CN107828740B

CN107828740B - Homer3单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN107828740B
Application number: CN201711228984.9A
Authority: CN
Inventors: 涂建成; 张献伟; 沈鹤霄; 景伟; 李南迪; 朱满; 罗萍; 保罗·沃利
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2037-11-29
Also published as: CN107828740A

Abstract

本发明公开了Homer3单克隆抗体及其应用。本发明提供两株能稳定分泌特异性识别Homer3蛋白的单克隆抗体Homer3 1B11及Homer3 2F6的杂交瘤细胞株，其保藏编号分别为CCTCC No:C2017192、CCTCC No:C2017194。利用本发明提供的能够识别不同天然Homer3蛋白抗原位点的单克隆抗体制备了用于检测Homer3蛋白的免疫检测工具。本发明的双抗夹心ELISA方法批内变异系数为8.1%，其最低检测浓度为93 pg/ml。因此，本发明的单克隆抗体具有更广泛的应用空间。

Description

Homer3单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及Homer3的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体的免疫检测用途。

背景技术

Homer蛋白是在细胞内信号转导过程中非常重要的一种骨架蛋白，它参与了许多神经细胞的活动，包括调节钙离子的平衡及学习与记忆过程中突触重塑的细胞骨架的构成等。Homer蛋白家族包括了三个成员，Homer1、Homer2和Homer3，他们通过外显子不同的剪接，有形成了多种亚型。所有的亚型都含有N-端的EVH1区域，该区域可以和mGluR、IP₃R、TRPC等富含脯氨酸蛋白结合，长型Homer蛋白在C-端存在CC区域，通过CC区域Homer蛋白之间可以形成同源或异源二聚体，而短型的Homer不存在CC-区域，则不能形成二聚体，但可以通过其EVH1区域与长型Homer竞争与富含脯氨酸的受体蛋白结合，从而来调节mGluR、IP₃R、TRPC等受体的功能。Homer3蛋白是一种长片段Homer蛋白。研究表明Homer3蛋白在老年痴呆症的发病中扮演着重要的角色，Homer3蛋白与淀粉样前体蛋白结合形成复合体，调节β淀粉样蛋白的形成，从而影响阿尔兹海默病的进展。同时，Homer3蛋白在外周组织中有不同程度的表达，如肺脏、肝脏及免疫细胞中，但是其在这些组织中扮演的角色及含量还需要进一步研究。目前，市场上还没有出现针对Homer3蛋白的单克隆抗体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供两株能稳定分泌特异性识别Homer3蛋白不同位点的单克隆抗体Homer3 1B11及Homer3 2F6的杂交瘤细胞株以及该两种单克隆抗体在制备用于检测Homer3蛋白的免疫检测工具中的应用。本发明的单克隆抗体效价高、特异性强，因此具有更广泛的应用空间。

为实现上述目的本发明提供以下技术方案：

在本发明的第一方面，提供分泌Homer3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：C2017192和CCTCC NO：C2017194，均是His-Homer3免疫小鼠后至尾血效价检测达1:25600后，加强免疫后进行细胞融合，His-Homer3(116-350aa)肽段筛选获得，Homer3对应的氨基酸序列为SEQ NO:1，Homer3(116-350aa)的氨基酸序列对应SEQ NO:1的第116aa-350aa。

在本发明的第二方面，提供一种Homer3单克隆抗体Homer3 1B11，由编号为CCTCCNO：C2017192的杂交瘤细胞株分泌。

在本发明的第三方面，提供一种Homer3单克隆抗体Homer3 2F6，由编号为CCTCCNO：C2017194的杂交瘤细胞株分泌。

在本发明第四方面，提供单克隆抗体Homer3 1B11和Homer3 2F6在制备用于检测Homer3蛋白的免疫检测工具中的应用。

优选地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

优选地，所述试剂盒为定量检测Homer3蛋白含量的双抗夹心酶联免疫(ELISA)试剂盒，优选地，Homer3 2F6作为包被酶标板的抗体，Homer3 1B11作为检测抗体。

由于Homer3与Homer1、Homer2在N端均含有同源性较高的EVH1区域，为了保证本发明的单克隆抗体对Homer3的特异性，本发明选用重组的人Homer3(116-350aa)特异性片段作为筛选片段。本发明筛选获得的能够识别Homer3天然蛋白不同位点的抗体对，具有特异性强的特点；在间接ELISA实验中，本发明Homer3 1B11抗体的效价达到1：1.024*10⁶，具有效价较高的特点。本发明的双抗夹心ELISA方法批内变异系数为8.1％，且热稳定性良好，其最低检测浓度为93pg/mL。Homer3蛋白神经组织中有较高丰度的表达，并发挥着重要的生理功能。同时，Homer3蛋白在外周组织中有不同程度的表达，如肺、肝脏及免疫细胞中，但是其在这些组织中扮演的角色还需要进一步研究，因此本发明的单克隆抗体将在Homer3功能的研究领域具有广泛的应用空间。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为:

保藏单位全称:中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC；

藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；

保藏日期：2017年9月20日

培养物名称(分类命名)：杂交瘤细胞株Homer3 1B11，保藏编号：CCTCC NO：C2017192；

和

培养物名称(分类命名)：杂交瘤细胞株Homer3 2F6，保藏编号：CCTCC NO：C2017194。

附图说明

图1为western blot结果显示本发明的Homer3 1B11单克隆抗体能够特异性识别Homer3蛋白(A)，并且能够识别小鼠小脑、海马以及肺组织中的Homer3蛋白。

图2为双抗夹心ELISA法检测Homer3标准品蛋白，并绘制标准品曲线。

图3为使用本发明研制的Homer3双抗夹心试剂盒检测小鼠不同组织中的Homer3蛋白含量。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。未注明来源的实验用品均为市售。

【实施例1】抗Homer3单克隆抗体的制备

一、His-Homer3及His-Homer3(116-350aa)重组表达载体的构建。

从人肝组织中提取RNA，逆转录为cDNA，设计特异性PCR引物，克隆得到His-Homer3和His-Homer3(116-350aa)对应的DNA序列，然后将His-Homer3全长和His-Homer3(116-350aa)DNA片段重组入pET28a载体，构建pET28a-Homer3及pET28a-His-Homer3(116-350aa)质粒；DNA测序验证序列的准确性。

二、His-Homer3及His-Homer3(116-350aa)重组蛋白的表达与纯化

1、转化Rosetta大肠杆菌表达目标重组蛋白

采用42℃热激90s的方法将重组质粒转化Rosetta大肠杆菌，挑取抗卡那霉素的菌斑，DNA测序验证该菌落转化成功，放大培养至300mL LB培养基中，当菌液的OD为0.6-0.8时加入IPTG诱导目标蛋白的表达。30℃培养5小时后，收取菌体，超声破菌，离心收集上清。

2、重组蛋白纯化

菌体裂解液上清加入Ni-NTA琼脂糖凝胶中，4℃结合过夜，弃去上清。用5-10体积的10mM咪唑缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白。然后依次用20、50、250mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的特异性以及浓度。纯化得到的His-Homer3及His-Homer3(116-350aa)融合蛋白分别用于单克隆抗体制备中的免疫及筛选，His-Homer3同时用作双抗夹心ELISA实验中的标准品蛋白。

三、Bacl/c小鼠的免疫与效价检测

1、选取Balb/c(8-12周龄)小鼠5只(来自湖北省疾病预防及控制中心)。

2、首次免疫：

取重组His-Homer3融合蛋白200μg，添加PBS稀释到1000μL，加入1000μL的弗氏完全佐剂。搅拌乳化充分，每支注射器分装400μL，首次皮下多位点免疫Balb/c小鼠。

3、第二次免疫：两周后同样取重组His-Homer3融合蛋白200μg，加PBS稀释到1000μL，加入等体积的弗氏不完全佐剂。搅拌乳化充分，每支注射器分装400μL，第二次皮下多位点免疫Balb/c小鼠。

4、第三次免疫：两周后进行，方法同上。

5、第四次免疫两周后进行，方法同上。

6、测量第四次免疫后小鼠血清效价：

取重组His-Homer3融合蛋白用CB稀释(pH＝9.0)为2μg/mL包被酶标板，每孔100μL。4℃包被过夜。取出包被过夜的酶标板，TBST洗涤后，用5％的脱脂奶粉封闭，37℃温育两个小时；取出板条TBST洗三遍，4℃贮存待用。第四次免疫后3天，从小鼠尾部取血适量，12000r/min离心2min后取上清。用样本稀释液将上清稀释为1:800，然后进行倍比稀释1:1600、1:3200、1:6400、1：12800、1:25600。每孔100μL加入封闭后的酶标板。37℃，孵育1小时。取出TBST洗三遍，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，1:5000稀释，100μL/孔，37℃孵育40min。取出板条，TBST洗涤5遍，加入TMB底物，100μL/孔。37℃孵育20min。取出加入终止液，在酶标仪450nm波长处测量OD值。选取效价高于1:25600的小鼠，作为细胞融合脾脏的来源。

7、强化免疫：在细胞融合进行前三天，对小鼠进行冲击免疫。取100μg His-Homer3融合蛋白，PBS稀释为200μL，注射选定的小鼠腹腔。该小鼠作为杂交瘤细胞融合的脾脏来源。

四、杂交瘤细胞的融合、筛选与贮存

1、饲养层细胞的制备：

取成年未免疫Balb/c小鼠，引颈处死，75％酒精中浸泡5min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上。用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，用镊子撕开，暴露出腹部肌肉。用5mL注射器吸取5mL RPMI 1640培养液，注射入小鼠腹腔，待腹腔胀大后，用酒精棉对其腹部进行按摩以使RPMI 1640培养液充分进入腹腔各处后，小心吸出RPMI 1640培养基并注入50mL离心管中；继续打开小鼠腹腔，取出小鼠脾脏，放入匀浆器中，加入5mL RPMI 1640培养基，充分研磨后(组织变白)再加入5mL RPMI 1640培养液重悬，静置5min，吸出细胞悬液于上述50mL离心管里，混匀，1500r/min，离心5min，弃上清，100mL HAT培养基重悬。放入37℃CO₂培养箱中，温育待用。

2、准备SP2/0骨髓瘤细胞：

复苏一支8AG筛选过的SP2/0骨髓瘤细胞于10cm培养皿中，用10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养。第二天观察细胞状态与密度，当细胞铺满培养皿80％时进行传代。细胞融合时，取4-6皿SP2/0骨髓瘤细胞弃去培养基，用2mL预先37℃温育1640培养基把细胞吹打下来，放入离心管中，再加入10mL RPMI 1640培养基，吹打均匀。1500r/min，离心5min，弃去上清，待用。

3、免疫后的小鼠脾脏细胞的制备：

第五次免疫后3天，选取第四次免疫后血清效价较高的小鼠，引颈处死，75％酒精中浸泡5min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上。用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，然后用镊子撕开，暴露出腹部肌肉。然后打开腹腔，取出小鼠脾脏，加入5mL RPMI 1640培养基于匀浆器中，充分研磨后再加入5mL RPMI 1640培养基重悬，静置5min，吸出细胞悬液于上述50mL离心管里(弃去沉淀)，混匀，1500r/min，离心5min，弃上清。

4、细胞融合：

在细胞计数板上计数脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的数量，根据脾细胞的数量取SP2/0骨髓瘤细胞的数量，是脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞数量之比在5:1至1:1之间。用5mL预先37℃温育的RPMI 1640培养基重悬免疫过的脾细胞沉淀。然后将重悬的免疫过的脾细胞加入SP2/0骨髓瘤细胞中，吹打均匀。1500r/min，离心5min，弃去上清，用手指轻轻击打离心管底部，使细胞分布均匀、蓬松。取出37℃温育的1mL PEG4000，混匀后吸出，将PEG4000逐滴加入混合的细胞中，加入过程中要轻轻混匀，控制滴速，此过程尽量把时间控制在90秒左右。取出37℃预先温育的终止液(RPMI 1640培养基)40mL，然后在第1min逐滴加入1mL，均匀滴入，边滴加边缓慢旋转混匀，第2min加入2mL终止液，第3min加入3mL终止液，此后以适当加快速度，共加入40mL终止液，注意此过程先慢后快。轻轻混匀，800r/min，离心5min，弃去上清。

5、铺板：

用加入饲养层细胞的HAT培养基重悬上述融合细胞，然后移入HAT培养基的血清瓶中，混匀。取96孔培养板5块，然后将细胞培养液加入96孔培养板中，每孔200μL。放入37℃CO₂培养箱中培养。

6、筛选稳定产生单克隆抗体的杂交瘤细胞：

首先制作测量细胞上清效价的酶标板，方法如下：用CB包被液(pH＝9)将His-Homer3(116-350aa)融合蛋白稀释为2μg/mL，以每孔100μL包被酶标板，4℃，过夜。第二天取出，弃去包被液，每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，37℃孵育2小时。取出TBST洗3遍，放置4℃待用。

7、第一次克隆化：

细胞融合后第5天可以在显微镜下看到4、5个细胞聚集在一起的细胞集落，进行第一次换HAT培养基，吸出80μL，然后加入100μL HAT培养基。第7天进行第二次换液，换液方法同上。第9天进行第三次换液。第10天，细胞集落差不多铺满1/10孔，从每个孔里取出50μL加入预先制备的封闭过的酶标板中进行效价检测。分光光度计检测每个孔的吸光度。选取吸光度值在2.0以上的细胞孔，显微镜下观察对应孔是否有明显的细胞集落。选取其中存在细胞集落的细胞孔，采用有限稀释法进行克隆化。首先制作饲养层细胞，用RPMI 1640培养液稀释为50mL，每孔加入100μL，置于37℃CO₂培养箱待用。然后稀释杂交瘤细胞：将目标孔的杂交瘤细胞吹打均匀，吸取100μL加入900μL的20％胎牛血清HT培养基中，在显微镜下进行计数，根据细胞密度，将细胞稀释到1000个/毫升，然后吸取50μL加入到放有5mL的20％胎牛血清HT的RPMI 1640培养液培养基的青霉素瓶中。将青霉素瓶中的细胞混匀，加入铺有饲养层细胞的96孔板中，每孔100μL，即1个细胞每孔，每个原始孔杂交瘤细胞铺半块板，铺完后，放入37℃CO₂培养箱中培养。

8、定株：

将20％胎牛血清HAT RPMI 1640培养液换为20％胎牛血清HT RPMI 1640培养液，待细胞培养板中细胞铺满1/10孔，进行第二次克隆化。第二次亚克隆后将培养基换为20％胎牛血清RPMI 1640培养液。第二次、第三次克隆化，比对细胞集落与效价检测的结果，如果出现假阳性或假阴性，则继续进行克隆化，如果未出现假阴性和假阳性，则克隆化完成。选取若干个具有单细胞集落的细胞孔，吹打均匀细胞，移入预先铺有滋养层细胞的24孔板中。最终得到Homer3 1B11、2F6、2E6、3F7、9A1、9A8六株杂交瘤细胞株。

9、确定亚型：

当24孔板中的细胞达到一定的密度后，吸取50μL细胞上清，放入预先用1μg/mLHis-Homer3(116-350aa)融合蛋白包被且封闭过的酶标板中，37℃温育1h，然后加入标记HRP羊抗鼠免疫球蛋白亚型的抗体作为二抗，1:1000稀释。37℃温育40min。TBST洗涤5遍后，加入底物TMB，37℃温育20min显色，酶标仪450nm波长处测量OD值，确定单克隆抗体的亚型。结果显示本发明单克隆抗体Homer3 1B11、Homer3 2F6为IgG1均为亚型。

五、腹水的获得与单克隆抗体的纯化

1、取8周龄大的雌性Balb/C小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂，7-12天后，将扩大培养的杂交瘤细胞用PBS悬浮，每只小鼠腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞。注射杂交瘤细胞7天后，小鼠腹部明显膨大，此时用无菌注射器抽取腹水，置离心管中4000rpm 4℃离心10min。收集上清，即得到了单克隆抗体腹水。

2、用1％NaAc平衡Protein G琼脂柱料填充的柱子。

3、将腹水用孔径为0.2um的滤膜过滤，腹水用1％NaAc稀释，然后加入平衡过的柱子中，用阀门控制流速。

4、腹水上柱完毕后，然后用1％NaAc洗涤，G250检测洗涤液，不变蓝为止。

5、用3.5％的冰乙酸(用饱和Na₂CO₃调节pH为6-7之间)溶液洗脱单克隆抗体，G250检测洗脱液，不变蓝为止。

6、将洗脱液放入超滤管中4℃ 3500rpm离心30min。将超滤后的洗脱液吸入透析袋中，PBS透析过夜。将纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

【实施例2】单克隆抗体特异性及效价

一、Western blot实验

1、将Homer1、Homer2、Homer3转染的293T细胞以及小鼠的皮质、小脑、海马、肺脏和肝脏组织用RIPA裂解液裂解。12000r/min，4℃离心20min。收集上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度。

2、将细胞及组织裂解液加入12％PAGE中，120V电泳1h。然后将PAGE胶置于PVDF膜上，40mA转膜90min。

3、将PVDF膜放入1％的酪蛋白中室温封闭1h。然后分别用1:2000本发明的Homer31B11单克隆抗体及市售的Homer3多克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜。

4、取出PVDF膜PBST漂洗3次，每次3min。置于1:5000稀释的HRP标记的对应的二抗中室温孵育1h。弃去二抗，PBST洗涤5次，每次5min。

5、将DAB试剂盒中A液与B液1:1混合，避光，混匀，将膜加入显色液中避光显色15min左右终止反应，记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。

6、如图1所示，本发明的Homer3 1B11单克隆抗体能够特异性识别Homer3蛋白，并且能够用于检测小鼠小脑、海马和肺脏组织组织中的Homer3蛋白。说明本发明的Homer31B11具有特异性，并且能用于检测人源及鼠源的Homer3蛋白。

二、单克隆抗体的效价

1、以His-Homer3融合蛋白2μg/mL作为包被抗原，每孔100μL包被，4℃过夜。

2、把本发明的单克隆抗体做1:1000、1:2000、1：4000、1：8000.......1:2.048×10⁶稀释，100μL/孔，37℃孵育2h。

3、取出酶标板TBST洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育1h。

4、TBST洗涤后，TMB底物显色，20min后终止液终止反应。用酶标仪读取450nm波长处的OD值，与阴性对照450nm波长处OD比值大于2.1时的最大稀释倍数作为本发明单克隆抗体的效价，检测结果显示，本发明的单克隆抗体Homer3 1B11的效价达到1：1.024×10⁶。

【实施例3】制备Homer3双抗夹心试剂盒

一、筛选抗体对

1、选取Homer3 1B11、2F6、2E6、3F7四株单克隆抗体分别标记生物素，两两之间进行双抗夹心ELISA实验。分别用未标记的单克隆抗体2μg/mL、4μg/mL包被酶标板，4℃放置过夜。

2、取出TBST洗涤一次，加入5％脱脂牛奶封闭，37℃，2h。

3、将原核表达的Homer3蛋白标准品500pg/mL，每孔100μL加入酶标板，同时用标准品蛋白稀释液做阴性对照，37℃，孵育1h。

4、取出TBST洗涤3次，分别将标记生物素的Homer3单克隆抗体1:4000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1h。

5、取出洗涤三次，加入1:4000稀释的亲和素HRP，每孔100μL，37℃孵育1h。

6、取出TBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色20min。取出，加终止液。酶标仪(波长n＝450nm)读取不同蛋白浓度梯度下的OD值。根据标准品的OD值与阴性对照孔的背景值，选择出最为理想的单克隆抗体对，即Homer3 2F6作为包被抗体，Homer3 1B11作为检测抗体。

二、ELASA法检测样本中Homer3蛋白含量的方法的建立

1、本发明的Homer3 2F6单克隆抗体用CB(pH＝9)包被液稀释为2μg/mL，包被酶标板，4℃放置过夜。

2、取出酶标板TBST洗涤一次，加入2％BSA封闭，37℃，2h。

3、将原核表达的Homer3蛋白标准品从20000pg/mL、10000pg/mL、5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、630pg/mL倍比稀释，每个稀释梯度3个重复孔加入酶标板中，37℃，孵育1h。

4、取出TBST洗涤3次，将标记生物素的Homer 1B11单克隆抗体1:4000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1h。

6、取出TBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色20min。取出，加终止液。酶标仪(波长＝450nm)读取不同蛋白浓度梯度下的OD值。

7、根据OD值与不同梯度的蛋白浓度可以绘制出OD值与Homer3蛋白浓度的关系曲线图，得出检测样本中Homer3蛋白含量的标准曲线，用于计算样本中Homer3蛋白的含量。通过对反应参数的不断优化，从而开发出一种可以用于科研及临床诊断中检测的样本中Homer3蛋白含量的双抗夹心ELISA试剂盒。该试剂盒的灵敏度为93pg/mL。

三、确定本发明的双抗夹心试剂盒的批内变异系数

2、取出TBST洗涤一次，加入2％BSA封闭，37℃，2h。

3、取出TBST洗涤3次。加入500pg/mL His-Homer3的标准品，20个重复孔，37℃，孵育1h。

4、取出TBST洗涤3次，将标记生物素的Homer3 1B11单克隆抗体1:4000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1h。

6、取出TBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色20min。取出，加终止液。酶标仪(波长＝450nm)读取检测样本OD值。根据500pg/mL His-Homer3标准品20个重复孔OD值，计算出该批内ELISA试剂盒的变异系数CV＝SD/X^ˉ*100％。该试剂盒的批内变异系数为8.1％。

四、确定本发明的双抗夹心ELISA试剂盒的热稳定性

2、取出TBST洗涤一次，加入2％BSA封闭，37℃，2h。取出TBST洗涤3次。

3、加入浸板液，37℃孵育2h，取出酶标板，弃去浸板液。

4、倍比稀释标准品蛋白为20000pg/mL、10000pg/mL、5000p/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、630pg/mL。同时将标准品蛋白稀释为1000pg/mL作为待测样本。在第1天进行第1次双抗夹心ELISA。

5、然后将酶标板置入37℃恒温箱中，分别在第3天、第7天进行双抗夹心ELISA实验。

6、根据置于37℃中不同天数的标准品蛋白的OD值，分析本发明的双抗夹心ELISA试剂盒的热稳定性。结果显示第3天和第7天检测结果相对于第1天分别降低7.2％和15.1％，提示本发明的双抗夹心ELISA试剂盒热稳定性良好。

五、采用本发明建立的双抗夹心ELISA的方法检测小鼠组织中的Homer3蛋白的含量

1、取昆明小鼠取出其小脑、海马、皮质组织，PBS清洗后，置入研钵中，加入液氮研磨粉末后，收集入EP管中，加入适量PBS(含1％蛋白酶抑制剂PMSF)，反复吹打混匀后，13000rpm,4℃离心20min，取上清。BCA试剂盒检测小鼠裂解液上清总蛋白浓度。使用样本稀释液，将组织裂解液稀释为相同的浓度200μg/mL。

2、采用本发明的ELISA试剂盒检测各组织中Homer3蛋白的含量，每孔加样量为100μL，进行双抗夹心ELISA实验，同时检测梯度稀释的标准品蛋白。

3、绘制本发明的双抗夹心ELISA法的标准曲线。将Homer3标准品蛋白进行倍比稀释，浓度依次为20000pg/mL、10000pg/mL、5000p/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、630pg/mL，进行双抗夹心ELISA实验。根据不同梯度的标准品蛋白浓度及波长为450nm处读取的OD值，通过EXCEL软件绘制出标准曲线，如图2所示，本实验得到的标准方程为y＝1.391x²+1.801x+0.369,R²＝0.994。

4、根据标准品的浓度与吸光度值，绘制出标准曲线，根据不同组织测得的OD值，计算出不同的组织中Homer3蛋白的含量。如图3所示，小鼠皮质、海马和皮质中的Homer3蛋白在组织总蛋白中的含量分别为57.78、164.26和273.14pg/μg。

序列表

<110> 武汉大学

<120> Homer3单克隆抗体及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 361

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ser Thr Ala Arg Glu Gln Pro Ile Phe Ser Thr Arg Ala His Val

1 5 10 15

Phe Gln Ile Asp Pro Ala Thr Lys Arg Asn Trp Ile Pro Ala Gly Lys

20 25 30

His Ala Leu Thr Val Ser Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Asn Val Tyr

35 40 45

Arg Ile Ile Ser Ile Gly Gly Ala Lys Ala Ile Ile Asn Ser Thr Val

50 55 60

Thr Pro Asn Met Thr Phe Thr Lys Thr Ser Gln Lys Phe Gly Gln Trp

65 70 75 80

Ala Asp Ser Arg Ala Asn Thr Val Tyr Gly Leu Gly Phe Ala Ser Glu

85 90 95

Gln His Leu Thr Gln Phe Ala Glu Lys Phe Gln Glu Val Lys Glu Ala

100 105 110

Ala Arg Leu Ala Arg Glu Lys Ser Gln Asp Gly Gly Glu Leu Thr Ser

115 120 125

Pro Ala Leu Gly Leu Ala Ser His Gln Val Pro Pro Ser Pro Leu Val

130 135 140

Ser Ala Asn Gly Pro Gly Glu Glu Lys Leu Phe Arg Ser Gln Ser Ala

145 150 155 160

Asp Ala Pro Gly Pro Thr Glu Arg Glu Arg Leu Lys Lys Met Leu Ser

165 170 175

Glu Gly Ser Val Gly Glu Val Gln Trp Glu Ala Glu Phe Phe Ala Leu

180 185 190

Gln Asp Ser Asn Asn Lys Leu Ala Gly Ala Leu Arg Glu Ala Asn Ala

195 200 205

Ala Ala Ala Gln Trp Arg Gln Gln Leu Glu Ala Gln Arg Ala Glu Ala

210 215 220

Glu Arg Leu Arg Gln Arg Val Ala Glu Leu Glu Ala Gln Ala Ala Ser

225 230 235 240

Glu Val Thr Pro Thr Gly Glu Lys Glu Gly Leu Gly Gln Gly Gln Ser

245 250 255

Leu Glu Gln Leu Glu Ala Leu Val Gln Thr Lys Asp Gln Glu Ile Gln

260 265 270

Thr Leu Lys Ser Gln Thr Gly Gly Pro Arg Glu Ala Leu Glu Ala Ala

275 280 285

Glu Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Val Gln Asp Leu Glu Thr Arg Asn

290 295 300

Ala Glu Leu Glu His Gln Leu Arg Ala Met Glu Arg Ser Leu Glu Glu

305 310 315 320

Ala Arg Ala Glu Arg Glu Arg Ala Arg Ala Glu Val Gly Arg Ala Ala

325 330 335

Gln Leu Leu Asp Val Ser Leu Phe Glu Leu Ser Glu Leu Arg Glu Gly

340 345 350

Leu Ala Arg Leu Ala Glu Ala Ala Pro

355 360

Claims

1.分泌Homer3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：C2017192和CCTCC NO：C2017194，均是His-Homer3免疫小鼠后至尾血效价检测达1:25600后，加强免疫后进行细胞融合，His-Homer3的第116-350氨基酸肽段筛选获得，Homer3对应的氨基酸序列为SEQ NO:1，Homer3的第116-350氨基酸的氨基酸序列对应SEQ NO:1的第116氨基酸-350氨基酸。

2.一种Homer3单克隆抗体Homer3 1B11，其特征在于，由编号为CCTCC NO：C2017192的杂交瘤细胞株分泌。

3.一种Homer3单克隆抗体Homer3 2F6，由编号为CCTCC NO：C2017194的杂交瘤细胞株分泌。

4.权利要求2和3所述的Homer3单克隆抗体在制备用于检测Homer3蛋白的免疫检测工具中的应用。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为定量检测Homer3蛋白含量的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其中权利要求2所述的Homer3 1B11作为检测抗体，权利要求3所述的Homer3 2F6作为包被酶标板的抗体。