CN110684105B

CN110684105B - 一种抗hsp90单克隆抗体及试剂盒

Info

Publication number: CN110684105B
Application number: CN201910859302.7A
Authority: CN
Inventors: 刘晗青; 屠志刚
Original assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Current assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-09-11
Also published as: CN110684105A

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种抗HSP90单克隆抗体及试剂盒。本发明利用细胞融合技术筛选出能够稳定分泌抗HSP90单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量生产抗HSP90单克隆抗体。得到的抗HSP90单克隆抗体具有高效价、高特异性、可大量生产的特点，抗HSP90单克隆抗体能够特异性的结合HSP90蛋白，减少了可能的交叉反应，试验结果可信度更大，制备的蛋白酶联免疫双抗体夹心法试剂盒适用于检测血清中的HSP90表达量，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，在制备以HSP90为靶点的体外诊断试剂中具有重要的意义。

Description

一种抗HSP90单克隆抗体及试剂盒

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体涉及一种抗HSP90单克隆抗体及试剂盒。

背景技术

热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是一种广泛存在于原核和真核生物中的在应激（病毒感染、缺氧、紫外线照射等）状态下合成的高度保守的蛋白质分子，又称应激蛋白。多以分子伴侣的形式参与细胞内相关蛋白质的装配、折叠、蛋白质降解及细胞内运输等过程。近年来因与肿瘤、微生物耐药性发生发展有较密切的关系而成为抗瘤治疗的热点。根据分子质量大小可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60 和小HSP五大家族。HSP90 作为HSP最重要的成员之一，日益引起人们的重视，HSP90表达于所有的真核细胞，但其在肿瘤细胞中的组成表达比相应的正常细胞高出2～10倍。其生理功能主要体现在以下几个方面：（1）维持细胞蛋白质稳定。蛋白质在跨膜转运前必须解折叠，跨膜后又要重新折叠以形成成熟型，HSP90作为分子伴侣具有解折叠酶功能，能识别蛋白质解折叠后局部暴露的疏水面，并与之结合，防止相互作用产生凝聚，直至跨膜运送。（2）提高细胞对应激的耐受性。在应激条件下，HSP90的表达及其上调，通过传导信号，使机体做出正确的应答。（3）增强抗氧化作用使细胞维持正常的生理功能。

HSP90是细胞内最活跃的分子伴侣之一, 对细胞在生理、病理及应激条件下的生存发挥重要作用。在发生应激反应时，HSP90 由于环境刺激而使自身构象发生改变，保证蛋白进行适当的折叠并防止其非特异性聚集，从而维持细胞的正常活性。作用除了生理功能外，近年来HSP90在肿瘤组织中的作用也受到泛重视。HSP90可以与相应的底物结合而在肿瘤的形成和发展中产生作用。与之结合的底物具有一定的选择性，大多为某些转录因子及与细胞信号转导相关的蛋白激酶。肿瘤形成过程中，大量编码的HSP作为分子伴侶起着调节和稳定这一异常增殖过程的作用。可见，HSP90或可成为肿瘤诊断的生物标志物之一，拮抗HSP90的表达具有防治肿瘤发生发展的潜在应用价值，如何快速、准确的检测血液或组织局部HSP90 的蛋白表达是一项继续解决的难题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种高效价、高特异性的抗HSP90单克隆抗体及包含该抗体的试剂盒。所述的单克隆抗体针对人HSP90肽段的第201至300位氨基酸序列有反应性。

本发明利用原核表达的重组HSP90蛋白作为免疫原免疫6~8周龄的BALB/c雌性小鼠，采用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合，通过有限稀释法和间接酶联免疫吸附试验ELISA 法筛选阳性产抗HSP90单克隆抗体的杂交瘤细胞株，随后将杂交瘤细胞株接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗HSP90单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗HSP90单克隆抗体，并且对抗HSP90单克隆抗体进行效价测定和特异性的鉴定。获得的抗HSP90单克隆抗体效价高、特异性好，可直接应用于分子免疫学研究，或制成多种体外诊断试剂盒用于检测HSP90抗原的免疫检测工具中，进一步应用于肿瘤细胞的鉴定及诊断。可用于制备以HSP90为靶点的生物诊断试剂的研究与开发。

本发明所述抗HSP90单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

在某一具体实施方式中，本发明还具体公开了所述抗HSP90单克隆抗体的制备方法，包括如下工艺步骤：

（1）重组HSP90蛋白的表达与纯化；

（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测；

（3）杂交瘤细胞的融合、筛选；

（4）抗HSP90单克隆抗体的生产及纯化。

本发明还提供了一种能产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明还提供所述的抗HSP90单克隆抗体在制备以HSP90为靶点的诊断试剂中的用途。

本发明还提供所述的抗HSP90单克隆抗体在制备用于检测HSP90抗原的试剂中的用途。

本发明还提供一种HSP90蛋白酶联免疫双抗体夹心法试剂盒。所述试剂盒中抗HSP90单克隆抗体与HSP90兔多克隆抗体进行配对组合，将抗HSP90单克隆抗体包被在固相载体上，特异性地结合重组HSP90蛋白标准品或待测样本中的HSP90蛋白；加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的HSP90兔多克隆抗体，形成固相抗体-抗原-酶标检测抗体复合物，显色液对底物显色后终止，于450 nm波长下读取各待测样本吸光度值，与标准曲线比较后得出待测样本中HSP90蛋白的含量。

本发明还提供一种试剂或芯片，包含所述的抗HSP90单克隆抗体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用以HSP90 肽段的第201至300位氨基酸序列表达的蛋白免疫原免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，筛选出能够稳定分泌抗HSP90单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量生产抗HSP90单克隆抗体，经纯化后获得高纯度的抗HSP90单克隆抗体具有高效价、高特异性、可大量生产的特点，所得抗体的效价均达到1×10⁵以上。本发明的蛋白酶联免疫双抗体夹心法试剂盒适用于检测血清中的HSP90表达量，检测的灵敏度、准确度高，精密度好。检测方法简单，易操作，检测成本低，对操作者要求低，身体危害相对较小。

附图说明

图1是重组蛋白HSP90洗脱组分收集的SDS-PAGE电泳图，图中从左往右依次为洗脱的HSP90蛋白组分；

图2是纯化后的抗HSP90单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；

图3是不同稀释度的抗HSP90单克隆抗体的免疫效价检测结果图；

图4是抗HSP90单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；

图5是HSP90基因工程抗体的特异性鉴定结果；

图6是不同酶联免疫双抗体夹心法试剂盒对HSP90蛋白检测结果图；图中，图A是本申请制备的HSP90酶联免疫试剂盒检测结果图，图B是烟台普罗吉生物技术公司的试剂盒检测结果图，图C为Thermo Fisher公司的试剂盒检测结果图，图D为Protein Tech公司的试剂盒检测结果图；。

具体实施方式

本发明公开了一种抗HSP90单克隆抗体及检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

实施例1：抗HSP90单克隆抗体的制备

（1）重组HSP90蛋白的表达与纯化

a. 转化大肠杆菌BL21表达目标重组蛋白

重组质粒pET-30a-HSP90（购自Invitrogen公司），采用42℃热激90 s的方法将重组质粒转化进大肠杆菌BL21，挑取卡那霉素抗性的菌斑，在200 mL LB培养基中培养至当菌液的OD为0.6~0.8时加入0.5 mM IPTG诱导目标蛋白的表达，25℃恒温培养12 h后，收集菌体，超声破菌，离心收集上清。

b. 重组蛋白纯化

将菌体裂解液上清加入镍柱层析柱中（购自Novagen），4℃结合过夜，弃去上清，用Wash Buffer缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白，然后用10倍柱体积的500 mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，图1是重组蛋白HSP90洗脱组分收集的SDS-PAGE电泳图，如图1所示，HSP90蛋白经1次洗脱后即能获得较高的纯度，收集合并洗脱后的蛋白，冻干后进行后续动物免疫。

（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测

本实施例所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。

a. 首次免疫：

取重组HSP90蛋白100 μg，添加PBS到200 μL，加入200 μL的弗氏完全佐剂，充分乳化成黏稠的乳剂，腹腔注射，完成首次免疫。

b. 第二次免疫：

首次免疫间隔三周后，取同样的重组HSP90蛋白100 μg，添加PBS到200 μL，加入200 μL弗氏不完全佐剂，充分乳化成黏稠的乳剂，腹腔注射，完成第二次免疫。

c. 利用间接ELISA法检测第二次免疫后小鼠血清效价：

取出HSP90重组蛋白，用pH 9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将HSP90蛋白稀释为1μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000 g离心15 min分离血清，用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100 μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100μL 1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），37℃孵育30 min。取出酶标板，经TBS-T缓冲液洗涤5次后，每孔加入100 μL TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1：10⁵以上小鼠，进行第三次免疫；

d. 第三次免疫：

第二次免疫间隔三周后，对血清效价达到1：10⁵以上小鼠进行第三次免疫，具体方法与第二次免疫一致；

e. 强化免疫/冲击免疫：

在第三次免疫间隔三周后，进行最后一次强化免疫/冲击免疫，取HSP90重组蛋白200 μg，添加PBS稀释到200 μL，腹部皮下多点注射，完成强化免疫/冲击免疫，免疫结束后3~4天后取小鼠脾脏细胞进行细胞融合。

（3）杂交瘤细胞的融合、筛选

a. 饲养层细胞的制备：

取成年未免疫BALB/c小鼠，引颈处死，75％酒精中浸泡5 min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上；用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，用镊子撕开，暴露出腹部肌肉；用5 mL注射器吸取5 mL生理盐水，注射入小鼠腹腔，待腹腔胀大后，用棉签对其腹部进行3~5 min按摩，使得生理盐水充分分布腹腔各处后，小心吸出生理盐水，250 g离心5~10 min，弃上清，用含20％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬后铺96孔板，每孔100 μL，放入37℃ 5％CO₂培养箱中培养，待用。

b. 准备SP2/0骨髓瘤细胞：

复苏一支8AG筛选过的SP2/0骨髓瘤细胞（购自中科院昆明细胞库）于15 cm培养皿中，用10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，当细胞铺满培养皿50~60％时进行传代并扩大培养。细胞融合时，取约3~4碟SP2/0骨髓瘤细胞弃去培养基，用10 mL预先37℃温育的RPMI 1640培养基将细胞吹打下来，放入离心管中，再加入10 mL RPMI 1640培养基，吹打均匀放入50 mL离心管，250 g，离心5 min，弃去上清，待用。

c. 免疫后的小鼠脾脏细胞的制备：

取冲击免疫结束后3天的BALB/c小鼠，引颈处死，75％酒精中浸泡5 min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上；用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，然后用镊子撕开，暴露出腹部肌肉，然后打开腹腔，取出小鼠脾脏，经80目网筛充分研磨后，加入5 mL RPMI 1640培养基重悬，吸出细胞悬液于50 mL离心管里，250 g，离心5 min，弃上清，待用。

d. 细胞融合：

通过细胞计数，将脾脏淋巴细胞按5:1的比例与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，吹打均匀，250 g，离心5 min，弃去上清，用手指轻轻击打离心管底部，使细胞分布均匀、蓬松；取出37℃预热的1 mL PEG1500，混匀后吸出，将PEG1500逐滴加入混合好的细胞中，加入过程中要轻轻晃动离心管，控制滴速，时间控制在90 s左右；取出37℃预热RPMI 1640培养基，于第1 min逐滴加入1 mL，均匀滴入，边滴加边缓慢旋转混匀，第2 min加入3 mL，第3 min加入10 mL速度逐步加快，终止细胞融合，共加入14 mL培养基，注意此过程先慢后快。轻轻混匀，37℃静置5 min后，250 g，离心5 min，弃去上清。

e. 铺板：

利用HAT特殊培养基重悬上述融合细胞，轻轻吹打混匀，将细胞培养液加入提前准备的含饲养层细胞的96孔培养板中，100 μL/孔，37℃ 5％CO2培养箱培养。经HAT筛选后，未融合的骨髓瘤细胞将无法生长，而有效融合的杂交瘤细胞将在培养孔内生长、增殖、并分泌抗体。

f. 利用间接ELISA法筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞：

取出HSP90重组蛋白，用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将HSP90重组蛋白稀释为1 μg/mL加入96孔酶标板，100 μL/孔，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。

细胞融合后第4~5天可以在显微镜下看到10~15颗细胞聚集在一起的细胞集落，此时可进行第一次换液，吸出原有培养基，重新加入HAT培养基，第8~10天进行第二次换液，此时细胞集落约铺满1/10孔，可用HT培养基代替HAT培养基，在二次换液后48 h，从每个孔里取出50 μL培养基上清，加入预先包被的酶标板中，37℃，孵育1 h后，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson ImmunoResearch公司），37℃孵育30 min后，经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100 μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。显色反应明显且吸光度值较高（OD450数值大于2.0以上）的孔即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。

g. 第一次亚克隆筛选：

采用有限稀释法对阳性的孔进行第一次亚克隆筛选。稀释杂交瘤细胞：将阳性孔的杂交瘤细胞吹打均匀，进行细胞计数，根据细胞密度，将细胞稀释到10个/mL，加入96孔板中，每孔100 μL，即1个细胞/孔，放入37℃ 5％CO₂培养箱中培养，3~5天后，通过显微镜观察，能够观察到每颗细胞生长至由4~5颗细胞聚集在一起的细胞集落，随后，利用间接ELISA法筛选出阳性孔，方法同上。

h. 第二次亚克隆筛选：

待第一次亚克隆筛选出的阳性孔中的细胞集落铺满1/10孔时，进行第二次亚克隆筛选，方法同上，最终选取抗体分泌性最好的杂交瘤细胞株编号命名为： 46-2-C9。

（4）抗HSP90单克隆抗体的生产及纯化。

a. 小鼠单克隆抗体腹水的制备：

取6~8周龄的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射500 μL液体石蜡致敏，4~7天后，将得到的46-2-C9杂交瘤细胞株按5×10⁵个/只，注射入已致敏的小鼠腹腔，7~14天后观察小鼠腹水生产情况，如腹部明显膨大，即可抽取腹水，腹水采集后5000 g离心10~15 min去除油脂和沉淀，收集上清，即为腹水抗HSP90单克隆抗体，本发明中由46-2-C9杂交瘤细胞株生产的单克隆抗体以细胞株编号区分。

b. 小鼠单克隆抗体腹水的纯化：

利用正辛酸-蛋白G法对腹水抗HSP90单克隆抗体进行纯化，抗体纯度经SDS-PAGE电泳验证，图2为纯化后的HSP90单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；如图2所示，抗体经纯化后即能获得较高的纯度，抗HSP90单克隆抗体IgG(H+L)分子量约为160 KD，其中IgG重链约为55 KD， IgG轻链约为25KD。

纯化抗体具体方法如下：

腹水抗体与醋酸盐缓冲液按体积比1：3充分混匀，逐滴加入正辛酸，混匀后，4℃静置1 h，3000g离心30 min，取上清，弃沉淀；

加入0.1倍体积的10×PBS，调节pH至7.4 ，溶液经0.45 μm滤膜过滤；

将过滤后的液体装入已平衡的蛋白G-层析柱中；

利用20倍体积PBS洗涤非特异性结合的蛋白；

利用10倍体积pH2~3的0.1 mol/L的甘氨酸缓冲液洗脱抗体并收集液体；

将洗脱液加入10 KD超滤管，5000 g 4℃离心10~15 min进一步浓缩抗体，加入50%甘油，-20℃保存。

实施例2：抗HSP90单克隆抗体效价测定及特异性

（1）单克隆抗体的效价测定：

用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将HSP90重组蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜；用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）分别将以上单克隆抗体按1:10³、1:10⁴、1：10⁵、1：10⁶稀释，100 μL/孔，37℃孵育1 h取出酶标板，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），37℃孵育30 min；经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100 μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。图3为不同稀释度的抗HSP90单克隆抗体免疫效价检测结果对比图；如图3所示，纯化后的单克隆抗体的效价均达到1×10⁵。

（2）单克隆抗体特异性识别及交叉反应鉴定：

用将碳酸盐缓冲液将HB-EGF、EGFR、TNF-α、IL-1β、HGF蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，并设置空白对照，空白对照组为1 μg/mL BSA蛋白，用抗HSP90单克隆抗体进行间接法ELISA检测，图4为抗HSP90单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果图；结果如图4所示，抗HSP90单克隆抗体与HB-EGF、EGFR、TNF-α、IL-1β、HGF蛋白之间均无交叉反应，表明该抗体的特异性较好。

实施例3：抗HSP90单克隆抗体重轻链可变区的测序及鉴定

（1）抗HSP90单克隆抗体重轻链可变区的扩增及序列测定

为了避免单克隆细胞长期保存或多次传代后不稳定及污染问题导致阳性克隆丢失的问题，本发明利用分子生物学技术，对阳性单克隆细胞株进行重链可变区（mVH）和轻链可变区（mVL）基因扩增，并进行序列测定。

具体方法如下：收集生长状态良好的杂交瘤细胞，利用Thermo公司的Trizol提取杂交瘤细胞总RNA，按南京诺唯赞公司的HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNAwiper)说明书的操作方案将mRNA逆转录为cDNA，-20℃冻存备用。逆转录反应体系为5 μLRNA（2500 ng），10 μL4×gDNA，10 μL 5×supermixⅡ，加ddH₂O补足至50 μL，总反应体积为50 μLL。以cDNA为模板，通过NCBI数据库查找鼠源重链FR1区及铰链区基因序列（NC000078.6），根据序列设计重链PCR引物重链可变区上游引物，重链可变区上游引物如SEQ.ID.NO.3所示，即：CAGGTGCAGCTTGTAGAGAC，重链可变区下游引物如SEQ.ID.NO.4所示，即：CGAGGAGACGGTGACMGTGG；同样通过NCBI数据库查找鼠源轻链FR1区及恒定区基因序列（NC000072.6），设计轻链PCR引物，轻链可变区上游引物如SEQ.ID.NO.5所示，即GAYATTKTGCTCACTCAGTC，轻链可变区下游引物如SEQ.ID.NO.6所示，即：CTTTGGGGTAGAAGTTGTTCAAG，分别PCR获得抗体的轻链和重链片段。按南京诺唯赞公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase说明书的操作方案进行PCR，PCR反应体系为：25 μL 2×Phanta，1 μL dNTP，4 μL 10 μM引物对，4 μL杂交瘤细胞cDNA，1 μL DNApolymerase，15 μL dd H₂O，总反应体积为50 μL。扩增条件为：预变性94℃，3 min；变性94℃，30 s；退火64℃，30 s；延伸72℃，5 min。按照OMEGA公司OMEGA Gel Extraction Kit说明书对PCR产物进行胶回收，进行测序分析，获得杂交瘤细胞的重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，即：EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDKASLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARSKKYGNYTWFAYWGQGTLVTVSA，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，即：DVQMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYIFTFGSGTKLEIKR。

（2）抗HSP90单克隆抗体重轻链可变区序列鉴定

将重链可变区序列克隆入pFUSEss-CHIg-mG2b-TDS（购自Invitrogen公司）载体，轻链可变区序列克隆入pFUSE2ss-CLIg-mk-TDS（购自Invitrogen公司）载体，分别挑取博来霉素与杀稻瘟菌素抗性的菌斑，扩大培养后进行质粒抽提，并进行测序分析，选取测序结果正确的质粒共同转染入人胚胎肾上皮细胞HEK293A（购自中科院昆明细胞库）、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞（购自中科院昆明细胞库），收集48 h后的细胞上清液，4000 g离心30 min，去除上清中细胞等杂质，并用0.45 μm滤器过滤除菌后进行间接ELISA实验，检测上清液中是否存在相应的HSP90抗体。图5是抗HSP90单克隆抗体的特异性鉴定结果；如图5所示，HEK293A及CHO细胞上清液均能够检测到HSP90抗体，表明筛选的抗HSP90单克隆抗体的重、轻链可变区具有较好的特异性且能够通过转染适当的受体细胞如HEK293、CHO细胞等表达出HSP90抗体。

实施例4：HSP90酶联免疫试剂盒（双抗夹心法）

一种HSP90酶联免疫试剂盒（双抗夹心法）包括有：包被有抗HSP90的单克隆抗体、HRP标记的HSP90兔多克隆抗体、重组HSP90蛋白标准品、稀释液、显色液和终止液。

其中，重组HSP90蛋白标准品的制备：

试剂中的重组HSP90蛋白标准品用pET-30a-HSP90（Invitrogen公司）质粒转化入大肠杆菌诱导重组HSP90蛋白在体外进行表达，再通过镍柱亲和层析法获得高纯度的HSP90蛋白。

试剂中HRP标记的HSP90兔多克隆抗体是按照以下方法制备的：

选取新西兰兔（购自南京大学动物模式研究所）作为免疫动物，以重组HSP90蛋白标准品为免疫原进行免疫，免疫剂量为每只兔子每次免疫500 μg的HSP90蛋白。首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫，免疫4~5次，间接ELISA法测定血清效价达到1：10⁵以后，颈总动脉取血，通过硫酸铵法纯化多克隆抗体，分装，于-20°C低温保存用于酶标抗体的制备。其中硫酸铵法纯化抗体具体步骤如下：

a. 抗体血清与PBS缓冲液按体积比1：1混合，随后逐滴加入饱和硫酸铵溶液，充分混合均匀使之成为20％的硫酸铵溶液，静置30 min，于4℃，2500 g离心30 min，弃沉淀，收上清液；

b. 往上清液中继续滴加饱和硫酸铵溶液，使之成为50％的硫酸铵溶液，充分混合，静置30 min，于4℃，2500 g离心30 min，弃上清，收集沉淀；

c. 往沉淀中加入1倍体积的PBS缓冲液，充分溶解沉淀后继续加入硫酸铵溶液，使之成为40％的硫酸铵溶液，充分混合，静置30min，于4℃，2500 g离心30 min，弃上清，收及沉淀，此步骤重复2~3次；

d. 用PBS溶解沉淀，获得多克隆抗体。

将多克隆抗体用辣根过氧化物酶标记，具体标记方法如下：

a. 称取HRP 5 mg溶解于1 mL 0.2 mol/L pH5.6醋酸盐缓冲液中，加入含1% DNFB的无水乙醇溶液0.1 mL，室温下轻微搅拌1 h；

b. 加入0.5 mL新鲜配置的0.1 mol/L NaIO₄溶液，4℃放置30 min，随后加入多克隆抗体5~10 mg，利用碳酸盐缓冲液调整pH值至9.0~9.5，充分混匀， 4℃放置过夜；

c. 加入0.1 mL新鲜配制的4 mg/ml NaBH₄溶液，混匀，于4℃放置3 h；

d. 将上述液体装入透析袋中，于pH7.4，0.01 mol/L的PBS溶液中透析，4℃过夜；

e. 收集透析袋中液体，3000 g离心30 min，去除沉淀物，上清液即为HRP标记的HSP90兔多克隆抗体。

HSP90酶联免疫试剂盒检测HSP90蛋白含量的方法包括如下步骤：

a. 取制备的抗HSP90单克隆抗体用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液包被液稀释为1 μg/mL，包被酶标板，4℃放置过夜；

b. 取出酶标板TBST洗涤一次，加入0.5％BSA封闭，37℃，1 h；

c. 将表达的HSP90蛋白标准品按625 pg/μL、125 pg/μL、25 pg/μL、5 pg/μL、1pg/μL、0.2 pg/μL、0.04 pg/μL、0 pg/μL浓度稀释，每个稀释梯度3个重复孔加入酶标板中，37℃，孵育1 h；

d. TBS-T洗涤3次，将HRP标记的HSP90兔多克隆抗1:1000稀释加入酶标板孔中，每孔100 μL，放入37℃，孵育1 h；

e. 取出TBS-T洗涤5次，加入TMB底物显色液，37℃显色10~15 min。取出，加入2mol/L的硫酸终止液，每孔50 μL。酶标仪（波长450 nm）读取不同蛋白浓度梯度下的OD值；

f. 标准曲线的建立以HSP90蛋白标准品的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标建立标准曲线，方程式y =0.0029x + 0.0832，回归系数R²≥0.99，根据标准曲线计算样品中的HSP90蛋白含量。图6-A是HSP90蛋白酶联免疫双抗体夹心法试剂盒的检测标准曲线图。如图6-A可见，检测的HSP90蛋白具有较好的线性范围，检测灵敏度较高、检测范围广。

实施例5：HSP90酶联免疫试剂盒工作浓度的选择

采用正交试验方法，确定出HSP90酶联免疫试剂盒中抗体的最佳工作浓度。分别将抗HSP90单克隆抗体稀释为3 μg/mL、1 μg/mL、0.3 μg/mL和0.1 μg/mL，HRP标记的HSP90兔多克隆抗体稀释为3 μg/mL、1 μg/mL、0.3 μg/mL和0.1 μg/mL，重组HSP90蛋白标准品浓度为200 pg/μL、40 pg/μL、8 pg/μL和0 pg/μL。经吸光度测定后正交试验摸索酶联免疫试剂盒的抗体最佳工作浓度如表1所示。

表1. 正交试验摸索酶联免疫试剂盒的抗体最佳工作浓度

由表1可见，在不同浓度的标准蛋白组中，抗HSP90单克隆抗体浓度在0.1 μg/mL后检测的吸光度值出现明显减弱趋势，HSP90兔多克隆抗体浓度在1 μg /mL后检测的吸光度值出现明显减弱趋势，则确定抗HSP90单克隆抗体作为包被抗体的最佳工作浓度为0.1~0.3μg/mL ，优选0.1 μg/mL，HRP标记兔多克隆抗体的最佳工作浓度为1-3 μg /mL ，优选1 μg/mL。

实施例6：HSP90酶联免疫试剂盒准确度和精密度的测定

对实施例4中制备的HSP90酶联免疫试剂盒进行准确度及精密度检测，测试中所用血清样品来源于健康志愿者。

a.准确度测定

通过添加回收试验来检测试剂盒的准确度，试验中人血清样品来源于健康志愿者。将不同浓度（100 pg/μL、50 pg/μL、10 pg/μL和0 pg/μL）的重组HSP90蛋白添加到血清样品中，使用实施例4中所制备的试剂盒进行回收率检测，同一浓度样品设3个重复，取平均值，根据标准曲线计算得到各个样品中的HSP90蛋白含量，减去空白血清中的HSP90蛋白含量即得到所测定的HSP90蛋白含量，除以理论添加的蛋白量即为添加回收率。

表2. HSP90蛋白试剂盒准确度测定

由表2可见，结果显示添加回收率为95%-110%，表明所制备的试剂盒的准确度良好，血清基质对检测无明显干扰。

b. 试剂盒的批间差异测定

取5份含有不同HSP90蛋白浓度的血清样品，编号为1~5，分批重复检测5次，每次每个样品设3个重复，取平均值，每次板内设置标准品对照曲线。计算同一份样品5次检测结果间的变异系数（C.V)，检测结果如表3所示。

表3. HSP90蛋白试剂盒的批内重复性试验

由表3可见，5份样品5次检测结果的变异系数平均为11.18%（当C.V > 15％表明不同组别之间差异性较大），说明所制备试剂盒批间差异较小。

实施例7：HSP90酶联免疫试剂盒检测人血清样本中的HSP90蛋白含量的应用

使用实施例4中所制备的试剂盒测定人血清HSP90蛋白含量，共检测20个人血清样品（来自健康的志愿者），结果见表4，在检测的人血清中HSP90蛋白含量范围为1~200 pg/μL，符合人血清中HSP90蛋白含量的正常值范围。以上结果表明，利用本发明试剂盒能定量检测出人血清标本中HSP90蛋白的含量，因此，本发明涉及的ELISA试剂盒灵敏度完全能够满足基础研究和临床诊断需要，对人HSP90蛋白含量进行准确定量测定。

表4.人血清中HSP90蛋白含量测定

实施例8：HSP90酶联免疫试剂盒与市面上已售试剂盒的性能对比

在本实施例中将本申请制备的HSP90酶联免疫试剂盒与烟台普罗吉生物技术公司的试剂盒、美国Thermo Fisher公司的HSP90 ELISA KIT试剂盒以及ProteinTech公司的HSP90 ELISA KIT试剂盒同时对不同浓度HSP90的标准品（625 pg/μL、125 pg/μL、25 pg/μL、5 pg/μL、1 pg/μL、0.2 pg/μL、0.04 pg/μL、0 pg/μL）进行检测，比较其灵敏度及线性检测范围。图6是不同酶联免疫双抗体夹心法试剂盒对HSP90蛋白检测结果图；图中，图A是本申请制备的HSP90酶联免疫试剂盒检测结果图，图B是烟台普罗吉生物技术公司的试剂盒检测结果图，图C为Thermo Fisher公司的试剂盒检测结果图，图D为Protein Tech公司的试剂盒检测结果图；由图6可见，本申请制备的试剂盒在0.04~625 pg/μL检测范围中均有较好的线性，方程式y = 0.0029x + 0.0832，回归系数R²≥0.99；烟台普罗吉生物技术公司的试剂盒检测结果与试剂盒说明书一致，在25~400 pg/μL之间有较好的线性范围；Thermo Fisher公司的试剂盒检测结果与试剂盒说明书基本一致仅在0.2~25 pg/μL之间有较好的线性范围；Protein Tech公司的试剂盒检测结果与试剂盒说明书基本一致仅在0.2~25 pg/μL之间有较好的线性范围。比较此次平行检测的四种不同试剂盒的结果发现，本申请所的制备的HSP90酶联免疫试剂盒对HSP90蛋白的检测具有更宽的线性范围与更高的检测灵敏度。需要说明的是，以上仅是在本司的检测条件下的平行实验的发现，由于实验条件和检测试剂的限制，不一定是这些试剂盒的最优检测效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏莱森生物科技研究院有限公司

<120> 一种抗HSP90单克隆抗体及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Lys Lys Tyr Gly Asn Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggtgcagc ttgtagagac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gayattktgc tcactcagtc 20

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctttggggta gaagttgttc aag 23

序列表

<110> 江苏莱森生物科技研究院有限公司

<120> 一种抗HSP90单克隆抗体及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

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<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

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<211> 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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Claims

1.一种抗HSP90单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备以HSP90为靶点的生物诊断试剂中的用途。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测HSP90抗原的试剂中的用途。

4.一种HSP90蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的抗HSP90单克隆抗体、HRP标记的HSP90兔多克隆抗体、重组HSP90蛋白标准品、稀释液、显色液和终止液。

5.根据权利要求4所述的双抗夹心试剂盒，其特征在于，所述的抗HSP90单克隆抗体的浓度为0.1~0.3 μg/mL。

6.根据权利要求5所述的双抗夹心试剂盒，其特征在于，所述的抗HSP90单克隆抗体的浓度为0.1 μg/mL。

7.根据权利要求4所述的双抗夹心试剂盒，其特征在于，所述的HRP标记兔多克隆抗体的浓度为1-3 μg /mL。

8.根据权利要求7所述的双抗夹心试剂盒，其特征在于，所述的HRP标记兔多克隆抗体的浓度为1 μg /mL。

9.根据权利要求4所述的双抗夹心试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测范围为0.04~625 pg/μL。