CN108004214B - Homer2单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了Homer2单克隆抗体及其应用。本发明提供两株能稳定分泌特异性识别Homer2蛋白的单克隆抗体Homer2 2B7及Homer2 2F8的杂交瘤细胞株，其保藏编号分别为CCTCC No:C2017193、CCTCC No:C2017195。利用本发明提供的能够识别不同天然Homer2蛋白抗原位点的单克隆抗体制备了用于检测Homer2蛋白的免疫检测工具，含Homer2 2B7及Homer2 2F8的免疫组化试剂盒。本发明的双抗夹心ELISA方法批内变异系数为9.7%，其最低检测浓度为32.23 pg/ml。因此本发明的单克隆抗体具有更广泛的应用空间。

Description

Homer2单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及Homer2 的单克隆抗体，产生该抗
体的杂交瘤细胞株，以及该抗体的免疫检测用途。
背景技术
Homer蛋白是在细胞内信号转导过程中非常重要的一种骨架蛋白，它参与了许多神经细胞的活动，包括调节钙离子的平衡及学习与记忆过程中突触重塑的细胞骨架的构成等。Homer蛋白家族包括了三个成员，Homer1、Homer2和Homer3，他们通过外显子不同的剪接，有形成了多种亚型。所有的亚型都含有N-端的EVH1区域，该区域可以和mGluR、IP3R、TRPC等富含脯氨酸蛋白结合，长型Homer蛋白在C-端存在CC区域，通过CC区域Homer蛋白之间可以形成同源或异源二聚体，而短型的Homer不存在CC-区域，则不能形成二聚体，但可以通过其EVH1区域与长型Homer竞争与富含脯氨酸的受体蛋白结合，从而来调节mGluR、IP3R、TRPC等受体的功能。Homer2蛋白广泛存在于神经、免疫及骨骼肌等系统中，调节着不同组织的生理病理过程。例如，通过调节体内钙离子的信号，参与体内众多生理和病理过程，研究报道骨架蛋白Homer2通过竞争性结合钙调磷酸酶（NFAT）和蛋白激酶B（AKT），而抑制T细胞活性，从而调节人体的免疫功能。本实验室的前期研究表明在大动脉粥样硬化性卒中的病人白细胞中Homer2信使RNA的表达水平显著增高，并且对于大动脉粥样硬化性卒中具有良好的诊断价值。近年来Homer2蛋白的功能的研究在世界范围内正广泛的开展，但在市场上还缺少针对Homer2蛋白的单克隆抗体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供两株能稳定分泌特异性识别Homer2蛋白不同位点的单克隆抗体Homer2 2B7及Homer2 2F8的杂交瘤细胞株以及该两种单克隆抗体在制备用于检测Homer2蛋白的免疫检测工具中的应用。本发明的单克隆抗体效价高、特异性强，因此具有更广泛的应用空间。
为实现上述目的本发明提供以下技术方案：
在本发明的第一方面，提供分泌Homer2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：C2017193和CCTCC NO：C2017195，均是His-Homer2免疫小鼠后至尾血效价检测达1:25600后，加强免疫后进行细胞融合，His-Homer2（110-354aa）肽段筛选获得，Homer2对应的氨基酸序列为SEQ NO:1，Homer2（110-354aa）的氨基酸序列对应SEQ NO:1的第110aa-354aa。
在本发明的第二方面，提供一种Homer2单克隆抗体Homer2 2B7，由编号为CCTCCNO：C2017193的杂交瘤细胞株分泌。
在本发明的第三方面，提供一种Homer2单克隆抗体Homer2 2F8，由编号为CCTCCNO：C2017195的杂交瘤细胞株分泌。
在本发明第四方面，提供单克隆抗体Homer2 2B7和Homer2 2F8在制备用于检测Homer2蛋白的免疫检测工具中的应用。
优选地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
优选地，所述试剂盒为定量检测Homer2蛋白含量的双抗夹心酶联免疫（ELISA）试剂盒，优选地，Homer2 2F8作为包被酶标板的抗体，Homer2 2B7作为检测抗体。
由于Homer2与Homer1、Homer3在N端均含有同源性较高的EVH1区域，为了保证本发明的单克隆抗体对Homer2的特异性，本发明选用重组的人Homer2（110-354aa）特异性片段作为筛选片段。本发明筛选获得的能够识别Homer2天然蛋白不同位点的抗体对，具有特异性强的特点；在间接ELISA实验中，本发明抗体的效价达到1：1.024*106，具有效价较高的特点；通过免疫组织化学的方法，可以观察到本发明的Homer2单克隆抗体特异性识别肝癌细胞HepG2中的Homer2蛋白。本发明的双抗夹心ELISA方法批内变异系数为9.7%，且热稳定性良好，其最低检测浓度为32.23 pg/mL。Homer2蛋白在神经、肌肉及免疫等系统的生理病理过程中扮演着重要的角色，且具体的机制尚有待于进一步研究，因此本发明的单克隆抗体将在Homer2功能的研究领域具有广泛的应用空间。
保藏信息
用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为:
保藏单位全称: 中国典型培养物保藏中心；
保藏单位简称：CCTCC；
保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；
保藏日期：2017年9月20日；
培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株Homer2 2B7，保藏编号：CCTCC NO：C2017193；
和
培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株Homer2 2F8，保藏编号：CCTCC NO：C2017195。
附图说明
图1 为western blot结果验证本发明单克隆抗体的特异性。
图2为免疫组织化学法验证本发明的单克隆抗体对人肝癌细胞HepG2中的Homer2蛋白的表达。
图3为双抗夹心ELISA法检测Homer2标准品蛋白，并绘制标准品曲线。
图4为使用本发明研制的Homer2双抗夹心试剂盒检测小鼠不同组织中的Homer2蛋白含量。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。未注明来源的实验用品均为市售。
【实施例1】 抗Homer2单克隆抗体的制备
一、His-Homer2 全长、His-Homer2（110-354aa）重组表达载体的构建。
从人肝组织中提取RNA，逆转录为cDNA，设计特异性PCR引物，克隆得到His-Homer2全长和His-Homer2（110-354aa）对应的DNA序列，His-Homer2 全长和His-Homer2（110-354aa） DNA片段重组入pET28a载体，构建pET28a -Homer2 及pET28a -Homer2（110-354aa）；DNA测序验证序列的准确性。
二、His-Homer2及His-Homer2（110-354aa）重组蛋白的表达与纯化。
1、转化Rosetta大肠杆菌表达目标重组蛋白：
采用42℃热激90s 的方法将重组质粒转化Rosetta大肠杆菌，挑取抗卡那霉素抗性的菌斑，DNA测序验证该菌落转化成功，放大培养至300mL LB培养基中，当菌液的OD为0.6-0.8时加入IPTG诱导目标蛋白的表达。30℃培养5小时后，收取菌体，超声破菌，离心收集上清。
2、重组蛋白纯化：
将菌体裂解液上清加入Ni-NTA琼脂糖凝胶中，4℃结合过夜，弃去上清。用5-10体积的10mM咪唑缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白。然后依次用20、50、250mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的特异性以及浓度。纯化得到的His-Homer2及His-Homer2（110-354aa）融合蛋白用于单克隆抗体制备中的免疫及筛选，His-Homer2同时用作双抗夹心ELISA实验中的标准品蛋白。
三、Bacl/c小鼠的免疫与效价检测。
1、选取Balb/c(8-12周龄)小鼠5只（来自湖北省疾控中心）。
2、 首次免疫： 取重组His-Homer2融合蛋白200μg，用PBS稀释到1000μL，加入1000μL的弗氏完全佐剂。搅拌乳化40 min，每支注射器分装400μL，首次皮下多位点免疫Balb/c小鼠。
3、 第二次免疫 ：两周后同样取重组His-Homer2融合蛋白200μg，加PBS稀释到1000μL，加入等体积的弗氏不完全佐剂。搅拌乳化40 min，每支注射器分装400μL，第二次皮下多位点免疫Balb/c小鼠。
4、第三次免疫： 两周后进行，方法同第二次免疫。
5、第四次免疫 两周后进行，方法同第二次免疫。
6、 测量第四次免疫后小鼠血清效价：
取重组His-Homer2融合蛋白用CB稀释（pH=9.0）为2μg/mL包被酶标板，每孔100μL。4℃包被过夜。取出包被过夜的酶标板，TBST洗涤后，用5％的脱脂奶粉封闭，37℃温育2 h；取出板条TBST洗三遍，4℃贮存待用。第四次免疫后3天，从小鼠尾部取血适量，12000 r/min离心2 min后取上清。首先用样本稀释液将上清稀释为1:800，然后进行倍比稀释1:1600、1:3200、1:6400、1：12800、1:25600。加入封闭后的酶标板，每孔100μL。37℃，孵育1 h。取出TBST洗三遍，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，1:5000稀释，100μL/孔，37℃孵育40min。取出板条，TBST洗涤5遍，加入TMB底物，90μL每孔。37℃孵育20 min。取出加入终止液，在酶标仪450 nm波长处测量OD值。选取效价高于1:25600的小鼠，作为细胞融合脾脏的来源。
7、 强化免疫：
细胞融合前3天进行，挑选出的血清效价较高的小鼠，取重组His-Homer2融合蛋白100μg , PBS稀释终体积为200μL，注射入小鼠腹腔。
四、杂交瘤细胞的融合、筛选与贮存
1、饲养层细胞的制备：
取成年未免疫Balb/c小鼠，拉颈处死，75％酒精中浸泡5 min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上。用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，用镊子撕开，暴露出腹部肌肉。用5 mL注射器吸取5 mL RPMI1640培养液，注射入小鼠腹腔，待腹腔胀大后，用酒精棉对其腹部进行按摩以使RPMI1640培养液充分进入腹腔各处后，小心吸出RPMI1640培养基并注入50 mL离心管中；继续打开小鼠腹腔，取出小鼠脾脏，置入匀浆器中，加入5mL RPMI1640培养基，充分研磨后（组织变白）再加入5 mL RPMI1640 培养液重悬，静置5 min，吸出细胞悬液于上述50mL离心管里，混匀，1500 rpm，离心5 min，弃上清，100 mL 20%胎牛血清的HAT RPMI1640培养基重悬。放入37 ℃CO2培养箱中，温育待用。
2、 准备SP2/0骨髓瘤细胞：
复苏一支8AG筛选过的SP2/0骨髓瘤细胞于10 cm培养皿中，用10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养。第二天观察细胞状态与密度，当细胞铺满培养皿80％进行传代。细胞融合时，取4-6皿SP2/0骨髓瘤细胞弃去培养基，用2 mL预先37℃温育1640培养基把细胞吹打下来，放入离心管中，再加入10 mL RPMI1640培养基，吹打均匀。1500 r/min，离心5 min，弃去上清，待用。
3、免疫后的小鼠脾脏细胞的制备：
取重组His-Homer2融合蛋白强化免疫后的小鼠，拉颈处死，75％酒精中浸泡5 min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上。用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，然后用镊子撕开，暴露出腹部肌肉。然后打开腹腔，取出小鼠脾脏，置入5 mL RPMI1640培养基于匀浆器中，充分研磨后再加入5 mL RPMI1640培养基重悬，静置5 min，吸出细胞悬液于上述50 mL离心管里（弃去沉淀），混匀，1500 r/min，离心5 min，弃上清。
4、 细胞融合：
在细胞计数板上计数脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的密度，根据脾细胞的数量确定使用SP2/0骨髓瘤细胞的数量，确保脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞数量之比在5:1左右。用5 mL预先37℃温育的RPMI1640培养基重悬免疫过的脾细胞沉淀。然后将重悬的脾细胞加入SP2/0骨髓瘤细胞中，加入40 mL RPMI1640培养基，吹打均匀。1500 r/min，离心5 min，弃去上清，用手指轻轻击打离心管底部，使细胞分布均匀、蓬松。取出37℃温育的1 mL 50%PEG4000，混匀后吸出，将50% PEG4000逐滴加入混合的细胞中，加入过程中要轻轻混匀，控制滴速，此过程尽量把时间控制在1 min左右，静置1 min。取出37℃预先温育的终止液（RPMI1640培养基）40 mL，然后在第1min逐滴加入1 mL，均匀滴入，边滴加边缓慢旋转混匀，第2 min加入2 mL终止液，第3min加入3 mL终止液，此后以适当加快速度，共加入40 mL终止液，注意此过程先慢后快。轻轻混匀，800 r/min，离心5 min，弃去上清。
5、铺板：
用加入饲养层细胞的20%胎牛血清的HAT RPMI1640培养基重悬上述融合细胞，然后移入HAT培养基的血清瓶中，混匀。取96孔培养板5块，然后将细胞培养液加入96孔培养板中，每孔200μL。放入37℃ CO2培养箱中培养。
6、筛选稳定产生单克隆抗体的杂交瘤细胞：
首先包被测量细胞上清效价的酶标板，方法如下：用CB包被液（pH=9）将重组His-Homer2（110-354aa）融合蛋白稀释为2μg/mL，以每孔100μL包被酶标板，4℃，过夜。第二天取出，弃去包被液，每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，37℃孵育2 h。取出TBST洗3遍，放置4℃待用。
7、 第一次克隆化：
细胞融合后第5天可以在显微镜下看到4、5个细胞聚集在一起的细胞集落，进行第一次换20%胎牛血清HAT RPMI1640培养基，吸出80μL，然后加入100μL 20%胎牛血清HATRPMI1640培养基。第7天进行第二次换液，换液方法同上。第9天进行第三次换液。第10天，细胞集落差不多铺满1/10孔，从每个孔里取出50μL加入酶标板中进行效价检测。分光光度计检测每个孔的吸光度。选取吸光度值在2.0以上的细胞孔，显微镜下观察对应孔是否有明显的细胞集落。选取其中存在细胞集落的细胞孔，采用有限稀释法进行克隆化。首先制作饲养层细胞，用RPMI1640培养液稀释为50 mL，每孔加入100μL，置于37℃ CO2培养箱待用。然后稀释杂交瘤细胞：将目标孔的杂交瘤细胞吹打均匀，吸取100μL加入900μL的20％胎牛血清HT RPMI1640培养基中，在显微镜下进行计数，根据细胞密度，将细胞稀释到1000个/mL，然后吸取50μL加入到放有5 mL的20％胎牛血清HT 的RPMI1640培养液培养基的青霉素瓶中。将青霉素瓶中的细胞混匀，加入铺有饲养层细胞的96孔板中，每孔100μL，即预期1个细胞每孔，每个原始孔杂交瘤细胞铺48孔，置入37 ℃ CO2培养箱中培养。
8、换液方法同上，将20%胎牛血清HAT RPMI1640培养液换为20%胎牛血清HTRPMI1640培养液，待细胞培养板中细胞铺满1/10孔，进行第二次克隆化。第二次亚克隆后将培养基换为20％胎牛血清RPMI1640培养液。比对细胞集落与效价检测的结果，如果出现假阳性或假阴性，则继续进行克隆化，如果未出现假阴性和假阳性，则克隆化完成。选取若干个具有单细胞集落的细胞孔，吹打均匀细胞,转移入预先铺有滋养层细胞的24孔板中。最终本发明得到Homer 2B7、2F8，4B7，5C1这4株杂交瘤细胞株。
9、确定亚型：
当24孔板中的细胞达到一定的密度后，吸取50μL细胞上清，放入预先用1μg/mL 重组His-Homer2（110-354aa）融合蛋白包被、封闭过的酶标板中，37℃温育1h，TBST洗涤后，加入标记HRP羊抗鼠免疫球蛋白亚型二抗，1:1000稀释。37℃温育40 min。TBST洗涤5遍后，加入底物TMB，37℃温育20 min显色，酶标仪450 nm波长处测量OD值，确定单克隆抗体的亚型。结果显示本发明单克隆抗体Homer2 2B7和Homer2 2F8的亚型均为IgG1型。
10、杂交瘤细胞保藏：本发明的杂家瘤细胞保藏于液氮中。
五、腹水的获得与单克隆抗体的纯化
1、取8周龄的雌性Balb/C小鼠腹腔注射0.5 mL弗氏不完全佐剂，7-12天后，将扩大培养的杂交瘤细胞用PBS悬浮，每只小鼠腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。注射杂交瘤细胞7天后，小鼠腹部明显膨大，此时用无菌注射器抽取腹水，置离心管中4000 rpm 4℃离心10min。收集上清，即得到了单克隆抗体腹水。
2、腹水纯化：
①用1% NaAc平衡Protein G 琼脂柱料填充的柱子。②将腹水用孔径为0.2um的滤膜过滤，腹水用1% NaAc稀释，然后加入平衡过的柱子中，用阀门控制流速。③腹水上样完毕后，然后用1% NaAc洗涤，G250检测洗涤液，不变蓝为止。④用3.5％的冰乙酸（用饱和NaCO3调节pH为6-7之间）溶液洗脱单克隆抗体，G250检测洗脱液，不变蓝为止。⑤将洗脱液放入超滤管中4℃ 3500 rpm离心30 min。⑥将超滤后的洗脱液吸入透析袋中，PBS透析过夜。PAGE胶鉴定单克隆抗体纯度及浓度，将纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
【实施例2】 单克隆抗体特异性及效价
一、Western blot实验
1、将Homer1、Homer2、Homer3转染的293T细胞以及小鼠的皮质、小脑、海马、小肠、肺脏和肝脏组织用RIPA裂解液裂解。12000 r/min，4℃离心20 min。收集上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度。
2、将细胞及组织裂解液加入12％ PAGE中，120V电泳1h。然后将PAGE胶置于PVDF膜上，40mA转膜90 min。
3、将PVDF膜放入1％的酪蛋白中室温封闭1h。然后分别用1:2000本发明的Homer22B7及市售的Homer多克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜。
4、取出PVDF膜PBST漂洗3次，每次3min。置于1:5000稀释的HRP标记的对应的二抗中室温孵育1h。弃去二抗， PBST洗涤5次，每次5min。
5、将DAB试剂盒中A液与B液1:1混合，避光，混匀，将膜加入显色液中避光显色15min左右终止反应，记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。
6、如图1所示，相对于Homer 多克隆抗体，本发明的Homer2 2B7单克隆抗体能够特异性识别Homer2蛋白，并且能够用于检测小鼠皮质、海马、小肠、肺脏和肝脏组织组织中的Homer2蛋白。
二、细胞免疫化学实验 1、将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/mL的细胞密度将HepG2肝癌细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 2、PBS清洗标本 3次 各 1 min。 3、4%多聚甲醛固定 15 min。 4、PBS清洗标本3次 各 2 min。 5、0.5%Triton X-100( DPBS配 ) 孵育 1次 20 min。 6、PBS清洗标本 3次各 2 min。 7、3%H2O2孵育 15 min。 8、DPBS清洗标本 3次 各 2 min。 9、封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液） 20min。 10、去除封闭液，勿冲洗，加入 1:150 比例稀释的本发明单克隆抗体Homer2 2B7；置于湿盒中，37℃孵育 60min。PBST（含0.1%Tween-20）洗涤 2 次，每次洗涤 5min。PBST（含0.02%Tween-20）洗涤1次，每次洗涤5min。 11、二抗工作液孵育，37℃1小时，使用 PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 12、应用 DAB 溶液显色，显色 3~10min。蒸馏水洗涤。 13、苏木精复染细胞核1min，蒸馏水漂洗，1% 盐酸分化。蒸馏水漂洗 3 次，室温静置1min。 14、脱水和透明：75％乙醇 5min，100% 乙醇 5min×3 次，85％乙醇 5min，95％乙醇5min，100％乙醇 3×5min ；二甲苯 3×5min，中性树胶封片。 15、镜检，结果如图2所示，相比于非免疫小鼠血清的对照组，本发明的Homer2 2B7单克隆抗体能够特异性识别肝癌细胞HepG2中的Homer2蛋白。
三、单克隆抗体的效价
1、取His-Homer2融合蛋白2μg/mL作为包被酶标板，5% 脱脂奶粉封闭后间接ELASA法检测纯化后单克隆抗体的效价。
2、把本发明的单克隆抗体Homer2 2B7做1:1000、1:2000、1：4000、1：8000、1:16000、1:32000…1:2.048×106 倍比稀释，PBS做阴性对照，每孔100μL，加入酶标板中，37℃温育1 h。
3、TBST洗涤后，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育40 min；
4、TBST洗涤后TMB底物显色，20 min后终止液终止反应。酶标仪读取450 nm波长处的OD值，P/N>2.1作为cut-off值，检测结果显示，本发明的Homer2 2B7单克隆抗体的效价达到1：1.024×106。
【实施例3】双抗夹心试剂盒的制备
一、筛选识别Homer2不同抗原表位的抗体对
1、选取Homer 2B7、2F8，4B7，5C1四株不同原始孔来源单克隆抗体分别标记生物素，两两之间互相作为包被抗体和检测抗体，进行双抗夹心ELISA。取未标记的单克隆抗体2μg/mL、4μg/mL包被酶标板，4℃ 放置过夜。取出TBST洗涤一次，加入2％ BSA封闭，37℃ ，2h。
2、将原核表达的His-Homer2蛋白标准品稀释为500 pg/mL，每孔100μL加入酶标板，同时用标准品蛋白稀释液做阴性对照，37℃，孵育1 h。
3、取出酶标板TBST洗涤3次，分别将标记生物素的Homer2单克隆抗体1:1000、1:2000、1:4000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1 h。
4、取出洗涤三次，加入1:4000稀释的Avidin-HRP，每孔100μL，37℃孵育1h。
5、取出TBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色20 min。取出，加终止液。酶标仪（波长=450 nm）读取不同蛋白浓度梯度下的OD值。根据标准品的OD值与阴性对照孔的背景值，选择出最为理想的单克隆抗体对，即Homer2 2F8作为包被抗体，Homer2 2B7作为检测抗体。
二、ELASA法检测样本中Homer2蛋白含量的方法的建立
1、本发明的Homer2 2F8单克隆抗体用CB（pH=9）包被液稀释为2μg/mL，包被酶标板，4℃ 放置过夜。取出TBST洗涤一次，加入2％ BSA封闭，37℃ ，2 h。
2、将原核表达的His-Homer2蛋白标准品从2500 pg/mL、1250 pg/mL、625 pg/mL、312.5 pg/mL、156.25 pg/mL、78.13 pg/mL倍比稀释，每个稀释梯度3个重复孔加入酶标板中，37℃，孵育1 h。
3、取出TBST洗涤3次，将连接生物素的Homer2 2B7单克隆抗体1:4000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1 h。
4、取出洗涤三次，加入1:4000稀释的Avidin-HRP，每孔100μL，37℃孵育1 h。
5、取出TBST洗涤五遍，加入TMB底物，37 ℃显色20 min。取出，加终止液。酶标仪（波长=450 nm）读取不同蛋白浓度梯度下的OD值，绘制出OD值与Homer2蛋白浓度的关系曲线图,用于计算样本中Homer2蛋白的含量。本发明的双抗夹心ELISA试剂盒的最低检测浓度为32.23pg/mL。
三、确定本发明的双抗夹心试剂盒的批内变异系数
1、本发明的Homer2 2F8单克隆抗体用CB（pH=9）包被液稀释为2μg/mL，包被酶标板，4 ℃ 放置过夜。
2、取出TBST洗涤一次，加入2％ BSA封闭，37℃ ，2 h。
3、取出TBST洗涤3次，加入300 pg/mL His-Homer2标准品，20个重复孔，37℃，孵育1 h。
4、取出TBST洗涤3次，将连接生物素的Homer2 2B7单克隆抗体1:4000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1 h。
5、取出洗涤三次，加入1:4000稀释的Avidin-HRP，每孔100μL，37℃孵育1 h。
6、取出TBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色20 min。取出，加终止液。酶标仪（波长=450 nm）读取检测样本OD值。根据300 pg/mL His-Homer2标准品20个重复孔OD值，计算出该批内ELISA试剂盒的变异系数CV=SD/X¯×100％。本发明的双抗夹心试剂盒的批内变异系数为9.7%。
四、确定本发明的双抗夹心ELISA试剂盒的热稳定性
1、本发明的Homer2 2F8单克隆抗体用CB（pH=9）包被液稀释为2μg/mL，包被酶标板，4℃ 放置过夜。取出TBST洗涤一次，加入2％ BSA封闭，37 ℃ ，2 h。
2、取出TBST洗涤3次。加入浸板液，37℃孵育2 h，取出酶标板，弃去浸板液。
3、倍比稀释标准品蛋白2500 pg/mL、1250 pg/mL、625 pg/mL、312.5 pg/mL、156.25 pg/mL、78.13 pg/mL。同时稀释标准品蛋白浓度为500ng/mL作为待测样本。进行首次双抗夹心ELISA。
4、然后将浸板完成的酶标板置入37℃恒温箱中，分别在第1天、第3天和第7天进行双抗夹心ELISA实验。
5、根据比较置于37℃中不同天数的标准品蛋白的OD值，分析本发明的双抗夹心ELISA试剂盒的热稳定性。结果显示相对于第1天的检测结果第3天和第7天的检测结果分别降低5.6%和11.1%，提示本发明的双抗夹心试剂盒热稳定性良好。
五、采用本发明建立的双抗夹心ELISA的方法检测小鼠组织中的Homer2蛋白的含量
1、取昆明小鼠取出其肝、肾、肺、脑组织，PBS清洗后，置入研钵中，加入液氮研磨粉末后，收集入EP管中，加入适量PBS（含1％蛋白酶抑制剂PMSF），反复吹打混匀后，13000 rpm，4℃离心20 min，取上清。BCA试剂盒检测小鼠裂解液上清总蛋白浓度。
2、使用样本稀释液，将组织裂解液稀释为相同的浓度200μg/mL，采用本发明的ELISA试剂盒检测各组织中Homer2蛋白的含量，每孔上样量为100μL，进行双抗夹心ELISA实验。同时进行标准品蛋白的检测。
3、绘制本发明的双抗夹心ELISA法的标准曲线。将Homer2标准品蛋白进行倍比稀释，浓度依次为2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL、78.13pg/mL，进行双抗夹心ELISA实验。根据不同梯度的标准品蛋白浓度及波长为450 nm处读取的OD值，通过EXCEL软件绘制出标准曲线，如图3所示，本实验得到的标准方程为y=0.216x2+0.536x+0.026，R2=0.998, 其最低检测浓度为32.23pg/mL。
4、根据不同组织测得的OD值，计算出不同的组织中Homer2蛋白的含量小鼠组织中的含量。如图4所示，小鼠脑、肾、肝和肺组织中的Homer2蛋白在总组织蛋白中的含量分别为97.84、16.53、110.57和15.88(pg/μg)。
序列表
<110> 武汉大学
<120> Homer2单克隆抗体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 354
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Glu Gln Pro Ile Phe Thr Thr Arg Ala His Val Phe Gln Ile
1 5 10 15
Asp Pro Asn Thr Lys Lys Asn Trp Met Pro Ala Ser Lys Gln Ala Val
20 25 30
Thr Val Ser Tyr Phe Tyr Asp Val Thr Arg Asn Ser Tyr Arg Ile Ile
35 40 45
Ser Val Asp Gly Ala Lys Val Ile Ile Asn Ser Thr Ile Thr Pro Asn
50 55 60
Met Thr Phe Thr Lys Thr Ser Gln Lys Phe Gly Gln Trp Ala Asp Ser
65 70 75 80
Arg Ala Asn Thr Val Phe Gly Leu Gly Phe Ser Ser Glu Gln Gln Leu
85 90 95
Thr Lys Phe Ala Glu Lys Phe Gln Glu Val Lys Glu Ala Ala Lys Ile
100 105 110
Ala Lys Asp Lys Thr Gln Glu Lys Ile Glu Thr Ser Ser Asn His Ser
115 120 125
Gln Glu Ser Gly Arg Glu Thr Pro Ser Ser Thr Gln Ala Ser Ser Val
130 135 140
Asn Gly Thr Asp Asp Glu Lys Ala Ser His Ala Gly Pro Ala Asn Thr
145 150 155 160
His Leu Lys Ser Glu Asn Asp Lys Leu Lys Ile Ala Leu Thr Gln Ser
165 170 175
Ala Ala Asn Val Lys Lys Trp Glu Ile Glu Leu Gln Thr Leu Arg Glu
180 185 190
Ser Asn Ala Arg Leu Thr Thr Ala Leu Gln Glu Ser Ala Ala Ser Val
195 200 205
Glu Gln Trp Lys Arg Gln Phe Ser Ile Cys Arg Asp Glu Asn Asp Arg
210 215 220
Leu Arg Asn Lys Ile Asp Glu Leu Glu Glu Gln Cys Ser Glu Ile Asn
225 230 235 240
Arg Glu Lys Glu Lys Asn Thr Gln Leu Lys Arg Arg Ile Glu Glu Leu
245 250 255
Glu Ala Glu Leu Arg Glu Lys Glu Thr Glu Leu Lys Asp Leu Arg Lys
260 265 270
Gln Ser Glu Ile Ile Pro Gln Leu Met Ser Glu Cys Glu Tyr Val Ser
275 280 285
Glu Lys Leu Glu Ala Ala Glu Arg Asp Asn Gln Asn Leu Glu Asp Lys
290 295 300
Val Arg Ser Leu Lys Thr Asp Ile Glu Glu Ser Lys Tyr Arg Gln Arg
305 310 315 320
His Leu Lys Val Glu Leu Lys Ser Phe Leu Glu Val Leu Asp Gly Lys
325 330 335
Ile Asp Asp Leu His Asp Phe Arg Arg Gly Leu Ser Lys Leu Gly Thr
340 345 350
Asp Asn

Claims (6)

1.分泌Homer2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：C2017193和CCTCC NO：C2017195，均是His-Homer2免疫小鼠后至尾血效价检测达1:25600后，加强免疫后进行细胞融合，His-Homer2（110-354aa）肽段筛选获得，Homer2对应的氨基酸序列为SEQ NO:1，Homer2（110-354aa）的氨基酸序列对应SEQ NO:1的第110-354位氨基酸。
2.一种Homer2单克隆抗体Homer2 2B7，其特征在于，由编号为CCTCC NO：C2017193的杂交瘤细胞株分泌。
3.一种Homer2单克隆抗体Homer2 2F8，由编号为CCTCC NO：C2017195的杂交瘤细胞株分泌。
4.权利要求2所述的Homer2单克隆抗体Homer2 2B7和权利要求3所述的Homer2单克隆抗体Homer2 2F8在制备用于检测Homer2蛋白的免疫检测工具中的应用。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为定量检测Homer2蛋白含量的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其中权利要求2所述的Homer2 2B7作为检测抗体，权利要求3所述的Homer2 2F8作为包被酶标板的抗体。
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