胞后，再次于450g下离心7min，保留脾脏细胞。将脾脏细胞用100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM基础培养基重悬，450g下离心7min，所得脾脏细胞用完全培养基(含有15％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM基础培养基)重悬备用。

(3)B淋巴细胞分选

具体分选方法参考中国授权专利CN110016462B《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》中公开的方法。如图2所示，图中R5区域即为分选出来的B淋巴细胞，铺进96孔细胞培养板培养，每孔1个B淋巴细胞培养。

(4)编码兔单克隆抗体基因的克隆

培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆，阳性对照是将免疫后兔血清1:2000稀释后制得，阴性对照为PBS缓冲液。如下表1所示。

表1培养后B细胞上清Elisa鉴定结果(OD450和OD620的差值)

表1中，第一行和第一列的序号是指96孔酶标板的编号；显示字体加粗和加下划线数据为选定进入下一步实验的阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA。以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，通过变性，退火，延伸，扩增出天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)并测序。

(5)单克隆抗体的生产和纯化

以表1中字体加粗和加下划线数据对应的兔单克隆抗体为对象，为了获得多株识别人ROR1蛋白的兔单克隆抗体，将兔单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在表达载体上，将质粒转染293F细胞；转染72-96h获得培养上清中含有重组的识别人ROR1蛋白的兔单克隆抗体。使用protein G亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人ROR1蛋白的兔单克隆抗体，抗体鉴定后分装，于-20℃低温保存备用。将表1的14株进行最终测序，6株测序失败丢弃(培养时细胞死亡，或失去分泌抗体的能力等)，剩余8株重组的兔单抗抗体凝胶电泳图如图3所示。从图中可以看到，兔单抗重组抗体条带均一，分子量正确，抗体成功表达。

实验例2：抗体的筛选和鉴定

如表2所示，利用双抗夹心ELISA实验，将实施例1中筛选出的8株重组的兔单抗抗体作为包被抗体，分别标记为包被1#-8#；并且分别按照常规方法进行生物素标记制成生物素标记抗体，分别标记为生物素标记1#-8#。

抗体包被酶标板的具体方法为：

(1)使用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6，0.05M)将捕获抗体(抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体)进行包被，包被浓度2μg/mL，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗涤液洗板；

(2)用含有3％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2，0.05M)进行封闭。

抗体进行生物素标记的具体方法为：

(1)生物素使用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/mL，得到生物素溶液；

(2)抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH＝8.5，终浓度1-10mg/ml，得抗体溶液；所用的碳酸盐缓冲液(CBS缓冲液)的pH＝9.0，

(3)按每mg抗体溶液加5μL生物素溶液的比例，将生物素溶液和抗体溶液于室温避光搅拌2h；

(4)收集反应物使用PBS缓冲液透析过夜，中途更换PBS缓冲液3-4次；

(5)收集透析完毕的产物，即得到生物素标记的第二抗体。

交叉组合测试全部8株重组兔单抗，挑选出夹心信号最佳的1组组合(表2中的字体加粗和加下划线数据)。最终选取6#克隆抗体为第一抗体(即包被抗体)，3#克隆抗体为第二抗体(即作为生物素标记抗体)。

表2培养后B细胞上清Elisa鉴定结果(OD450和OD620的差值)

利用Biacore 8000生物分子相互作用分析仪对本实验例获得的抗人ROR1兔单克隆抗体第一抗体和第二抗体的亲和力进行精确测定。其中，使用所选定第一抗体和第二抗体的浓度分别为50nM，并将其固定在CM5芯片(GE Healthcare)上；然后针对第一抗体，用50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM和0.78nM七个浓度的重组人ROR1蛋白去结合，获得亲和力曲线，如图4所示；针对第二抗体，用50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78nM七个浓度的重组人ROR1蛋白去结合，获得亲和力曲线，如图5所示。图4、5中，横轴为反应时间，纵轴为响应值，彩色线条为对应的不同浓度抗体上样状态下的响应值，根据响应值得到结合常数Ka和解离常数Kd，根据公式KD＝Kd/Ka，计算出亲和力值KD。KD值越小，代表抗体亲和力越强。一般抗体亲和力小于10^-12即可认为该抗体亲和力非常高。下表3、4分别为第一抗体和第二抗体的亲和力的检测结果。

表3第一抗体的亲和力检测结果

Sample	Kd(1/s)	Ka(1/Ms)	KD(M)
				第一抗体	5.51×10<sup>-7</sup>	6.15×10<sup>5</sup>	8.96×10<sup>-13</sup>

表4第二抗体的亲和力检测结果

Sample	Kd(1/s)	Ka(1/Ms)	KD(M)
				第二抗体	1.02×10<sup>-7</sup>	7.16×10<sup>5</sup>	1.42×10<sup>-13</sup>

从图4-5和表3-4可以看到。最终通过曲线拟合和计算，获得人ROR1兔单克隆抗体第一抗体的亲和力为8.96×10^-13M；人ROR1兔单克隆抗体第二抗体的亲和力为1.42×10^- ¹³M。

通过委托第三方公司(擎科生物公司)测序获得第一抗体的重链和轻链，以及第二抗体的重链和轻链的完整序列。然后，根据Kabat规则(参考文献：Kabat E.A.,Wu T.T.,Bilofsky H.Attempts to locate residues incomplementarity-determining regionsof antibody combining sites that makecontact with antigen.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1976；73:617–619)即可得到两种抗体的重链和轻链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3区的序列。

本实验例所获得的抗人ROR1兔单克隆抗体的第一抗体的重链氨基酸序列如SEQID NO.8所示，第一抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。其中，第一抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。第一抗体的重链上的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ IDNo.1-3所示；第一抗体的轻链上的互补决定区CDR1和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ IDNo.4、5所示，第一抗体的轻链上的互补决定区CDR2的氨基酸序列为KAS。

本实验例所获得的抗人ROR1兔单克隆抗体的第二抗体的重链氨基酸序列如SEQID NO.17所示，第二抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。其中，第二抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示。第二抗体的重链上的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ IDNo.10-12所示；所述第二抗体的轻链上的互补决定区CDR1和CDR3的氨基酸序列依次如SEQID No.13、14所示，所述第二抗体的轻链上的互补决定区CDR2的氨基酸序列为SAS。

实验例3：抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体和第二抗体的灵敏度检测

利用所获得的抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体和第二抗体，进行双抗夹心法酶联免疫检测方法的条件摸索。通过正交试验方法，综合考虑背景及重组蛋白的光吸收值，选择抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体的包被浓度为2μg/mL，生物标记的抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体的检测浓度为0.5μg/mL。

1、使用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6，0.05M)将捕获抗体(抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体)进行包被，包被浓度2ug/mL,100uL/孔，4℃孵育过夜；洗涤液洗板；

2、用含有3％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2，0.05M)进行封闭；

3、标准品依次进行倍比稀释操作得到共计7个标准点10000pg/mL、5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL，最后再以100μL磷酸盐缓冲液为零标准(即不含标准品)，加入到酶标板中，共计8个标准点，常温条件孵育1h，然后用洗涤液洗板；

4、将用含0.1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释的经生物素标记的抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第二抗体(稀释后终浓度0.5μg/mL)加入到板中，常温条件孵育1h，然后用洗涤液洗板；

5、加入用含0.1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释的亲和素标记的辣根过氧化物酶(jackson immunoresearch，货号016-030-084)；辣根过氧化物酶的终浓度为0.1μg/mL，常温条件孵育1h，然后用洗涤液洗板；

6、加入TMB显色液，常温显色10min；加50μL 2M盐酸终止显色，然后分别于波长450nm和630nm下测定吸光值，OD450减去OD630为校正后的吸光值。以人ROR1蛋白浓度为横坐标，吸光值的校正值(OD450-OD630)为纵坐标作图，标准曲线见图6所示，标曲方程为y＝0.0003x+0.0018，R2＝0.9994。

以吸光值平均值大于三倍空白对照吸光值平均值的最低人ROR1蛋白浓度为双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度。实验结果显示，基于抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体和第二抗体所建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法，检测灵敏度达到156.25pg/mL。

实验例4：抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体和第二抗体的性能检测

1、特异性检测

取3种与人ROR1蛋白相近的小鼠ROR1、大鼠ROR1和人ROR2，用于对抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体和第二抗体特异性的检测。

采用双抗夹心法酶联免疫检测方法，以第一抗体为包被抗体，以第二抗体为生物素标记的抗体，所有标准品蛋白的浓度均为1μg/mL。如图7所示，基于本发明提供的第一抗体和第二抗体的双抗夹心法酶联免疫检测方法，对小鼠ROR1、大鼠ROR1和人ROR2均无任何交叉反应。这说明本发明提供的第一抗体和第二抗体对人ROR1蛋白具有高度的特异性。

2、热稳定性测试

将抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体和第二抗体被放置于37℃保温箱中，并于第14天取样。通过双抗夹心法酶联免疫检测方法，对人ROR1标准品蛋白进行检测，以未经处理的第一抗体和第二抗体(即第一抗体、第二抗体分别一直在-20℃环境中保存)，作为空白对照。对37℃处理14天的抗体样品和空白对照，分别建立的标准曲线。

如图8、9所示，本发明提供的抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体和第二抗体，在37℃处理14天后，抗体观察无明显沉淀或变质，浓度无明显下降，双抗夹心法酶联免疫检测信号无明显下降，结果显示信号降低小于5％。这说明本发明提供的抗人ROR1蛋白兔单克隆抗体第一抗体和第二抗体热稳定性强。

以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为第一抗体或第二抗体；

所述第一抗体的重链上的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1-3所示；所述第一抗体的轻链上的互补决定区CDR1和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示，所述第一抗体的轻链上的互补决定区CDR2的氨基酸序列为KAS；

所述第二抗体的重链上的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.10-12所示；所述第二抗体的轻链上的互补决定区CDR1和CDR3的氨基酸序列依次如SEQID NO.13和SEQ ID NO.14所示，所述第二抗体的轻链上的互补决定区CDR2的氨基酸序列为SAS。

2.根据权利要求1所述的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于，所述第一抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.根据权利要求2所述的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于，所述第一抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述第一抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。

4.根据权利要求1所述的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于，所述第二抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述第二抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

5.根据权利要求4所述的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于，所述第二抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述第二抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.18所示。

6.权利要求1-5任一项所述的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体在建立以非诊断目的的高灵敏度的人ROR1的酶联免疫检测方法中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酶联免疫检测方法为双抗夹心法酶联免疫检测方法。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述双抗夹心法酶联免疫检测方法中，捕获抗体为所述第一抗体，检测抗体为经生物素标记的所述第二抗体。

9.权利要求1-5任一项所述的抗人ROR1高亲和力兔单克隆抗体在制备用于检测人ROR1的试剂或试剂盒中的应用，所述人ROR1为重组表达的人ROR1蛋白、细胞分泌的人ROR1蛋白或人血清中的ROR1蛋白。