CN114720689B

CN114720689B - 半夏凝集素蛋白酶联免疫Elisa试剂盒及应用

Info

Publication number: CN114720689B
Application number: CN202210362218.6A
Authority: CN
Inventors: 郁红礼; 吴皓
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2022-04-07
Filing date: 2022-04-07
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2042-04-07
Also published as: WO2023193376A1; CN114720689A

Abstract

半夏凝集素蛋白酶联免疫Elisa试剂盒及应用，属于生物技术领域，该试剂盒含有单克隆抗体25E2E8和/或单克隆抗体28E3D3，所述25E2E8抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述28E3D3抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，28E3D3抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。本发明试剂盒由PTL的单克隆抗体制备而成，可以达到快速且灵敏地定量检测样品中半夏凝集素蛋白含量。

Description

半夏凝集素蛋白酶联免疫Elisa试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及半夏凝集素蛋白酶联免疫Elisa试剂盒及应用。

背景技术

半夏凝集素蛋白（Pinellia ternate lectin，PTL）属于植物凝集素中的单子叶植物甘露糖结合凝集素蛋白。PTL为氨基酸序列长度为256-258aa，分子量为25-27kDa，等电点为6-7的植物蛋白，具有抗虫、抗真菌、抗肿瘤以及凝血的作用。PTL由天南星科植物半夏的鲜品经过提取纯化得到。

目前某种特定蛋白含量的检测方法常采用Western Blot（免疫印迹）法或ELISA（酶联免疫吸附测定）法。其中Western Blot法过程较为繁琐、耗时长，成本较高、检测线性范围窄，且此法属于半定量方法，多用于两种样品中某种蛋白含量的比较。本发明所述PTL检测试剂盒是以PTL的单克隆抗体为原料制备的ELISA试剂盒，可以用于样品中PTL的定量检测，方法灵敏度高、重复性、特异性好，简便、快速，成本较低，可同时进行大批量样品测定。同时本发明提供的用于制备ELISA试剂盒的抗体为PTL的单克隆抗体，该抗体可用于制备半夏凝集素蛋白检测试剂。

发明内容

解决的技术问题：为了定量检测样品中半夏凝集素蛋白含量，本发明提供半夏凝集素蛋白酶联免疫Elisa试剂盒及应用。

技术方案：半夏凝集素蛋白酶联免疫Elisa试剂盒，含有单克隆抗体25E2E8和/或单克隆抗体28E3D3。

上述25E2E8抗体的重链可变区的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述25E2E8抗体的轻链可变区的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

上述25E2E8抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

编码所述单克隆抗体的核酸分子，所述25E2E8抗体重链的编码基因如SEQ ID NO:9所示；所述轻链的编码基因如SEQ ID NO:10所示。

上述28E3D3抗体的重链可变区的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；所述28E3D3抗体的轻链可变区的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。

上述28E3D3抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示，28E3D3抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。

编码所述单克隆抗体的核酸分子，所述28E3D3抗体重链的编码基因如SEQ ID NO:19所示；所述28E3D3抗体轻链的编码基因如SEQ ID NO:20所示。

上述单克隆抗体在制备半夏凝集素蛋白检测试剂中的应用。

有益效果：本发明提供一种用于检测半夏凝集素蛋白含量的试剂盒，是一种酶联免疫吸附测定试剂盒，由PTL的单克隆抗体制备而成，可以达到快速且灵敏地定量检测样品中PTL含量。

附图说明

图1纯化的单克隆抗体SDS-PAGE图；M. Marker；1. 28E3D3抗体；2. Mouse IgG；3.25E2E8抗体；4. Mouse IgG；

图2为25E2E8抗体Western Blot图；M. Marker；P.PTL；S. 半夏；

图3为28E3D3抗体Western Blot图；M. Marker；P.PTL；S. 半夏。

具体实施方式

以下结合附图和实验例对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实验例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：单克隆抗体制备

（1）免疫原PTL的准备：称取适量半夏鲜品，洗净去皮后，加适量去离子水匀浆，8000 μg·mL^-1离心30 min，取上清，加入饱和硫酸铵至45 %饱和度，搅拌均匀后8000 μg·mL^-1离心20 min，收集沉淀，加适量0.6 mol·L^-1硫酸铵溶液溶解，得到半夏蛋白粗提物。将粗提蛋白分别经疏水层析柱及离子交换柱层析纯化，经分子量为7000 Da的透析袋透析后冻干，得到纯化的半夏凝集素蛋白。

（2）动物免疫：将免疫原PTL溶于磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）。将免疫原溶液与等体积弗氏完全佐剂进行充分乳化，在第0周进行初免，按照每只小鼠250 μg·mL^-1 取进行腹腔注射免疫，免疫5只小鼠。分别在第2周、5周、8周按照每次125 μg·mL^-1的免疫原溶液与弗氏不完全佐剂的乳浊液进行加强免疫；第3周、7周、9周眼眶采血，10000 r·min^-1离心5min，收集血清，采用间接ELISA方法进行血清效价测定（效价：为当待测孔A450值/阴性孔A450值≥2.1(P/N≥2.1)时的抗体最高稀释倍数），终免后5只小鼠的效价均达1:128000，进行下一步细胞融合。

（3）细胞融合及单抗制备：终免4天后用小鼠骨髓瘤细胞（S/P2）和免疫小鼠的脾细胞进行电融合，有限稀释法进行亚克隆，间接ELISA方法筛选特异性抗体，阳性细胞连续亚克隆培养，直至所有孔均为阳性为止，获得分泌单抗的细胞株，得到的细胞株经传代确定为稳定细胞株后，液氮保存。然后使用转瓶培养得到单克隆抗体，并采用Protein A亲和层析进行抗体纯化，通过透析将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液（PBS）中。

实施例2：单克隆抗体亚型的鉴定

使用小鼠抗体亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1亚型鼠源单克隆抗体，轻链类型为κ。

实施例3：单克隆抗体纯度测定

采用SDS-PAGE法分析单克隆抗体纯度。

结果如图1所示，SDS-PAGE分析抗体纯度，在分子量约55kD和24kD处可见重链、轻链两个条带，抗体纯度较高。

实施例4：单克隆抗体的效价测定

采用间接ELISA 法测定抗体效价。采用本发明所述单克隆抗体25E2E8和28E3D3作为捕获抗体，包被酶标板，4℃过夜，使其吸附聚苯乙烯板孔，PBST洗涤1次后封闭2h；PTL从1000ng/mL倍比稀释，加入包被孔，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板4次；分别加入生物素标记的本发明所述单克隆抗体25E2E8、28E3D3，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板4次；加入SA-HRP，100μL/孔，37℃孵育15min，PBST洗板4次；加入TMB显色液显色15min后终止显色，读取OD₄₅₀值，得到单抗腹水效价。

经检测，确定25E2E8、28E3D3的效价均达到1:512000。

实施例5：单克隆抗体特异性反应实验

为验证25E2E8、28E3D3是否特异结合PTL，将本发明所述单克隆抗体25E2E8、28E3D3作为一抗，通过Western blot法检测其特异反应。

经验证，25E2E8、28E3D3均可特异性地与PTL结合，在12kD左右出现特异性条带，说明抗原抗体特异性反应明显，结果如图2、图3所示。

以上所述仅是本发明地优选实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京中医药大学

<120> 半夏凝集素蛋白酶联免疫Elisa试剂盒及应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ala Tyr Ala Trp Asn

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asn Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val

1 5

<210> 4

<211> 459

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile

1 5 10 15

Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro

20 25 30

Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ala Ile Thr

35 40 45

Ser Ala Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Pro

65 70 75 80

Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Phe Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Phe Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Asn Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly

115 120 125

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

130 135 140

Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu

145 150 155 160

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp

165 170 175

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser

195 200 205

Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

210 215 220

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

225 230 235 240

Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser

275 280 285

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

290 295 300

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

305 310 315 320

Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn

325 330 335

Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

340 345 350

Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu

355 360 365

Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe

370 375 380

Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala

385 390 395 400

Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr

405 410 415

Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly

420 425 430

Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His

435 440 445

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Trp Thr

1 5 10

<210> 8

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Phe Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys

100 105 110

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp

165 170 175

Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys

195 200 205

Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys

210 215 220

Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 9

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgagagtgc tgattctttt gtggctgttc acagcctttc ctggtatcct gtctgatgtg 60

cagcttcagg agtcgggacc tggcctggtg aaaccttctc agtctctgtc cctcacctgc 120

actgtcactg gctacgcaat caccagtgct tatgcctgga attggatccg gcagtttcca 180

ggaaacaaac tggagtggat gggctacata agcttcagtg gtagtaccag ctactcccca 240

tctctcaaaa gtcgaatctc tttcactcga gacacatcca agaaccagtt cttcctgcac 300

ttgaattctg tgactactga cgacacagcc acatattact gtgcaaggaa taacttttgg 360

tacttcgatg tctggggcgc agggaccaca gtcaccgtct cctcagccaa aacgacaccc 420

ccatctgtct atccactggc ccctggatct gctgcccaaa ctaactccat gctgaccctg 480

ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc 540

ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc 600

agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc 660

cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag 720

ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag 780

gatgtgctca ccattactct gactcctaag gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag 840

gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag 900

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cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg 1080

tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg 1140

ataacagact tcttccctga agacattact gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg 1200

gagaactaca agaacactca gcccatcatg gacacagatg gctcttactt cgtctacagc 1260

aagctcaatg tgcagaagag caactgggag gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta 1320

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<210> 10

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120

tcttgcagat ctagtcagag ccttctacac agtaacggaa acacctattt acattggtac 180

cagcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatcttca aagtttccaa ccgattttct 240

ggggtcccag acaggttcag tggcactgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300

agagtggagg ctgaggatct gggactttat ttctgctctc aaagtacaca tgttcctccg 360

tggacgttcg gtggaggcac caggctggaa atcaaacggg ctgatgctgc accaactgta 420

tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 480

ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 540

caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 600

agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 660

gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgttag 720

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Asn Tyr Trp Met Ser

1 5

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Ile Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asn Arg Ser Phe Val Tyr

1 5

<210> 14

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Ile Asn Tyr Ala Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

85 90 95

Arg Ser Ser Val Phe Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Arg Asn Arg Ser Phe Val Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

130 135 140

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

210 215 220

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys

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Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe

245 250 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val

260 265 270

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe

275 280 285

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro

290 295 300

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro

305 310 315 320

Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val

325 330 335

Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

340 345 350

Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys

355 360 365

Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp

370 375 380

Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro

385 390 395 400

Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser

405 410 415

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala

420 425 430

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His

435 440 445

His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Ile Gln Lys Asn Tyr Leu

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Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 17

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 18

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Ala Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Lys Ile Thr Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser

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Leu Leu Tyr Ser Ser Ile Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

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Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

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130 135 140

Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys

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165 170 175

Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln

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Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

<210> 19

<211> 1383

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<400> 19

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gtgaagcttg aggagtctgg aggaggcttg gtgcaacctg gaggatccat gaaactctcc 120

tgtattgcct ctggattcac tttcagtaac tactggatga gctgggtccg ccagtctcca 180

gagaagggac ttgagtgggt tgctgaaatt agattgaaat ctattaatta tgcaacactt 240

tatgcggagt ctgtgaaagg gaggttcacc atttcaagag atgattccag aagtagtgtc 300

ttcctgcaaa tgaacaactt aagagctgaa gacactggca tttattactg ttccaggaat 360

cgatcctttg tttattgggg ccaggggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacgaca 420

cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 480

ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 540

tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 600

agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 660

gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgtggttgt 720

aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc 780

aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc 840

aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct 900

cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc 960

atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct 1020

ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag 1080

gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc 1140

atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca 1200

gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta cttcgtctac 1260

agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg 1320

ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa 1380

tga 1383

<210> 20

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggattcac aggcccaggt tcttatgtta ctgctgctat gggcatctgg tacctgtggg 60

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagttgtgt cagttggaga gaaaattact 120

atgagctgca ggtccagtca gagcctttta tatagtagca ttcaaaagaa ctacttggcc 180

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 240

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300

atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 360

cctctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gggctgatgc tgcaccaact 420

gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg gaggtgcctc agtcgtgtgc 480

ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt ggaagattga tggcagtgaa 540

cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca gcaaagacag cacctacagc 600

atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac gacataacag ctatacctgt 660

gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga gcttcaacag gaatgagtgt 720

tag 723

Claims

1.半夏凝集素蛋白酶联免疫Elisa试剂盒，其特征在于，含有单克隆抗体25E2E8或同时含有单克隆抗体25E2E8和单克隆抗体28E3D3，所述25E2E8抗体的重链可变区的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述25E2E8抗体的轻链可变区的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述25E2E8抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

3.编码权利要求2中所述的单克隆抗体25E2E8的核酸分子，其特征在于：所述25E2E8抗体重链的编码基因如SEQ ID NO: 9所示；所述轻链的编码基因如SEQ ID NO:10所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述28E3D3抗体的重链可变区的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；所述28E3D3抗体的轻链可变区的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQID NO:17所示。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述28E3D3抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示，28E3D3抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。

6.编码权利要求5中所述的单克隆抗体28E3D3的核酸分子，其特征在于：所述28E3D3抗体重链的编码基因如SEQ ID NO: 19所示；所述28E3D3抗体轻链的编码基因如SEQ ID NO:20所示。

7.权利要求1中所述的单克隆抗体25E2E8在制备半夏凝集素蛋白检测试剂中的应用。