CN110927387B

CN110927387B - 一种brca2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110927387B
Application number: CN201911088542.8A
Authority: CN
Inventors: 屠志刚; 孙丹琳; 谢旺旺; 刘晗青
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN110927387A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒及其应用。发明通过蛋白酶联免疫双抗体夹心法试剂盒检测组织样本中的BRCA2表达量，检测的灵敏度、准确度高，精密度好，批间变异系数为6.22％，其最低检测浓度为0.1 pg/μl。本发明试剂盒中以BRCA2（348~473AA）肽段和BRCA2（1137~1255AA）肽段为免疫原制备单克隆抗体，特异性结合BRCA2蛋白；本发明所涉及的检测方法简单，易操作，检测成本低，对操作者要求低。

Description

一种BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒及其应用。

背景技术

卵巢癌是最致命的一种妇科癌症，患者五年生存率仅有30％。由于卵巢癌异质性高，病理学机制复杂，常规化疗药物仅能使部分患者的病情较好缓解，且停药后多数患者会经历复发，长期化疗可使癌细胞产生耐药性。因此，寻找新的卵巢癌治疗方法和策略尤为重要。在中国，随着经济的发展和人民生活水平的提高，卵巢癌的发病率正呈上升趋势，因此如何进行卵巢癌的早期预防、早期诊断、早期治疗己经成为卵巢肿瘤研究中的重要研究方向。

大量研究显示卵巢癌的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果，部分卵巢癌的发生有一定的家族遗传倾向。有些卵巢癌是因为患者自身携带有显性遗传并且是高外显率的卵巢癌易感基因突变所致，这些易感基因主要包括BRCA2(GenBank：675)、BRCA1、p53、PTEN、ATM等，其中BRCA2和BRCA1基因的突变最为常见，携带者两个基因致病性突变的女性发生卵巢癌的风险较普通人群明显升高。携带BRCA2基因致病性突变的女性的卵巢癌风险要高得多。

随着人们对卵巢癌认知的不断加深，以及预防手段不断改进，来自卵巢癌高危家庭的女性越来越多地被推荐进行易感基因的检测，以此来评估其患卵巢癌的风险，对其准确、快速的检测对卵巢癌的早期诊断、早期预防的意义十分关键，故急需建立一种简便、高效、可用于对常见样本如血清、体液、组织液等的高通量快速检测的试剂盒和方法。

发明内容

有鉴于此，本发明为解决现有技术中存在的问题，提供了一种BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒及其应用。本发明所述的BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒简便快捷、安全、经济。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

在某一具体实施方式中，本发明提供了一种BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒，所述试剂盒包含特异性结合BRCA2蛋白第348～473AA肽段的包被酶标板抗体和特异性结合BRCA2蛋白第1137～1255AA肽段的检测抗体。所述包被酶标板抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述检测抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。

所述包被酶标板抗体的浓度为1～2μg/mL，优选1μg/mL，所述检测抗体的浓度为1～2μg/mL，优选1μg/mL。

本发明还提供了所述的BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒在BRCA2抗原的免疫检测中的应用。

在某一具体实施方式中，本发明提供一种检测BRCA2蛋白的单克隆抗体，其特异性结合BRCA2蛋白第348～473AA肽段，重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供一种检测BRCA2蛋白的单克隆抗体，其特异性结合BRCA2蛋白第1137～1255AA肽段，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒，所述的试剂盒含有特异性结合BRCA2蛋白第348～473AA肽段的包被酶标板抗体和特异性结合BRCA2蛋白第1137～1255AA肽段的检测抗体。用来检测组织样本中的BRCA2表达量，检测的灵敏度、准确度高，精密度好；制备的试剂盒批间变异系数为6.22％，其最低检测浓度为0.1pg/μl。所提供的试剂盒中分别将348～473AA肽段的BRCA2蛋白和1137～1255AA肽段的BRCA2蛋白为免疫原，特异性结合BRCA2蛋白；本发明所涉及的检测方法简单，易操作，检测成本低，对操作者要求低。

附图说明

图1是重组BRCA2肽段的SDS-PAGE电泳图；

图2是纯化后的BRCA2单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图；

图3是不同稀释度BRCA2单克隆抗体的免疫效价检测结果；

图4是BRCA2单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；

图5是BRCA2蛋白酶联免疫双抗体夹心法试剂盒的检测标准曲线图。

具体实施方式

本发明公开了一种BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

实施例1：抗BRCA2单克隆抗体的制备

(1)重组BRCA2肽段的表达与纯化

分别构建用来表达BRCA2(GenBank，Gene ID：675)多肽片段348～473AA的质粒pET-30a-BRCA2-1和用来表达BRCA2多肽片段1137～1255AA的质粒pET-30a-BRCA2-2，质粒pET-30a-BRCA2-1编码多肽片段的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，质粒pET-30a-BRCA2-2编码多肽片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。将质粒pET-30a-BRCA2-1和质粒pET-30a-BRCA2-2分别转化至感受态大肠杆菌BL21，诱导表达重组蛋白，用镍柱(购自ThermoFisher)纯化蛋白，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达。图1是重组BRCA2肽段的SDS-PAGE电泳图，图中，A是BRCA2重组蛋白的348～473AA肽段，B是BRCA2重组蛋白的1137～1255AA肽段；如图1所示，重组BRCA2片段经纯化能获得较高的纯度，收集蛋白，冻干后进行后续动物免疫。

(2)BALB/c小鼠的免疫与效价检测

所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。按常规方法进行小鼠免疫。用间接ELISA法检测免疫后小鼠血清效价：

将实施例1中纯化后348～473AA肽段的重组蛋白BRCA2片段和1137～1255AA肽段的重组蛋白BRCA2片段免疫BALB/c小鼠。pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将其稀释为1μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000g离心15min分离血清，用样本稀释液(含有0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100μL 1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗(购自Jackson ImmunoResearch公司)，37℃孵育30min。取出酶标板，经TBS-T缓冲液洗涤5次后，每孔加入100μLTMB底物显示液，37℃避光显色10～15min，随后加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1：10⁵以上小鼠，进行第三次免疫。

(3)杂交瘤细胞的融合、筛选

制备饲养层细胞，准备SP2/0骨髓瘤细胞，免疫结束后3～4天后取小鼠脾脏细胞进行细胞融合。融合后的细胞铺板(6块96孔板)，利用间接ELISA法筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞，经过两轮亚克隆，筛选得到分别由重组蛋白BRCA2的348～473AA肽段的和重组蛋白BRCA2的1137～1255AA肽段免疫得到的抗体分泌性最好的杂交瘤细胞株编号为3-5-D7和4-6-C3。

(4)抗BRCA2单克隆抗体的生产及纯化。

按常规方法制备小鼠单克隆抗体腹水，用蛋白G法对腹水抗体进行纯化，抗体纯度经SDS-PAGE电泳验证。如图2所示，3-5-D7和4-6-C3抗体经洗脱后能获得较高的纯度，其中IgG重链约为55KD，IgG轻链约为25KD。

实施例2：单克隆抗体效价测定及特异性

(1)单克隆抗体的效价测定：

用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将重组蛋白BRCA2的348～473AA肽段与重组蛋白BRCA2的1137～1255AA肽段分别稀释为1μg/mL，包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜；用样本稀释液(含有0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)将上述制备的特异性结合BRCA2蛋白第348～473AA肽段的抗BRCA2单克隆抗体(3-5-D7)和特异性结合BRCA2蛋白第1137～1255AA肽段的抗BRCA2单克隆抗体(4-6-C3)分别按1:10³、1:10⁴、1：10⁵、1：10⁶稀释，100μL/孔，37℃孵育1h；取出酶标板，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30min；经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10～15min，随后加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm波长下读取吸光值，图3是不同稀释度BRCA2单克隆抗体的免疫效价检测结果图；如图3所示，纯化后的单克隆抗体的效价均达到1×10⁶。

(2)单克隆抗体特异性结合及交叉反应鉴定：

用碳酸盐缓冲液将HSP90(Abcam公司)、HBEGF(PeproTech公司购买)、EGFR(PeproTech公司购买)、HGF(Thermo Fisher公司购买)蛋白稀释为1μg/mL，包被酶标板，并设置空白对照，空白对照组为1μg/mL BSA蛋白，用BRCA2单克隆抗体进行间接法ELISA检测，图4是BRCA2单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；如图4所示，抗BRCA2单克隆抗体3-5-D7和4-6-C3与HSP90、HB-EGF、EGFR、HGF蛋白之间均无交叉反应，表明制备的抗体的特异性较好。

实施例3：单克隆抗体重轻链可变区的测序

单克隆细胞长期保存，可能由于多次传代后不稳定及污染问题导致阳性克隆丢失，为解决上述问题，本发明利用分子生物学技术，对阳性单克隆细胞株利用Mouse Ig-Primer Set试剂盒(69831，Merck Millipore)，进行重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)基因扩增，并进行序列鉴定。

3-5-D7杂交瘤细胞的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区序列氨基酸序列为SEQ ID NO:4；4-6-C3杂交瘤细胞的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区序列氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

实施例4：BRCA2酶联免疫双抗夹心法试剂盒的制备

(1)辣根过氧化物酶标记的抗体制备

a.称取HRP 5mg溶解于1mL 0.2mol/L pH5.6醋酸盐缓冲液中，加入含1％DNFB的无水乙醇溶液0.1mL，室温下轻微搅拌1h；

b.加入0.5mL新鲜配置的0.1mol/L NaIO₄溶液，4℃放置30min，随后加入5～10mg抗BRCA2单克隆抗体4-6-C3，利用碳酸盐缓冲液调整pH值至9.0～9.5，充分混匀，4℃放置过夜；

c.加入0.1mL新鲜配制的4mg/ml NaBH₄溶液，混匀，于4℃放置3h；

d.将上述液体装入透析袋中，于pH7.4，0.01mol/L的PBS溶液中透析，4℃过夜；

e.收集透析袋中液体，3000g离心30min，去除沉淀物，上清液即为HRP标记的抗BRCA2单克隆抗体4-6-C3。

(2)正交试验摸索酶联免疫试剂盒的最佳抗体组合及工作浓度

采用正交法摸索最佳抗体使用浓度，将抗BRCA2单克隆抗体3-5-D7稀释为2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL和0.25μg/mL，HRP标记的抗BRCA2单克隆抗体4-6-C3稀释为2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL和0.25μg/mL，标准品BRCA2(购自USBiological公司)浓度为16pg/μL、4pg/μL、0.5pg/μL和0.1pg/μL。表1是正交试验摸索酶联免疫试剂盒的最佳抗体组合及工作浓度结果表，如表1所示，在不同浓度的标准蛋白组中，抗BRCA2单克隆抗体3-5-D7浓度在1μg/mL后检测的吸光度值出现明显减弱趋势，HRP标记的抗BRCA2单克隆抗体4-6-C3浓度在1μg/mL后检测的吸光度值出现明显减弱趋势，可以确定抗BRCA2单克隆抗体3-5-D7作为包被酶标板抗体的最佳工作浓度为1～2μg/mL，优选1μg/mL，HRP标记的抗BRCA2单克隆抗体4-6-C3作为检测抗体的最佳工作浓度为1～2μg/mL，优选1μg/mL。

表1.正交试验摸索酶联免疫试剂盒的最佳抗体组合及工作浓度结果

(3)BRCA2蛋白酶联免疫试剂盒主要参数的测定

对试剂盒的主要参数进行测定，包括试剂盒准确度和精密度，具体方法和结果如下：

a.试剂盒的准确度测定

通过添加回收实验来检测试剂盒的准确度，向人卵巢组织样本(由江苏大学附属医院提供)中添加重组BRCA2蛋白，所添加的BRCA2蛋白浓度为8pg/μL、4pg/μL、2pg/μL、1pg/μL、0.5pg/μL和0pg/μL，然后用所制备试剂盒对添加后样品进行检测，根据标准曲线计算得到各个样品中的BRCA2蛋白含量，减去空白血清中的BRCA2蛋白含量即得到所测定的BRCA2蛋白含量，除以理论添加的蛋白量即为添加回收率。

结果见表2，结果显示添加回收率为95％-103％，说明所制备试剂盒的准确度良好，血清基质对检测无明显干扰。

表2.BRCA2蛋白试剂盒准确度测定

b.试剂盒的精密度测定

选择5份含有不同BRCA2蛋白浓度的卵巢组织样本(由江苏大学附属医院提供)，平行在5块酶标板检测，每块板上每个样品重复3次，各板分别设置标准品对照曲线，分别计算每个检测结果的变异系数C.V，C.V＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％，见表3，平均变异系数为6.22％(当C.V>15％表明不同组别之间差异性较大)，说明所制备试剂盒有很好的重复性。

表3.BRCA2蛋白试剂盒的批内重复性试验

(4)ELASA法检测样本中BRCA2蛋白含量的方法的建立

a.抗BRCA2单克隆抗体3-5-D7用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液包被液稀释为2μg/mL，包被酶标板，4℃放置过夜。

b.取出酶标板TBST洗涤一次，加入0.5％BSA封闭，37℃，2h

c.将BRCA蛋白标准品从16pg/μL、8pg/μL、4pg/μL、2pg/μL、1pg/μL、0.5pg/μL、0.25pg/μL、0.1pg/μL倍比稀释，每个稀释梯度3个重复孔加入酶标板中，37℃，孵育1h。

d.取出TBST洗涤3次，将HRP标记的抗BRCA2单克隆抗体4-6-C3抗体1:1000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1h。

e.取出TBST洗涤5次，加入TMB底物，37℃显色20min。取出，加终止液，酶标仪(波长＝450nm)读取不同蛋白浓度梯度下的OD值。

f.标准曲线的建立以BRCA2蛋白标准品的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标建立标准曲线图5是BRCA2蛋白酶联免疫双抗体夹心法试剂盒的检测标准曲线图；如图5所示，方程式y＝0.017x+0.014，回归系数R²≥0.99，根据标准曲线计算样品中的BRCA2蛋白含量。测定试剂盒的线性范围是0.1-16pg/μL。

实施例5：BRCA2蛋白酶联免疫检测试剂盒检测人血清中BRCA2蛋白含量

BRCA2蛋白酶联免疫检测试剂盒测定人卵巢组织BRCA2蛋白含量，本实施例采用3例正常卵巢组织样本和10例肿瘤卵巢组织样本(由江苏大学附属医院提供，病理情况由病理医生鉴定确认)。取50mg组织，加入1.5ml的EP管中，随后加入1ml的预冷PBS，加入磁珠后匀浆机匀浆(300Hz，30s)。冰上静置30分钟后，然后用高速低温离心机在4℃离心(10000g，10min)，取上清液作为检测样品。表4是人卵巢组织中BRCA2蛋白含量测定表，如表4所示，利用本发明试剂盒能定量检测出人卵巢组织中BRCA2蛋白的含量，因此，本发明涉及的ELISA试剂盒灵敏度完全能够满足基础研究和临床诊断需要，对人BRCA2蛋白含量进行准确定量测定。

表4.人卵巢组织中BRCA2蛋白含量测定

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

序列表

<110> 江苏大学

<120>一种BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgaaagaaa aatactcatt tgtatctgaa gtggaaccaa atgatactga tccattagat 60

tcaaatgtag caaatcagaa gccctttgag agtggaagtg acaaaatctc caaggaagtt 120

gtaccgtctt tggcctgtga atggtctcaa ctaacccttt caggtctaaa tggagcccag 180

atggagaaaa tacccctatt gcatatttct tcatgtgacc aaaatatttc agaaaaagac 240

ctattagaca cagagaacaa aagaaagaaa gattttctta cttcagagaa ttctttgcca 300

cgtatttcta gcctaccaaa atcagagaag ccattaaatg aggaaacagt ggtaaataag 360

agagatgaag agcagcat 378

<210> 2

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgcagaaga gtacatttga agtgcctgaa aaccagatga ctatcttaaa gaccacttct 60

gaggaatgca gagatgctga tcttcatgtc ataatgaatg ccccatcgat tggtcaggta 120

gacagcagca agcaatttga aggtacagtt gaaattaaac ggaagtttgc tggcctgttg 180

aaaaatgact gtaacaaaag tgcttctggt tatttaacag atgaaaatga agtggggttt 240

aggggctttt attctgctca tggcacaaaa ctgaatgttt ctactgaagc tctgcaaaaa 300

gctgtgaaac tgtttagtga tattgagaat attagtgagg aaacttctgc agaggta 357

<210> 3

<211> 123

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

Glu Ala Ile Gly Ala Cys Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Leu

1 5 10 15

Ile Met Ser Leu Gly Leu Ser Cys Phe Leu Ser Ser Gly Phe Thr Phe

20 25 30

Thr Asp Tyr Tyr His Ile Glu Gly Gly Gln Leu Pro Gly Ile Leu Leu

35 40 45

Ile Met Leu Gly Phe Ile Gly Asp Gly Ala Ile Tyr Val Tyr Val Glu

50 55 60

Tyr Ser Ala Ser Val Ile Gly Gly His Ile Glu Gln Gly Asp Thr Ser

65 70 75 80

Gln Gly His Ile Thr Leu Gln Met Thr Thr Leu Gly Thr Glu Ile Ala

85 90 95

Phe Leu Tyr Tyr Cys Ala Thr Leu Ile Tyr Gly Ile Leu Leu Gln Ile

100 105 110

Val Gly Gln Gly Thr Leu Lys Met Met Tyr Ala

115 120

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Asp Thr Leu Met Phe Gln Thr Leu Leu Glu His Ile Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Tyr Val Ile Ala Thr Leu Glu Ile Ala

20 25 30

Thr Gly Thr Thr Tyr Leu His Val Tyr Leu Gln Lys Leu Gly Gln Ala

35 40 45

Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ala Thr Arg Phe Ala Gly Val Leu

50 55 60

Asp Arg Phe Ala Gly Gly Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile

65 70 75 80

Ala Arg Leu Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ala Gln Ser

85 90 95

Thr His Ile Leu Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Ile Leu Glu Ile Ile

100 105 110

Arg

<210> 5

<211> 118

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

Glu Ile Leu Val Ala Gly Ala Gly Leu Glu Val Val Ile Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ala Val Ile Val Ala Cys Ile Ala Ala Gly Tyr Val Phe Thr Ala Thr

20 25 30

His Met Phe Val Val Ile Gln Ala His Ile Leu Val Ala Gly Val Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Leu Tyr Asn Gly Asp Thr Tyr Tyr Thr Gln Ile Phe

50 55 60

Ile Gly Ile Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ala Ala Ala Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ala Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ala Leu Gly Ala Thr Ala Met Asp Leu Val Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ala Val Thr Val Ala Ala

115

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Leu Leu Ala Leu Leu Val Ala Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ala Ile Ala Cys Gly Ala Ala Gln Ala Leu Leu His Ala

20 25 30

Ile Leu Val Ala Phe Leu His Val Tyr Leu Gln Gly Leu Gly Gln Ala

35 40 45

Leu Ile Leu Leu Ile Tyr Ile Val Ala Thr Arg Phe Ala Gly Val Leu

50 55 60

Asp Gly Phe Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile

65 70 75 80

Ala Gly Val Glu Ile Leu Val Ala Gly Val Tyr Phe Cys Ala Gln Ala

85 90 95

Thr His Val Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly

Claims

1.一种BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含包被酶标板单克隆抗体和检测单克隆抗体，所述包被酶标板单克隆抗体特异性结合BRCA2蛋白第348~473AA肽段，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述检测单克隆抗体特异性结合BRCA2蛋白第1137~1255AA肽段，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒，其特征在于，所述酶标板抗体的浓度为1~2μg/mL。

3.根据权利要求1所述的BRCA2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒，其特征在于，所述检测抗体的浓度为1~2μg/mL。

4.一种检测BRCA2蛋白的单克隆抗体的组合，其特征在于，所述组合包括特异性结合BRCA2蛋白第348~473AA肽段的单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；还包括特异性结合BRCA2蛋白第1137~1255AA肽段的单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。